一、蛋白质纯化的方法选择（论文文献综述）
张婷[1]（2021）在《转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究》文中认为近年来,血栓性疾病越发受到关注,临床上有逐年渐增之势,严重威胁人类的生命健康。用溶栓药消除血栓是一种临床常用的方法。现有的溶栓药虽然有明确的治疗效果,但也存在治疗窗口期窄,用药量大,纤维蛋白特异性低,再灌注率低,系统出血率高,半衰期短,副作用大等问题。而纤维蛋白特异性高,溶栓效率高,出血风险低,半衰期长,毒副作用低的吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂（Desmodus rotundus salivary plasminogen activator alpha 1,DSPAα1）又称去氨普酶（desmoteplase）,有望成为新型、高效的溶栓药物。本研究应用哺乳动物转基因技术,在获得了乳腺特异性表达重组DSPA（recombinant DSPA,rDSPA）转基因兔的基础上,收集兔乳中的表达产物,应用自制的单克隆抗体,用于兔乳的ELISA和Western-blot检测;建立从转基因兔乳汁中分离和纯化rDSPA的方法;对rDSPA进行一级结构和生物活性分析,包括N端和C端氨基酸序列、相对分子量以及体外溶纤活性;应用角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型,并通过此血栓模型研究纯化产物rDSPA的体内溶栓效果及血浆半衰期。1.乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖两只原代兔经扩群繁殖、近交和回交,获得乳腺特异性表达rDSPA转基因兔134只,其中经测交确定纯合子兔2只（F2代）。收集兔乳,离心分离乳清,经ELISA检测,兔乳中rDSPA表达水平为1.19±0.26 mg/mL,纤维平板溶圈法（Fibrin Agarose Plate Assay,FAPA）检测F0代、F1代、F2代转基因兔乳清中DSPA的溶纤活性,溶圈直径大小基本一致（18.6-20.4 mm）,结果表明外源基因rDSPA能稳定遗传给后代,此外培育出的纯合子兔能免除繁琐的基因型检测工作量,为rDSPA的转基因兔的保种提供了保障。2.原核表达去氨普酶（DSPA）基因载体的构建采用分子生物学技术,用PCR法扩增pCL25/DSPA表达载体上的编码DSPAαl成熟肽的DNA序列,用于与原核表达载体连接,构建pET-28a/DSPA原核表达载体。pET-28a/DSPA原核表达载体转入Rosetta感受态细胞,进行诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE电泳估测大小约为50 kDa。目的蛋白纯化后纯度为92%,远远满足其作为制备rDSPA单克隆抗体的免疫原的纯度要求。3.rDSPA单克隆抗体制备及筛选纯化的原核表达产物加弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠,分离B淋巴细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得阳性杂交瘤细胞株,分泌PR-mAb杂交瘤细胞注入同系小鼠腹腔制备抗体。本研究共得到36株阳性杂交瘤细胞,从中筛选出12株稳定分泌抗体的细胞株（命名M1-M12）。经ELISA-elution筛选,其中M3、M4两株为多羟基反应单克隆抗体（PR-mAb）,筛选率为16.67%（2/12）。注射M3和M4细胞株的小鼠腹水的抗体效价为1:125000,腹水抗体可用于ELISA和western blot检测。4.转基因兔乳中rDSPA的分离、纯化小鼠腹水抗体经rProtein A亲和层析柱纯化后与CNBr-activated Bestarose 4 FF介质偶联制成免疫亲和层析柱。rDSPA转基因兔乳经超速离心和硫酸铵沉淀预处理后。分别选用自制免疫亲和层析、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析纯化rDSPA。结果表明rDSPA转基因兔乳通过超速离心、55%硫酸铵沉淀、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析分离纯化,获得纯度为98%的rDSPA。运用阴离子交换层析去除纯化产物中的内毒素,使用内毒素检测试剂盒检测结果表明纯化rDSPA内毒素含量低于0.015 EU/mL,符合注射剂标准。5.乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测运用Edman降解法测定rDSPA的N端氨基酸序列,结果显示rDSPA的N端氨基酸序列为 Val Ala Cys Lys Asp Glu IIe Thr Gln Met Thr Tyr Arg Arg Gln,与设计的 DSPA编码序列的理论N端的第4-18位氨基酸序列完全一致,表明rDSPA编码序列N-端的山羊β-乳球蛋白（β-lactoglobulin）的信号肽已完全切除;运用液相色谱-质谱/质谱联用技术（LC-MS/MS）测定rDSPA的C端氨基酸序列及其它部分的氨基酸序列,结果显示 rDSPA 的 C 端氨基酸序列为 Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Tyr Leu Gly Trp IIe Arg Asp Asn Met His Leu,与设计的rDSPA编码序列的C末端完全一致,共有47%（208个氨基酸）的序列与DSPA编码序列完全同源。经高分辨率质谱仪检测后确定rDSPA的相对分子量为53126.75 Da,大于理论的49535.94 Da,推测是翻译后的糖基化修饰导致;运用纤维平板溶圈法（FAPA）检测纯化产物rDSPA的体外纤溶活性（773333 IU/mg）略高于阿替普酶（580000 IU/mg）。6.rDSPA体内外溶栓效果的初步评价SD大鼠腹主动脉采血,血凝块切成约0.1 cm3方块并称重,分成7组（0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL DSPA;0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL 阿替普酶;生理盐水）,37℃孵育16 h,称重剩余血凝块并计算血凝块溶解率。结果显示rDSPA体外大鼠血凝块溶解率（48.34±2.25%）明显高于阿替普酶组（40.91±1.36%）的血凝块溶解率（p<0.05）,表明rDSPA体外溶栓活性强于阿替普酶。8周龄的雄性SD大鼠随机分成4组,每组6只,分成低、中、高剂量rDSPA组（2 mg/kg、8 mg/kg、32mg/kg）和阿替普酶组（8 mg/kg）,安慰剂组,空白对照组。各组大鼠心脏采血检测凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）,纤维蛋白原（FIB）和D-二聚体,同时测量大鼠尾部血栓长度。结果显示rDSPA有显着的溶栓效果,rDSPA低（APTT:18.80±1.26 s;TT:35.75±0.41 s）、中（APTT:27.78±1.88 s;TT:39.18±0.82 s）、高（APTT:36.51±1.29 s;TT:37.56±1.07 s）剂量组和阿替普酶组（APTT:27.00±1.76 s;TT:34.05±0.99 s）的 APTT、TT 均较安慰剂组（APTT:12.53±0.54 s;TT:26.87±1.31 s）相比有所延长,且差异极显着（p<0.01）,rDSPA 中（PT:14.28±0.79 s;D-二聚体:2.49±0.07 mg/L）、高（PT:17.07±1.19 s;D-二聚体:3.12±0.55 mg/L）剂量组和阿替普酶组（PT:14.26±0.93 s;D-二聚体:2.53±0.12 mg/L）的PT、D-二聚体水平均比安慰剂组（PT:12.29±0.76 s;D-二聚体:2.30±0.07 mg/L）显着升高（p<0.05）,表明大鼠注射rDSPA和阿替普酶后都有效激活纤溶系统。阿替普酶组（200.22±6.09mg/dL）较rDSPA低（222.40±7.89 mg/dL）、中（228.30±1.72mg/dL）、高（228.19±1.89mg/dL）剂量组的 FIB 水平较有所下降（p<0.05）,rDSPA低、中、高剂量组之间的FIB水平差异不显着,表明rDSPA在溶栓过程中FIB消耗量小于阿替普酶,相比阿替普酶不易引起颅内出血副作用,更具有安全性。rDSPA低（48.96±9.42%）、中（24.71±6.26%）、高（0.00±0.00%）剂量组和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比明显小于安慰剂组（67.76±6.06%）,即rDSPA低、中、高剂量组的尾栓消溶相对长度明显长于安慰剂组,并与剂量成正比例,且rDSPA高剂量组大鼠尾部不形成血栓。相同剂量的rDSPA中剂量组（24.71±6.26%）和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比差异极显着（p<0.01）,表明纯化产物rDSPA的溶栓能力明显优于阿替普酶。8周龄的SD雄性大鼠随机分成2组,每组4只,分为rDSPA组和阿替普酶组。rDSPA组和阿替普酶组均以8 mg/kg的剂量尾静脉注射rDSPA或阿替普酶,采集血浆进行纤溶酶-抗纤溶酶复合物（PAP）的测定,计算rDSPA半衰期。结果显示rDSPA组和阿替普酶组大鼠血浆PAP浓度分别在6 min及3 min达到顶峰（133.06±63.90 ng/mL,219.44±1.18 ng/mL）,rDSPA和阿替普酶在SD大鼠体内的血浆半衰期分别为52.41 min和10.41 min。推算rDSPA的半衰期较阿替普酶延长5倍,表明rDSPA可用于单次注射针剂溶栓药的制备。综上所述,本研究成功培育出乳腺特异性表达rDSPA转基因兔,且rDSPA转基因兔具有较高的表达水平,建立了有效的分离纯化的实验室工艺,并保持原有的溶纤溶栓活性,表明该研究迈出临床应用的第一步。rDSPA的一级结构分析表明,重组DSPA编码序列可以在转基因兔乳腺上皮细胞中表达,并剪切去除异源性的信号肽序列,翻译后加工为有溶栓活性的成熟蛋白,这一结果在国内外尚未见报道。大鼠体内外溶栓试验中rDSPA表现出优于阿替普酶的溶栓性能,且rDSPA在大鼠体内的半衰期长于阿替普酶,体内溶栓试验呈现出更安全、更持续的溶栓效果,该结果在国内外也未见报道。本研究成果为开发和生产新的高效溶栓药奠定了实验基础。
冯学珍[2]（2021）在《裙带菜ACE抑制肽的分离纯化及其抑制机理研究》文中研究表明高血压是导致心血管疾病的主要危险因素之一,血管紧张素转化酶（Angiotensin-I-converting enzyme,ACE）抑制剂是治疗高血压的主要药物。化学合成的ACE抑制剂,如赖诺普利、卡托普利等由于其副作用使其应用受限,从海洋食源生物中筛选ACE抑制肽成为众学者研究的热点。ACE抑制肽在酶解活性肽组分中存在含量相对较少、分离纯化步骤繁琐等问题,且有关抑制肽作用机理的研究相对较少。本文以裙带菜为研究对象,基于“蛋白改性-亲和介质制备-生物亲和纯化”的思路,运用超声预处理改性裙带菜蛋白,采用磁性金属有机骨架（Magnetic metal-organic framework,MOF）材料固定化ACE构建亲和介质,亲和分离获得新颖ACE抑制肽,研究抑制肽与ACE的相互作用,以解决亲和材料制备复杂、使用前仍需活化等问题。主要内容如下:（1）采用超滤、凝胶过滤柱层析和反相高效液相色谱（reversed high performance liquid chromatography,RP-HPLC）等对裙带菜蛋白酶解产物进行分离纯化,获得高抑制ACE活性组分,经质谱仪鉴定其氨基酸序列为:Tyr-Lys-Tyr-Tyr（YKYY）,IC50=71.88±1.43μM,经检索为已报道的抑制肽。实验纯化步骤相对较少,用于酶解的菠萝蛋白酶更安全、经济。（2）运用超声预处理对蛋白进行改性,改性蛋白酶解后产物具有更高水解度（Degree of hydrolysis,DH）和ACE抑制率:在超声功率200 W、超声时间15 min、超声工作间歇比1:2（s/s）的条件下,裙带菜蛋白(4.0mg·m L-1)酶解产物的ACE抑制率由41.2±2.0%提高至88.1±2.1%,DH由9.2±0.2%提高至15.6±0.3%,肽含量由13.6±0.2%提高至19.5±0.2%。运用紫外、红外、荧光光谱等分析其原因,结果表明超声预处理可诱导裙带菜蛋白结构由α-螺旋转向β-折叠,蛋白结构变得松弛,酶解产物中疏水性氨基酸含量增加;同时,显着提高了蛋白的溶解度、乳化活性、表面疏水性等性质。（3）采用磁性MOF材料（Fe3O4@ZIF-90）吸附-交联猪肺ACE,最佳固定化条件为:蛋白浓度为10.0 mg·m L-1,固定化pH值为8.0,温度为45℃,时间为2.0 h,Fe3O4@ZIF-90-ACE活力可达0.028±0.006 U·g-1。酶学性质研究结果表明固定化酶的最适pH为8.3,最适温度为45℃,与游离酶相比,固定化ACE增强了对温度的抵抗力,提高了酶的最适温度。稳定性研究结果表明固定化ACE具有较好的热、pH和储存稳定性,重复使用6次后的相对酶活保留率为54.05%,具有良好的操作稳定性。采用密度泛函理论和光电子能谱等方法从结合能、金属离子亲和层析、成键等方面探讨了Fe3O4@ZIF-90分离、固定化ACE机理,结果表明Zn2+可与ACE中的咪唑基（His）、硫醇基（Trp）和吲哚基（Cys）等配位结合亲和分离猪肺ACE,ACE通过物理吸附和共价结合固定在Fe3O4@ZIF-90上。（4）采用Fe3O4@ZIF-90-ACE磁性亲和分离结合RP-HPLC从裙带菜蛋白酶解液中分离纯化获得具有较高抑制ACE活性组分,经基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪鉴定为未报道的ACE抑制肽:Lys-Asn-Phe-Leu（KNFL）,IC50=225.87±2.7μM。与传统分离纯化方法相比,亲和纯化时间短,过程简化,亲和介质Fe3O4@ZIF-90-ACE的制备无需活化,且固定化粗提ACE具备成本低、稳定性高、可操作性强的优点。（5）运用初始速率法、等温滴定量热法、紫外、荧光、圆二色谱和分子对接等方法,解析抑制肽KNFL与ACE的作用机理。抑制肽KNFL对ACE的抑制类型为混合型抑制模式;KNFL与ACE多位点结合,且结合为自发的放热反应;二者相互作用的热力学模式为熵、焓双驱动模式,KNFL可与ACE的活性中心和非活性中心发生氢键相互作用,使ACE分子直径增加;KNFL对ACE产生荧光猝灭效果,影响ACE的Trp-、Tyr-残基周围的微环境;使ACE的α-螺旋和无规则卷曲结构向β-折叠结构转变,引起肽链重排,导致ACE空间构象发生变化,ACE活性下降。采用分子动力学模拟对对接复合物进行稳定性考察,通过根均方偏差、均方根涨落和回旋半径的分析结果表明对接复合物在模拟条件下是稳定的,最终建立KNFL与ACE相互作用模型,KNFL与ACE通过多步的诱导契合和构象选择形成相对稳定的复合物。
侯恒磊[3]（2021）在《基于大孔聚合物金属螯合层析介质的制备与评价研究》文中研究表明本课题通过一种简便的氧化还原接枝法开发了一种高镍含量的聚合物层析介质。以大孔聚丙烯酸酯类微球为基质,亚氨基二乙酸改性的甲基丙烯酸缩水甘油酯作为功能单体（GMA-IDA）,通过Ce4+引发其在微球表面及孔道内部进行接枝共聚。以单体接枝量为性能指标,分别对Ce4+接枝共聚反应体系的影响因素进行系统考察,发现随着GMA-IDA浓度（0.075-0.4 mol/L）、Ce4+浓度（0.0075-0.025 mol/L）、H+浓度（0.2-0.4 mol/L）、反应温度（30-60℃）的增加,单体接枝量均呈现先增长后减小的趋势。当GMA-IDA浓度超过0.32 mol/L时,接枝聚合反应体系中均聚反应增加,使得微球表面单体接枝量减少;当Ce4+浓度超过0.32 mol/L时,过多的Ce4+会造成终止反应速率增加,使得微球表面单体接枝量减少;当H+浓度超过0.3 mol/L时,会抑制Ce4+引发自由基活性位点的产生;当反应温度超过45℃后,使得自由基终止反应速率大于引发速率,不利于单体在微球表面的接枝共聚。当反应时间超过4.5 h后,单体基本消耗完毕,单体接枝量基本保持不变。最终确定最佳制备条件为2 g聚丙烯酸酯类微球,改性单体GMA-IDA浓度0.32 mol/L,Ce4+浓度0.0225 mol/L,H+浓度0.3 mol/L,反应温度45℃,反应时间5 h。基于此制备方法所得镍螯合层析介质的螯合配基量可达0.20 mmol/m L,镍含量可达180μmol/m L。采用红外光谱和电子扫描显微镜对微球官能团和表面形貌进行表征。以牛血红蛋白作为模型蛋白,测得PGMA-IDA-Ni(接枝GMA-IDA单体且螯合Ni2+的大孔聚丙烯酸酯类微球)介质的静态载量122.5 mg/m L。对PGMA-IDA-Ni介质进行色谱性能表征,流速为1 m L/min时,对牛血红蛋白（1 mg/m L）的动态载量（10%流穿）为17 mg/m L,性能优于商品IDA型聚合物层析介质（12 mg/m L）。同时考察了螯合不同金属离子(Cu2+、Zn2+、Co2+)PGMA-IDA微球的蛋白载量,结果表明螯合铜离子的介质蛋白载量最高,静态载量为174.4 mg/m L,动态载量为24.5 mg/ml。以金属螯合层析介质常用流动相磷酸缓冲液洗脱PGMA-IDA-Ni介质,洗脱100个柱体积后,其镍含量仅下降2.3%。经十次循环再生测试,介质镍含量基本保持不变,表明此介质可以反复多次使用。此外,对四齿配基乙二胺二乙酸和五齿配基亚氨基琥珀酸进行甲基丙烯酸缩水甘油酯改性,在大孔聚丙烯酸酯类微球表面采用Ce4+引发接枝四齿、五齿类改性单体,通过红外光谱和扫描电子显微镜对接枝四齿和五齿改性单体微球进行化学官能团、表面形貌表征,对Ce4+接枝多齿改性单体进行了初步探索。选用不同GMA-IDA单体接枝量的PGMA-IDA-Ni介质对大肠杆菌表达的六聚组氨酸标签重组麦芽糖结合蛋白和六聚组氨酸标签SL11蛋白进行纯化,结果表明无论从蛋白回收率还是纯化样品的纯度均优于同类商品介质。
池伟亚[4]（2021）在《聚丙烯酸酯微球结构与色谱性能的构效关系研究》文中研究表明生物制品作为生物医药行业中重要的产品之一,其分离纯化效率受到人们的广泛关注,层析作为蛋白质分离纯化的主流技术,其核心技术在于层析介质,层析介质结构对层析效率有着至关重要的影响。因此,研究层析介质结构与色谱性能之间的关系对于提高蛋白分离效率有着重要意义。本课题选择聚丙烯酸酯类微球作为研究对象,对其结构与色谱性能之间的关系进行了研究。主要工作内容如下:（1）以悬浮聚合法制备了甲基丙烯酸缩水甘油酯与乙二醇二甲基丙烯酸酯的共聚微球,系统考察了致孔剂组分的比例及单体含量对微球孔径的影响规律,通过调节三元致孔剂组分的比例及单体含量制备了比表面积在2.5～207.4 m2/g范围内的聚丙烯酸酯微球。基于该微球偶联了聚乙烯亚胺（PEI）,制备了弱阴离子交换层析介质。考察了PEI加入量对PEI偶联量（离子交换容量）的影响,发现随PEI加入量的增加PEI偶联量增加。（2）以该弱阴离子交换层析介质为研究对象,系统考察了离子交换容量、PEI分子对介质的蛋白吸附容量和结构的影响规律,结果表明:1)当离子交换容量小于165.5 mmol/L时,介质的静态蛋白载量和动态蛋白载量均随离子交换容量的上升而迅速增加;当离子交换容量大于165.5 mmol/L时,随着离子交换容量的增加,介质的静态蛋白载量缓慢上升,而动态蛋白载量则呈下降趋势;2)偶联PEI对不同孔径分布微球的比表面积的影响程度不同,当偶联前微球的比表面积小于65 m2/g时,偶联PEI对介质比表面积影响较小,而当偶联前微球的比表面积大于65 m2/g时,微球小孔比例较大,偶联PEI会导致1～4 nm孔隙堵塞,使介质比表面积明显下降;3)同时发现随着微球比表面积的增加,介质的静态蛋白载量先增加后减小,在比表面积为170 m2/g时达到峰值;4)偶联PEI会造成介质内1～4 nm范围内孔体积的显着减小,但对64 nm以上孔径的孔隙影响较小。（3）使用逆体积排阻色谱法（ISEC）测定了偶联PEI的聚丙烯酸酯微球的孔径结构,并用对数正态分布函数对实验结果进行拟合,得到了良好的拟合效果。通过分析发现,相比率直接影响介质的静态蛋白载量及动态蛋白载量。还研究了牛血清白蛋白（BSA）和牛甲状腺球蛋白在不同介质上的静态蛋白载量,发现,小孔径介质有利于BSA（1.9688 mmol/mg）的吸附,而大孔径介质更有利于牛甲状腺球蛋白（0.2110 mmol/mg）的吸附。（4）利用偶联PEI的聚丙烯酸酯微球对模型蛋白及鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白进行了分离。考察了三种孔结构的介质对模型蛋白的分离的效果和不同流速下介质的分离度差异,结果发现平均孔径为83.83 nm、14.22 nm、8.74 nm的介质都对模型蛋白有良好的分离效果,但平均孔径为83.83 nm的介质的分离度优于另外两种介质,且其随流速增加,其分离度下降最小。
郭育[5]（2021）在《中华鲎血液中凝血相关蛋白的制备及应用》文中研究指明中华鲎是一种古老的海洋生物。中华鲎的先天免疫系统完全依赖于一套独特且有效的凝血系统。凝血系统的凝血级联反应主要由Factor C（FC）、Factor G（FG）、Factor B（FB）以及Proclotting Enzyme（PCE）等4种凝血血蛋白和一种凝固蛋白原组成的。该系统为一种由内毒素激活FC途径,另外一种由（1,3）-β-D-葡聚糖激活FG途径。天然的鲎血制品广泛地应用于药品和食品的内毒素和真菌葡聚糖的检验、医疗器械、临床医学研究等多个领域。但由于鲎资源过度消耗,导致鲎的数量急剧减少。2019年,中华鲎已经被列入到世界自然保护联盟（IUCN）红色名录——濒危（EN）。因此,鲎试剂的制备需要通过其他的方法替代天然鲎血获得鲎试剂的原材料。本课题实验旨在通过在大肠杆菌工程菌中表达异源蛋白获得凝血蛋白,来构建检测内毒素或（1,3）-β-D-葡聚糖的反应体系,使检测更加灵敏、特异性更强,从而替代提取天然鲎血,解决生产鲎试剂原材料短缺的问题。本论文通过大肠杆菌表达系统分别异源表达FGα、FGβ和PCE等凝血因子蛋白,构建特异性检测（1,3）-β-D-葡聚糖的单一途径反应体系。通过改变诱导条件、与分子伴侣素CpkA共表达、设计融合标签肽等实验方法提高FGα和PCE的可溶性表达。对诱导表达的包涵体进行体外复性实验,利用得到的复性蛋白构建检测（1,3）-β-D-葡聚糖的反应体系,并测定不同凝血因子组合（双因子和三因子）的反应体系的肽酶活性;我们还尝试利用分子伴侣素辅助FGα和PCE体外复性。结果表明,我们在Esherichia coli BL21（DE3）中分别成功表达出FGα、FGβ和PCE重组蛋白,但主要以包涵体形式存在。分子伴侣素在体内/体外都能辅助鲎凝血因子折叠。标签肽/分子伴侣素共表达体系可提高FGα的可溶性表达:FGα’可溶性表达提高2倍;FGα’与分子伴侣素MA4386共表达,可溶性表达提高7.5倍。三种鲎凝血因子蛋白的复性均有活性,在1M和2M的尿素浓度范围内都具有肽酶活性,并在2M尿素环境中活性最高,其中CpkB辅助复性的FG a+PCE双因子检测体系具有最高的（1,3）-β-D-葡聚糖诱导的肽酶活性9.6 U/mg,且高于鲎试剂的比活为0.9 U/mg;此外非葡聚糖糖类无法诱导肽酶活性实验表明双因子检测体系对（1,3）-β-D-葡聚糖的高特异性。本实验成功表达了三种鲎凝血因子蛋白,并应用标签肽/分子伴侣素共表达体系提高了FGα的可溶性表达;最终构建了一个高活力、高特异性地用于检测（1,3）-β-D-葡聚糖反应体系。
王旭明[6]（2021）在《PHA磁性纳米微球固定化羰基还原酶及催化性能研究》文中认为手性醇药物以其独特的药效,在医疗卫生、生物医药和生命健康领域起着重要作用。其制备方法也成为药物研究的焦点。托伐普坦（Tolvaptan,TVP）是一种高效、高选择性和口服有效的非肽类加压素V2受体拮抗剂,用于治疗心力衰竭的低钠血症,而光学纯托伐普坦对人体毒副作用更小,代谢稳定性更高,受到越来越多的关注。利用生物法不对称还原7-氯-1-[2-甲基-4-[（2-甲基苯甲酰基）氨基]苯甲酰基]-5-氧代-2,3,4,5-四氢-1H-1-苯氮?（PK1）合成光学纯托伐普坦,具有立体选择性高、环境友好以及低能耗等优点。但是,目前仅有生物催化合成S型TVP的研究报道,尚无R型TVP相关研究。因此,本研究为了建立R型TVP的生物催化合成路线,通过蛋白纯化技术和基因工程方法从兔肝脏中筛选出具有R型TVP合成能力的羰基还原酶（RLSR5）。为了进一步增强游离酶的稳定性以及重复利用率,成功合成了固定化RLSR5的聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates,PHA）磁性纳米微球,实现光学纯托伐普坦的高效合成。主要研究结果如下:（1）综合利用硫酸铵逐级沉淀法、DEAE阴离子交换色谱、Hi Trap Sephadex 6B分子排阻色谱层析和超滤离心截流等方法从兔肝脏粗酶液中分离纯化出有活性的蛋白,蛋白质分子量集中在23-53 kDa。通过蛋白质质谱检测粗蛋白,并将检测结果与NCBI数据库比对,获得7种羰基还原酶类基因序列。使用Primer Premier 5设计引物,以兔肝脏基因组为模板,PCR扩增得到羰基还原酶基因片段,并成功构建3种重组表达菌株。以PK1为底物进行全细胞催化,通过HPLC检测不同重组菌株对底物PK1的催化能力,筛选出具有较高催化能力的羰基还原酶RLSR5。（2）重组菌株E.coli BL21（DE3）/pET28a-RLSR5经过诱导表达和亲和纯化获得羰基还原酶RLSR5,分子量为40 kDa。RLSR5酶活力为2.12 U,比酶活为26.5 U/m L。研究了该酶的辅酶依赖性,反应温度、pH、金属离子对羰基还原酶的酶学性质影响,得出该酶为NADPH依赖型,最适反应温度为30℃,最适反应pH为6.0。该酶在温度为20℃时保持最大活性,pH为7.0的缓冲体系中稳定性较好。金属离子对酶活性影响实验表明Zn2+离子的引入抑制了酶活性,Mg2+对酶活力的促进作用最强。（3）以聚（3-羟基丁酸-co-3-羟基己酸酯）（PHBHHx）和Fe3O4纳米颗粒为原材料,通过溶剂挥发法,合成表面光滑,呈圆球型,粒径为500 nm的PHA磁性纳米微球。利用表面结合蛋白PhaP可与PHA微球表面产生较强的吸附力这一特点,以PhaP为接头分子,实现融合蛋白PhaP-linker-RLSR5稳定固定化在PHA磁性纳米微球表面,固载量为203.5 mg/g。固定化酶可生物催化合成R型托伐普坦,底物浓度为2.23 m M时,37℃反应12 h,转化率达97%,e.e.值达到99%。和游离酶相比,固定化酶在pH为8.0缓冲体系中稳定性最好,保持较高的活性,提高了RLSR5的耐碱性。反应温度为30℃时酶的稳定性较好,剩余酶活达到93%。固定化羰基还原酶经过10次重复使用后仍保持78.62%剩余酶活。此固定化方法有效改善了游离酶稳定性差,耐受性差,不可重复使用等缺点。
杨淑暖[7]（2021）在《豌豆乳清蛋白与多糖的选择性复凝聚行为及其稳定酸性乳液的应用研究》文中认为豌豆乳清蛋白作为豌豆分离蛋白的副产物,主要存在于豌豆乳清中,总量大,具有一定的生理活性,是一种较优的蛋白资源。豌豆乳清蛋白的有效回收不仅可以避免环境污染,还可以提高豌豆加工的附加值。选择性复凝聚通过多糖选择性结合蛋白质可实现目标蛋白的快速分离及纯化,被认为是一种具有发展潜力的蛋白质纯化技术。本文以PA1a及PA2为主要研究对象,研究不同电荷性质的多糖与蛋白质的选择性复凝聚行为,考察p H、蛋白质多糖质量比及多糖类型等因素对选择性复凝聚行为的影响,确定分离及纯化PA1a及PA2蛋白的选择性复凝聚条件;最后利用豌豆乳清蛋白及多糖的复凝聚物制备酸稳定性乳液,拓展其应用范围。主要研究内容及结果如下:研究了豌豆乳清蛋白与阳离子多糖壳聚糖的选择性复凝聚行为。通过质谱鉴定,鉴定得到豌豆乳清中蛋白质组分主要包括PA1a、PA2和凝集素等。当透析的豌豆乳清（去除盐离子、低聚糖等小分子物质）与壳聚糖发生复凝聚时,p H浊度曲线及ζ-电位显示,豌豆乳清蛋白与壳聚糖形成最大程度的复凝聚(p Hmax)时,复合物电荷需满足电中性;在蛋白质/多糖质量比为1:1时,蛋白质回收率最高（38.16%）;p Hmax条件下,凝集素基本不参与形成复凝聚物,PA1a和PA2在复凝聚物中的占比与蛋白质/多糖质量比有关,在高蛋白质/多糖质量比下（≥40:1）,仅有PA2参与形成复凝聚物;在蛋白质/多糖质量比为100:1条件下,通过复凝聚,离心去除壳聚糖后,得到纯化的PA2（SEC-HPLC下纯度约为93.26%）。另外研究了壳聚糖与未透析处理的豌豆乳清液的复凝聚行为,结果发现,在p H滴定过程中,盐离子和其他小分子物质的存在会影响复凝聚的强度,表现为临界p H值(p Hc,p Hφ1)向低p H偏移,蛋白质回收率降低;选择性纯化PA2的条件由蛋白质/多糖质量比40:1偏移到20:1。为了进一步纯化得到PA1a,研究了不同类型的阴离子多糖（硫酸型,羧基型）与豌豆乳清蛋白的选择性复凝聚行为。首先将原始豌豆乳清进行分级盐析,制备得到PA1a及PA2两种蛋白质组分的混合物（PPM）,研究了PPM与阴离子多糖的选择性复凝聚行为。PPM-硫酸多糖体系相较于PPM-羧基多糖体系具有更高的临界p Hc和蛋白质回收率;PA2与PA1a共同参与形成复凝聚物,但是PA2优先转移至复凝聚物中,表现为未参与复凝聚的PA1a在上清相中不断富集,最终当蛋白质/多糖质量比例降低到一定程度时,仅有单一的PA1a存在于上清中。随着多糖电荷密度的升高,蛋白质回收率逐渐增加,同时获得单一PA1a所需的多糖相对量逐渐降低;羧甲基纤维素相对电荷密度较低,在蛋白质/多糖质量比为20:1条件下,其复凝聚体系中总蛋白质回收率最低,仅为59.40%,即自由未结合的PA1a残留率最高,因此PPM-羧甲基纤维素体系的PA1a回收率最高,SEC-HPLC检测纯度约为92.65%。电势分析及ITC结果表明,PA2比PA1a具有更高的等电点及携带更多的正电荷,PA2与硫酸葡聚糖的亲和能力(1.098±0.114×106M-1)高于PA1a(0.439±0.061×106M-1),这初步解释了PA2优先参与复凝聚的原因。最后,研究了豌豆乳清蛋白-多糖复凝聚物制备的酸性乳液的乳化特性及物理化学稳定性的影响。作为对照,仅有豌豆乳清蛋白制备的乳液在p H 5、p H 6条件下稳定性差,在均质后出现明显的油水相分离现象,14天的贮存过程中p H 3～p H 7条件下的乳液均出现不同程度的乳析分层现象。相反,在贮存2天内,豌豆乳清蛋白-硫酸葡聚糖复凝聚物制备的乳液在p H 3～p H 7范围内表现出良好的乳化稳定性,后随着贮存时间的延长,乳析指数逐渐增大。此外,经过热处理（95°C下热处理30 min）豌豆乳清蛋白-硫酸葡聚糖制备的乳液的乳析指数明显低于未加热的乳液,同时,热处理后的乳液的蛋白质吸附率和界面蛋白质含量均高未加热的乳液,使得更多的凝集素和具有良好的乳化性PA2吸附在油水界面。
周挺峻[8]（2021）在《断裂内含肽介导的C端断裂系统的性能优化研究》文中提出亲和层析技术是对重组蛋白分离纯化的有效手段之一,具有易操作、纯化效率高等特点,但是亲和层析技术通常需要在目的蛋白中引入特殊的亲和标签。工业上常用的去标签手段有内切酶法、化学法等,但处理手段往往耗时耗力且十分昂贵。内含肽作为一种特殊的蛋白质,包含了IN、IC两个互不连续的蛋白片段。内含肽通过一系列重排、转酯、环化等自我催化的反应过程,可以从前体蛋白中切除并将两端的蛋白多肽链（蛋白质外显肽,Extein）通过一个天然的肽键连接,即通过蛋白质自我剪接作用实现蛋白质结构的重新布局。以此作为基础,将IN和IC片段分别设计为亲和配体和标签,借助两者的亲和作用完成蛋白纯化,再通过内含肽的自我剪切作用去除标签,有效的避免了标签对蛋白的影响,简化了蛋白纯化的操作。在实际应用过程中发现,基于Cfa Dna E内含肽制备的亲和层析介质纯化蛋白能得到较高的纯度,但是该新型介质的再生率较低,重复使用能力较差,本研究以该内含肽为研究对象,以分子对接结果为指导,结合蛋白质工程对Cfa Dna E内含肽进行改造,得出介质的最优再生条件。本研究成功构建了新的IC蛋白,在对识别连接、介质载量等方面没有明显影响的情况下,有效地提升了洗脱效果。具体研究内容如下:（1）研究Cfa Dna E内含肽IN的蛋白结构。需要根据IN的碱基序列建立IN蛋白模型,并进行分子动力学模拟,根据RMSF值分析IN蛋白中的柔性区域,结合蛋白质工程,对IN的部分蛋白进行改造。（2）预测突变对IN蛋白稳定性的影响。根据IN蛋白结构对模型进行突变,得到单突变、双突变和三突变的IN蛋白模型。对突变蛋白模型进行分子动力学模拟,分析不同的突变蛋白的Rg值变化,得到最优的突变蛋白。（3）验证突变对IN蛋白稳定性和识别连接能力的影响。根据分子模拟结果使用PCR技术对IN蛋白进行改造,得到的最优的IN蛋白,进其进行断裂反应,分析突变对IN蛋白稳定性和识别连接能力的影响。（4）研究Cfa Dna E内含肽IN、IC之间的相互作用。本研究首先根据IN、IC片段的氨基酸序列构建了IN、IC蛋白的三维模型,在模型的基础上进行IN、IC的分子对接,结合已有的Npu Dna E、Ssp Dna E等内含肽的三维模型和对接模型评分,选出最优的蛋白复合物模型。以该模型为研究对象,分析相互作用力大小及作用区域,结果显示在IC的第12、14、15位氨基酸位点都具有2个氢键,因此,认为12到15位氨基酸之间为相互作用关键区域。（5）构建IC突变蛋白。为了进一步优化亲和层析系统的再生条件,本实验的主要研究手段是结合蛋白质工程,计划在IC中插入甘氨酸以降低稳定性。为了研究甘氨酸插入数量对IC稳定性的影响,在IC蛋白的第12、15号位之间插入3、6、12、18个甘氨酸。（6）研究突变对IC蛋白的影响。在上柱洗脱实验插入3、6个甘氨酸后IC-GFP-D蛋白在0.1 M的Na OH洗脱条件下洗脱效果明显。通过断裂反应分析突变对识别连接的影响,发现插入甘氨酸会导致断裂速率略微下降,但断裂率并没有明显的影响。同时,静态吸附实验中,插入甘氨酸会使载量下降,但仍在可接受的范围内。将突变蛋白应用于蛋白纯化,发现未对纯化效果产生明显影响。在重复上样实验中IC-6G能保持约95%的再生率,较IC有明显提升。综上,插入六个甘氨酸的IC为最优的突变蛋白。
王壹[9]（2021）在《几种原核DNA解旋酶重组表达及其活性研究》文中研究表明解旋酶（helicase）是由ATP供能解开DNA或者RNA双链的酶,在细胞中几乎所有涉及核酸的过程都发挥着作用。解旋酶可以应用于聚合酶链反应（PCR）以构建多酶反应体系、DNA测序技术等生物学研究。本文研究的解旋酶基因TK0178、MA1411和TTE0604分别来自于古细菌Thermococcus kodakarensis、古细菌Methanosarcina acetivorans和细菌Thermoanaerobacter tengcongensis。目前已商业化的解旋酶在解旋活性、反应温度等方面仍有相当的不足。因此,寻找新的DNA解旋酶对提升解旋酶的应用十分重要。本论文对解旋酶基因TK0178、MA1411、TTE0604进行古细菌的菌种培养、克隆、表达;并对解旋酶TK0178、TTE0604基因编码蛋白质使用热处理和阴离子交换柱组合纯化策略进行蛋白质纯化,并测定了ATPase酶活;最后将纯化后的解旋酶应用于PCR反应中,降低热循环PCR的非特异性扩增,以及构建依赖于解旋酶的等温PCR多酶反应体系。本论文成功地表达了解旋酶TK0178、MA1411、TTE0604基因编码蛋白质,解旋酶TK0178、TTE0604均在上清中有大量表达,蛋白大小分别为76KDa、82KDa,且目的蛋白在上清中表达量与总蛋白量近似;而解旋酶MA1411则主要表达在沉淀。纯化后得到了高纯度的解旋酶TK0178、TTE0604,蛋白质电泳显示几乎只有一条条带。纯化的TK0178和TTE0604均有ATP酶活力,在单链DNA存在下,TK0178解旋酶ATP酶活力随温度升高而升高,在100℃的活力最高,为0.387 U/mg,当温度低于60℃时,则几乎没有活力。TTE0604解旋酶ATP酶活力范围较窄,只在60℃～65℃之间可以测得酶活:60℃时,其比活为0.134U/mg,65℃时,其比活为0.136 U/mg。DNA解旋酶对热循环PCR和等温PCR的性能均有提升作用:解旋酶TK0178能够降低热循环PCR的非特异性扩增,核酸电泳表明非特异性扩增条带几乎消失;解旋酶TK0178还可在等温扩增中与聚合酶KOD pol配合,以较短的时间（～1.5 h）扩增特定DNA片段。相比市售的等温扩增试剂盒只能扩增中低GC含量DNA模板,以解旋酶TK0178构建的等温扩增反应体系能对高GC含量DNA模板有特异性扩增。本实验为构建高活性、高特异性、高稳定性的PCR多酶反应体系提供了实验基础。
李敏[10]（2021）在《多房棘球绦虫粪抗原检测靶分子的筛选与鉴定》文中进行了进一步梳理泡型棘球蚴病（Alveolar echinococcosis,AE）是由多房棘球绦虫的幼虫引起的一种重要的人畜共患病,此病又称为“虫癌”,具有高度致死性。该病对人群身体健康、畜牧业生产和社会经济发展带来较大影响,已引起社会高度关注。蛋白质组学是在大规模水平上研究蛋白质的特征,具体包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰、蛋白质与蛋白质之间的相互作用等,由此获得蛋白质水平上的关于生命活动的整体而全面的认识,是独立于基因组学而发展起来的一门新兴学科。本研究通过给犬人工感染多房棘球绦虫原头蚴,收集感染后不同时间的犬粪,对犬粪灭活后提取感染后30 d、60 d和90 d犬粪的总蛋白质,利用SDS-PAGE技术分离总蛋白质,并对高丰度条带切胶后进行质谱分析,再利用生物信息学技术对质谱数据进行系统分析,初步筛选鉴定棘球绦虫特异蛋白质和候选诊断抗原。然后从筛选的蛋白质中选取1个候选诊断抗原,克隆其蛋白质编码基因,并利用蛋白质表达系统进行表达和纯化后制备多克隆抗体,初步建立粪抗原夹心ELISA方法,利用临床样品评价确认所选蛋白质的检测能力。最后制备抗该重组蛋白质的单隆抗体,为棘球绦虫粪抗原检测试剂盒研制奠定基础。结果显示,我们从多房棘球绦虫感染后30 d、60 d、90 d的犬粪中共筛选到66个多房棘球绦虫相关蛋白质,30 d、60 d和90 d分别鉴定到28、44和21个蛋白质,其中8个蛋白质为三个时间点共有,13个蛋白质为30 d所特有,27个蛋白质为60 d所特有,7个蛋白质为90 d所特有;30 d和60 d有5个共有蛋白质,30 d和90 d有2个共有蛋白质,60 d和90 d有4个共有蛋白质。经进一步筛选,我们共选取了6个候选诊断蛋白质,对其中一个蛋白质（Em Snpt）进行编码基因克隆、表达、纯化,然后分别免疫新西兰兔和Balb/c小鼠,制备多克隆抗体。利用制备的多克隆抗体初步建立了棘球绦虫粪抗原夹心ELISA检测方法,并用临床阴阳性样品进行了评价,表明基于该蛋白质所建立的方法特异性和敏感性均较理想,是较理想的诊断靶抗原。本研究首次利用蛋白质组学技术对多房棘球绦虫感染犬粪中的寄生虫相关抗原进行了分析鉴定,并对部分抗原进行了检测能力评价,为后续棘球绦虫粪抗原检测试剂盒的研制提供了重要依据。
二、蛋白质纯化的方法选择（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、蛋白质纯化的方法选择（论文提纲范文）
（1）转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 血栓性疾病与溶栓药物的研究进展 |
| 1.1 血栓的概述及溶栓机理 |
| 1.2 去氨普酶(DSPA)研究进展 |
| 1.3 其它生物溶栓药物的研究进展 |
| 1.4 问题及展望 |
| 2 乳腺生物反应器研究进展 |
| 2.1 乳腺生物反应器简介 |
| 2.2 乳腺生物反应器优势 |
| 2.3 作为乳腺生物反应器的常用动物 |
| 2.4 乳腺生物反应器应用 |
| 2.5 问题与展望 |
| 3 蛋白质分离纯化研究进展 |
| 3.1 蛋白质分离纯化概述及其常用技术 |
| 3.2 乳腺生物反应器生产的重组蛋白的分离纯化 |
| 3.3 DSPA的分离纯化 |
| 3.4 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 常用试剂的配制 |
| 1.5 DSPA编码区设计 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 2.2 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 2.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 3.2 rDSPA转基因兔后代测交 |
| 3.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 3.4 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第二章 原核表达去氨普酶(DSPA)基因载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 载体 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 DSPA功能基因的引物设计 |
| 2.2 PCR扩增pCL25/DSPA表达载体 |
| 2.3 PCR产物和表达载体双酶切 |
| 2.4 PCR产物和表达载体酶切产物纯化 |
| 2.5 DSPA与pET-28a表达载体连接 |
| 2.6 DSPA与pET-28a表达载体连接产物转化TOP10 |
| 2.7 菌落PCR鉴定 |
| 2.8 pET-28a/DSPA重组质粒提取 |
| 2.9 pET-28a/DSPA重组质粒转化Rosetta |
| 2.10 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达 |
| 2.11 亲和层析柱纯化DSPA |
| 2.12 蛋白透析 |
| 2.13 浓缩及定量 |
| 3 结果 |
| 3.1 pCL25/DSPA表达载体的构建 |
| 3.2 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达及可溶性鉴定 |
| 3.3 Ni-NTA Resin亲和层析柱纯化DSPA |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 rDSPA单克隆抗体制备及筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物及免疫原 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及材料 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠免疫 |
| 2.2 小鼠血清检测 |
| 2.3 细胞融合 |
| 2.4 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 2.5 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化 |
| 2.6 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 2.7 阳性杂交瘤细胞的扩大培养和冻存 |
| 2.8 rDSPA单克隆抗体(PR-mAb)的大量制备 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫小鼠血清检测 |
| 3.2 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 3.3 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化鉴定结果 |
| 3.4 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 3.5 小鼠腹水抗体制备及腹水抗体ELISA检测 |
| 3.6 小鼠腹水抗体纯化及SDS-PAGE蛋白电泳检测 |
| 3.7 纯化抗体的ELISA检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 转基因兔乳中rDSPA的纯化 |
| 1 材料 |
| 1.1 纯化原料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 兔乳前处理 |
| 2.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 2.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 2.4 小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 2.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.10 纯化产物脱盐 |
| 2.11 FAPA 法检测rDSPA |
| 2.12 SDS-PAGE检测rDSPA |
| 2.13 Western Blot检测rDSPA |
| 2.14 纯化产物纯度测试 |
| 2.15 纯化产物去除内毒素 |
| 2.16 纯化产物内毒素检测 |
| 2.17 rDSPA注射剂配制 |
| 3 结果 |
| 3.1 兔乳前处理 |
| 3.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 3.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 3.4 纯化小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 3.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.10 转基因兔乳中rDSPA的最终纯化方案 |
| 3.11 纯化产物脱盐 |
| 3.12 纯化产物SDS-PAGE及Western Blot检测 |
| 3.13 纯化产物纯度测试 |
| 3.14 纯化产物去除内毒 |
| 3.15 纯化产物内毒素检测 |
| 3.16 DSPA注射剂配制 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第五章 乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 2.2 蛋白质N端测序 |
| 2.3 蛋白质C端测序 |
| 2.4 相对分子量测序 |
| 2.5 纯化产物体蛋白三维结构模拟 |
| 2.6 纯化产物体外活性测试 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 3.2 蛋白质N端测序 |
| 3.3 蛋白质C端测序 |
| 3.4 相对分子量测序 |
| 3.5 纯化产物蛋白三维结构模拟 |
| 3.6 纯化产物体外活性测试 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文 |
| 第六章 rDSPA体内外溶栓效果的初步评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验试剂及耗材 |
| 1.5 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 体外血凝块溶解试验 |
| 2.2 角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型 |
| 2.3 体内溶栓试验 |
| 2.4 大鼠血浆rDSPA半衰期试验 |
| 2.5 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA体外血凝块溶解效果评价 |
| 3.2 大鼠尾部血栓模型制备结果 |
| 3.3 rDSPA对大鼠尾部血栓模型溶栓效果评价 |
| 3.4 大鼠血浆rDSPA半衰期评价 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）裙带菜ACE抑制肽的分离纯化及其抑制机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 血管紧张素转化酶 |
| 1.2.1 ACE的分类和结构特点 |
| 1.2.2 ACE在血压调节系统中的作用 |
| 1.3 ACE抑制肽的研究进展 |
| 1.3.1 海洋来源的ACE抑制肽 |
| 1.3.2 ACE抑制肽的制备 |
| 1.3.3 ACE抑制肽的分离纯化 |
| 1.3.4 ACE抑制肽的构效关系 |
| 1.3.5 ACE抑制肽的作用机理 |
| 1.4 裙带菜的研究进展 |
| 1.4.1 裙带菜的主要化学成分 |
| 1.4.2 裙带菜的药理作用 |
| 1.5 论文研究的目的、内容和创新点 |
| 1.5.1 目的与意义 |
| 1.5.2 主要内容 |
| 1.5.3 创新点 |
| 第二章 裙带菜ACE抑制肽的分离纯化与鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 材料与试剂 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 裙带菜蛋白的提取 |
| 2.3.2 裙带菜蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 2.3.3 蛋白酶的筛选 |
| 2.3.4 裙带菜ACE抑制肽的分离 |
| 2.3.5 反相高效液相色谱法分离ACE抑制肽 |
| 2.3.6 高活性组分的结构鉴定 |
| 2.3.7 ACE抑制肽的分子对接 |
| 2.3.8 检测方法 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 牛血清白蛋白、葡萄糖及马尿酸的标准曲线 |
| 2.4.2 裙带菜蛋白的提取及酶解蛋白酶的筛选 |
| 2.4.3 裙带菜ACE抑制肽的分离 |
| 2.4.4 反相高效液相色谱法分离裙带菜ACE抑制肽 |
| 2.4.5 结构鉴定分析 |
| 2.4.6 分子对接分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 超声预处理改性裙带菜蛋白 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 材料与试剂 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 裙带菜蛋白的超声预处理 |
| 3.3.2 水解度(DH)的测定方法 |
| 3.3.3 多肽含量的测定方法 |
| 3.3.4 浊度和粒径的测定方法 |
| 3.3.5 裙带菜蛋白的差示扫描量热分析 |
| 3.3.6 裙带菜蛋白的光谱分析 |
| 3.3.7 裙带菜蛋白的功能特性的研究 |
| 3.3.8 氨基酸组成分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 裙带菜蛋白的超声预处理 |
| 3.4.2 裙带菜蛋白浊度的测定和粒径分布 |
| 3.4.3 裙带菜蛋白的差示扫描量热分析 |
| 3.4.4 裙带菜蛋白的光谱分析 |
| 3.4.5 裙带菜蛋白功能特性的研究 |
| 3.4.6 氨基酸组成分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 磁性金属有机骨架亲和介质的制备及性质研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 材料与试剂 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 磁性金属有机骨架Fe_3O_4@ZIF-90 的制备 |
| 4.3.2 猪肺ACE的提取 |
| 4.3.3 Fe_3O_4@ZIF-90 固定化 ACE条件优化 |
| 4.3.4 Fe_3O_4@ZIF-90 固定化ACE性质研究 |
| 4.3.5 Fe_3O_4@ZIF-90 及固定化ACE的表征 |
| 4.3.6 Fe_3O_4@ZIF-90 固定化ACE机理研究 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 Fe_3O_4@ZIF-90-ACE的制备工艺研究 |
| 4.4.2 Fe_3O_4@ZIF-90 固定化ACE性质研究 |
| 4.4.3 Fe_3O_4@ZIF-90-ACE的稳定性研究 |
| 4.4.4 Fe_3O_4@ZIF-90 及固定化ACE的表征 |
| 4.4.5 Fe_3O_4@ZIF-90 固定化ACE机理研究 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 磁性金属有机骨架亲和介质分离裙带菜ACE抑制肽 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与仪器 |
| 5.2.1 材料与试剂 |
| 5.2.2 仪器设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 超滤法分离裙带菜ACE抑制肽 |
| 5.3.2 Fe_3O_4@ZIF-90-ACE亲和分离裙带菜ACE抑制肽 |
| 5.3.3 反相高效液相色谱法分离裙带菜ACE抑制肽 |
| 5.3.4 ACE抑制肽的结构鉴定 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 超滤法分离 |
| 5.4.2 磁性亲和分离 |
| 5.4.3 反向高效液相色谱法分离 |
| 5.4.4 MALDI-TOF/TOF MS分析 |
| 5.4.5 ACE抑制肽KNFL的构效关系 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 ACE抑制肽的抑制机理研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与仪器 |
| 6.2.1 材料与试剂 |
| 6.2.2 仪器设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 ACE抑制肽的抑制类型研究 |
| 6.3.2 等温滴定量热法测定酶催化反应动力学参数 |
| 6.3.3 ITC法测定ACE抑制肽与ACE结合的热力学参数 |
| 6.3.4 紫外光谱法研究ACE抑制肽与ACE的相互作用 |
| 6.3.5 荧光光谱法研究ACE抑制肽与ACE的相互作用 |
| 6.3.6 圆二色谱法研究ACE抑制肽与ACE的相互作用 |
| 6.3.7 分子对接法研究ACE抑制肽与ACE的相互作用 |
| 6.3.8 分子动力学模拟研究ACE抑制肽与ACE的相互作用 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 ACE抑制肽的抑制类型分析 |
| 6.4.2 等温滴定量热法测定酶催化反应动力学参数 |
| 6.4.3 ACE抑制肽与ACE结合的热力学分析 |
| 6.4.4 紫外光谱法研究ACE抑制肽的作用机理 |
| 6.4.5 荧光光谱法研究ACE抑制肽的作用机理 |
| 6.4.6 圆二色谱法研究ACE抑制肽的作用机理 |
| 6.4.7 分子对接法研究ACE抑制肽的作用机理 |
| 6.4.8 分子动力学模拟法研究ACE抑制肽的作用机理 |
| 6.4.9 ACE抑制肽KNFL与 ACE相互作用模型的建立 |
| 6.5 本章小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
（3）基于大孔聚合物金属螯合层析介质的制备与评价研究（论文提纲范文）
| 学位论文数据集 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 选题背景与研究意义 |
| 1.2 蛋白纯化方法 |
| 1.2.1 沉淀法 |
| 1.2.2 离心法 |
| 1.2.3 电泳法 |
| 1.2.4 膜分离法 |
| 1.2.5 层析法 |
| 1.3 固定化金属亲和层析 |
| 1.3.1 IMAC基本原理 |
| 1.3.2 IMAC层析介质组成 |
| 1.3.3 IMAC的应用 |
| 1.3.4 存在的问题及解决办法 |
| 1.4 金属螯合层析介质制备方法 |
| 1.4.1 偶联小分子配基法 |
| 1.4.2 接枝聚合物长链配基法 |
| 1.5 研究目标和技术路线 |
| 1.5.1 研究目标 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 第二章 表面接枝法制备三齿镍螯合层析介质及表征 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验仪器及材料 |
| 2.2.1 实验材料及试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 金属螯合层析介质的制备 |
| 2.3.2 扫描电子显微镜测试 |
| 2.3.3 红外光谱测试 |
| 2.3.4 GMA-IDA单体接枝量测定 |
| 2.3.5 镍含量的测定 |
| 2.3.6 耐压性测定 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 PGMA-IDA-Ni微球的制备过程分析 |
| 2.4.2 Ce~(4+)引发GMA-IDA接枝共聚的影响因素考察 |
| 2.4.3 接枝单体前后微球形貌分析 |
| 2.4.4 红外分析 |
| 2.4.5 PGMA-IDA-Ni介质Ni~(2+)螯合量的研究 |
| 2.4.6 接枝PGMA-IDA前后微球耐压性对比研究 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 PGMA-IDA固定金属离子介质色谱性能考察 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验仪器及材料 |
| 3.2.1 实验材料及试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 静态载量的测定 |
| 3.3.2 动态载量的测定 |
| 3.3.3 化学稳定性测试 |
| 3.3.4 接枝不同齿类功能单体 |
| 3.3.5 螯合铜(Ⅱ)、锌(Ⅱ)、钴(Ⅱ)离子的方法 |
| 3.3.6 微球螯合金属离子含量的测定 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 不同螯合配基量 PGMA-IDA-Ni 介质对静态蛋白载量的影响 |
| 3.4.2 不同螯合配基量 PGMA-IDA-Ni 介质对动态蛋白载量的影响 |
| 3.4.3 螯合不同金属离子PGMA-IDA介质蛋白载量的对比 |
| 3.4.4 PGMA-IDA-Ni 介质化学稳定性考察 |
| 3.4.5 四齿、五齿类改性单体的接枝 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 PGMA-IDA-Ni 介质在分离实际混合蛋白体系中的应用研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验仪器及材料 |
| 4.2.1 实验试剂及材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 流动相的配制 |
| 4.3.2 细胞破碎 |
| 4.3.3 融合蛋白的分离纯化 |
| 4.3.4 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 4.3.5 凝胶过滤柱测定蛋白纯度 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 六聚组氨酸标签重组麦芽糖结合蛋白(6His-MBP)的纯化 |
| 4.4.2 六聚组氨酸标签重组 6His-SL11 蛋白的纯化 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究成果及发表的学术论文 |
| 作者与导师简介 |
（4）聚丙烯酸酯微球结构与色谱性能的构效关系研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 层析方法种类 |
| 1.2.1 离子交换层析 |
| 1.2.2 疏水作用层析 |
| 1.2.3 亲和层析 |
| 1.2.4 凝胶过滤层析 |
| 1.3 层析介质基质 |
| 1.3.1 多糖类基质 |
| 1.3.2 硅胶类基质 |
| 1.3.3 聚合物类基质 |
| 1.3.4 层析介质结构差异对其色谱性能的影响 |
| 1.4 表征介质孔径结构的常用方法 |
| 1.4.1 氮气吸脱附法 |
| 1.4.2 压汞法 |
| 1.4.3 电镜观察法 |
| 1.4.4 逆体积排阻色谱法 |
| 1.5 逆体积排阻色谱法的介绍及其应用 |
| 1.5.1 逆体积排阻色谱法的基本原理 |
| 1.5.2 逆体积排阻色谱法的优缺点 |
| 1.5.3 ISEC法的相关理论 |
| 1.5.4 ISEC法的应用 |
| 1.6 立题依据与研究思路 |
| 第二章 层析介质的结构对蛋白质吸附行为的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器及材料 |
| 2.2.1 材料与试剂 |
| 2.2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 PGMA-EDMA微球的制备 |
| 2.3.2 PGMA-EDMA-PEI微球制备 |
| 2.3.3 微球的扫描电子显微镜分析 |
| 2.3.4 BET和 BJH法测定微球的比表面积及孔径分布 |
| 2.3.5 ISEC法测定PGMA-EDMA-PEI微球的孔径结构 |
| 2.3.6 PGMA-EDMA-PEI的微球离子交换容量测定 |
| 2.3.7 PGMA-EDMA-PEI微球的静态蛋白载量测定 |
| 2.3.8 PGMA-EDMA-PEI微球的动态蛋白载量测定 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 单体含量对PGMA-EDMA微球表面形貌的影响 |
| 2.4.2 致孔剂组分比例对PGMA-EDMA微球表面形貌的影响 |
| 2.4.3 PEI用量对微球离子交换容量的影响 |
| 2.4.4 离子交换容量对微球蛋白载量的影响 |
| 2.4.5 微球表面PEI对不同孔径分布微球比表面积的影响 |
| 2.4.6 PEI键合数量对微球比表面积的影响 |
| 2.4.7 比表面积对蛋白载量的影响 |
| 2.4.8 偶联PEI对微球孔径分布的影响 |
| 2.4.9 ISEC结果与色谱性能的关系 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 PGMA-EDMA-PEI介质分离性能评价研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验仪器及材料 |
| 3.2.1 材料与试剂 |
| 3.2.2 主要实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 不同孔结构PGMA-EDMA-PEI介质分离模型蛋白 |
| 3.3.2 细胞破碎 |
| 3.3.3 VP2 蛋白纯化 |
| 3.3.4 凝胶电泳 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 PGMA-EDMA-PEI介质分离模型蛋白 |
| 3.4.2 流速对PGMA-EDMA-PEI基质分离度的影响 |
| 3.4.3 VP2 蛋白纯化 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究成果及发表的学术论文 |
| 作者及导师简介 |
（5）中华鲎血液中凝血相关蛋白的制备及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 中华鲎 |
| 1.2 鲎的凝血机制 |
| 1.3 凝血因子蛋白 |
| 1.4 鲎试剂 |
| 1.5 中华鲎凝血蛋白的异源表达研究 |
| 1.6 研究的目的及意义 |
| 1.7 研究方法及策略 |
| 第二章 鲎凝血因子蛋白的原核表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌种及质粒 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验药品 |
| 2.1.4 试剂及配方 |
| 2.2 实验内容 |
| 2.2.1 FGα、FGβ和PCE质粒的提取 |
| 2.2.2 感受态的制备及转化 |
| 2.2.3 FGα、FGβ和PCE的诱导表达 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 FGα原核表达结果 |
| 2.3.2 FGβ的原核表达结果 |
| 2.3.3 PCE的原核表达结果 |
| 2.4 结果讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 标签肽/分子伴侣素共表达体系辅助鲎凝血因子蛋白的原核可溶性表达及蛋白质纯化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 质粒及菌株 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验药品 |
| 3.1.4 试剂及配方 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 FGα和PCE与分子伴侣素CpkA的共转化 |
| 3.2.2 共转菌株的表达及诱导条件的优化 |
| 3.2.3 融合标签肽的FGα/分子伴侣素共表达体系的构建 |
| 3.2.4 FGα’的蛋白纯化 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 FGα和PCE与分子伴侣素CpkA共表达体系的验证 |
| 3.3.2 FGα’的重组质粒的验证及共表达的结果 |
| 3.3.3 FGα’的蛋白纯化 |
| 3.4 结果讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 应用于检测真菌(1,3)-β-D-葡聚糖的鲎凝血因子反应体系的构建 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 质粒及菌株 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验药品 |
| 4.1.4 试剂及配方 |
| 4.2 实验内容 |
| 4.2.1 FGα、FGβ和PCE的体外复性 |
| 4.2.2 FGα、FGβ和PCE的性质表征 |
| 4.2.3 分子伴侣素参与FGα和PCE的体外复性 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 FGα、FGβ和PCE的复性结果 |
| 4.3.2 FGα、FGβ和PCE的性质表征结果 |
| 4.3.3 CpkA或 CpkB参与FGα和PCE体外复性结果 |
| 4.3.4 不同肽酶活性反应体系的最高活性对比 |
| 4.4 结果讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5 章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的成果 |
| 致谢 |
（6）PHA磁性纳米微球固定化羰基还原酶及催化性能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 手性醇药物 |
| 1.1.1 手性醇药物概述 |
| 1.1.2 手性醇药物的临床应用 |
| 1.1.3 手性醇药物的合成方法 |
| 1.2 托伐普坦研究进展 |
| 1.2.1 托伐普坦 |
| 1.2.2 光学纯托伐普坦研究进展 |
| 1.3 羰基还原酶研究进展 |
| 1.3.1 羰基还原酶催化机制 |
| 1.3.2 生物酶催化不对称还原合成手性醇药物 |
| 1.4 固定化酶技术的研究概况 |
| 1.4.1 固定化酶的方法 |
| 1.4.2 新型固定化酶载体的研究进展 |
| 1.5 聚羟基脂肪酸酯(PHA)固定化酶的研究概况 |
| 1.5.1 PHA生物材料简介 |
| 1.5.2 体内原位组装固定化酶 |
| 1.5.3 PHA包涵体固定化酶 |
| 1.5.4 PHA磁性纳米微球 |
| 1.6 本论文的研究意义与研究内容 |
| 第二章 动物肝脏中不对称还原PK1羰基还原酶的筛选与纯化 |
| 2.1 实验试剂与仪器 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 动物肝脏粗酶液制备 |
| 2.2.2 不同动物肝脏催化活性测试 |
| 2.2.3 硫酸铵盐析逐级沉淀 |
| 2.2.4 DEAE阴离子交换纯化 |
| 2.2.5 Hi Trap Sephadex 6B分子排阻色谱层析 |
| 2.2.6 超滤离心浓缩 |
| 2.2.7 SDS-PAGE蛋白电泳分析 |
| 2.2.8 蛋白质质谱检测 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 不同肝脏对托伐普坦前手性酮的转化 |
| 2.3.2 SDS-PAGE电泳检测纯化效果 |
| 2.3.3 蛋白质质谱检测结果分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 羰基还原酶基因的克隆、表达及纯化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 实验质粒、菌株 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 兔肝脏样品来源及样品处理 |
| 3.2.2 兔肝脏RNA的提取 |
| 3.2.3 兔肝脏基因组c DNA的获取 |
| 3.2.4 引物设计 |
| 3.2.5 目的基因的克隆 |
| 3.2.6 PCR产物胶回收 |
| 3.2.7 羰基还原酶重组质粒构建 |
| 3.2.8 PCR筛选阳性克隆子 |
| 3.2.9 目的基因测序 |
| 3.2.10 重组质粒的诱导与表达 |
| 3.2.11 重组蛋白SDS-PAGE电泳分析 |
| 3.2.12 重组菌株全细胞催化托伐普坦前手性酮 |
| 3.2.13 目标羰基还原酶的纯化 |
| 3.2.14 目的蛋白SDS-PAGE电泳分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 兔肝脏RNA的提取及反转录 |
| 3.3.2 羰基还原酶基因的克隆 |
| 3.3.3 重组质粒的构建 |
| 3.3.4 测序结果 |
| 3.3.5 重组菌株的诱导表达 |
| 3.3.6 重组菌株全细胞催化托伐普坦前手性酮活性比较 |
| 3.3.7 目标羰基还原酶的分离纯化 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 羰基还原酶的酶学性质 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验试剂 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 羰基还原酶浓度测定 |
| 4.2.2 酶活测定 |
| 4.2.3 羰基还原酶的辅酶依赖性测定 |
| 4.2.4 最适反应pH的测定 |
| 4.2.5 最适反应温度的测定 |
| 4.2.6 羰基还原酶pH稳定性测试 |
| 4.2.7 羰基还原酶温度稳定性测试 |
| 4.2.8 金属离子对酶的影响 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 酶浓度测定 |
| 4.3.2 羰基还原酶的酶活测定 |
| 4.3.3 羰基还原酶的辅酶依赖性 |
| 4.3.4 羰基还原酶最适pH |
| 4.3.5 羰基还原酶最适温度 |
| 4.3.6 羰基还原酶pH稳定性 |
| 4.3.7 羰基还原酶温度稳定性 |
| 4.3.8 金属离子对酶活性的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 PHA磁性纳米微球固定化酶体系的构建 |
| 5.1 实验试剂与设备 |
| 5.1.1 实验试剂 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 PHA纳米颗粒的合成 |
| 5.2.2 PHA磁性纳米颗粒的合成 |
| 5.2.3 PHA表面结合蛋白PhaP的克隆 |
| 5.2.4 绿色荧光蛋白(EGFP)基因的克隆 |
| 5.2.5 PhaP和EGFP融合表达载体的构建 |
| 5.2.6 PhaP和EGFP融合蛋白的诱导与纯化 |
| 5.2.7 负载罗丹明B的 PHA纳米颗粒表面固定化PhaP-EGFP融合蛋白 |
| 5.2.8 PHA磁性纳米颗粒表面固定化PhaP-EGFP融合蛋白 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 PHA纳米颗粒的合成及表征 |
| 5.3.2 PHA磁性纳米颗粒的合成及表征 |
| 5.3.3 PhaP和EGFP融合表达载体的构建 |
| 5.3.4 融合蛋白的SDS-PAGE电泳分析 |
| 5.3.5 PhaP-EGFP与负载罗丹明B的PHA纳米颗粒的体外吸附 |
| 5.3.6 PHA磁性纳米颗粒与EGFP结合体在磁场中的移动 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 羰基还原酶固定化研究 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 实验试剂 |
| 6.1.2 实验仪器 |
| 6.1.3 实验菌种与质粒 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 PhaP与RLSR5基因的克隆 |
| 6.2.2 PhaP-linker-RLSR5融合蛋白表达体系构建 |
| 6.2.3 融合蛋白PhaP-linker-RLSR5的纯化 |
| 6.2.4 PHA磁性纳米微球固定化羰基还原酶 |
| 6.2.5 固定化酶pH稳定性研究 |
| 6.2.6 固定化酶温度稳定性研究 |
| 6.2.7 固定化酶重复使用性研究 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 PhaP-linker-RLSR5融合蛋白表达体系构建 |
| 6.3.2 羰基还原酶PLSR5的固定化 |
| 6.3.3 固定化酶的pH稳定性 |
| 6.3.4 固定化酶的温度稳定性 |
| 6.3.5 固定化酶重复使用性研究 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 结论及创新点 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的科研成果 |
（7）豌豆乳清蛋白与多糖的选择性复凝聚行为及其稳定酸性乳液的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 豌豆乳清蛋白 |
| 1.1.1 豌豆蛋白 |
| 1.1.2 豌豆乳清蛋白 |
| 1.2 蛋白质与多糖的复凝聚机理及应用 |
| 1.2.1 蛋白质-多糖复凝聚机理 |
| 1.2.2 蛋白质-多糖复凝聚的应用 |
| 1.3 蛋白质-多糖复凝聚在选择性纯化蛋白质中的应用研究 |
| 1.3.1 选择性复凝聚 |
| 1.3.2 影响因素 |
| 1.4 豌豆蛋白与多糖复合物制备乳液的研究现状 |
| 1.5 立题背景与意义 |
| 1.6 主要研究内容与技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 原始豌豆乳清、透析的豌豆乳清和PA1a及PA2的混合物(PPM)的制备 |
| 2.2.2 浊度测定 |
| 2.2.3 蛋白质结合多糖的热力学行为研究 |
| 2.2.4 乳液的制备 |
| 2.3 分析方法 |
| 2.3.1 电泳表征 |
| 2.3.2 基质辅助激光解析/离子化飞行时间质谱鉴定(MALDI-TOF/TOF-MS) |
| 2.3.3 N-端序列测定 |
| 2.3.4 ζ-电位测定 |
| 2.3.5 分子排阻色谱 |
| 2.3.6 蛋白质回收率测定 |
| 2.3.7 微观结构观测 |
| 2.3.8 灰分的测定 |
| 2.3.9 超滤与总糖的测定 |
| 2.3.10 粒径的测定 |
| 2.3.11 蛋白质吸附率,界面蛋白质含量及界面蛋白质组成测定 |
| 2.3.12 流变性分析 |
| 2.3.13 乳析指数测定 |
| 2.3.14 统计分析 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 豌豆乳清蛋白与壳聚糖的选择性复凝聚行为研究及PA2的分离纯化 |
| 3.1.1 豌豆乳清基本组成分析 |
| 3.1.2 豌豆乳清蛋白组成鉴定 |
| 3.1.3 透析的豌豆乳清与壳聚糖的选择性复凝聚 |
| 3.1.4 原始豌豆乳清与壳聚糖的选择性复凝聚 |
| 3.2 豌豆乳清蛋白与阴离子多糖的选择性复凝聚行为研究及PA1a的分离纯化 |
| 3.2.1 PA1a/PA2混合物(PPM)与阴离子多糖的选择性复凝聚 |
| 3.2.2 原始的豌豆乳清与阴离子多糖的选择性复凝聚 |
| 3.2.3 PA1a及PA2选择性结合多糖的机理初探究 |
| 3.3 豌豆乳清蛋白-硫酸葡聚糖制备的乳液性质研究 |
| 3.3.1 乳液贮存稳定性 |
| 3.3.2 豌豆乳清蛋白乳液和复合乳液电势 |
| 3.3.3 热处理及pH对乳液液滴粒径的影响 |
| 3.3.4 热处理及pH对乳液液滴微观结构影响 |
| 3.3.5 热处理及pH对豌豆乳清蛋白-硫酸葡聚糖复合乳液流变学性质影响 |
| 3.3.6 豌豆乳清蛋白-硫酸葡聚糖复合乳液的蛋白质界面吸附规律 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（8）断裂内含肽介导的C端断裂系统的性能优化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 内含肽的概述 |
| 1.2.1 内含肽的结构 |
| 1.2.2 内含肽的自我剪接机制 |
| 1.3 内含肽的应用 |
| 1.3.1 毒素蛋白的生产 |
| 1.3.2 生物传感器 |
| 1.3.3 重组多肽的环化 |
| 1.3.4 蛋白质的部位特异性标记 |
| 1.3.5 内含肽在蛋白质纯化方面的应用 |
| 1.4 蛋白稳定性的影响因素 |
| 1.5 计算机模拟应用 |
| 1.5.1 蛋白模型构建 |
| 1.5.2 分子动力学模拟 |
| 1.5.3 常用分子模拟软件介绍 |
| 1.5.4 分子对接 |
| 1.6 研究内容与意义 |
| 1.7 研究思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验试剂与仪器 |
| 2.3 重组蛋白的设计 |
| 2.3.1 分子动力学模拟 |
| 2.3.2 分子对接 |
| 2.4 亲和纯化系统中的重组菌的构建 |
| 2.4.1 IN片段的改造 |
| 2.4.2 IC片段的改造 |
| 2.5 重组蛋白的表达和优化 |
| 2.5.1 重组蛋白的表达 |
| 2.5.2 I_N亲和配体和I_C-GFP融合蛋白的纯化 |
| 2.6 I_N、I_C-GFP蛋白的断裂反应 |
| 2.7 层析介质的研究 |
| 2.7.1 IN层析介质的制备 |
| 2.7.2 层析介质洗脱条件的研究 |
| 2.7.3 I_C-GFP蛋白静态吸附的研究 |
| 2.8 层析介质的纯化应用 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 层析介质的再生条件的研究 |
| 3.2 构建I_N、I_C蛋白模型 |
| 3.2.1 拉氏图分析I_N、I_C蛋白模型准确性 |
| 3.3 IN蛋白的分子动力学模拟 |
| 3.3.1 I_N蛋白的均方根偏差分析 |
| 3.3.2 I_N蛋白的均方根涨落分析 |
| 3.3.3 蛋白质工程在I_N蛋白中的应用 |
| 3.3.4 IN蛋白的回转半径分析 |
| 3.3.5 IN蛋白的B因子分析 |
| 3.4 I_N蛋白改造 |
| 3.4.1 突变蛋白IN断裂反应 |
| 3.5 I_N、I_C蛋白分子对接 |
| 3.6 IC片段的改造 |
| 3.6.1 不同IC-GFP的洗脱实验 |
| 3.6.2 不同IC-GFP的断裂反应 |
| 3.6.3 不同IC-GFP的静态吸附 |
| 3.6.4 I_C-6G亲和层析介质的应用 |
| 3.6.5 I_CD-6G重复饱和上样实验 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（9）几种原核DNA解旋酶重组表达及其活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 聚合酶简介 |
| 1.1.1 解旋酶的分类 |
| 1.1.2 本文所用解旋酶的来源 |
| 1.1.3 解旋酶的结构及功能 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 解旋酶的主要研究阶段 |
| 1.2.2 解旋酶在热循环PCR反应中的应用 |
| 1.2.3 依赖解旋酶的等温扩增技术 |
| 1.2.4 解旋酶在DNA测序中的应用 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 1.4 主要研究内容 |
| 第二章 解旋酶基因的克隆及表达载体的构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株及载体 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验药品 |
| 2.1.4 溶液的配制 |
| 2.2 实验内容 |
| 2.2.1 超嗜热古菌T.kodakarensis的培养 |
| 2.2.2 解旋酶基因引物设计及合成 |
| 2.2.3 解旋酶基因的克隆 |
| 2.2.4 解旋酶基因表达载体的构建 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 超嗜热古菌T.kodakarensis的培养结果 |
| 2.3.2 全基因组DNA提取和解旋酶基因PCR扩增结果 |
| 2.3.3 解旋酶重组质粒基因表达载体的双酶切鉴定结果 |
| 2.3.4 测序结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 解旋酶表达菌株的构建及蛋白质的诱导表达、纯化、性质表征 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株及载体 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验药品 |
| 3.1.4 试剂及溶液 |
| 3.2 实验内容 |
| 3.2.1 解旋酶基因表达菌株的构建 |
| 3.2.2 解旋酶基因编码蛋白质的诱导表达、纯化 |
| 3.2.3 解旋酶基因编码蛋白质的性质表征 |
| 3.2.4 解旋酶ATP酶活性的性质表征 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 几种解旋酶表达菌株的构建结果 |
| 3.3.2 解旋酶的表达结果 |
| 3.3.3 解旋酶纯化性质表征结果 |
| 3.3.4 解旋酶ATP酶活性的性质表征结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 解旋酶在PCR中的活性研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验仪器 |
| 4.1.2 实验药品 |
| 4.1.3 试剂及溶液 |
| 4.2 实验内容 |
| 4.2.1 解旋酶对聚合酶在热循环PCR反应特异性的影响 |
| 4.2.2 解旋酶和KOD DNA聚合酶共同参加的等温PCR反应 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 解旋酶对聚合酶在热循环PCR反应特异性的影响结果 |
| 4.3.2 不同解旋酶参与的等温PCR反应结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论及展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）多房棘球绦虫粪抗原检测靶分子的筛选与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 棘球蚴病概述 |
| 1.2 病原学检测方法 |
| 1.3 粪抗原ELISA检测方法 |
| 1.3.1 常规ELISA检测方法 |
| 1.3.2 斑点酶联免疫吸附试验 |
| 1.3.3 金标试纸条法 |
| 1.4 分子生物学检测方法(粪DNA检测法) |
| 1.4.1 常规PCR方法 |
| 1.4.2 其他PCR方法 |
| 1.4.2.1 实时荧光定量PCR |
| 1.4.2.2 多重PCR方法 |
| 1.4.2.3 巢式PCR方法 |
| 1.4.2.4 PCR-RFLP |
| 1.4.2.5 新型PCR方法 |
| 1.4.3 LAMP |
| 1.4.4 RAA |
| 1.5 目的与意义 |
| 第二章 多房棘球绦虫感染犬粪蛋白质组分析 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 动物感染与粪便处理 |
| 2.1.4 蛋白质胶条鉴定 |
| 2.1.4.1 蛋白质提取 |
| 2.1.4.2 SDS-PAGE |
| 2.1.4.3 胶内酶切 |
| 2.1.5 质谱分析 |
| 2.1.6 蛋白质鉴定 |
| 2.1.7 蛋白质的初步筛选 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 多房棘球绦虫感染犬犬粪蛋白质组的筛选 |
| 2.2.2 犬粪蛋白质GO注释和Pathway注释 |
| 2.2.3 筛选结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 多房棘球绦虫候选诊断抗原的克隆及生物信息学分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 多房棘球蚴的获取 |
| 3.2.2 克隆构建 |
| 3.2.2.1 总RNA的提取 |
| 3.2.2.2 总RNA反转录 |
| 3.2.2.3 引物设计与合成 |
| 3.2.2.4 基因的PCR扩增 |
| 3.2.2.5 核酸电泳检测 |
| 3.2.2.6 连接 |
| 3.2.2.7 筛选阳性单克隆并鉴定和测序 |
| 3.2.2.8 转化 |
| 3.2.3 生物信息学分析 |
| 3.2.3.1 EmSnpt蛋白质的理化性质预测 |
| 3.2.3.2 EmSnpt蛋白质的信号肽、跨膜区预测 |
| 3.2.3.3 EmSnpt蛋白质的二级结构预测 |
| 3.2.3.4 EmSnpt蛋白质的三级结构预测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 多房棘球蚴总RNA的提取 |
| 3.3.2 EmSnpt蛋白质克隆 |
| 3.3.3 EmSnpt理化性质 |
| 3.3.4 EmSnpt信号肽及跨膜区预测 |
| 3.3.5 EmSnpt二级结构分析 |
| 3.3.6 EmSnpt抗原表位预测 |
| 3.3.7 三级结构预测 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 EmSnpt重组蛋白质表达、纯化、复性 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 主要设备仪器及耗材 |
| 4.1.3 主要试剂配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 目的片段扩增 |
| 4.2.2 载体连接 |
| 4.2.3 转化 |
| 4.2.4 质粒鉴定 |
| 4.2.5 重组蛋白质原核表达及表达形式鉴定 |
| 4.2.6 表达条件优化 |
| 4.2.7 蛋白质纯化 |
| 4.2.7.1 样品准备 |
| 4.2.7.2 蛋白质纯化 |
| 4.2.7.3 重组蛋白质透析复性 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 阳性质粒鉴定 |
| 4.3.2 重组质粒的酶切和PCR鉴定 |
| 4.3.3 EmSnpt原核表达 |
| 4.3.4 不同诱导剂浓度的优化 |
| 4.3.5 不同温度和转速的优化 |
| 4.3.6 重组蛋白的纯化 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 EmSnpt 蛋白多克隆抗体的制备及其ELISA检测方法的初步建立 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 实验仪器及耗材 |
| 5.1.4 相关试剂的配置 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 兔抗EmSnpt多克隆抗体的制备 |
| 5.2.1.2 兔阴性血清的采集 |
| 5.2.1.3 兔阳性血清的制备 |
| 5.2.1.4 抗体的检测 |
| 5.2.2 小鼠免疫 |
| 5.2.2.1 小鼠阴性血清的采集 |
| 5.2.2.2 小鼠阳性血清的制备 |
| 5.2.2.3 抗体的检测 |
| 5.2.2.4 蛋白质印迹法(Western Blot) |
| 5.2.3 粪抗原夹心ELISA方法的初步建立 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 兔子免疫效价分析 |
| 5.3.2 小鼠免疫效价分析 |
| 5.3.3 蛋白质免疫印迹 |
| 5.3.4 粪抗原ELISA方法检测结果 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、蛋白质纯化的方法选择（论文参考文献）
- [1]转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究[D]. 张婷. 扬州大学, 2021
- [2]裙带菜ACE抑制肽的分离纯化及其抑制机理研究[D]. 冯学珍. 广西大学, 2021
- [3]基于大孔聚合物金属螯合层析介质的制备与评价研究[D]. 侯恒磊. 北京石油化工学院, 2021(02)
- [4]聚丙烯酸酯微球结构与色谱性能的构效关系研究[D]. 池伟亚. 北京石油化工学院, 2021(02)
- [5]中华鲎血液中凝血相关蛋白的制备及应用[D]. 郭育. 长春理工大学, 2021(02)
- [6]PHA磁性纳米微球固定化羰基还原酶及催化性能研究[D]. 王旭明. 河北大学, 2021(09)
- [7]豌豆乳清蛋白与多糖的选择性复凝聚行为及其稳定酸性乳液的应用研究[D]. 杨淑暖. 江南大学, 2021(01)
- [8]断裂内含肽介导的C端断裂系统的性能优化研究[D]. 周挺峻. 江南大学, 2021(01)
- [9]几种原核DNA解旋酶重组表达及其活性研究[D]. 王壹. 长春理工大学, 2021(02)
- [10]多房棘球绦虫粪抗原检测靶分子的筛选与鉴定[D]. 李敏. 中国农业科学院, 2021