一、纯化大鼠胚肝细胞脾内移植增殖的实验研究（论文文献综述）
郑雪[1]（2019）在《骨髓间充质干细胞对大鼠肝纤维化的影响》文中提出目的通过移植大鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC）治疗肝纤维化大鼠,并评价其疗效。方法通过全骨髓贴壁法分离培养纯化大鼠BMSC,用流式细胞仪对第3代BMSC进行表面抗原鉴定。选取清洁Sprague-Dawley大鼠20只构建肝纤维化模型,利用四氯化碳（Carbon tetrachloride,CCl4）皮下注射构建大鼠肝纤维化模型,将肝纤维化大鼠随机分为BMSC组、PBS组,每组10只;分别通过尾静脉注射,予1mL细胞浓度为1^106个/mL的BMSC细胞悬液、1mLPBS溶液,另取6只健康雄性SD大鼠作为空白对照组;移植后第5周处死各组大鼠,采集血液检测大鼠肝功;取肝脏组织切片进行HE、Masson染色,观测大鼠肝细胞组织损伤及纤维化程度,利用Image J软件计算肝脏胶原容积分数（Collagen Volume Fraction,CVF）;通过qRT-PCR检测各组大鼠肝脏Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达。结果1.通过流式细胞术鉴定BMSC表面抗原,CD29、CD90高表达,CD45低表达;2.与对照组比较,BMSC组大鼠肝脏肝小叶网状结构较完整,CVF降低且Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达减少（P<0.05）;3.与PBS相比,BMSC组大鼠肝功能改善,且差异具有统计学学意义（P<0.05）结论同种异体移植BMSC可以有效减少肝脏胶原沉积,改善肝纤维化大鼠肝脏功能。
孙婷[2]（2019）在《超声靶向微泡破坏介导BMSCs修复大鼠急性肝损伤的实验研究》文中指出目的:超声靶向微泡破坏（Ultrasound targeted microbubble destruction,UTMD）技术是一种新的药物和基因递送方式,靶向特异性强、效率高,已有研究显示UTMD能增强骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的靶向归巢率,改善心功能和修复缺血心肌。本研究中,我们拟探讨UTMD对BMSCs归巢至肝脏的可行性、有效性,进而评估BMSCs对急性肝损伤的治疗效果,试图分析UTMD促进BMSCs靶向归巢的潜在机制。方法:采用贴壁离心法分离培养大鼠BMSCs,鉴定其增殖特性、三向分化能力和细胞表面抗原标志。携带增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）的慢病毒感染BMSCs用于体内示踪。SD大鼠经腹腔单次注射1.5g/kg D-氨基半乳糖（D-galactosamine,D-Gal）建立急性肝损伤（Acute liver injury,ALI）模型,检测24小时后血清学和肝脏组织结构评价模型是否成功建立。辐照急性肝损伤大鼠,24h后检测肝组织内基质细胞衍生因子（Stromal cell derived factor 1,SDF-1）和肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）的蛋白水平以确定合适的UTMD辐照强度。60只ALI模型鼠随机分Control,UTMD,BMSCs以及UTMD+BMSCs四组,大鼠进行相应实验处理48h后,每组随机选取3只大鼠,检测肝脏内BMSCs的归巢数量,并通过Western Blot和实时荧光定量聚合酶链锁反应（Quantitative real time polymerase chain reaction）qRT-PCR分析肝组织内趋化因子的表达程度-SDF-1,monocyte chemotactic protein 1（MCP-1）,intercellular cell adhesion molecule（ICAM-1）,vascular cell adhesion molecule 1（VCAM-1）和hepatocyte growth factor（HGF）。分别于治疗后48h,72h,1w和2w后检测大鼠血液生化指标—丙氨酸转氨酶（Alanine transaminase,ALT）,天冬氨酸转氨酶（Aspartate transaminase,AST）,碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）以及肝脏组织结构改变,同时于治疗后1w检测各组大鼠的肝细胞凋亡和增殖情况。结果:分离培养的大鼠BMSCs显示良好的干细胞特性。应用不同强度超声辐照ALI大鼠肝脏后,SDF-1和TNF-α表达水平随超声能量增加而增强（p<0.01）。在BMSCs和/或UTMD治疗后,UTMD+BMSCs组大鼠肝脏内BMSCs数量明显高于BMSCs组。此外,UTMD+BMSCs组大鼠肝内SDF-1,MCP-1,ICAM-1,VCAM-1和HGF的蛋白和mRNA表达量均高于BMSCs组（p<0.01）。UTMD+BMSCs组大鼠肝脏的生物学标志物的血清水平显着降低,肝细胞凋亡率明显低于BMSCs组（均p<0.05）。UTMD+BMSCs组大鼠肝脏病理损伤程度较其他三组改善明显。结论:UTMD能通过上调某些特异性的粘附分子和细胞因子增强BMSCs在ALI大鼠的肝脏归巢,从而增强干细胞对损伤肝脏的修复,改善受损肝功能,抑制细胞凋亡,促进肝细胞增殖。UTMD可为BMSCs移植修复急性损伤的肝脏提供有效且无创的治疗新方案。
王亚萍[3]（2013）在《鼠胎肝干细胞的体外分离培养及体内移植的实验性研究》文中研究指明第一章一种改进的大鼠胎肝干细胞分离纯化方法背景干细胞是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞,存在于许多组织中；根据其发育阶段不同分为胚胎干细胞和成体干细胞。肝干细胞（hepatic stem cell,HSC）是成体干细胞的一种,可分化为成熟肝细胞、胆管上皮细胞和胰腺上皮细胞。跟据其起源的不同,可分为肝源性肝干细胞和非肝源性肝干细胞,前者主要包括肝卵圆细胞、小肝细胞,后者主要起源于骨髓干细胞和胚胎干细胞。目前研究肝干细胞已成为世界范围的热点,由于它具有来源广泛、增殖能力强、移植细胞体积小等传统肝细胞无可比拟的优点,可以预测它将替代肝脏移植和肝细胞移植成为治疗器官衰竭的一种重要细胞来源。正是由于肝干细胞治疗各种原因引起的肝病具有无可比拟的优势,因此探讨如何获得高纯度的肝干细胞及其特异性的标志物有重要的现实意义。正常情况下,体内肝干细胞多处于静息期,数量极少,分离时常先经药物或手术造成肝脏损伤,肝脏灌流或联合细胞分离液分离来获得肝干细胞,操作复杂且成本较高。相比较传统的肝干细胞分离培养方法而言,本实验室首次采用先机械剪碎酶消化法分离获得肝干细胞,简单的离心分离法和胰蛋白酶选择性消化法相结合,从孕15天大鼠胎肝组织中成功分离出肝干细胞。此方法在原代即可获得形态均一、增殖速度快、性状稳定的LSCs,且具有操作简单、快捷、实用、对细胞损伤小等优点,为其作为组织工程种子细胞提供了实验基础。目的改进大鼠胎肝干细胞的分离纯化方法,提高肝脏干细胞分离的纯度和活力。方法1、购清洁级别近交系孕15天SD大鼠,利用械剪碎酶消化法分离获得肝干细胞,后经简单的离心分离法以及胰蛋白酶选择性消化法进行进一步的纯化,得到较为纯化的肝干细胞。加入含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养,显微镜下观察细胞贴壁情况及形态学变化。2、将卵圆细胞接种于预先用0.2%明胶处理的盖玻片上置于24孔培养板中,37℃,5%CO2孵箱培养24小时,至细胞长成单层后行免疫荧光化学检测。细胞消化传代,对P10代细胞进行免疫组织化学检测。分别检测P1和P10代肝干细胞表面标志物CD34、C-Kit、0V6、CK19的表达情况结果分离的大鼠胎肝干细胞接种培养瓶24h后开始贴壁,5d后细胞体积增大,呈梭形或多边形。经1-2次差异性消化传代后,细胞呈集落样生长,边缘清晰且折光率强。免疫细胞化学检测示：P1代大鼠胎肝干细胞C-Kit、甲胎蛋白（AFP）抗原、OV6、细胞角蛋白（CK）19呈阳性表达,不表达ALB。P10代肝干细胞C-Kit、 CK19、OV-6及CD34呈阳性表达。结论此方法在原代即可获得形态均一、增殖速度快、性状稳定的LSCs,且具有操作简单、快捷、实用、对细胞损伤小等优点,为深入研究肝干细胞生物学特性和进行体内移植实验提供了物质基础。第二章大鼠肝损伤后成熟肝细胞和卵圆细胞在肝再生中的作用背景长期以来,成熟肝细胞和卵圆细胞在损伤肝的再生中如何发挥作用一直是肝干细胞研究领域的核心问题,对两者在损伤肝再生中的作用也有着不同的观点。一方面,有报道认为部分肝切除（partial hepatectomy, PH）后大鼠肝可在二周内再生并恢复至原来大小,有人连续进行了12次PH后发现仍能完成肝再生：这种肝再生多被认为是单独由成熟肝细胞分裂增殖完成的。另一方面,在损伤肝再生中发挥了作用的、起源于门管区小胆管和Hering’s管的卵圆细胞（OVC）被认为可能是肝内源性的具有肝胆双向分化潜能的成体肝干细胞。目前,为研究成体肝脏中肝干细胞的增殖、分化,研究者们采用各种不同的方法抑制肝细胞增殖,并采用药物（如CCl4）或肝部分切除术等诱导肝脏急性损伤,以激活肝脏干细胞。从而研究肝损伤后成熟肝细胞和卵圆细胞与肝脏再生的关系。本研究鉴于RS是公认的能长期抑制成熟肝细胞分裂增生的肝化学毒剂,而PH又能给予强烈的肝再生需求,我们建立了肝脏切除及其联合应用倒千里光碱导致肝脏急性损伤的大鼠模型,通过对Rs/PH和1/3PH后肝再生过程中成熟肝细胞和卵圆细胞的比较病理学研究,并依据研究中观察到的一系列现象,探讨关于肝损伤后成熟肝细胞和卵圆细胞与肝脏再生的关系。目的联合应用倒千里光碱（RS）和肝脏1/3切除术（1/3PH）建立大鼠肝损伤模型。观察大鼠肝损伤后肝细胞和卵圆细胞增殖情况,探讨关于肝损伤后成熟肝细胞和卵圆细胞与肝脏再生的关系。方法1、30只大鼠随机分为2组,每组15只。倒千里光碱／肝脏1/3切除组（RS/PH组）：取150g左右SD大鼠,腹腔注射倒千里光碱溶液30mg/kg,共注射2次,每次间隔2周。肝脏1/3切除组（1/3PH组）：用生理盐水代替倒千里光碱,腹腔注射30mg/kg,共注射2次,每次间隔2周,第2次腹腔注射4周后,两组大鼠行肝脏1/3切除术。2、分别于术后第3、7、14、20天处死大鼠,10%甲醛固定,石蜡包埋,常规切片,采用苏木精-伊红染色,BrdU注射及BrdU免疫荧光化学检测,CK19、 C-Kit免疫组织化学检测观察两组大鼠术后不同时间点肝脏病理形态变化、细胞增殖情况和CK19、C-kit免疫组化检测情况结果RS/PH组大鼠术后20d体质量仍低于术前,肝脏增大明显小于1/3PH组,HE染色示胞体肿大、胞浆疏松、肝细胞广泛空泡变性,汇管区小胆管周围和肝小叶内可见成簇或散在分布的卵圆细胞增生；1/3PH组术后20d体质量恢复接近术前,肝脏损害较RS/PH组轻,Brdu免疫荧光示成熟肝细胞大量增生,术后14d见肝OVC增生,多出现在肝细胞索中,形态和免疫组化标记与RS/PH组OVC一致。结论成功构建了倒千里光碱联合肝脏1/3切除术的急性肝损伤大鼠模型,实验可见肝脏中毒及中毒后肝干细胞和成熟肝细胞增殖的现象,证实肝细胞更新与损伤后再生是肝流域中肝内外源肝干细胞及成熟肝细胞共同作用的结果。第三章GFP转基因小鼠胎肝干细胞体外分离培养及脾内移植的初步研究背景各种原因引起的急、慢性肝功能衰竭的发病率和死亡率很高,已成为威胁肝病患者生命的主要原因。目前,原位肝移植（OLT）已被证明是治疗各种肝功能失代偿期、肝功能衰竭期最有效的治疗方法,但因为肝源缺乏、费用昂贵、以及移植后并发症多等限制了OLT的广泛应用。近年来,新的干预性治疗不断出现,肝细胞移植已开始应用于一些动物模型和人类临床实验,但由于肝细胞来源不充足,人们仍然希望能够获得大量更安全的细胞来源。肝干细胞的移植为此开拓了新的途径,肝干细胞是一种多能干细胞,它具有自我更新、高度增殖及向肝细胞和胆管细胞分化的能力,在体内可以分化为肝细胞和胆管细胞,参与肝脏的发生发育及损伤后修复等生理病理过程。若能将其大量扩增后再进行移植,就可能从量上解决细胞来源短缺的问题。肝干细胞移植相对于肝细胞具有更大的优势：（1）肝干细胞具有更大的增殖能力,植入受体后增殖能力强,较少的移植细胞数就能达到较好的增殖效果；（2）移植肝内后能分化为肝细胞和胆管上皮细胞,对肝组织结构重建及功能恢复更为有利,更为重要的是,肝细胞增殖需要受肝存在选择压力,而肝干细胞在正常肝脏环境中就能大量增殖,为受体肝脏的再生及肝功能恢复提供机会；（3）肝干细胞分化不成熟,免疫原性更弱,Kubota等研究表明肝母细胞中不表达经典的MHC-1分子,在肝干细胞同种异体移植时能引起免疫逃逸。移植失败现象较肝细胞移植少,对受体影响小；（4）肝干细胞直径（10-12μm）较肝细胞（20-35μm）小,更容易通过肝窦到达肝脏各叶,使其定植及扩增效率增加。而肝细胞移植浓度较高时部分细胞则不能通过汇管区小血管。因此肝干细胞可以作为生物型人工肝和肝细胞移植最理想的细胞来源,从而在肝病基因治疗中发挥重要作用,并有望成为取代严重肝功能衰竭患者肝移植的替代疗法,具有很大的研究前景。本研究对L-CL2MDP/RS/PH处理的大鼠进行GFP转基因小鼠胎肝干细胞移植,结果表明本实验室建立的肝干细胞系能够成功植入L-CL2MDP/RS/PH大鼠肝脏中,植入的细胞能够在受体大鼠肝脏中存活,并且出现不同程度的增殖。而在未作预处理的正常大鼠肝脏中未见GFP+肝干细胞。虽然我们并不能明确移植的胎肝干细胞在肝内增殖程度,但从肝脏中GFP阳性的细胞比例比较,L-CL2MDP/RS/PH实验组比正常对照组具有明显的优势。说明L-CL2MDP/RS/PH模型能够提供一个相对较好的肝干细胞植入的环境。这为研究适用于细胞移植的实验动物模型提供了一些有价值的信息。今后我们将扩展这一研究成果,努力与临床实践相结合,并回答移植研究中尚待解决的排斥免疫学机制问题。目的1、从荧光转基因小鼠胎肝中获得稳定表达GFP蛋白的肝脏干细胞2、联合应用L-CL2MDP/RS/PH,建立适合肝脏干细胞移植的大鼠动物模型,进一步提高肝干细胞的移植效率。方法：1、孕15d绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠,体重40-60g,SPF级150g左右SD雄性大鼠30只,GFP转基因小鼠胎肝干细胞的分离、体外培养与传代及免疫组化鉴定2、建立L-CL2MDP/RS/PH动物模型,将分离的胎肝干细胞通过脾脏注射移植到大鼠肝脏,检测细胞移植后GFP蛋白的表达,以及免疫组化检测C-Kit、 AFP明确移植的肝干细胞在肝脏内是否增殖。结果1、倒置显微镜下见分离的肝干细胞大小均匀,呈鹅卵石形态。接种培养瓶24h细胞开始贴壁并伸展；培养5d后细胞体积增大,呈梭形或多角形,荧光显微镜可观察到细胞发出绿色荧光。传代3次后,细胞状态良好,在荧光显微镜下可见炫目的绿色荧光,免疫组化检测P3代细胞CD34、AFP呈阳性表达,。2. HSCs经脾脏移植后3d在荧光显微镜下观察两组大鼠的肝脏冰冻切片,发现L-CL2MDP/RS/PH组大鼠肝内散在分布GFP阳性细胞,细胞大小为正常肝细胞的1/3-1/2,与周围细胞相比,呈现高亮度的绿色荧光；而对照组大鼠肝内未见GFP阳性细胞。移植后30d移植大鼠肝脏内仍可见GFP阳性表达,阳性细胞成团聚集、局灶状分布,细胞形态与肝细胞相似。结论1、从GFP转基因小鼠肝脏中成功分离出胎肝干细胞,分离的细胞原代形态均一、增殖速度快、传代3次后均可以稳定而强烈表达绿色荧光,为进一步研究提供了良好的示踪工具。2、成功建立了L-CL2MDP/RS/PH的大鼠模型,植入的细胞能够在受体大鼠肝脏中存活,并且出现不同程度的增殖。说明L-CL2MDP/RS/PH模型能够提供一个相对较好的肝干细胞植入的环境。这为研究适用于细胞移植的实验动物模型提供了一些有价值的信息。小结1、改进大鼠胎肝干细胞的分离纯化方法,提高肝脏干细胞分离的纯度和活力。本研究选择大鼠胚胎肝脏作为细胞来源,采用机械剪碎酶消化法分离获得肝干细胞,后经简单的离心分离法以及胰蛋白酶选择性消化法进一步纯化,得到较纯净的大鼠胎肝干细胞。利用免疫细胞化学方法分别检测P1和P10代肝干细胞表面标志物,证实本研究分离培养的细胞具有干细胞特性,是肝干细胞。2、观察倒千里光碱联合肝脏部分切除术（RS/PH）对肝损伤后再生修复的影响。本实验成功构建了倒千里光碱联合肝脏部分切除术导致肝脏急性损伤的大鼠模型,实验可见肝脏中毒及中毒后肝干细胞增殖的现象,术后H-E染色发现RS/PH组汇管区小胆管周围和肝小叶内可见成簇或散在分布的卵圆细胞增生,CK19、c-kit阳性细胞出现在汇管区,特别是小胆管周围,形态与周围胆管细胞相似。而PH组未见以上表现。证实该模型可抑制成熟肝细胞增殖,同时通过刺激肝卵圆干细胞增殖以实现修复。这为研究适用于肝干细胞移植的动物实验模型提供一些有价值的信息。3、肝干细胞移植的成功率低仍是目前国内外研究中亟待解决的一个问题。为了进一步提高肝干细胞在肝脏中的存活,本实验室完成脂质体包裹的二氯亚甲基二磷酸盐（L-CL2MDP）的制备,通过腹腔注射L-CL2MDP,特异性的清除肝脏及脾脏中的巨噬细胞,并进一步联合应用我们已经构建的倒千里光碱/部分肝切的大鼠肝损伤模型,建立一种新的肝干细胞移植模型。目前,我们从本实验室已有荧光转基因小鼠肝脏分离肝脏干细胞,获得稳定表达GFP的细胞株,将GFP+-LSC细胞通过脾脏注射移植给L-CL2MDP/RS/PH处理的大鼠。观察其在肝内的增殖情况,并对对照组和处理组加以检测及比较,以确定此模型是否能够提高肝干细胞的移植效率。
李武,戴虹,何贵清,黄学惠,陈一晖,王超秀[4]（2011）在《环孢霉素A联合脾内肝细胞移植治疗急性肝衰竭的实验研究》文中认为目的探讨应用环孢霉素A（CsA）与同种异体肝细胞脾内移植联合治疗大鼠急性肝衰竭的疗效.方法采用硫代乙酰胺（TAA）诱导大鼠急性肝衰竭模型,24 h后随机分为三组:Ⅰ组:脾内注射浓度约为2×107个/mL肝细胞悬液1 mL,肌肉注射CsA 10 mg/（kg.d）;Ⅱ组:仅脾内注射约2×107个/mL肝细胞悬液1 mL,不用CsA;Ⅲ组:仅脾内注射生理盐水1 mL,作为空白对照.观察各组存活率、肝功能、肝脏病理变化及脾内移植肝细胞的存活情况.结果Ⅰ组、Ⅱ组1周存活率显着高于Ⅲ组（64.7%vs 12.5%,P<0.01;56.3%vs 12.5%,P<0.01）,但Ⅰ组和Ⅱ组之间比较无显着性差异（64.7%vs 56.3%,P>0.05）.肝功能及病理情况在Ⅰ组、Ⅱ组有明显改善,尤以Ⅰ组最为显着.结论 CsA联合同种异体肝细胞移植能有效治疗大鼠急性肝衰竭,改善TAA诱导的肝衰竭大鼠的存活率,促进肝功能恢复及改善肝脏病理状况.
闫益波[5]（2010）在《小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为肝细胞及细胞移植对急性肝损伤作用的研究》文中研究表明肝脏是动物体内最大的腺体,也是最重要的器官之一,肝脏的功能极为复杂,有体内“化学工厂”之称,所以肝脏一旦发病就严重威胁人类的身体健康,也是人类因疾病死亡的主要原因之一。目前人们对于各种原因导致终末期肝病仍然没有有效的治疗措施,原位肝移植（orthotopic liver transplantation, OLT）成为了疾病治疗最后的保障,然而由于肝脏供体来源的短缺和可能发生免疫排斥反应的限制,肝移植的应用比较局限。肝细胞移植技术（hepatoeyte transplantation, HCT）是继原位肝移植技术后又一种治疗各种终末期危重肝病的方法,而且相对于OLT更具有优势,但同样也面临着细胞来源的问题,而目前作为体外支持治疗用的生物人工肝（bioartificial liver, BAL）也因为肝细胞来源问题而进展缓慢,如何进一步解决肝细胞的来源、数量和活力问题成为了开展HCT治疗和BAL技术的核心问题。胚胎干细胞（Embryonic stem cells, ES细胞）具有无限增殖和三胚层多向分化的潜能,是再生医学重要的种子细胞,为各种损伤及退行性疾病的细胞治疗带来了新的希望,建立有效的定向诱导分化技术用于损伤和疾病组织的修复和替代治疗研究是目前ES细胞研究的重要方向。研究表明ES细胞可以在体内外成功地分化为肝细胞,这对于各种终末期肝病的细胞治疗提供了潜在无限的细胞来源,然而ES细胞诱导分化肝细胞的研究还处于初级阶段,目前主要模拟肝脏发育的机制,通过相关细胞因子或化合物、基因修饰和共培养的方式诱导ES细胞分化为肝细胞,技术复杂、分化效率低下、成本高。本研究使用小鼠胚胎干细胞系ES-D3细胞作为研究对象,建立了两步法单层诱导ES细胞分化为肝样细胞的方法,并对诱导分化所得的肝样细胞从形态学、基因表达、蛋白分子标记及细胞功能等方面进行了检测,证明了分化所得细胞为肝细胞,而且分化所得肝细胞脾脏移植到损伤小鼠肝脏后可以归巢并整合到小鼠损伤肝组织内；最后,利用建立的小鼠四氯化碳急性肝损伤模型,通过活体动物实验检测了人胎肝细胞系HL-7702作为生物人工肝细胞来源的潜力。本研究共分为六个部分,第一、二和三部分进行了小鼠胚胎干细胞系ES-D3细胞的培养和诱导分化,并从细胞的形态结构、基因表达、蛋白分子标记及细胞功能方面进行了全面检测,诱导分化所得细胞为肝样细胞；同时对诱导分化过程中,丁酸钠导致的细胞凋亡现象和细胞周期分布进行了研究,表明EGF可以抑制细胞凋亡。第四部分通过灌胃的方法,建立了小鼠急性四氯化碳肝损伤模型；第五部分将体外DAPI标记的分化所得的ES-D3-Hep细胞通过脾脏注射的方法,移植到急性肝损伤小鼠体内,表明移植的ES-D3-Hep细胞可以整合到损伤的肝组织内。第六部分利用建立的小鼠急性四氯化碳肝损伤模型,过腹腔移植人胎肝细胞HL-7702,表明其作为生物人工肝的细胞来源具有潜在的价值。主要的研究结果如下：第一部分在小鼠ES-D3细胞的培养及定向诱导分化为肝细胞的形态学观察试验中,以小鼠胚胎干细胞系nESC-D3为实验材料,应用KNOCKOUT-DMEM和KNOCKOUT-SERUM REPLACEMENT建立了小鼠ES细胞无血清培养的基础上,结合明胶铺被,初步建立了小鼠ES细胞无血清无饲养层的培养体系,通过比较差速贴壁结合传代和单纯传代对去除饲养层细胞MEF的效果,结果表明,差速贴壁结合传代去除饲养层细胞MEF的效果好于单纯传代,为ES细胞后续诱导分化奠定了基础。同时,mESC-D3细胞通过两阶段单层诱导分化培养共19天,逐渐分化为肝样细胞,光镜和透射电镜对分化细胞形态结构和超微结构的观察表明,分化所得细胞具有肝细胞的形态结构特征。第二部分对ES-D3细胞诱导分化所得的ES-D3-Hep细胞的一些标志基因的表达进行了检测,同时对第一阶段诱导分化过程中诱导分化剂丁酸钠产生的细胞凋亡和细胞周期分布进行了检测。结果表明,分化所得的ES-D3-Hep细胞表达肝细胞具有的标志基因AFP、ALB、TTR和AAT,而自发分化组细胞只是微弱表达AFP和ALB,不表达肝细胞晚期标志物TTR和AAT,提示诱导分化所得的ES-D3-Hep细胞已经具备肝细胞具有的基因表达特征,包含不同成熟阶段的肝细胞。诱导分化7天,NaB引起细胞凋亡使大量细胞的细胞周期阻滞在S期,而通过添加EGF,可以明显降低S期细胞周期的比例,增加GO/G1期细胞的比例,抑制细胞凋亡。第三部分对ES-D3细胞分化所得的ES-D3-Hep细胞进行了相关重要标志蛋白的免疫荧光分析,同时对其肝细胞功能进行了鉴定。结果显示,ES-D3-Hep细胞表达肝细胞特异性标志蛋白ALB.AFP.CK8和CK18,而自发分化组也有一些细胞表达ALB和AFP,但不表达CK8和CK18,诱导分化组肝细胞分化率分别为37.27%和41.67%,两组间差异不显着,和自发分化组比较,差异显着。对ES-D3-Hep细胞进行相关肝细胞特异性功能检测,显示诱导分化组细胞具有代谢ICG的细胞功能,而自发分化组只有少量细胞具有代谢ICG的细胞功能；PAS实验显示ES-D3-Hep细胞具有合成糖原的细胞功能,而自发分化组细胞染色较少且淡染；这些结果表明分化所得的ES-D3-Hep细胞具有肝细胞的特异蛋白分子标记,同时又具备了肝细胞特异的细胞功能。第四部分通过灌胃的方法,通过观察小鼠的行为状态、统计死亡率、病理解剖观察肝脏的病理变化、组织学观察肝脏组织病理变化以及检测血清中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）活性的改变,结果表明,5μl/g四氯化碳剂量灌胃的方法,可以建立稳定的小鼠四氯化碳急性肝损伤模型。第五部分利用已经建立的小鼠四氯化碳肝损伤模型,通过脾脏注射的方法,将体外DAPI标记的ES-D3-Hep细胞移植到急性肝损伤小鼠体内,观察是否具有真正的支持肝脏代谢的功能。结果表明,ES-D3-Hep细胞经DAPI标记后,标记率可达到100%,台盼蓝染色检测标记后细胞活率与未标记细胞相比没有明显差别,表明DAPI是一种良好的体外细胞移植示踪标记物；细胞移植后连续10天观察小鼠的存活情况,细胞移植组存活率高于溶剂移植组,但差异不显着；肝脏冰冻切片观察发现,细胞移植可以观察到一些散在的蓝色荧光点,表明移植的ES-D3-Hep细胞可以整合到损伤的肝组织内。第六部分利用建立的小鼠四氯化碳急性肝损伤模型,使用已经建立的正常人胎肝细胞系HL-7702进行腹膜腔移植,观察对急性肝损伤是否具有代谢支撑功能。结果表明,细胞移植组（G1）的血清转氨酶ALT、AST在移植后第3天和第7天相对于空白对照组（G3）显着升高（P<0.05）,而相对于溶剂移植对照组（G2）显着降低（P<0.05）,而移植后14天,三组差异不显着（P>0.05）。小鼠肝脏白蛋白ALB在移植后的第3天和第14天3组差异不显着（P>0.05）,而在移植后的第7天细胞移植组（G1）和空白对照组（G3）差异不显着（P>0.05）,但都与溶剂移植组（G2）差异显着（P<0.05）。三组实验动物的组织学观察表明,移植后第3天差异不显着,都表现为严重的组织细胞坏死,而移植后第7天细胞移植组（G1）的损伤程度明显轻于溶剂移植组（G2）,到移植后第14天时,存活小鼠肝脏组织学差异不明显,都趋于正常结构,表明细胞移植组的损伤恢复要比溶剂移植组相对要快,尽管细胞移植组（G1）小鼠存活率比溶剂对照组（G2）高,但差异不显着（P>0.05）。结果提示,该永生化胎肝细胞具备正常胎肝细胞的功能,进行腹膜腔细胞移植可以起到明显的改善和缓解作用,其用于生物人工肝的细胞来源具有潜在的价值。
刘波[6]（2010）在《肝卵圆细胞移植治疗肝纤维化与肝功能不全的实验研究》文中进行了进一步梳理目的：建立一种稳定而确实可靠的肝卵圆细胞分离方法,为后续的实验研究奠定基础。方法：参照Bryon等的报道,利用携带GFP（绿色荧光蛋白）转基因C57BL/6小鼠12只,2只作为空白对照,10只喂以含浓度为0.1%的3,5-二乙酯基-1,4二氢三甲基毗啶（DDC）,刺激卵圆细胞的增生。而后利用两步酶灌注法分离出肝非实质细胞,以Sca-1抗体标记的免疫磁珠分选方法加以纯化分离出携带有GFP的SCa-1+细胞。结果：DDC喂养小鼠6周后,病理切片结果显示肝组织内可见明显的肝卵圆细胞增生反应。分离每只小鼠得可到约106/ml的非肝实质细胞,培养扩增约5d后可见克隆样生长的卵圆细胞,通过Sca-1抗体标记的免疫磁珠分选提纯。电镜下细胞直径10-15μm,呈铺路石样排列,多角形,折光性强,核大,卵圆形,胞浆少,核仁明显。经过鉴定,分离得到的Sca-1+细胞符合卵园细胞的形态学表现,也表达胆管上皮的表面标记OV-6及肝细胞的表面标记AFP,分离纯度达95%以上。结论：该方法稳定可靠,可为肝卵圆细胞的相关研究提供较为理想的研究手段。目的：研究肝卵圆细胞在治疗小鼠肝纤维化疾病中的有效性。方法：SPF级C57BL/6小鼠利用皮下注射四氯化碳的方法,建立小鼠肝纤维化模型。40只肝纤维化模型小鼠分为两大组,将两大组小鼠根据是否继续皮下注射CCl4分为A、B两组,其中A组为施予处理后（HOCA或NSA）,继续皮下注射CCl4,B组为施予处理后（HOCB或NSB）,不再皮下注射CCl4,每小组10只小鼠。4周后观察肝功能各项指标、羟脯氨酸及胶原纤维及肝脏的病理改变,比较各组间的差别。结果：卵圆细胞经脾脏移植后入肝,在共聚焦激光显微镜下可以观察到肝组织中存在GFP阳性细胞,这些细胞主要分布于门脉区。在A组继续皮下注射CCl4时,NSA组的ALT.AST均明显升高；而HOCA组ALT.AST明显降低,同时升高TP.ALB；HOCA组与NSA组两两比较,差异有统计学意义（P＜0.05）；在B组未继续皮下注射CCl4时,各组ALT.AST均下降,而且下降至近似正常水平,TP和ALB有升高,但两两比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。肝脏病理学检测,在继续皮下注射CCl4情况下,治疗组肝纤维化程度有减轻,NSA组则呈典型肝纤维化改变；在未继续皮下注射CCl4情况下,两组肝纤维化程度都有不同程度减轻,HOCB组缓解更为明显。结论：携带GFP的基因卵圆细胞经短暂体外培养扩增,经脾注射肝纤维化小鼠体内后,可定植于受者肝脏内（主要聚集于汇管区）,并可缓解肝纤维化的进展,促进肝纤维化的逆转。目的：比较肝卵圆细胞与骨髓间充质干细胞治疗小鼠肝纤维化的疗效差别。方法：利用皮下注射四氯化碳的方法,建立小鼠肝纤维化模型。将肝纤维化/肝硬化成模小鼠60只随机分为6组,即HOC移植治疗组A （HOCA）、HOC移植治疗组B （HOCB）, MSC移植治疗组A （MSCA）和MSC移植治疗组B （MSCB）,对照组A（NSA）和对照组B（NSB）,每组10只。根据不同的组别经脾分别输入卵圆细胞、生理盐水（NS）或四氯化碳。4周后观察肝功能各项指标、羟脯氨酸及胶原纤维及肝脏的病理改变,比较各组间的差别。结果：SPF级C57BL/6小鼠85只,其中6只行骨髓间充质干细胞提取,79只行肝纤维化模型制作,成功造模64只（成功率81%）。分别对两组大鼠肝脏羟脯氨酸及胶原纤维含量这两项指标进行检测,统计分析发现两指标在各组间总体比较均有统计学差别（p＜0.05）。在继续皮下注射CCl4情况下,比较各组间差异显示HOCA组与MSCA组及NSA组之间的差异均有统计学意义（P＜0.05）,而MSCA组与NSA组间无统计学意义（p>0.05）；在未继续皮下注射CCl4情况下,进一步比较各组间差异显示三组间均无统计学意义（p>0.05）。病理组织学检测结果,在未继续皮下注射CCl4情况下,各组肝纤维化程度都有不同程度减轻,肝纤维化程度HOC。组<MSCB组<NS。组,其中HOCB组肝纤维化程度减轻最为明显；在继续皮下注射CCl4情况下,肝纤维化程度HOCA组<MSCA组<NSA组,NSA组呈典型肝硬化改变。结论：肝卵圆细胞和骨髓间充质干细胞经脾注射移植后,均能不同程度改善肝纤维化小鼠的肝功能,减轻其肝硬化的程度,但肝卵圆细胞的治疗效果更为明显。肝卵圆细胞移植可作为肝硬化疾病的一种新型的治疗方法进一步研究。
孙艳[7]（2007）在《骨髓干细胞移植治疗急慢性肝损伤的实验研究》文中研究说明本实验首先采用密度梯度离心法联合贴壁培养分离、纯化及扩增培养鼠骨髓MSCs,流式细胞仪检测P3代MSCs表面标志,透射电镜观察MSCs超微结构。其次将扩增培养的P3代MSCs体外诱导向肝系细胞分化,诱导后7d、14d及21d采用RT-PCR、免疫细胞化学检测AFP、ALB、CK18及肝细胞抗原等肝系细胞的标志,电镜观察细胞超微结构的变化。并将诱导后向肝系细胞分化的细胞用荧光染料DAPI标记后,经脾移植于CCl4制造的小鼠急性肝损伤模型体内。且通过门静脉、尾静脉及脾脏途径移植于CCl4制造的大鼠慢性肝损伤模型体内。移植后通过血清学、病理学检测移植效果,探讨治疗急、慢性肝损伤的可行性,以及何种途径更有效率。结果显示MSCs强表达CD44、CD29,基本不表达CD34、CD45。MSCs超微结构良好,具有处于原始状态下细胞超微结构的特点。骨髓MSCs可在体外分化为具有肝系细胞表型和功能的细胞。门静脉、尾静脉及脾脏三种途径移植向肝系细胞诱导分化的骨髓MSCs,均可迁徙定位于肝脏,对急、慢性肝损伤具有修复作用,脾内移植途径优于门静脉及尾静脉。
江海洪[8]（2006）在《小鼠胚胎干细胞向肝前体细胞诱导分化及其对实验性急性肝衰竭的移植治疗研究》文中进行了进一步梳理背景在各种干细胞（stem cells, SC）的应用研究中,胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES细胞）由于具有发育全能性、种系传递能力（形成嵌合体）以及便于进行遗传学的基因改造而最引人注目,发展最快,且ES细胞作为研究的基本工具和潜在的细胞治疗来源继续强烈吸引着人们的注意力。在国外,1981年英国的Evans等和美国的Martine分别成功地分离和体外培养了小鼠ES细胞,建立了小鼠ES细胞系,而且证实了该ES细胞系具有发育全能性,能在体外诱导分化为各种类型的组织细胞。特别是继1998年James Thomson博士建立人ES细胞系之后,世界上其他许多科学家也相继成功地从囊胚内细胞团分离并建立了ES细胞系。目前,在NIH注册的ES细胞有83个系,分别来自不同的国家。据报道,ES细胞目前已有在体外培养两年,连续传代达450次以上,而胚胎生殖干细胞传代次数最多可达7080次。更令人兴奋的是,科学家们已经开始对ES细胞进行基因改造,实现了转基因表达和基因的同源重组,这意味着将可以有针对性地改变ES细胞的遗传表型,如采用基因敲除技术等。所有这些重要突破都使ES细胞用于各种终末期疾病的治疗更接近于现实的需要。我国早在80年代就开始了ES细胞的研究,近几年来,ES细胞的研究更是发展迅猛,国内不少研究机构以及政府职能部门对ES细胞的研究也表现出高度的重视和极大兴趣,为ES细胞研究专门组织了“973项目”和“863项目”。目前在全国范围内已形成了一支干细胞研究的庞大队伍。李凌松教授在北京成立了干细胞研究中心,筹建组织干细胞库,进行了组织干细胞的诱导分化以及干细胞对疾病治疗的动物实验和临床试用,如神经干细胞对帕金森氏病和角膜干细胞对角膜损伤的治疗等。卢光绣教授在湖南湘雅医学院自1999年以来一直致力于治疗性克隆的研究。广州中山大学黄绍良教授等利用人受精卵发育形成的囊胚内细胞团建立了3株人类ES细胞系。上海中科院亦于1999年投资建立了盛慧珍教授主持的上海市发育生物学重点实验室,集中进行治疗性克隆的研究,在2003年就曾报道采用细胞共培养技术已将小鼠ES细胞诱导为类肝细胞,该肝细胞能表达成熟肝细胞标志物如酪氨酸氨基转移酶、葡萄糖-6-磷酸酶
蔡金华[9]（2006）在《大鼠间充质干细胞磁标记及肝脏移植后的MR活体示踪》文中研究说明第一部分大鼠间充质干细胞的分离、培养及生物学特性目的建立大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）分离及体外扩增的方法，并了解其生物学特性，为应用MSCs进行进一步研究奠定基础。方法取Wistar大鼠双侧股骨及胫骨，冲洗骨髓腔获得骨髓全系细胞，离心后重悬于含10％胎牛血清的5ml DMEM/F12培养基，置37℃、5％CO2饱合湿度培养箱中，利用贴壁法培养、纯化MSCs。接种后第3d全量换液，以后每2d换液1次，至贴壁细胞逐渐铺满瓶底时，传代扩增。倒置显微镜下观察细胞形态。分别取生长良好的P1、P3、P5代细胞绘制生长曲线，并进行贴壁率的检测。方差分析检验三代细胞生长性状及贴壁特性差异。结果（1）原代细胞生长较慢，以克隆集落方式增殖，培养早期细胞表现为短梭形、三角形或星形等多种形态。之后，细胞集落逐渐融合，细胞形态也渐趋均一，呈长梭形或纤维状。至第12～14d，细胞已基本融合，形态均一，呈成纤维细胞样生长。传代后细胞生长明显增快，形态及分布也更为均匀一致。（2）细胞生长曲线显示，第3d起细胞开始进入对数生长期，细胞倍增时间平均为28.1h，传代周期4～6d。P1、P3、P5代各时相细胞数之间差异无统计学意义（P＞0.05）。（3）传代后细胞贴壁较快，4h约有60％的细胞贴壁，10h贴壁细胞已达90％以上。三代之间贴壁率差异无统计学意义（p＞0.05）。结论（1）采用贴壁法可达到分离、纯化MSCs的目的。（2）含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液适用于MSCs的体外培养、扩增。（3）大鼠骨髓MSCs体外培养表现为成纤维细胞样形态，贴壁及增殖性能良好，且多次传代后生长性状稳定，可作为进一步研究的理想细胞来源。第二部分应用超顺磁性氧化铁纳米微粒标记大鼠间充质干细胞目的探讨超顺磁性氧化铁纳米微粒标记大鼠骨髓间充质干细胞的可行性，优化标记方法，提高标记效率。方法菲立磁与多聚左旋赖氨酸（PLL）混悬（铁和PLL的终浓度分别为250ug/ml和7.5ug/ml）制备菲立磁—PLL复合物。将不同浓度的菲立磁—PLL复合物混合于培养基（铁的终浓度分别为150ug/ml、100ug/ml、50ug/ml、25ug/ml、10ug/ml和5ug/ml），加入MSCs，孵育过夜。分别于细胞标记后24h、1w、2w、3w、4w行普鲁士蓝染色观察细胞内铁颗粒，原子吸收分光光度法测定细胞铁含量，台盼蓝排除试验检测细胞活性，并与未标记细胞或单纯菲立磁标记的细胞对照。所有数据以（?）±S表示，行方差分析，p＜0.05为有显着差异。结果菲立磁—PLL标记的细胞内可见较多蓝染颗粒，细胞标记率100％，单纯菲立磁标记的细胞内仅见少许细小蓝染颗粒。菲立磁—PLL标记组细胞铁含量显着高于单纯菲立磁标记组（p＜0.05），25ug/ml铁浓度标记的细胞铁含量明显高于10ug/ml及其以下浓度组（P＜0.05），但与50ug/ml及其以上浓度组差异无统计学意义（p＞0.05）。随细胞的分裂增殖，细胞内铁含量逐渐减少。台盼蓝排除试验显示100ug/ml及其以下浓度组磁标记干细胞的生长、增殖活力与未标记细胞之间差异无统计学意义（p＞0.05）。结论（1）应用菲立磁—PLL复合物标记大鼠间充质干细胞是可行的。（2）以25ug/ml铁浓度标记干细胞不仅标记效率高，而且对细胞生长及增殖活力无明显影响。（3）细胞铁含量与细胞的分裂增殖状态有关，细胞内铁可随传代进入子代细胞。第三部分磁标记大鼠间充质干细胞的体外MR成像目的探讨1.5 T临床应用型MR成像系统显示磁标记干细胞的可行性，了解磁标记干细胞的MR成像规律，并寻找MR成像的最佳序列和参数，为进一步磁标记干细胞体内移植的MR活体示踪奠定基础。方法（1）将1×103、1×104、1×106个磁标记干细胞悬于0.5ml明胶（10％）制备不同浓度细胞悬液，行MR成像。（2）1×106个细胞分别于标记后24h、1w、2w、3w、4w行MR成像，观察磁标记干细胞的动态信号变化。（3）MR成像方法及信号分析：1.5 T MR，SE T1WI（TR/TE=500ms/15ms）、SE T2WI（TR/TE=4000ms/100ms）、GRE T2*WI（300ms/20ms，flip angle=15°）序列，头线圈，层厚3mm，矩阵256×160，视野6～8cm×6～8cm。信号改变以下列公式计算：△SI=（（SIL-SIU）/SIU）×100％（△SI为信号变化率，SIL为标记细胞信号，SIU为未标记细胞信号）。（4）原子吸收分光光度法分别测定上述1×106个细胞各时相的铁含量。结果（1）1×103、1×104、1×105个磁标记干细胞在T1WI上信号改变率分别为（-4.93±1.99）％、（-9.90±1.95）％、（-15.87±3.05）％；T2WI信号改变率分别为（-67.93±2.94）％、（-78.77±1.37）％、（-88.73±1.12）％；T2*WI分别为（-72.50±5.96）％、（-82.90±2.72）％、（-92.60±1.01）％；T2WI和T2*WI显着高于T1WI（P＜0.05），其中以T2*WI更为明显。（2）1×105个磁标记细胞于24h、1w、2w、3w、4w的T2*WI信号降低率依次为（93.37±1.12）％、（65.52±0.92）％、（30.63±1.27）％、（13.63±0.96）％、（5.60±0.10）％，细胞铁含量依次为1.87±0.35ug、0.81±0.09ug、0.40+0.02ug、0.19±0.02ug、0.08+0.01ug，二者有显着相关（r=0.94，P＜0.05）。结论（1）在1.5T MR上，磁标记干细胞可引起明显的T2信号降低；（2）GRE T2*WI对显示磁标记干细胞最为敏感；（3）磁标记干细胞T2*信号降低程度与细胞数量有关。（4）T2*信号降低程度随细胞分裂增殖而逐渐降低。第四部分磁标记大鼠间充质干细胞肝脏移植的MR活体示踪目的探讨1.5 T MR活体示踪磁标记干细胞经门静脉肝脏移植的可行性。方法Wistar大鼠30只，以2％CCl4灌喂法建立急性肝损伤模型，实验组和对照组分别为20只和10只。大鼠间充质干细胞行菲立磁和DAPI双重标记。将1×106个双标记干细胞经门静脉注射移植，对照组以同样方法注射等量未标记细胞。分别于细胞移植前及移植后1h、3d、7d和14d取4只实验组及2只对照组大鼠行MR扫描，并测量靶器官的信噪比。MR扫描：GRE T2*WI：TR/TE=300ms/20ms，flip angle=15°，表面线圈，层厚3mm，矩阵256×160，2～4次采集，视野6～8cm×6～8cm。动物于MR扫描后立即引颈处死，取肝脏、肾脏、肺和肌肉等组织，冰冻切片，每一标本相邻切面分别行荧光显微镜观察和普鲁士蓝染色。所有数据以（?）±S表示，行方差分析及t检验，p＜0.05为有显着差异。结果磁标记干细胞移植后1小时，肝脏信噪比为1.10±0.26，3d、7d及14d后信噪比分别为8.18±1.55，11.08±1.30，14.15±1.02，信号降低程度呈逐渐减弱趋势，移植后7d以内肝脏信噪比与移植前比较均有显着降低（p＜0.05）。实验组肾脏、肌肉以及对照组肝脏、肾脏、肌肉信噪比在移植前后差异无统计学意义（p＞0.05）。实验组磁标记干细胞移植后1h荧光显像及铁染色均较明显，以后逐渐减弱。各时相肝组织铁染色分布区域与荧光显微镜下荧光颗粒分布区域高度一致，并与MR信号降低程度一致。结论（1）磁标记干细胞经门脉肝脏移植后可引起明显的MR信号改变，1.5 T MR示踪时间可持续7d。（2）MR信号改变随移植时间而逐渐减弱。（3）MR信号改变程度与铁含量及荧光显像一致。
陈继达[10]（2005）在《大鼠胚肝细胞肝内移植和慢病毒载体Lenti-lacZ的表达》文中指出很多研究已经证实了胚胎肝脏中大量存在的胚肝上皮祖细胞（Fetalliver epithelial progenitor cells, FLEC）具有肝干细胞特性,由于其数量较多而且较易分离,已经成为当前研究最多的一种肝干细胞。国内外很多学者对肝干细胞的生物学特性、增殖机制以及诱导方法等方面进行了研究,并取得令人鼓舞的成果。研究表明,胎龄14天大鼠胚肝细胞经门静脉移植到倒千里光碱/肝叶切除处理的大鼠肝脏,移植的胚肝细胞在肝内持续增殖,形成的集落数量和体积随着时间不断增加,最后可达到全部肝细胞的60-80%。胚肝细胞在肝内可分化为肝细胞和胆管上皮细胞,形成正常的肝小叶结构。相对于成熟肝细胞,胚肝细胞具有更大的增殖能力和双向分化能力,细胞体积更小,不易引起受体的排斥反应等优点,因此肝干细胞有可能作为肝病尤其是代谢性疾病基因治疗理想的受体细胞,将治疗基因带入体内,随着胚肝细胞的增殖而放大并长期稳定表达,从而在肝病ex vivo途径基因治疗中发挥重要作用,具有很大的研究前景。 为了研究大鼠胚肝细胞作为肝病基因治疗受体细胞的可行性,明确目的基因在体外培养的胚肝细胞中能否表达,携带目的基因的胚肝细胞移植到肝内能否大量增殖,目的基因能否持续大量表达,以及方法的建立,我们设计了本实验:第一部分,原代培养胎龄14天SD大鼠胚肝细胞,构建慢病毒载体Lenti-lacZ并体外转导大鼠胚胎肝细胞,检测LacZ基因的表达:
二、纯化大鼠胚肝细胞脾内移植增殖的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、纯化大鼠胚肝细胞脾内移植增殖的实验研究（论文提纲范文）
（1）骨髓间充质干细胞对大鼠肝纤维化的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 实验材料及方法 |
| 1.大鼠骨髓间充质干细胞的分离纯化、扩增及鉴定 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2.大鼠肝纤维化模型的建立 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3.骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠肝纤维化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 4.技术路线 |
| 4.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离纯化、扩增及鉴定 |
| 4.2 骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠肝纤维化 |
| 第三章 统计学分析 |
| 第四章 结果 |
| 1.骨髓间充质干细胞的形态学、鉴定及荧光标记 |
| 1.1 骨髓间充质干细胞的形态学 |
| 1.2 流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面抗原 |
| 1.3 骨髓间充质干细胞的荧光标记 |
| 2.大鼠肝纤维化模型的建立 |
| 3.骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠肝纤维化 |
| 3.1 大鼠的一般情况 |
| 3.2 骨髓间充质干细胞移植后肝脏定植情况 |
| 3.3 大鼠肝功能检测结果 |
| 3.4 大鼠肝脏大体表现 |
| 3.5 大鼠肝脏HE、Masson染色 |
| 3.6 q RT-PCR检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白 |
| 第五章 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 第七章 参考文献 |
| 第八章 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 肝硬化ISHAK’S评分系统 |
| 作者简介 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
（2）超声靶向微泡破坏介导BMSCs修复大鼠急性肝损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 绪论 |
| 第一章 大鼠BMSCs的分离、培养、鉴定 |
| 前言 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 大鼠急性肝损伤模型的建立与评估 |
| 前言 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 UTMD促进BMSCs靶向归巢急性肝损伤大鼠肝脏 |
| 前言 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 UTMD增强BMSCs对急性肝损伤的修复作用 |
| 前言 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间已发表的论文 |
（3）鼠胎肝干细胞的体外分离培养及体内移植的实验性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 一种改进的大鼠胎肝干细胞分离纯化方法 |
| 前言 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 大鼠肝损伤后成熟肝细胞和卵圆细胞在肝再生中的作用 |
| 前言 |
| 一、材料和方法 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 GFP转基因小鼠胎肝干细胞体外分离培养及脾内移植的初步研究 |
| 前言 |
| 一、材料和方法 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词 |
| 成果 |
| 致谢 |
（5）小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为肝细胞及细胞移植对急性肝损伤作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语中英文对照 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 胚胎干细胞分化为肝细胞的研究进展 |
| 1 胚胎干细胞研究现状 |
| 1.1 胚胎干细胞的概念和研究概况 |
| 1.2 ES细胞的生物学特性和研究价值 |
| 1.3 ES细胞的最新进展:iPS细胞 |
| 1.4 ES细胞研究的重点领域 |
| 1.5 ES细胞研究面临的主要问题 |
| 2 哺乳动物体内肝脏发育过程 |
| 3 ES细胞诱导分化为肝细胞的策略和方法 |
| 3.1 体外拟胚体途径诱导分化 |
| 3.2 体外细胞单层诱导分化 |
| 3.3 体内诱导分化 |
| 4 诱导性多能干细胞在肝病细胞治疗中的应用潜力 |
| 4.1 iPS细胞的分化研究 |
| 4.2 iPS细胞分化为肝细胞的研究现状 |
| 5 胚胎干细胞诱导分化来源的肝细胞的筛选 |
| 6 ES细胞或iPS细胞诱导分化为肝细胞存在的问题与前景 |
| 参考文献 |
| 第二章 肝细胞移植的研究现状 |
| 1 哺乳动物肝脏的重要生理功能 |
| 2 细胞治疗与肝细胞移植 |
| 2.1 肝移植 |
| 2.2 细胞治疗 |
| 2.3 肝细胞移植 |
| 2.4 生物人工肝系统 |
| 3 移植用肝细胞的来源 |
| 3.1 原代肝细胞 |
| 3.2 永生化肝细胞系 |
| 3.3 成体干细胞 |
| 3.4 胚胎干细胞或诱导性多能干细胞 |
| 4 肝细胞移植的部位 |
| 4.1 门静脉内移植 |
| 4.2 脾脏移植 |
| 4.3 腹腔内移植 |
| 4.4 外周血静脉移植 |
| 4.5 其它部位移植 |
| 5 肝细胞移植面临的主要问题 |
| 5.1 供体肝细胞的来源、活性和保存 |
| 5.2 免疫排斥 |
| 5.3 移植肝细胞的追踪和长期功能评价 |
| 6 肝细胞移植的前景 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第三章 小鼠ES-D3细胞的培养及定向诱导分化为肝细胞的形态学观察 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 MEF的分离培养及饲养层的制备 |
| 2.2 mESC-D3细胞在饲养层细胞上的生长和扩增 |
| 2.3 mESC-D3细胞在明胶上的生长 |
| 2.4 mESC-D3细胞单层分化为肝样细胞过程中的形态学观察 |
| 2.5 ES-D3-Hep细胞的超微特征 |
| 3 讨论 |
| 3.1 无血清无饲养层培养体系的建立 |
| 3.2 胚胎干细胞诱导分化为肝细胞的策略 |
| 参考文献 |
| 第四章 ES-D3-Hep细胞的基因表达检测及EGF对分化中细胞凋亡的影响 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 总RNA的提取 |
| 2.2 肝脏发育相关标志基因的RT-PCR的结果 |
| 2.3 细胞凋亡率的比较 |
| 2.4 细胞周期的分布比较 |
| 3 讨论 |
| 3.1 分化所得ES-D3-Hep细胞的基因表达的检测 |
| 3.2 诱导分化中的细胞凋亡和周期分布 |
| 参考文献 |
| 第五章 ES-D3-Hep细胞的蛋白分子标记检测及功能分析 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 细胞免疫荧光检测 |
| 2.2 ICG的摄取和排泌 |
| 2.3 PAS实验 |
| 2.4 分化率 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 小鼠四氯化碳肝损伤模型的建立 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 小鼠精神状态观察及存活情况统计 |
| 2.2 肝脏病理形态学观察 |
| 2.3 血液生化指标检测 |
| 2.4 小鼠肝脏组织学观察 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 ES-D3-Hep细胞移植对小鼠四氯化碳急性肝损伤作用的研究 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 DAPI标记效果及标记后细胞活率 |
| 2.2 冰冻切片的观察 |
| 2.3 存活率 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第八章 人胎肝细胞移植对四氯化碳肝损伤小鼠效果的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和细胞 |
| 1.2 仪器设备 |
| 1.3 药品试剂 |
| 1.4 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 人肝细胞系HL-7702的培养 |
| 2.2 血液生化指标检测及肝脏白蛋白分析 |
| 2.3 存活率分析 |
| 2.4 组织病理学分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（6）肝卵圆细胞移植治疗肝纤维化与肝功能不全的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 肝卵圆细胞的分离与体外扩增 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要的试剂及药品 |
| 1.2 主要试剂的配制 |
| 1.3 主要的仪器及设备 |
| 1.4 动物的选择及喂养 |
| 1.5 肝脏标本的采集 |
| 1.6 卵圆细胞的分离培养 |
| 1.7 卵圆细胞的纯化 |
| 1.8 卵圆细胞的鉴定 |
| 1.8.1 组织切片 |
| 1.8.1.1 常规石蜡切片的制作 |
| 1.8.1.2 苏木精—伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色 |
| 1.8.1.3 免疫组化染色 |
| 1.8.2 纯化卵圆细胞的进一步鉴定 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 卵圆细胞经脾脏移植治疗小鼠肝纤维化的实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要的试剂及药品 |
| 1.2 主要试剂的配制 |
| 1.3 主要的仪器及设备 |
| 1.4 动物的选择及喂养 |
| 1.5 肝纤维化模型的建立 |
| 1.6 麻醉及移植方法的建立 |
| 1.7 卵圆细胞治疗实验性肝纤维化的研究 |
| 1.7.1 动物的分组及处理 |
| 1.7.2 标本的采集 |
| 1.7.3 疗效的评价 |
| 1.7.3.1 分别进行以下指标的检测 |
| 1.7.3.2 肝功能指标 |
| 1.7.3.3 肝脏羟脯氨酸(Hyp)含量测定 |
| 1.7.3.4 肝脏胶原纤维含量 |
| 1.7.3.5 肝纤维化病理学分级 |
| 1.7.3.6 移植后卵圆细胞在肝脏内的定居 |
| 1.7.4 数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 小鼠的一般情况变化 |
| 2.2 肝纤维化的建模情况 |
| 2.3 卵圆细胞的分布情况 |
| 2.4 小鼠肝功能指标的变化 |
| 2.5 肝脏羟脯氨酸和胶原纤维含量的变化 |
| 2.6 病理组织学的分级变化情况 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 卵圆细胞与骨髓间质干细胞经脾移植治疗实验性小鼠肝纤维化的疗效比较 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要的试剂及药品 |
| 1.2 主要试剂的配制 |
| 1.3 主要的仪器及设备 |
| 1.4 动物的选择及喂养 |
| 1.5 肝纤维化模型的建立 |
| 1.6 骨髓间充质干细胞的分离与培养 |
| 1.6.1 骨髓细胞的采集 |
| 1.6.2 密度梯度离心法分离MSC及培养 |
| 1.7 MSC的鉴定 |
| 1.7.1 小鼠MSC表面标记的测定 |
| 1.7.2 体外诱导成骨细胞鉴定 |
| 1.8 麻醉及移植方法的建立 |
| 1.9 HOC与MSC移植治疗实验性肝纤维化的疗效比较 |
| 1.9.1 动物的分组及处理 |
| 1.9.2 标本的采集及疗效的评价 |
| 1.9.2.1 标本的采集 |
| 1.9.2.2 疗效的评价 |
| 1.9.2.2.1 分别进行以下指标的检测 |
| 1.9.2.2.2 肝功能指标 |
| 1.9.2.2.3 肝脏羟脯氨酸(Hyp)含量测定 |
| 1.9.2.2.4 肝脏胶原纤维含量 |
| 1.9.2.2.5 肝纤维化病理学分级 |
| 1.9.3 数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 MSC的鉴定结果 |
| 2.1.1 MSCs的形态学观察 |
| 2.1.2 MSCs的鉴定 |
| 2.2 小鼠的一般情况变化 |
| 2.3 小鼠肝功能指标的变化 |
| 2.4 肝脏羟脯氨酸和胶原纤维含量的变化 |
| 2.5 病理组织学的分级变化情况 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 干细胞研究进展 |
| 综述二 肝卵圆干细胞研究进展 |
| 攻读学位期间公开发表的学术论文及科研课题 |
| 致谢 |
（7）骨髓干细胞移植治疗急慢性肝损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一：骨髓干细胞的可塑性及应用前景 |
| 1、骨髓干细胞的分类及特征 |
| 2、骨髓干细胞的可塑性 |
| 3、骨髓干细胞可塑性的生物学机制 |
| 4、骨髓干细胞的应用前景 |
| 5、结语 |
| 综述二：骨髓源性肝干细胞在肝病治疗中的研究进展 |
| 1.B DHSCs 概念的提出 |
| 2.B DHSCs 向肝系细胞分化的体外实验研究 |
| 3.B DHSCs 向肝系细胞分化的体内实验研究 |
| 4.B DHSCs 在肝病治疗中的应用前景 |
| 5、问题与展望 |
| 第二部分 实验部分 |
| 实验一：鼠骨髓MSCs 的分离、培养及鉴定 |
| 1、材料与方法 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 4、小结 |
| 实验二：体外诱导鼠骨髓MSCs 向肝系细胞分化及标记的实验研究 |
| 1、材料与方法 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 4、小结 |
| 实验三：诱导分化的骨髓MSCs 移植治疗急性肝损伤的实验研究 |
| 1、材料与方法 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 4、小结 |
| 实验四：诱导分化的骨髓MSCs 移植治疗慢性肝损伤的实验研究 |
| 1、材料与方法 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 4、小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间的科研成果 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
（8）小鼠胚胎干细胞向肝前体细胞诱导分化及其对实验性急性肝衰竭的移植治疗研究（论文提纲范文）
| 主要英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 小鼠胚胎干细胞向肝前体细胞诱导分化及其对实验性急性肝衰竭的移植治疗研究 |
| 前言 |
| 第一部分 小鼠胚胎干细胞的体外培养、GFP 基因转染及其鉴定的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 小鼠胚胎干细胞向肝前体细胞诱导分化条件的建立及优化 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 小鼠胚胎干细胞诱导分化为肝前体细胞的超微结构、功能的检测及其诱导机制的探讨 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 小鼠胚胎干细胞诱导分化的肝前体细胞移植并整合到肝、脾组织的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第五部分 小鼠胚胎干细胞诱导分化的肝前体细胞移植治疗实验性急性肝衰竭的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 本课题创新之处 |
| 致谢 |
| 文献综述一 肝干细胞与肝细胞移植的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 肝细胞移植的研究现状 |
| 参考文献 |
| 博士研究生期间发表文章目录 |
（9）大鼠间充质干细胞磁标记及肝脏移植后的MR活体示踪（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 论文正文 |
| 第一部分 大鼠间充质干细胞的分离、培养及生物学特性 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第二部分 应用超顺磁性氧化铁纳米微粒标记大鼠间充质干细胞 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第三部分 磁标记大鼠间充质干细胞的体外MR成像 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第四部份 磁标记大鼠间充质干细胞肝脏移植的MR活体示踪 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述一 干细胞磁标记及MR活体示踪 |
| 综述二 肝干细胞移植的研究进展 |
| 致谢 |
| 附录 攻读博士学位期间发表的论文 |
（10）大鼠胚肝细胞肝内移植和慢病毒载体Lenti-lacZ的表达（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 论文正文 |
| 前言 |
| 第一部分 慢病毒载体Lenti-lacZ在体外培养大鼠胚肝细胞中的表达 |
| 第二部分 大鼠胚肝细胞肝内移植和慢病毒载体Lenti-lacZ的表达 |
| 综述 |
| 一 肝干细胞的研究进展 |
| 二 胰腺癌的诊治进展 |
| 缩写词 |
| 致谢 |
四、纯化大鼠胚肝细胞脾内移植增殖的实验研究（论文参考文献）
- [1]骨髓间充质干细胞对大鼠肝纤维化的影响[D]. 郑雪. 石河子大学, 2019(01)
- [2]超声靶向微泡破坏介导BMSCs修复大鼠急性肝损伤的实验研究[D]. 孙婷. 上海交通大学, 2019(06)
- [3]鼠胎肝干细胞的体外分离培养及体内移植的实验性研究[D]. 王亚萍. 南方医科大学, 2013(03)
- [4]环孢霉素A联合脾内肝细胞移植治疗急性肝衰竭的实验研究[J]. 李武,戴虹,何贵清,黄学惠,陈一晖,王超秀. 昆明医学院学报, 2011(07)
- [5]小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为肝细胞及细胞移植对急性肝损伤作用的研究[D]. 闫益波. 南京农业大学, 2010(06)
- [6]肝卵圆细胞移植治疗肝纤维化与肝功能不全的实验研究[D]. 刘波. 中南大学, 2010(11)
- [7]骨髓干细胞移植治疗急慢性肝损伤的实验研究[D]. 孙艳. 吉林大学, 2007(03)
- [8]小鼠胚胎干细胞向肝前体细胞诱导分化及其对实验性急性肝衰竭的移植治疗研究[D]. 江海洪. 第三军医大学, 2006(11)
- [9]大鼠间充质干细胞磁标记及肝脏移植后的MR活体示踪[D]. 蔡金华. 华中科技大学, 2006(03)
- [10]大鼠胚肝细胞肝内移植和慢病毒载体Lenti-lacZ的表达[D]. 陈继达. 浙江大学, 2005(05)