一、拓扑替康与顺铂对bcl-2及fas在卵巢癌细胞系3AO及其耐药系3AO/cDDP表达的影响（论文文献综述）
李艳青[1]（2021）在《PGC1α通过HSP70/HK2/VDAC1途径参与卵巢癌顺铂耐药机制的研究》文中提出背景:顺铂耐药仍然是卵巢癌治疗的瓶颈。随着凋亡研究的逐步深入,人们认识到化疗药物除了通过同各自的靶点直接作用外,也可以通过诱导细胞凋亡而杀伤肿瘤细胞。因此肿瘤细胞凋亡受到抑制时,可导致顺铂耐药性的产生。此外,线粒体不仅是肿瘤细胞调控凋亡的关键,也是肿瘤细胞发生化疗耐药的核心环节。20世纪20年代,Otto Warburg认为肿瘤细胞“抛弃”线粒体更倾向于利用有氧糖酵解满足其能量需求。但是越来越多的研究表明肿瘤细胞为了应对化疗药物等的应激,可以通过线粒体生物合成等线粒体适应性机制抵抗线粒体途径凋亡,促进细胞的存活。因此,线粒体生物合成相关分子在调控线粒体途径凋亡中的作用机制急需被探索。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）辅激活因子-1α（PPARG coactivator 1 alpha,PGC1α）作为线粒体生物合成的主要调控者,与肿瘤细胞线粒体能量代谢、细胞凋亡密切相关。Sancho P等人发现PGC1α可以通过增加抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2（BCL2 apoptosis regulator,BCL2）等表达,减少促凋亡蛋白 BCL2 相关 X 蛋白（BCL2 associated X,apoptosis regulator,BAX）等表达来抵抗胰腺癌细胞凋亡。课题组早期结果也发现,与卵巢癌SKOV3细胞相比,卵巢癌顺铂耐药的SKOV3/CDDP细胞线粒体生物合成水平较高。此外,PGC1α在SKOV3/CDDP细胞中表达上调,特异性敲减PGC1α发现SKOV3/CDDP细胞的抗凋亡蛋白BCL2表达下降,促凋亡蛋白BAX表达增加,线粒体途径凋亡增加。然而,线粒体途径凋亡机制复杂,简单的表达差异并不能清楚地解释PGC1α调控SKOV3/CDDP细胞凋亡的具体机制,仍需要我们进一步探究。线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeablity transition pore,MPTP）的开放是线粒体途径凋亡级联效应的开始,随后凋亡诱导因子、细胞色素C等因子释放到细胞质,进而激活半胱氨酸天冬蛋白酶等凋亡下游因子促进细胞凋亡。因此,MPTP开放是线粒体途径凋亡的关键步骤之一。此外,己糖激酶2（hexokinase 2,HK2）作为MPTP重要的组成成员之一,在线粒体中可以通过与电压依赖性阴离子通道蛋白1（voltage-dependent anion channel,VDAC1）结合,维持 MPTP 的关闭,抑制细胞凋亡。Angelova等人研究发现线粒体分裂蛋白（mitochondrial fission factor,Mff）可以减少HK2与VDAC1的结合并促进MPTP的开放,导致细胞凋亡。此外,线粒体糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase 3 beta,GSK3B）也可以通过减少 HK2 与 VDAC1 的结合以开放MPTP,导致黑色素瘤细胞的凋亡。由于HK2与VDAC1的结合受线粒体相关蛋白的调节,而PGC1α作为线粒体生物合成的主要调控分子,与这些线粒体相关蛋白密切相关。因此,探讨HK2/VDAC1信号通路可能为PGC1α调控耐药细胞线粒体途径凋亡的机制提供新的思路。热休克蛋白/伴侣蛋白家族（heat shock protein,HSPs）具有将蛋白质运输到线粒体的功能。其中,HSP70是HSPs家族最主要的成员之一,它可以协助J蛋白等蛋白转运至线粒体。此外,Henry Aceros等人发现HSP70保护剂可以减少心肌缺血再灌注时MPTP的开放进而减少心肌细胞的凋亡。Liang-Jun Yan等人在调控HSP70的转录的HSF1基因敲除小鼠中发现肾脏细胞MPTP的开放,诱导了线粒体膜电位下降。已知HK2-VDAC1是MPTP开放的核心机制。因此,HSP70可能通过HK2/VDAC1信号通路调控MPTP的开放。进一步有研究发现PGC1α可以通过促进HSP70等蛋白的表达,减少小鼠肝脏、肾脏和成纤维细胞中的热应激损伤。然而,在顺铂化疗药物的应激下,HSP70和PGC1α的复杂作用机制并不清楚。提示通过研究HSP70和HK2在线粒体途径凋亡中的机制可能为PGC1α调控卵巢癌顺铂耐药细胞凋亡提供新的策略。综上我们提出假设:在顺铂的应激下,PGC1α通过调节HSP70的表达,其可以促进HK2与VDAC1的结合,减少MPTP的开放,增强了卵巢癌顺铂化疗耐药。通过抑制PGC1α,可以减少HSP70的表达,进而减少HK2与VDAC1的结合,增加了 MPTP的开放,逆转了卵巢癌顺铂化疗耐药。目的:本实验从抑制PGC1α调控线粒体途径凋亡增加顺铂敏感性的角度入手,探讨影响线粒体途径凋亡MPTP开放的因素,以阐明线粒体生物合成与凋亡的调控机制,为靶向PGC1α治疗卵巢癌顺铂耐药提供依据。方法:（1）以人卵巢癌获得性顺铂耐药细胞SKOV3/CDDP与其亲本细胞SKOV3、卵巢癌获得性顺铂耐药细胞A2780/CDDP细胞与其亲本细胞A2780细胞为研究对象,Western Blot检测PGC1α的蛋白表达。（2）构建PGC1α-shRNA特异性敲减质粒,在卵巢癌顺铂耐药细胞SKOV3/CDDP和A2780/CDDP中特异性敲减PGC1α,MTT检测在不同浓度顺铂作用下细胞的活力;Western Blot检测抗凋亡蛋白BCL2、促凋亡蛋白BAX、凋亡下游效应分子c-caspase3的蛋白表达;线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1染色）联合流式细胞术检测SKOV3/CDDP细胞线粒体膜电位。（3）在 SKOV3/CDDP 和 A2780/CDDP 细胞中特异性敲减 PGC1α,Western Blot检测MPTP相关分子蛋白水平的改变;RT-qPCR检测细胞中MPTP相关分子mRNA水平的改变。（4）在SKOV3/CDDP和A2780/CDDP细胞中特异性敲减PGC1α,并给予顺铂刺激,线粒体提取实验检测细胞中HK2在线粒体的蛋白表达水平;Mitotracker着色线粒体,免疫荧光检测HK2与线粒体的共定位。（5）在SKOV3/CDDP和A2780/CDDP细胞中特异性敲减PGC1α,并给予顺铂刺激,免疫共沉淀检测HK2与VDAC1的结合;免疫荧光检测HK2与VDAC1的共定位。（6）在SKOV3/CDDP和A2780/CDDP细胞中特异性敲减PGC1α,转录组测序检测具有蛋白转运功能家族分子的mRNA;Western Blot检测热休克蛋白家族的蛋白表达。（7）构建调控HSP70的转录的HSF1基因荧光素酶报告基因质粒,荧光素酶报告基因实验检测PGC1α能否在转录水平上调控HSP70的表达。（8）构建HSP70过表达质粒,在SKOV3/CDDP和A2780/CDDP细胞中使用PGC1α小分子抑制剂SR-18292,同时过表达HSP70。线粒体提取实验检测HK2在线粒体上的蛋白水平表达;免疫共沉淀检测HK2与VDAC1的结合;JC-1染色联合流式细胞术检测线粒体膜电位;AnnexinV/PI染色联合流式细胞术检测细胞凋亡。（9）构建HSP70 SBD结构域400氨基酸位点突变过表达质粒（HSP70 S400K）,在SKOV3/CDDP和A2780/CDDP细胞中使用PGC1α小分子抑制剂SR-18292,同时过表达HSP70或HSP70S400K。线粒体提取实验检测HK2在线粒体上的蛋白水平表达;免疫共沉淀检测HK2与VDAC1的结合。结果:（1）与卵巢癌亲本SKOV3和A2780细胞相比,Western Blot检测发现卵巢癌顺铂耐药细胞SKOV3/CDDP和A2780/CDDP具有较高的PGC1α表达水平。特异性敲减PGC1α之后,MTT检测发现SKOV3/CDDP和A2780/CDDP细胞对顺铂的敏感性增加;Western Blot检测发现SKOV3/CDDP和A2780/CDDP细胞抗凋亡相关蛋白BCL2减少,促凋亡蛋白BAX增加,凋亡下游因子c-caspase3增加;JC-1染色联合流式细胞术检测发现SKOV3/CDDP细胞线粒体膜电位下降。（2）在 SKOV3/CDDP 和 A2780/CDDP 细胞中特异性敲减 PGC1α后,Western Blot和RT-qPCR检测发现MPTP相关分子蛋白水平和mRNA水平没有显着性改变。（3）在SKOV3/CDDP和A2780/CDDP细胞中特异性敲减PGC1α并给予顺铂刺激后,线粒体提取和免疫荧光实验检测发现HK2在线粒体上的表达减少;免疫共沉淀和免疫荧光实验检测发现HK2与VDAC1的结合减少。（4）在SKOV3/CDDP和A2780/CDDP细胞中特异性敲减PGC1α后,转录组测序发现热休克相关蛋白具有表达差异;Western Blot检测发现HSP70蛋白表达水平下降。荧光素酶报告基因实验发现,PGC1α可以促进调控HSP70表达的HSF1基因的转录。（5）在SKOV3/CDDP和A2780/CDDP细胞中使用PGC1 α小分子抑制剂SR-18292,并同时过表达HSP70质粒后,线粒体提取实验检测发现HK2在线粒体的表达增加;免疫共沉淀检测发现HK2与VDAC1的结合增加;AnnexinV/PI染色联合流式细胞术检测发现细胞凋亡减少。（6）在SKOV3/CDDP和A2780/CDDP细胞中使用PGC 1 α小分子抑制剂SR-18292,并同时过表达HSP70或HSP70 S400K质粒后,线粒体提取实验检测发现与过表达HSP70相比,过表达HSP70 S400K后,HK2在线粒体上表达减少;免疫共沉淀检测发现与过表达HSP70相比,过表达HSP70 S400K后,HK2与VDAC1的结合减少。结论:（1）PGC1α可能通过调控线粒体途径凋亡参与了卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。（2）PGC1α可能通过调控HSP70介导了 HK2在线粒体中的表达以及与VDAC1的结合,减少了 MPTP的开放和线粒体凋亡,进而参与了卵巢癌顺铂耐药。（3）HSP70 SBD结构域400氨基酸位点促进了PGC1α介导的HK2在线粒体上的表达以及与VDAC1的结合。
雷雪萌[2]（2020）在《USP48在卵巢癌化疗耐药中的功能研究》文中进行了进一步梳理泛素特异性蛋白酶48（Ubiquitin specific protease 48,USP48）是去泛素化酶家族（Deubiquitinating enzymes,DUBs）成员之一,其在卵巢癌中的生物学功能尚不明确。我们通过TCGA和Kaplan-Meier Plotter数据库中卵巢癌数据进行分析发现:与USP48低表达的卵巢癌患者相比,USP48高表达的卵巢癌患者总生存（Overall survival,OS）和无进展生存（Progression free survival,PFS）预后较差;进一步的卵巢癌临床组织分析结果显示,USP48表达水平与卵巢癌患者的化疗耐药显着相关,USP48低表达的卵巢癌患者对铂类药物较敏感,且其总生存时间较长。体外细胞功能实验研究发现:与对照组相比,敲降USP48表达联合卡铂（Carboplatin,CBP）处理可显着增加ES2、3AO和A2780卵巢癌细胞的凋亡,亦增多了凋亡相关蛋白PARP和Caspase 3剪切带的表达;同时敲降USP48表达能显着抑制ES2、3AO和A2780卵巢癌细胞的迁移和侵袭,但对细胞增殖无明显影响。体内皮下移植瘤实验结果表明,敲降USP48表达显着提高了卵巢癌细胞形成的肿瘤对卡铂的敏感性;腹腔注射实验结果显示,敲降USP48表达联合卡铂处理能显着减弱卵巢癌细胞在小鼠腹腔内的播散转移且延长了小鼠的生存时间。综上所述,USP48的表达与卵巢癌患者化疗的敏感性相关,其具有作为耐药型卵巢癌治疗靶点的潜在价值。
吕腾[3]（2019）在《MiR-34a通过调控HDAC1抑制卵巢癌细胞增殖和顺铂耐药性机制的实验研究》文中进行了进一步梳理研究背景上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer,EOC）作为女性生殖系统常见三大恶性肿瘤之一,其致死高率居三者之首。75%的患者诊断时已为晚期,EOC患者的 5年生存率徘徊于40%左右,2年内复发率超过60%。癌细胞对化疗药物所致的获得性耐药是治疗失败的重要原因,细胞增殖及化疗耐药是EOC治疗面临的最大的挑战。MiR-34a 属于 miR-34ac/34bc-5p/449abc/449c-5p 家族,位于染色体lp36位点,在细胞增殖凋亡稳态失衡时起到重要作用。文献报道miR-34a在肿瘤细胞中起到“抑癌基因”的作用,能够抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移及耐药等多种恶行生物学行为。乙酰化和去乙酰化是组蛋白翻译后修饰的重要组成部分,组蛋白乙酰化的不平衡可能导致染色质结构的变化并进一步影响细胞周期进展,分化和/或凋亡的基因转录失调。与正常发育所需的许多基因一样,HDAC的失调功能可导致癌症。因此,在许多癌症中观察到HDAC的过表达。在肿瘤细胞通常发现HDAC同工酶的高水平表达和相应的组蛋白的低乙酰化状态。卵巢癌细胞增殖及耐药过程中miR-34a及HDAC1所起到的调控作用未见报道。本课题通过RT-qPCR方法检测miR-34a及HDAC1在卵巢癌组织及细胞系中的表达及对耐药情况的研究,并进一步验证了 HDAC1对miR-34a的靶标作用,对研究卵巢癌细胞增殖及逆转耐药和后期治疗中新型靶向治疗有重要的意义,为EOC的治疗奠定理论基础,有望对EOC的治疗提供了新思路和方向。第一部分 MiR-34a在卵巢癌组织中的表达及意义研究目的:通过检测miR-34a在卵巢癌组织中的表达,分析其与EOC临床病理特征之间的关系,探讨与卵巢癌的进展、侵袭和转移的关系。研究方法:收集2011年7月～2013年12月青岛大学附属医院EOC病理标本共54例,年龄38～70岁,平均年龄54.2±7.5岁:其中浆液癌48例,粘液癌6例;交界性卵巢肿瘤12例,年龄31～60岁,平均年龄46.9±8.1岁,其中浆液性8例,粘液性4例,正常卵巢组织1 0例,年龄48～59岁,平均年龄52.3±3.4岁,均为因子宫肌瘤而切除卵巢者。所有患者均签署知情同意书,并且经青岛大学附属医院伦理委员会审批通过。通过RT-qPCR方法检测miR-34a的表达,分析其表达与卵巢癌临床病理特征之间的关系,验证miR-34a的表达与卵巢癌的进展、侵袭和转移的密切关系。研究结果1.MiR-34a在卵巢肿瘤及正常卵巢组织中的表达:EOC组织中miR-34a相对表达量为0.5471±0.1 526,明显低于交界性卵巢肿瘤患者（0.9426±0.0849）和正常卵巢组织（1.03 75±0.0817）,差别具有统计学意义（P<0.001）,后两者比较无统计学意义（p=0.998）（见图 1.2 和表 1.4）;2.卵巢癌组织中miR-34a表达与临床病理特征的关系:2.1卵巢癌组织中miR-34a的表达与FIGO临床分期的关系:EOCⅠ期、Ⅱ期患者中miR-34a的相对表达量为0.77 15± 0.0813,Ⅲ、Ⅳ期miR-34a的相对表达量为0.4608±0.0501,差别具有统计学意义（p=0.022）（见图1.3和表1.5）。2.2卵巢癌组织中miR-34a的表达与EOC淋巴转移的关系:9例淋巴结转移患者miR-34a的相对表达量为0.4511± 0.0610,而无淋巴结转移患者miR-34a的相对表达量为0.5663±0.1 5 84;EOC组织中 miR-34a表达水平与淋巴结转移呈负相关,差别具有统计学意义（P=0.002）（见图1.4和表1.5）。2.3卵巢癌组织中miR-34a的表达与EOC分化程度的关系:高级别腺癌组织中相对表达量为0.5236±0.1314,而低级别腺癌组织为 0.8413±0.0668,两者无明显统计学差异（p=0.193）（见表1.5）。2.4卵巢癌组织中 miR-34a的表达与年龄的关系:年龄≤50岁EOC患者miR-34a的相对表达量0.5642±0.1715,年龄>50岁患者的表达量为 0.547 1±0.1 526,两者无明显统计学差异（P=0.194）（见表 1.5）。2.5卵巢癌组织中 miR-34a的表达与组织学分类的关系:在粘液性腺癌miR-34a表达量为0.6128±0.2033,浆液性腺癌miR-34a表达量为 0.538 9±0.1457,两者无明显统计学差异（p=0.112）（见表1.5）。2.6卵巢癌组织中 miR-34a的表达与 CA125水平的关系:在CA125≤200U/ml 的 患者 中 miR-34a 相对表 达量为0.7770±0.0946,CA125>200U/m1 的患者中 miR-34a 相对表达量为0.507 1±0.1 225,两者无明显统计学差异（p=0.5 83）（见表 1.5）。研究结论:MiR-3 4a的低表达与上皮性卵巢癌的进展相关。第二部分MiR-34a对卵巢癌细胞的增殖能力及顺铂耐药性作用的机制研究研究目的:探讨miR-34a在卵巢癌细胞增殖及顺铂耐药中的作用,并研究其作用的分子机制。研究方法:采用 MTT 法和软琼脂集落形成实验测定卵巢癌细胞系（SKOV3 和 OVCA433）中细胞的增殖及耐药情况;采用 RT-qPCR检测miR-34a在SKOV3和OVCA433中相对表达情况;培养卵巢癌耐药细胞系SKOV3cp（将SKOV3细胞采用顺铂药物诱导培养 6个月）;采用 miR-34a mimics 和 miR-34ainhibitor转染 SKOV3,OVCA433 和 SKOV3cp;real time P CR 检测SKOV3和 SKOV3cp细胞中极短期（48h+4μg/ml）顺铂干预对于SKOV3中miR-34a表达水平的影响;采用不同浓度的顺铂（0,0.5,1,2,4,8μg/ml）处理 SKOV3/SKOV3cp/SKOV3 cp+miR-34a 和 SKOV3/SKOV3 cp/SKOV3+miR-34a inhibitor 细胞,并测定细胞在不同顺铂浓度下的存活率。研究结果1 miR-34a模拟物对卵巢癌细胞存活率的影响:两种卵巢癌细胞系SKOV3和OVCA433分别转染了 miR-34a模拟物,同时分别对两个细胞系转染了乱序 miRNA,作为阴性对照组。转染后 1-5天,分别对两种细胞系进行细胞生长抑制情况的评估。SKOV3生长抑制率为 0.075 ± 0.005、0.138±0.011、0.245±0.026、0.467±0.038、1.045±0.13 6;OVAC433 生长抑制率分别为0.051±0.007、0.138±0.013、0.245±0.023、0.467±0.035、1.045±0.1 13。结果显示随着时间的延长,不论是否转染miR-34a,SKOV3 和 OVCA433 细胞在不断增殖,与转染了乱序miRNA的对照组,转染了 miR-34a模拟物的两类卵巢癌细胞系细胞相对存活率都明显低于对照组,差异具有显着性（p<0.001）（见图2.1、图2.2、表2.1及表2.2）。2 miR-34a模拟物对卵巢癌细胞集落形成的影响:软琼脂集落形成实验结果:转染miR-34a模拟物后,SKOV3细胞系:对照组集落计数为210.3±19.5,实验组集落计数为 146.5±9.6,差异具有统计学意义p=0.0022;OVCA43 3细胞系:对照组集落计数为200±35.2,实验组集落计数为 118.25±7.1,差异具有统计学意义（p=0.0076）;实验组相对于对照组,SKOV3和 OVCA433平均细胞集落数目分别降低了约29%和42%（见图2.3和图2.4）。3 miR-34a抑制物对卵巢癌细胞生长抑制的影响:分别对两种卵巢癌细胞系SKOV3和OVCA433分别转染miR-34a抑制物,阴性对照组则为未转染miR-34a抑制物的卵巢癌细胞。转染后等待24小时,在此后的1-5天,分别对两种细胞系进行了 MTT分析,以此评估生长抑制率。SKOV3生长抑制率分别为 0.075±0.007、0.187±0.023、0.502±0.034、0.987±0.047、1.965±0.146;OVAC433 生长抑制率分别为 0.075±0.007、0.157±0.028、0.432+0.024、0.837±0.077、1.765 ± 0.096。结果表明,随着培养时间的增加,转染了 miR-3 4a抑制物的两类卵巢癌细胞系中,细胞的相对存活率较对照组出现了明显提高,两组之间的存活率差异具有显着性（p<0.001）（见图2.5、图2.6、表2.3和表2.4）。4 miR-34a抑制物对卵巢癌细胞的细胞集落形成的影响:软琼脂集落形成实验结果:转染miR-34a抑制物后,SKOV3细胞系:对照组集落计数为1 7 6.5±3 4.6,实验组集落计数为2 42.0±1 1.9,差异具有统计学意义（p=0.02）;OVCA433细胞系:对照组集落计数为 173.5±14.2,实验组集落计数为 228.5±9.8,差异具有统计学意义（p=0.00 1 5）（见图2.7和图2.8）。结果显示当抑制miR-34a表达后,实验组相对于对照组,SKOV3和OVCA433平均细胞集落数目分别增加了约40%和3 6%。5 SKOV3和SKOV3cp细胞中的miR-34a的表达水平:采用实时定量PCR技术分析了 SKOV3和SKOV3cp细胞中的miR-34a的表达水平,其结果见图2.9。图中miR-34a在SKOV3细胞中的相对表达水平（1.00±0.23）高于 SKOVcp（0.38±0.11）的两倍以上,这表明在 SKOV3cp的细胞系中,miR-34a的表达出现非常明显的下调,显着性达到了 p<0.0 1。6短期顺铂（浓度4μg/ml+48h）处理对miR-34a表达的影响:对SKOV3细胞进行短期顺铂处理,药物浓度同耐药细胞株培养方法。采用实时定量PCR检测其miR-34a的表达水平,发现miR-34a在SKOV3细胞中的相对表达水平（1.00±0.1 5）为接受顺铂短期处理的SKOV3细胞的两倍以上（0.45±0.08）,表明即便是接受短期顺铂处理的SKOV3的细胞系中,miR-34a的表达也出现了非常明显的下调倍,显着性达到了 p<0.01（见图2.10）。7 miR-34a过表达对于顺铂处理抗药性的影响:应用 SKOV3和SKOV3cp细胞,同时对SKOV3cp细胞转染了 miR-34a,以此模拟具有顺铂耐药性细胞中 miR-34a过表达时对于化疗药物的影响。转染24小时后,采用不同浓度的顺铂（0,0.5,1,2,4,8μ g/ml）处理这三类细胞,MTT结果显示当顺铂给药浓度增加时其存活率均明显下降。与SKOV3细胞相比,当暴露于相同浓度的顺铂时,SKOV3cp细胞的存活率显着增高（p<0.001）。与未转染miR-34a 的 SKOV3cp 细胞比较,转染 miR-34a 的 SKOV3cp 细胞的存活率下降（p<0.001）（见图2.1 1）。8 miR-34a表达抑制对于顺铂处理抗药性的影响:实验中仍然采用两类细胞:SKOV3和SKOV3cp细胞,但是与上述实验不同的是,将 SKOV3 转染了 miR-34a抑制剂,模拟 SKOV3 细胞中miR-34a表达被抑制时,卵巢癌细胞对化疗药物的相应反应。结果显示:转染24小时后采用不同浓度的顺铂（0,0.5,1,2,4,8μg/ml）处理这三类细胞,MTT结果显示当顺铂给药浓度增加时其存活率均明显下降。与未转染miR-34a的 SKOV3细胞比较,转染miR-34a抑制剂的SKOV3细胞的增殖能力显着增强,不同浓度顺铂对于癌细胞的抑制能力减弱,其显着性达到了 p<0.001（见图 2.1 2）。研究结论:第三部分HDAC1对于miR-34a的靶标功能及对细胞增殖和顺铂耐药性作用的研究研究目的:1.通过预测 miR-34a的靶基因,进而研究靶基因在卵巢癌中的功能及表达的作用;2.验证miR-34a是否可以通过抑制靶基因的表达,以抑制卵巢癌细胞的增殖并逆转耐药性。研究方法通过生物信息学分析预测了 miR-34a的75 1个潜在靶标,并选择1 4个癌症相关基因用于进一步检测过表达转染miR-3 4a模拟物后相关基因的变化;构建含有荧光素酶编码序列的报告载体,连接上述潜在miR-34a作用靶标的3’-UTR,并进行双荧光素酶报告基因测定;Western-Blot验证卵巢癌细胞HDAC1表达特性以及与 miR-34a的调控关系;MTT法和软琼脂集落形成实验测定HDAC1 基因表达对卵巢癌细胞活性的影响;real time PCR、Western-Blot及MTT法验证HDAC1基因表达对顺铂对卵巢癌细胞耐药性的影响;构建HDAC1过表达质粒,采用MTT法和软琼脂集落形成实验检测 HDAC1 过表达对 miR-34a 转染的SKOV3和SKOV3cp细胞增殖的影响。研究结果1.miR-34a潜在靶基因筛选与分析:通过生物信息学分析预测并初步筛选了 miR-34a的 14种与癌症相关的基因RT-PCR检测发现在卵巢癌细胞系中过表达miR-34a会导致其中六种基因表达出现变化（Sox4,HDAC1,ITGB8,CDH4,TCF12 和 WNT1）;随后双荧光素酶报告基因测定结果显示TCF12和HDAC1的表达差异具有统计学意义,其中 HDAC1 荧光素酶活性抑制最为明显（p<0.001）（见图 3.1 和 3.2）;2.miR-34a对 HDAC1 表达的抑制作用:HDAC1 基因的 3’-UTR互补位点中引入突变并转染 miR-34a mimics:未引入突变1.miR-34a的过表达可有效的抑制卵巢癌细胞的增殖;2.miR-34a的过表达对逆转顺铂耐药有一定作用,为卵巢癌的潜在治疗靶点提供了理论基础。组的荧光活性抑制表现依然显着（p<0.001）,突变组中,由于miR-34a和HDAC1相互作用的中断,抑制不再显着（见图3.3和3.4）;3.卵巢癌细胞HDAC1表达特性以及与miR-34a的调控关系:电泳实验结果显示转染 miR-34a mimics 能够抑制 SKOV3,OVCA43 3和SKOV3cp细胞中的HDAC1表达（见图3.5）;4.HDAC1基因表达对卵巢癌细胞活性影响:采用 HDAC1 过表达质粒或HDAC1 siRNA转染SKOV3细胞作为实验组,未转染组作为阴性对照组。转染后 1-5天,MTT法对细胞生长情况进行评估。过表达HDAC1组SKOV3生长率为0.079±0.005、0.398±0.010、0.690±0.009、1.132±0.121、1.893±0.089,转染HDAC1 siRNA 组 SKOV3 生长率为 0.071 ± 0.005、0.312 ±0.014、0.456 ± 0.00 7、0.517±0.114、1.236±0.089,与未转染组相比,差别具有显着意义（P<0.001）。软琼脂集落形成实验结果显示与对照组（集落计数228.3±8.8）相比,HDAC1过表达组（集落计数296.3±24.5）能够显着促进软琼脂中SKOV3细胞的集落形成。与对照组（集落计数 211.3±9.7）相比,当HDAC1 表达沉默时（集落计数 153.8±15.0）,SKOV3细胞的集落形成显着受到抑制（P<0.0 1）（见图 3.6、3.7、3.8和表3.1、3.2）;5.HDAC1对顺铂在卵巢癌细胞敏感性影响:RT-PCR结果显示SKOV3细胞中 HDAC1-mRNA表达水平远低于 SKOV3cp细胞,Western-Blot结果说明SKOV3细胞中HDAC1蛋白质表达水平也远低于 SKOV3cp细胞（p<0.01）,HDAC1 过表达可显着提高顺铂处理后SKOV3细胞的存活率（p<0.001）（见图3.9、3.10、3.11 和表 3.3）;6.HDAC1过表达对miR-34a转染的SKOV3或SKOV3cp的影响:MTT和软琼脂集落形成实验均显示miR-34a抑制SKOV3细胞的活力和集落形成,HDAC1过表达能够逆转上述抑制作用,;顺铂处理可导致 SKOV3 细胞活力的显着降低（约 60%）,对SKOV3cp细胞活力几乎没有影响（约 1 5%）,而采用miR-34a转染的 SKOV3cp细胞,细胞活力则降至 50%左右,若同时转染HDAC1过表达质粒,细胞对顺铂的敏感性再次降低,细胞活力降低至只有20%左右,差别均具有统计学意义（p<0.001）（见图3.12、3.13、3.14）。研究结论:1.HDAC1是miR-3 4a的功能靶点,HDAC1的过表达增强了卵巢癌细胞的增殖能力,并与顺铂耐药性呈正相关;2.miR-34a通过靶向抑制HDAC1进一步抑制卵巢癌细胞增殖并逆转顺铂耐药性。
李状[4]（2012）在《二氢叶酸还原酶与卵巢上皮癌多药耐药关系的研究》文中研究指明第一章卵巢癌多药耐药的研究进展（文献综述）卵巢恶性肿瘤是女性生殖器三大恶性肿瘤之一。卵巢隐匿于盆腔的深部,早期病变时不易被发现,一旦出现症状时大多属于晚期,治疗后容易复发,死亡率亦一直位居妇科恶性肿瘤之首。目前卵巢癌的治疗目的是早期争取治愈、晚期控制复发、延长生存期及提高患者生活质量。治疗原则是以手术为主,联合化疗及放疗的综合治疗。大多数的情况下,手术是很难将卵巢癌的转移灶彻底的切除干净。对于那些残留的细小的转移和种植结节.都需要化学药物来进行治疗。因此,化疗在卵巢癌治疗的过程中具有极其重大的意义。晚期卵巢癌的治疗方法主要以肿瘤细胞减灭术及术后辅助化疗为主。但化疗失败常会导致卵巢癌的复发,其主要原因在于肿瘤细胞产生的多药耐药（multidrug resistance,MDR）。以顺铂为主的联合化疗对卵巢癌的有效率达40%-60%,由于疾病进展和机体对化疗产生耐药,晚期卵巢癌患者的5年生存率低于20%。所以,多药耐药是肿瘤化疗失败的主要因素之一。因此,肿瘤产生耐药机制的研究以及在临床上预防耐药、对抗耐药并尝试逆转耐药就成为了当前卵巢癌治疗中的热点和难点,成为提高卵巢癌的治疗效果及改善卵巢癌患者生存的重要目标之一。第二章卵巢癌组织中二氢叶酸还原酶基因的表达及临床意义目的探讨卵巢癌组织中二氢叶酸还原酶基因（DHFR）（?）的表达及其临床意义。方法采用实时荧光定量PCR法测定80例卵巢癌组织、50例良性卵巢组织及30例正常卵巢组织中的DHFR mRNA表达情况,分析其与卵巢癌临床病理及多药耐药的相关性。结果（1）DHFR mRNA表达量在止常卵巢,良性卵巢肿瘤和卵巢癌组织中分别为0.584±0.234,0.895±0.783和0.197±0.412,相比较差异有统计学意义（P<0.001,P=0.027,P<O.001）。（2）卵巢癌组织中DHFR mRNA表达量与患者临床分期及病理分级无相关（P>O.05）,但在上皮性癌中浆液性癌组织中DHFR mRNA表达量则明显高于粘液性和内膜样癌,相比较差异有统计学意义（P<0.001）。（3）卵巢癌组织中DHFR mRNA表达量与患者的腹水量,淋巴结转移和远处器官转移无明显相关（P>O.05）,但大网膜转移者肿瘤组织中DHFR mRNA表达量则低于无转移者（P=0.044）。（4）在卵巢癌患者中治疗后缓解者组织中DHFR mRNA表达量低于肿瘤进展者（P<O.001）；而铂类药物敏感型患者肿瘤组织中DHFR mRNA表达量也低于铂类药物耐药者（0.130±0.103vs0.341±0.701P=0.011）。（5）DHFR mRNA表达量判断卵巢肿瘤性质的ROC曲线Youden旨数最大值所对应的数值为0.331, DHFR mRNA表达量高于0.331的患者中位生存时间为16.4个月,而低于0.331的患者中位生存时间为44.5个月,着异有统计学意义（P<0.001）,且COX模型多因素分析亦显示DHFR mRNA表达量为影响预后的独立因素（P=0.018）。结论DHFR mRNA在正常和良性卵巢组织中表达量高于卵巢癌组织,提示DHFR参与正常组织细胞生理代谢；而在卵巢癌中DHFR mRNA在铂类耐药组织中高表达（O.341±0.701）,在铂类敏感组织低表达（0.130±0.103）,提示DHFR与卵巢癌多药耐药相关,可能为判断卵巢癌多药耐药潜在标志之一。第三章二氢叶酸还原酶基因表达上调对卵巢上皮癌细胞系生物学特性影响的体外实验研究目的构建携带人二氢叶酸还原酶（DHFR）基因的慢病毒表达载体pWPI。方法采用PCR方法扩增二氢叶酸还原酶cDNA全长,与EZ-T克隆载体连接,HindⅢ及BamHI-HF限制性内切酶双酶切回收的PCR片段并补平其缺口。慢病毒系统载体使用pWPI系统,采用PmeI酶切载体后回收片段,将其磷酸化,T4酶连接载体与目的基因。表达载体鉴定均采用核苷酸序列测定,重组质粒采用脂质体转染293T包装细胞后获得包装的病毒颗粒。通过流式细胞仪检测成功构建好的DHFR-pWPI-SKOV3细胞、空载pWPI-SKOV3细胞以及亲本SKOV3细胞在不同的顺铂浓度下（2.5ug/ml,5.0ug/ml,10.0ug/ml,20.0ug/m1）不同时间段（24h、48h及72h）的三种细胞的凋亡情况以及IC50顺铂浓度（6.0ug/m1）下三种细胞的周期变化,高效液相法（HPLC法）检测不同顺铂浓度（4.0ug/ml,6.0ug/ml,8.0ug/ml）不同时间段（24h、48h及72h）药物作用后三种细胞内的顺铂浓度,以及透射电镜观察IC50顺铂浓度（6.0ug/m1）下三种细胞的超微结构变化,以探讨DHFR基因的过表达对卵巢癌细胞的体外生物学行为影响。结果（1）成功扩增二氢叶酸还原酶全长并连接入pWPI载体构建成重组表达载体DHFR-pWPI,重组质粒测序结果显与DHFR基因的同源性达100%,按标准生产程序转染293T后有DHFR基因的表达,将其病毒液感染SKOV3细胞。（2）通过流式细胞仪检测转染DHFR基因的细胞的凋亡变化,发现DHFR-pWPI-SKOV3细胞在顺铂浓度（2.5ug/ml、5.0ug/m1）刺激下,其24h、48h及72h的凋亡率均低于pWPI-SKOV3及SKOV3细胞；DHFR-pWPI-SKOV3细胞在顺铂浓度（10.0ug/ml、20.0ug/ml）刺激下,其24h及48h的凋亡率均低于pWPI-SKOV3及SKOV3细胞,但在72h时,凋亡率却高于SKOV3细胞株。表明DHFR-pWPI-SKOV3细胞在浓度小于5.0ug/ml时,不管时间的改变（72小时内）,其对顺铂的抵抗力高于其他两种细胞。（3）通过流式细胞仪检测不同时间段IC50顺铂浓度（6.0ug/m1）对三种不同处理卵巢癌细胞的周期变化,结果提示1C50（6.0ug/m1）顺铂浓度给药时,DHFR-pWPI-SKOV3、pWPI-SKOV3及SKOV3三种细胞在24h、48h时其G1期含量明显低于G2+S细胞：而在72h时,DHFR-pWPI-SKOV3细胞的G2+S期明显低于pWPI-SKOV3及SKOV3细胞。（4）采用HPLC法检测细胞内顺铂浓度,结果显示细胞培养液中顺铂浓度（4.0ug/m1）给药24h、48h后及顺铂浓度（6.0ug/m1）给药24h后,DHFR-pWPI-SKOV3细胞内的顺铂含量均明显低于pWPI-SKOV3及SKOV3细胞；顺铂浓度（6.0ug/m1）给药48h及顺铂浓度（8.0ug/ml）给药24h、48h后,DHFR-pWPI-SKOV3细胞内的顺铂含量明显高于pWPI-SKOV3及SKOV3细胞。（5）通过电镜观察1C50顺铂浓度在不同时间段刺激三种不同处理的细胞的超微结构改变,发现DHFR-pWPI-SKOV3细胞在给药24h及48h其微丝聚集,线粒体从数量上及结构上改变明显,而pWPI-SKOV3细胞微丝少见,线粒体数目减少,但结构改变不明显,SKOV3细胞亦很少见到微丝,但其线粒体的结构改变亦明显,扩张与固缩同时存在；三者均出现扩张的内质网；三者均少见正常的细胞器；在给药72h后,pWPI-SKOV3及SKOV3细胞可见微丝排列紊乱,核膜部分消失,核糖体大量的聚集,进入了明显的坏死阶段,而DHFR-pWPI-SKOV3细胞未见微丝,核膜几乎完全消失,胞质内有白色囊状物质,线粒体结构基本消失,大部分细胞濒临死亡。结论成功采用慢病毒载体系统构建了二氢叶酸还原酶重组慢病毒转基因,耐药性功能实验表明DHFR表达量增高时卵巢癌细胞系耐药性增加,可以认为DHFR与卵巢癌顺铂的耐药性相关,为探讨DHFR在肿瘤多药耐药过程中的分子机理奠定基础。第一节RNA干扰质粒载体的构建及鉴定目的构建二氢叶酸还原酶（DHFR, dyhidrofolate reductase）基因RNAi慢病毒载体,为探讨抑伟DHFR基因表达在卵巢癌铂类耐药治疗中的意义奠定基础。方法设计DHFR基因靶向的发夹状siRNA,筛选出最佳siRNA沉默片段,退火后连接入p GSCIL载体,转化后进行序列鉴定,脂质体转染SKOV3细胞株,并进行荧光摄像。结果将退火后的双链寡核苷酸片段连接至pGPU6/GFP/Neo载体,测序结果正确。转染SKOV3细胞后,PCR鉴定干扰效果。G418筛选稳定细胞株。结论成功构建针对DHFR基因的siRNA载体,找到了有效的干扰靶序列,转染SKOV3细胞后,DHFR基因的表达明显减弱。第二节DHFR慢病毒干扰载体的构建及其在卵巢上皮癌细胞中生物学特性影响目的构建二氢叶酸还原酶（DHFR, dyhidrofolate reductase）基因RNA干扰慢病毒载体,研究其耐药性功能影响,为探讨抑制DHFR基因表达在卵巢癌铂类耐药治疗中的意义奠定基础。方法设计DHFR基因靶向的发夹状siRNA,筛选出最佳siRNA沉默片段,退火后连接入pGSCIL/GFP载体,转化后进行序列鉴定,脂质体转染SKOV3细胞株,并进行荧光摄像。Western blot验证构建成功通过流式细胞仪检测成功构建好的DHFR-pGSCIL-SKOV3细胞、空载pGSCIL-SKOV3细胞以及亲本SKOV3细胞在不同的顺铂浓度下（2.5ug/m1,5.0ug/ml,10.0ug/ml,20.0ug/m1）不同时间段（24h、48h及72h）的三种细胞的凋亡情况以及IC50顺铂浓度（4.4ug/ml）下三种细胞的周期变化,高效液相法（HPLC法）检测不同顺铂浓度（2.5ug/ml,5.0ug/ml,7.5ug/ml）不同时间段（24h、48h及72h）药物作用后三种细胞内的顺铂浓度,以及透射电镜观察IC50顺铂浓度（4.4ug/m1）下三种细胞的超微结构变化,以探讨DHFR基因的沉默对卵巢癌细胞的体外生物学行为影响。结果（1）将退火后的双链寡核苷酸片段连接至pGSCIL/GFP载体,测序结果正确。转染SKOV3细胞后,Western blot鉴定十扰效果。（2）在给药24h、48h及72h,DHFR-pGCSIL-SKOV3、pGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞的凋亡率随着顺铂浓度（2.5ug/ml、5.0ug/ml、10.0ug/ml、20.0ug/m1）的增大而升高,且DHFR-pGCSIL-SKOV3细胞给药48h及72h后的凋亡率明显高于pGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞。（3）在IC50（4.4ug/ml）顺铂浓度给药24h、48h后,DHFR-pGCSIL-SKOV3、pGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞均以G1期为主。DHFR-pGCSIL-SKOV3在48h时G1期的细胞比例明显减少,S期和G2/M期比例增多,72h后三种细胞G1期的含量均明显降低,S期和G2/M期的含量均增高。（4）采用高效液相检测细胞内顺铂浓度时,当2.5ug/m1、5.0ug/ml顺铂浓度作用三种不同处理的卵巢癌细胞时,DHFR-pGCSIL-SKOV3细胞在给药后24h、48h其细胞内顺铂浓度均明显高于pGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞。而DHFR-pGCSIL-SKOV3细胞在7.5ug/ml顺铂浓度给药后24h其细胞内顺铂浓度均明显低于PGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞,而在48h却又高于pGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞。（5）在IC50（4.4ug/m1）给药24h、48h三种不同处理细胞的微丝均少见,DHFR-pGCSIL-SKOV3细胞在24h时可见线粒体肿胀、脊消失、空泡化、萎缩,内质网扩张明显,有聚集的核糖体,末见高尔基体,48h时其有些线粒体溶解消失,且出现大量的白色囊泡；而pGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞24h、48h内质网扩张少见,线粒体结构改变不明显,甚至有2-3个高尔基体存在；DHFR-pGCSIL-SKOV3细胞至72h时,微丝明显的聚集、增多,线粒体结构亦消失。余两种细胞微丝排列紊乱,线粒体形态多样化。结论成功构建针对DHFR基因的siRNA慢病毒载体,找到了有效的干扰靶序列,转染SKOV3细胞后,DHFR基因的表达明显减弱。通过对DHFR下调后耐药性功能研究证实DHFR基因的下调与经过铂类药物作用的体外卵巢癌细胞的药物敏感性有一定的联系,抑制DHFR基因表达能增加顺铂药物敏感性,因此,抑制卵巢癌细胞DHFR基因的表达可以考虑作为顺铂多药耐药的逆转机制。
王桂玲[5]（2011）在《WWOX与P73a基因慢病毒表达载体的构建及其在卵巢癌细胞中的表达》文中认为背景：卵巢恶性肿瘤是最常见的女性恶性肿瘤之一,也是死亡率最高的妇科恶性疾病。具有发病隐匿、进展迅速的特点,由于缺少高敏感度和特异性的早期诊断方法,约80%的患者发现时已成为晚期。目前,卵巢上皮性癌的治疗模式为肿瘤细胞减灭术,术后给予以铂类为主的联合化疗,但5年生存率仍徘徊在35%左右。70%卵巢癌患者的5年内死因是肿瘤盆腹腔复发,其主要原因是铂类耐药而导致治疗失败。目前认为耐药机理有多种,但具体为什么途径耐药还有待进一步研究。据国外相关报道,WWOX与P73相互作用能增强凋亡,我们考虑这种相互作用是否与卵巢癌的铂类药物敏感性有关。但二者的作用机理尚不清楚,因此我们研究WWOX与P73a基因的相互作用机理,望能分析解决卵巢癌铂类耐药的途径,恢复卵巢癌铂类药物的敏感性。目的：构建及鉴定WWOX、P73a基因慢病毒载体,观察WWOX和P73a基因在人卵巢癌PEO1细胞株中的表达,为进一步研究WWOX与P73a基因的相互作用机制及其功能奠定基础。方法：1.采用PCR技术从克隆质粒模板中获得全长WWOX与P73a基因,将WWOX与P73a基因亚克隆到慢病毒载体PCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP中,构建慢病毒载体表达质粒WWOX-PCDH及P73a-PCDH。2.通过双酶切验证后,慢病：毒表达质粒与慢病毒包装质粒pPACKH1-GAG, pPACKH1-REV, Pvsv-G共转染人293T细胞,获得携带WWOX,P73a基因及EGFP基因的重组慢病毒Lenti WWOX和Lenti P73a。3.转染靶细胞人卵巢癌PEO1细胞株。通过RT-PCR和Western Blot验证Lenti wwox及Lenti P73a在人卵巢癌细胞PEO1中的表达。结果：1.测序结果显示成功构建重组慢病毒载体表达质粒PCDH-WWOX、PCDH-P73a。2.表达质粒与辅助包装质粒共转染包装细胞293T后能产生慢病毒颗粒并有效感染靶细胞PEO1,转导效率约为60%。3.经RT-PCR和Western Blot验证,被感染的PEO1细胞有WWOX与P73a基因mRNA和蛋白水平的高表达。结论：本实验成功构建了携带WWOX与P73a基因慢病毒表达载体,包装成病毒后能有效感染卵巢癌PEO1细胞。
张霞[6]（2011）在《抑癌基因PDCD4和PDCD5在卵巢癌中的作用及其机制研究》文中研究指明目的卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤,种类繁多,其中原发性卵巢上皮癌（最常见的是浆液性囊腺癌）占卵巢恶性肿瘤的85-90%。卵巢癌早期不易发现,就诊率低,病死率居女性生殖系统恶性肿瘤首位。临床上对于卵巢癌的治疗主要是采用手术及以铂类为主的联合化疗,尽管起初化疗效应约50-80%,但由于原发性与获得性耐药,患者的5年生存率仍然很低。因此,提高化疗敏感性,逆转化疗耐药（尤其是最常用的铂类化疗药物,如顺铂）是改善卵巢癌预后的关键。近些年来,基因治疗在肿瘤领域的成功应用为卵巢癌基因治疗奠定了基础,对恶性卵巢癌患者化疗药增敏基因和耐药基因的研究,成为卵巢癌治疗领域的热门课题。程序性细胞死亡-4（programmed cell death 4, PDCD4）是一种新的抑癌基因,可以通过抑制蛋白转录和翻译过程抑制肿瘤细胞的生长。我们和其他学者已经发现PDCD4在肺癌和神经胶质瘤等肿瘤中表达下调并且在肿瘤中发挥着非常重要的作用,但在卵巢癌中的作用尚未见报道。那么,PDCD4在卵巢癌中的表达状态如何?其对卵巢癌的发生发展到底有什么作用?能否影响卵巢癌的化疗敏感性并成为基因治疗的靶点之一?PDCD4的作用机制是什么,能否通过调控自噬的发生来发挥其在疾病中的作用?这些都是非常值得探索的问题。为了明确PDCD4在卵巢癌发生发展中的关系,阐明其发挥作用的机制,为PDCD4的临床应用提供理论依据和实验基础,本论文拟从以下三个方面进行研究：（一） PDCD4在人卵巢癌中的表达状态及其作用：通过多种方法检测正常卵巢、浆液性囊腺瘤和浆液性囊腺癌中PDCD4的表达发现,PDCD4在囊腺癌的表达出现明显的下调与缺失,并且与囊腺癌的病理级别密切相关。进一步研究发现,PDCD4在体外能够明显抑制卵巢癌细胞增殖和克隆形成能力,在裸鼠体内能降低卵巢癌细胞的成瘤能力,延长肿瘤发生的潜伏期。（二） PDCD4对卵巢癌化疗敏感性的影响及其机制研究：我们通过过表达和沉默表达PDCD4,从正反两方面证实PDCD4能显着增强卵巢癌细胞对铂类化疗药物的敏感性,在裸鼠体内PDCD4和顺铂联合治疗能有效地抑制卵巢癌的生长。进一步阐明其机制：PDCD4能够明显增强顺铂诱导的细胞凋亡,并且主要通过死亡受体通路介导的。（三） PDCD4在细胞发生自噬过程中的作用及其机制研究：PDCD4在卵巢癌细胞中过表达可以抑制自噬的发生,PDCD4-/-小鼠的巨噬细胞自噬水平明显高于C57小鼠。进一步的研究证明PDCD4是通过调控与自噬发生有关的p38MAPK通路来发挥作用。方法一、PDCD4在卵巢癌中的作用及其临床意义1.分别用RT-PCR. western blot和免疫组化方法检测人卵巢癌细胞系以及人正常卵巢、浆液性囊腺瘤和浆液性囊腺癌组织标本中PDCD4 mRNA和蛋白的表达情况。x2检验分析PDCD4在浆液性囊腺癌病例中的表达与其临床病理特点间的关系。2.利用脂质体转染PDCD4重组表达载体和G418筛选的方法建立PDCD4稳定表达的细胞系SKOV3-PDCD4和对照细胞系SKOV3-MOCK,用活细胞计数法检测PDCD4对细胞增殖能力的影响,平板集落形成实验检测PDCD4对细胞克隆形成能力的影响。3.将SKOV3,SKOV3-MOCK, SKOV3-PDCD4细胞分别注射到裸鼠腋窝皮下荷瘤,观察PDCD4表达对卵巢癌细胞SKOV3在裸鼠体内成瘤能力的影响。二、PDCD4对卵巢癌化疗敏感性的影响及其机制研究1.用MTT法检测四种卵巢癌细胞系,SKOV3、CAOV3、OVCAR3和3AO对顺铂的化疗敏感性,分析PDCD4表达水平与卵巢癌细胞对顺铂化疗敏感性的关系。2.在卵巢癌PDCD4相对低表达的卵巢癌细胞系SKOV3和CAOV3中,稳定或瞬时表达PDCD4,显微镜下观察细胞的状态,用MTT法检测PDCD4对卵巢癌细胞化疗敏感性的影响。3.设计合成两条PDCD4特异的siRNA,用siRNA沉默PDCD4高表达的卵巢癌细胞系OVCAR3中PDCD4的表达,干扰48小时后用RT-PCR和western blot检测PDCD4的表达,确定干扰效率。用MTT实验检测PDCD4沉默表达对卵巢癌化疗敏感性的影响。4.用卵巢癌细胞SKOV3注射到裸鼠腋窝皮下荷瘤后,随机分为6组,分别采用生理盐水,空载体,PDCD4载体,顺铂,空载体+顺铂,PDCD4+顺铂6种方法进行治疗,探讨PDCD4和顺铂联合治疗对肿瘤生长的影响。5.用PI染色,流式细胞仪检测PDCD4过表达对顺铂诱导的细胞周期变化的影响。进一步通过Hoechst染色从细胞形态学上观察PDCD4过表达对顺铂诱导的凋亡的影响,采用Tunnel染色对细胞的晚期凋亡率进行检测。6.应用western blot检测PDCD4过表达对顺铂诱导的凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9的活性变化及Bcl-2、Bax, c-FLIP蛋白表达变化。7.用caspase-8抑制剂抑致caspase-8的活性,检测PDCD4过表达对顺铂的化疗增敏作用的影响。8.利用流式细胞术检测PDCD4 j过表达对顺铂诱导的死亡受体DR5的表达状态的变化。三、PDCD4在细胞发生自噬过程中的作用及其机制研究1.用空载体或PDCD4重组表达载体转染卵巢癌细胞系SKOV3,转染48小时之后,采用饥饿的方法诱导细胞产生自噬,检测自噬标志性蛋白LC3的表达情况。2.分别获取C57和PDCD4基因敲除小鼠的腹腔巨噬细胞和骨髓来源的巨噬细胞,采用饥饿,LPS或雷帕霉素刺激诱导自噬的产生,western blot检测LC3表达情况。分别在C57和PDCD4基因敲除小鼠的腹腔巨噬细胞转染GFP-LC3,诱导自噬发生后,荧光显微镜观察GFP-LC3的表达分布情况。3.分别获取C57和PDCD4基因敲除小鼠的腹腔巨噬细胞,诱导自噬发生后,用ROS活性检测试剂盒,流式细胞术检测PDCD4对ROS活性的影响。Western blot检测PDCD4对自噬相关蛋白Beclin-1和自噬发生有关的p38MAPK通路中p38MAPK表达的影响。结果一、PDCD4在卵巢癌中的表达、临床意义及对肿瘤恶性行为的影响1. PDCD4在人卵巢癌细胞系和卵巢癌组织中的表达状况及临床意义为了研究PDCD4在卵巢癌中的作用,首先应用RT-PCR和western blot的方法检测了四种卵巢癌细胞系SKOV3、CAOV3、OVCAR3和3AO中PDCD4的表达情况,结果显示PDCD4在SKOV3和3AO中表达较低,CAOV3中度表达,OVCAR3表达相对较高。进而我们采用RT-PCR和免疫组化的方法检测了20例正常卵巢、26例浆液性囊腺瘤、43例浆液性囊腺癌组织中PDCD4的表达,发现与正常卵巢和浆液性囊腺瘤相比,PDCD4在浆液性囊腺癌中的表达明显下调甚至缺失。进一步分析发现,PDCD4的表达下调和缺失与浆液性囊腺癌患者高的病理级别密切相关。2.外源性PDCD4的表达能够明显抑制卵巢癌细胞的生长及克隆形成能力为了进一步研究PDCD4在卵巢癌中的作用,我们用脂质体介导将PDCD4重组表达载体和空载体转染到卵巢癌细胞系SKOV3中,并用G418进一步筛选,通过RT-PCR和western blot鉴定,得到稳定表达PDCD4的细胞系SKOV3-PDCD4和对照细胞系SKOV3-MOCK。通过活细胞计数的方法检测细胞增殖能力发现,SKOV3-PDCD4的增殖能力明显减弱（p<0.001）,克隆形成实验显示SKOV3-PDCD4的克隆形成数明显降低（p<0.05）,提示PDCD4在体外能明显抑制卵巢癌的恶性增殖能力。3.外源性PDCD4表达降低了卵巢癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力为了研究PDCD4在体内是否同样具有抑制卵巢癌恶性行为的能力,我们用SKOV3、SKOV3-MOCK、SKOV3-PDCD4细胞分别在裸鼠皮下进行荷瘤,观察肿瘤的生长。结果显示,SKOV3-PDCD4组的成瘤率明显降低,成瘤时间明显延长,而且形成的肿瘤大小和重量也明显低于其他两组（p<0.05）。这些结果显示,PDCD4过表达在体内同样可以抑制卵巢癌细胞的恶性行为。二、PDCD4对卵巢癌化疗敏感性的影响及其机制研究1. PDCD4表达水平与卵巢癌敏感性的关系上一部分研究提出PDCD4不仅在卵巢癌中表达降低,而且PDCD4在体内外都可以抑制卵巢癌的恶性增殖能力。然而,PDCD4能否增强卵巢癌的化疗敏感性,从而增强其疗效仍有待于进一步研究。我们通过MTT法检测上述四种卵巢癌细胞系SKOV3、CAOV3、OVCAR3及3AO对顺铂的化疗敏感性,分析PDCD4表达水平和其敏感程度的关系。结果显示,相对高表达PDCD4的CAOV3和OVCAR3细胞对顺铂更加敏感,而低表达细胞SKOV3和3AO则较不敏感,提示PDCD4表达水平可能与卵巢癌的化疗敏感性相关。2.外源性PDCD4表达可以增强卵巢癌细胞的化疗敏感性为了确定PDCD4对化疗敏感性的影响,我们在第一部分得到的稳定表达细胞系SKOV3-PDCD4和SKOV3-MOCK中分别加入不同浓度的顺铂,MTT检测细胞的生存率。结果显示,在12.5μg/ml浓度的顺铂作用下,SKOV3-PDCD4的细胞形态出现变圆或死亡,而SKOV3-MOCK没有明显的改变。MTT结果显示SKOV3-PDCD4的细胞生存率明显低于SKOV3-MOCK。我们通过瞬时转染的方法在CAOV3细胞中过表达PDCD4也发现了相似的结果,表明外源性的PDCD4表达可以增强卵巢癌细胞对顺铂的化疗敏感性。进一步检测了PDCD4过表达对其他化疗药物的影响,结果显示PDCD4同样也可以增强卵巢癌细胞对卡铂的化疗敏感性,但是对环磷酰胺,VP-16及紫杉醇的化疗敏感性没有明显的影响。3.沉默表达PDCD4减低了卵巢癌对顺铂的化疗敏感性为了进一步确定PDCD4对卵巢癌化疗敏感性的影响,我们设计合成了两条PDCD4特异性siRNA片段,将其转染PDCD4高表达的卵巢癌细胞系OVCAR3, RT-PCR和,western blot检测PDCD4表达发现,两条siRNA片段都能够有效的沉默PDCD4的表达（mRNA水平降低77%和76%,蛋白表达降低80%和88%）。进一步,我们采用这两条siRNA沉默OVCAR3中的PDCD4表达,发现其对顺铂的化疗敏感性明显降低（p<0.05）,从反方面验证了PDCD4能够增强卵巢癌对顺铂的化疗敏感性。4. PDCD4和顺铂体内联合治疗能明显抑制卵巢癌的生长为了验证PDCD4在体内能否增强卵巢癌对顺铂的化疗敏感性,我们用SKOV3细胞在裸鼠皮下荷瘤,随即分为6组进行治疗：生理盐水对照组,空载体组,PDCD4组,顺铂组,空载体+顺铂组,PDCD4+顺铂组。结果显示：PDCD4+顺铂组肿瘤的大小和重量（0.0375士0.0069 mm3,0.0300+0.0044 g）都明显的低于顺铂组（0.1386±0.0185 mm3,0.0860±0.0204 g）, PDCD4组（0.0779±0.0115 mm3,0.0533±0.0042 g）,和空载体+顺铂组（0.1621±0.0090 mm3,0.07667±0.0126 g）。通过免疫组化检测以上各组肿瘤中PDCD4的表达显示,有PDCD4载体治疗组的PDCD4表达明显增高,说明体内表达成功。体内实验结果显示PDCD4和顺铂联合治疗能明显抑制卵巢癌的生长,提示PDCD4在体内仍具有增强卵巢癌对顺铂的化疗敏感性的作用。5. PDCD4增强顺铂的化疗敏感性是通过诱导细胞凋亡,而不是改变细胞周期为了进一步检测PDCD4增强卵巢癌对顺铂化疗敏感性的机制,我们首先采用流式细胞术检测PDCD4对顺铂作用后细胞周期的影响,结果显示顺铂能明显诱导SKOV3细胞S期阻滞,这和其他有关顺铂的作用机制的研究报道是相一致的,但是PDCD4过表达对顺铂诱导的细胞周期改变没有明显的影响。进一步,我们通过Hoechst染色和Tunnel染色检测了细胞凋亡,结果显示在相同浓度顺铂作用下,与SKOV3-MOCK对照组（凋亡率为1.5%）相比,PDCD4过表达组SKOV3-PDCD4细胞的核固缩、碎裂明显增多,Tunnel染色流式细胞术检测显示PDCD4过表达组细胞凋亡率（30.1%）明显增高。这些结果说明PDCD4增强卵巢癌对顺铂化疗敏感性的机制主要是通过增强顺铂诱导的细胞凋亡,而对细胞周期的变化没有什么影响。6. PDCD4增强顺铂诱导的凋亡通路主要通过死亡受体通路介导细胞凋亡主要的信号通路分为线粒体通路和死亡受体通路。为了确定PDCD4增强顺铂诱导的凋亡通路,我们通过western blot检测了凋亡相关蛋白caspase-3,8,9以及Bcl-2,Bax的变化。结果显示,在相同浓度顺铂作用下,与SKOV3-MOCK对照组相比,PDCD4过表达组SKOV3-PDCD4细胞的caspase-3和caspase-8活性蛋白表达明显升高,而caspase-9和Bax具有轻微的升高,Bcl-2的表达没有明显变化,免疫组化检测肿瘤切片中的表达也得到了相似结果,提示死亡受体通路可能是PDCD4的主要作用通路。采用caspase-8抑制剂能够逆转PDCD4对顺铂的化疗增敏作用,进一步验证了这个结论。另外,在顺铂作用下,PDCD4过表达能明显上调死亡受体DR5的表达,内源性caspase-8的抑制蛋白c-FLIP-L的表达明显下调,可能是casapse-8活性蛋白升高的原因之一。根据这些结果,我们认为PDCD4主要通过死亡受体介导的凋亡通路促进了顺铂诱导的凋亡,从而增强了卵巢癌细胞对顺铂的化疗敏感性。三、PDCD4在细胞发生自噬过程中的作用及其机制研究尽管我们和其它学者的研究显示PDCD4可能通过诱导细胞凋亡或干扰细胞周期发挥作用,但其作用并不明显,不能完全解释PDCD4对肿瘤的有效抑制。自噬是近几年发现的细胞死亡的另一种形式,故进一步探讨了PDCD4对自噬的影响。1.外源性PDCD4表达抑制卵巢癌细胞发生自噬为了研究PDCD4对细胞自噬的作用,我们在SKOV3中过表达PDCD4之后,用饥饿诱导因素EBSS诱导自噬的发生,检测自噬的标记分子LC3蛋白的表达。结果发现,PDCD4过表达组LC3-Ⅱ明显降低,说明其自噬水平降低。进一步检测体内实验显示空载体和PDCD4表达载体治疗的肿瘤组织中LC3蛋白的表达也得到了相似的结果,说明PDCD4确实具有抑制卵巢癌细胞自噬发生的作用。2. PDCD4敲除后巨噬细胞自噬明显增强为了进一步确定PDCD4在自噬发生中的作用,我们获取了C57和PDCD4-/-小鼠的腹腔巨噬细胞和骨髓来源的巨噬细胞,分别用EBSS, LPS和雷帕霉素诱导自噬的发生,结果都显示PDCD4-/-小鼠的两种来源的巨噬细胞中LC3-Ⅱ表达明显升高。进一步在C57和PDCD4-/-两种小鼠的腹腔巨噬细胞中转染GFP-LC3质粒,LPS诱导自噬之后发现,PDCD4-/-小鼠的巨噬细胞中绿色荧光斑点明显多于C57小鼠,说明自噬小体形成增多,自噬水平升高。通过上述实验,我们得出结论：PDCD4敲除之后,自噬水平明显升高。3. PDCD4抑制LPS诱导的自噬可能是通过p38MAPK通路PDCD4本身可以抑制自噬的发生,PDCD4-/-小鼠的自噬也明显升高,其作用机制是什么呢?我们主要研究PDCD4对LPS诱导的自噬通路的影响,对LPS诱导自噬的几个通路进行了分析。我们通过流式细胞术检测ROS活性,结果发现PDCD4过表达对氧化应激通路没有明显的影响。进一步检测LPS诱导自噬作用下,自噬相关蛋白Beclin-1的表达,结果发现虽然LPS确实可以诱导Beclin-1的表达,但是PDCD4对这种诱导表达没有什么明显的影响,说明PDCD4不是通过ROS和Beclin-1介导的通路影响自噬。进一步探索发现LPS可以诱导磷酸化p38MAPK的表达,并且在PDCD4-/-小鼠的巨噬细胞中,这种诱导作用更加明显,磷酸化p38MAPK的表达明显高于C57小鼠,因此p38MAPK通路可能是PDCD4调控自噬发生的主要通路。结论1. PDCD4在人卵巢癌中表达明显降低甚至缺失,PDCD4的这种表达状态和卵巢癌高的病理级别密切相关。2. PDCD4过表达在体内外均可以抑制卵巢癌的恶性增殖能力。3. PDCD4在体内外都可以增强卵巢癌对顺铂的化疗敏感性。4. PDCD4增强顺铂化疗敏感性的机制主要是通过促进顺铂诱导的细胞凋亡,其通路主要是死亡受体介导的凋亡通路。5. PDCD4具有抑制自噬发生的作用,其作用可能是通过调控与自噬发生相关的p38MAPK通路来实现的。创新性和意义1.发现PDCD4在卵巢癌中表达降低甚至缺失,并且与肿瘤的病理级别密切相关。进一步通过体内外实验证明PDCD4过表达确实具有抑制肿瘤生长和恶性行为的能力,为PDCD4的临床治疗提供了理论和实验依据。2.国内外首次系统地研究了PDCD4与卵巢癌化疗敏感性的关系,并深入阐明了其机制。PDCD4在体内外均能够明显的增强卵巢癌对顺铂的化疗敏感性,其作用机制主要是通过促进顺铂诱导的细胞凋亡,其作用通路主要是死亡受体介导的凋亡通路。此研究不仅深入阐明了PDCD4的作用机制,而且为PDCD4应用与临床化疗药物联合应用提供了更有力的依据。3.国内外首次证明了PDCD4对细胞自噬的影响。细胞自噬是存在于所有细胞的一个广泛现象,生理水平对维持细胞的稳定有重要的作用,自噬失调将会参与很多疾病的发生。我们证明了PDCD4具有抑制自噬发生的作用,这不仅是对PDCD4的功能进行了补充,而且对深入研究很多疾病的发生机制具有重要的意义。研究的局限性1. PDCD4诱导死亡受体表达及降低c-FLIP-L的表达机制还有待于进一步研究。2. PDCD4抑制自噬发生的机制还有待于深入的研究。第二部分PDCD5在卵巢癌中的表达及其临床意义目的程序化死亡因子5基因（PDCD5）是北京大学人类疾病基因研究中心从白血病细胞株TF—1细胞中克隆的新基因。PDCD5蛋白在凋亡过程中不仅表达明显增加,而且在凋亡早期出现明显核转位现象,可能是一种细胞凋亡的早期信号。PDCD5单独不能对细胞产生明显的影响,只有在诱导凋亡的因素的存在下可明显促进凋亡,表明PDCD5是凋亡促进剂,而不是凋亡诱导剂。PDCD5作为促凋亡因子,已经证实在人类某些肿瘤如胃癌、胶质瘤等中表达降低,并且与病人的病理和预后相关,提示PDCD5可能和肿瘤的发生发展相关。但PDCD5在卵巢癌中表达和意义尚未见报道。本研究的目的主要是通过检测PDCD5在卵巢癌细胞系,浆液性囊腺癌、浆液性囊腺瘤以及正常卵巢中的表达水平,分析PDCD5表达与临床病理特征及预后之间的关系,为下一步研究其机制及与PDCD5的关系提供实验基础。方法一. PDCD5在人卵巢癌细胞和组织中的表达1.病例收集：收集山东大学齐鲁医院妇产科2001-2007年间41例浆液性囊腺癌,26例浆液性囊腺瘤,和20例正常对照（取自手术切除卵巢的非卵巢疾病患者）。所有患者手术前未接受任何放、化疗治疗。2.分别用RT-PCR、western blot及免疫组化的方法检测卵巢癌细胞系（SKOV3、CAOV3和OVCAR3）以及上述组织中PDCD5mRNA及蛋白质的表达。二、PDCD5在人卵巢癌组织中表达的临床意义1.利用x2检验及Fisher’s精确概率分析PDCD5表达和浆液性囊腺癌患者的年龄,发病部位,转移情况,病理分级和FIGO分期之间的关系。2.用Kaplan-Meier生存曲线分析PDCD5的表达与卵巢癌患者生存率之间的关系。结果一、PDCD5mRNA和蛋白在人卵巢癌细胞系中的表达为了探讨PDCD5在卵巢癌发生发展中的作用,我们首先用RT-PCR及western blot的方法检测了PDCD5在来源于浆液性囊腺癌的细胞系SKOV3、CAOV3和OVCAR3中的表达。结果显示,OVCAR3中表达较高的PDCD5mRNA和蛋白,SKOV3中表达较低,在CAOV3中虽然mRNA水平相对较高,但是蛋白水平仍然较低,表明在人浆液性囊腺癌细胞系中PDCD5的表达是降低的,提示PDCD5可能在卵巢癌中表达下调。二、PDCD5mRNA和蛋白在人浆液性囊腺癌组织中的表达进一步我们检测了正常卵巢,浆液性囊腺瘤（良性卵巢瘤）和浆液性囊腺癌组织中PDCD5的表达情况,结果显示在mRNA和蛋白水平,浆液性囊腺癌组织中的PDCD5表达下调甚至缺失,而在正常卵巢和浆液性囊腺瘤中均存在中等或高水平的PDCD5表达。进一步我们采用免疫组化的方法检测了20例正常卵巢,26例浆液性囊腺瘤和41例浆液性囊腺癌组织,结果显示所有的正常卵巢和浆液性囊腺瘤中PDCD5的表达都是阳性的,80%（16/20）的正常卵巢组织和76.9%（20/26）的浆液性囊腺瘤组织中PDCD5呈现中度或高度表达,然而,46.3%（19/41）的浆液性囊腺癌组织中呈现PDCD5低表达状态,甚至有22%（9/41）的浆液性囊腺癌组织中没有检测到PDCD5蛋白的表达。这些结果表明,PDCD5在卵巢癌组织中表达下调甚至缺失。三、PDCD5在浆液性囊腺癌的低表达状态和卵巢癌的FIGO分期相关为了进一步确定PDCD5在浆液性囊腺癌中低表达或缺失的临床意义,我们用χ2和Fisher’s精确检验法分析了PDCD5表达水平和患者的年龄,发病部位,转移情况,病理分级和FIGO分期之间的相关性。结果显示,PDCD5的表达水平和其他临床指标都没有明显的相关性,但是和患者的FIGO分期有显着的相关性,PDCD5高表达的比率在FIGO分期Ⅲ期和Ⅳ期病人中为19.2%（5/26）,明显低于其在FIGO分期Ⅰ期和Ⅱ期病人中的比率53.3%（8/15）。这些结果提示PDCD5在卵巢癌中的低表达状态和卵巢癌的进展相关。四、PDCD5在浆液性囊腺癌的低表达或缺失和病人的预后密切相关进一步,我们分析了PDCD5的表达和病人预后之间的关系。根据PDCD5的表达情况将病人分为两组：PDCD5高表达组（3-6分,n=16）,PDCD5低表达组（0-3分,n=14）。将两组的生存时间应用Kaplan-Meier生存曲线及生存率log-rank检验进行分析之后发现,PDCD5高表达患者的生存时间明显长于低表达组（p<0.05）,提示PDCD5的表达水平和患者的预后密切相关。结论1. PDCD5在人卵巢浆液性囊腺癌中表达显着降低甚至缺失。2. PDCD5在卵巢癌中的降低表达和卵巢癌病人的FIGO分期密切相关。3. PDCD5在卵巢癌中的表达水平和病人的预后有显着相关性。创新性和意义1.本研究发现PDCD5在卵巢浆液性囊腺癌中表达降低甚至缺失,并且和患者的FIGO分期密切相关,提出PDCD5可能在卵巢癌的发病中发挥重要作用。2.发现了PDCD5和卵巢癌病人的预后密切相关,为判断病人预后的依据提供了理论基础。并且初步提出PDCD5在卵巢癌发生发展的作用,为进一步研究PDCD5的作用和将来在临床治疗中的应用提供了依据和线索。局限性1. PDCD5对卵巢癌的生长及其恶性行为的影响有待于进一步研究。2. PDCD5在肿瘤中的作用机制至今还不清楚,有待于深入的研究。
舒丹[7]（2011）在《hMLH1基因对人卵巢癌耐药细胞株顺铂敏感性的研究》文中研究说明目的探讨错配修复基因hMLH1对人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP顺铂耐药的逆转作用及其可能的机制。方法（1）在第一部分实验中,对卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP分别用重组质粒pcDNA3.1-hMLH1和空质粒pcDNA3.1进行瞬时转染,并以SKOV3敏感细胞和未转染的SKOV3/DDP作为对照。RT-PCR和Western blot检测耐药细胞内hMLH1 mRNA及蛋白的表达变化。MTT法检测不同浓度顺铂（3.0、6.0、12.0、24.0、48.0μg/ml）对转染前后细胞的生长抑制情况。（2）在第二部分实验中,用流式细胞仪和Hochest染色法检测顺铂（6.0μg/ml）作用下转染前后细胞的凋亡情况。Western-blot检测耐药细胞内bcl-2蛋白的表达变化。结果转染后24h,经RT-PCR和Western blot检测发现, hMLH1mRNA和蛋白的表达水平在SKOV3/DDP细胞中均明显上调,与SKOV3敏感细胞接近,证实转染是成功的。MTT试验结果表明,转染重组质粒后,耐药细胞的IC50值明显降低,显示对顺铂的敏感性增强。流式细胞术和Hochest染色法表明,在顺铂作用下,转染重组质粒的SKOV3/DDP细胞出现了较多的凋亡,凋亡率明显提高。Western blot检测发现,凋亡抑制蛋白bcl-2在SKOV3/DDP细胞中的表达明显强于SKOV3细胞,而在转染hMLH1后SKOV3/DDP细胞中bcl-2蛋白的表达水平明显下调。结论hMLH1基因的成功转染能纠正卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP中该基因的缺失,从而增强耐药细胞对顺铂的敏感性,促进顺铂作用下耐药细胞的凋亡,在一定程度上逆转了人卵巢癌细胞对顺铂耐药。hMLH1基因逆转耐药的机制可能与降低细胞内bcl-2的表达水平有关。
唐兆前[8]（2010）在《卵巢癌耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证与结构和表型变化研究》文中研究指明卵巢上皮癌在妇科恶性肿瘤中致死率最高。手术后,以铂类为基础的联合化疗是其主要的治疗方法。但随着化疗的进行,患者最终获得难以治愈的多药耐药,因而其五年生存率一直徘徊在30-50%。为了更好地认识肿瘤抑制基因在卵巢癌多药耐药中的机制,我们对卵巢癌卡铂耐药基因差异表达谱芯片进行了肿瘤抑制基因的筛选及验证,对相关的肿瘤抑制基因启动子区进行了甲基化检测以及突变基因筛选研究。并在组织标本中进行了临床意义的探讨。第二章卵巢癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证目的:筛选卵巢癌卡铂耐药表达谱基因芯片中卡铂耐药细胞系（SKOV3-CB）较其亲本（SKOV3）细胞系差异表达下调的肿瘤抑制基因,并验证其差异表达。方法:应用分子生物信息学方法,分析卵巢癌卡铂耐药表达谱基因芯片中卵巢癌SKOV3-CB细胞系较SKOV3细胞系差异表达下调两倍以上的基因1554条,筛选肿瘤抑制基因。应用real-time PCR技术对基因芯片中差异表达基因检测验证。结果:从卵巢癌卡铂耐药表达谱基因芯片中筛选出RNASET2,VHL,DLG1,COPS2,NOL7,GGNBP2, RBL1, S100A2, PARG1,PERP,TCF3,DNAJA3,PCGF2,ING1,CYLD,RARRES3,RBBP8等17个肿瘤抑制基因,荧光定量PCR技术差异表达验证结果示:RNASET2,VHL, COPS2,NOL7, RBL1, S100A2, PARG1,PERP,TCF3,DNAJA3, ING1,CYLD,RARRES3,RBBP8等基因差异表达下调,下调倍数分别为24.47、65.24、10.81、21.30、72.94、5.95、27.13、1.57、1.32、12.93、46.8、7.57、14.9、14. 00、23.98。GGNBP2,PCGF2,DLG1等基因差异表达上调,上调倍数分别为5.76,2.19,17.1,基因芯片差异表达结果与real-time PCR所验证表达下降趋势的结果一致率为82.35%,下调两倍以上的基因一致率为64.70%。结论:利用基因芯片技术分析基因差异表达结合real-time PCR对其检测结果验证是一种有效的方法,多肿瘤抑制基因参与卵巢癌卡铂耐药的机制。第三章卵巢癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因甲基化检测目的:探讨卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因启动子区甲基化状态与卵巢癌卡铂耐药表达下调的关系。方法:应用分子生物信息学方法,分析肿瘤抑制基因启动子区CPG岛并设计出引物,采用甲基化特异性PCR（MS-PCR）法或亚硫酸盐测序法（bisulphite sequencing）检测SKOV3-CB、SKOV3中的耐药相关肿瘤抑制基因启动子区甲基化状态。结果:表达下调的14个基因（VHL, COPS2, NOL7,RANSET2, RBL1, S100A2, PARG1, PERP, TCF3, DNAJA3, ING1, RARRES3, RBBP8,CYLD）中,有10个基因（VHL, COPS2, NOL7, RBL1, PARG1, PERP, DNAJA3, ING1, RNASET2,CYLD）启动子区能够设计出引物,其中CYLD未检出结果,后改用亚硫酸盐测序法检测。MS-PCR检测结果显示,SKOV3-CB、SKOV3的ING1、DNAJA3、VHL甲基化引物均能够扩增出产物,未甲基化引物均不能扩增出产物;COPS2、PERP甲基化引物均不能够扩增出产物,未甲基化引物均能够扩增出产物;RNASET2,PARG1、NOL7、RBL1甲基化引物与未甲基化引物均能够扩增出产物,CYLD重亚硫酸盐测序提示在SKOV3-CB及SKOV3细胞系均为未甲基化状态。结论:卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因启动子区无超甲基化,甲基化机制不是引起卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因差异表达下调的原因。第四章卵巢癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因突变检测目的:筛查可能的基因突变,探讨其与卵巢卡铂耐药以及相关肿瘤抑制基因表达下调的关系。方法:以亲本细胞系（SKOV3）为对照,在卵巢癌卡铂耐药细胞系（SKOV3-CB）,应用单链构象多态性分析（SSCP）检测RNASET2,VHL, COPS2, NOL7, PARG1, RBL1, PERP, DNAJA3, ING1, CYLD等10个基因RT-PCR扩增片段的突变。结果:以SKOV3细胞系为对照,在SKOV3-CB细胞系中,SSCP检测发现DNAJA3,PERP基因聚丙烯酰胺电泳带型存在差异;RNASET2,VHL,COPS2, NOL7, PARG1, RBL1,ING1, CYLD等基因未检测到差异带型。经测序发现PERP第三外显子1093,1160,1222位点上分别存在A→G突变;1083位点及1085,1086位点,分别存在T,C,C,碱基缺失。DNAJA3第八个外显子87位点处存在A→T突变。结论:DNAJA3,PERP的基因突变以及PERP基因的碱基缺失与卵巢癌卡铂耐药相关,可能是导致其表达下调的原因,宜进一步深入研究。第五章卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因表达与临床病理的关系的研究目的:探讨卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因表达的临床意义方法:Trizol一步法提取卵巢肿瘤患者卵巢组织总RNA,应用RT-PCR检测85例卵巢组织的RNASET2、VHL、PARG1、CYLD、COPS2、PERP、DNAJA3、ING1、NOL7、RBL1基因mRNA表达,其中卵巢癌49例,卵巢良性组织21例,卵巢正常组织15例。结果: RT-PCR结果显示RNASET2、ING1、PARG 1、RBL1、NOL7基因在正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤组织、卵巢癌组织中均有一定程度表达;VHL、PERP、COPS2、CYLD基因在正常卵巢组织、良性肿瘤中、卵巢癌组织中均有一定程度表达,但在部分卵巢癌组织中表达沉默,分别为4（4/49）、3（3/49）、2（2/49）、32（32/49）例;采用Fisher确切概率法统计分析,提示RNASET2、ING1、PARG 1、RBL1、NOL7、VHL、PERP、COPS2基因在卵巢癌中的表达沉默阳性率与在卵巢正常组织及卵巢良性肿瘤中的表达沉默阳性率比较差异无意义。CYLD、DNAJA3基因在卵巢癌中的表达沉默阳性率与在卵巢良性肿瘤组织与正常卵巢组织中的表达沉默阳性率比较差异有显着意义（P分别为0.00、0.00;0.00,0.00）。VHL等10个基因表达与卵巢癌临床病理的关系Fisher确切概率法统计分析,提示CYLD在FIGO I-II与III-IV期存在差异有意义外（P<0.05）,其余基因差异均无意义（P均>0.05）。Log Rank分析发现卵巢癌组织VHL、PERP、CYLD基因表达阳性患者与阴性患者的生存时间比较,差异均无统计学意义（P分别为0.183、0.493、0.271）。COPS2基因表达阳性患者与阴性患者的生存时间比较,差异有统计学意义（P=0.005）。COX回归模型多因素生存分析提示FIGO分期、病理分级进入模型（P分别为0.045、0.028）;淋巴结转移及COPS2、PERP、CYLD、ING1基因表达沉默等参数均未进入模型（P分别为0.907、0.476、0.754、0.728、0.304）。结论:结论CYLD、DNAJA3基因表达沉默可作为卵巢癌与卵巢良性肿瘤及正常卵巢组织鉴别诊断的一个潜在的指标,COPS2、PERP、CYLD、ING1不能作为卵巢癌独立的预后因素。
吴飞翔[9]（2009）在《核苷酸切除修复基因多态性与卵巢癌铂类药物耐药相关性研究》文中研究指明卵巢上皮癌是妇科恶性肿瘤中发病率占第三位,死亡率却居第一的恶性疾病。由于卵巢解剖上隐匿于盆腔深处,在发病早期缺乏特异性症状和体征,很难在早期发现和诊断,约60%-70%的卵巢癌患者确诊时已属于晚期。近30年来,虽然经过全世界妇科肿瘤专家的不懈努力,不断改进手术方式、现更新更好的化疗药物和增加新的化疗方案,但是5年生存率一直徘徊在20%-30%左右。铂类药物是治疗卵巢癌、肺癌等实体瘤的常用药物,而DNA损伤修复能力增强是导致卵巢癌铂类耐药的主要原因之一, DNA修复途径中的核苷酸切除修复、错配修复、碱基切除修复等均与铂类药物耐药有关,而核苷酸切除修复（NER）通路被认为是机体内修复DNA损伤的最主要途径。NER通路主要基因有:①DNA损伤的识别:涉及XPA、XPC等基因;②损伤部位DNA链的打开:由TFIIH的亚基ERCC3/XPB和ERCC2/XPD解旋酶打开DNA双链;③寡核苷酸链的切断:XPG和XPF-ERCC1复合体分别在损伤部位的3’端和5’端切断DNA单链;④PCNA、RPA等基因完成缺损部位单链片段的再合成和修补缺口。其中,损伤的识别/切除是通路中的限速或调节环节。在通路中,各个基因发挥着相应的独特作用,并按照严格的顺序加入和置换出NER过程,其中任何一个基因的功能异常即可导致整个通路对损伤修复的效率。目前国内尚未见有关DNA修复基因ERCC1、XPA、XPC、XPD、XPG与卵巢癌铂类药物敏感性的关系的报道,为了了解ERCC1、XPA、XPC、XPD、XPG等基因与卵巢癌铂类药物化疗敏感性的关系,我们在本实验中应用PCR及测序方法筛查ERCC1、XPA、XPC、XPD、XPG外显子单核苷酸多态性在卵巢癌耐铂类药物的细胞株和敏感细胞株中的分布差异,探讨了XPGHis46His及XPGHis1104Asp的多态基因型102例卵巢癌患者化疗敏感性的关系,并通过构建人XPG基因的shRNA表达载体,转染卵巢癌SKOV3耐DDP细胞,检测其对XPG基因的干扰效率。继而筛选出稳定干扰的细胞株,进行一系列功能实验,以了解XPG在卵巢癌耐药细胞株中的作用。为提高卵巢癌铂类药物化疗敏感性提供一些的实验依据。卵巢上皮癌铂类耐药与非耐药细胞间核苷酸切除修复酶类基因多态性的检测与比较目的:肿瘤细胞对铂类药物的化疗敏感性与个体的DNA损伤修复能力关系密切, ERCC1、XPA、XPC、XPD、XPG基因是核苷酸切除修复系统（ nucleotide excision repair,NER）中与铂类药物抵抗有关的关键因子,本实验拟筛查ERCC1、XPA、XPC、XPD、XPG遗传多态与卵巢癌耐铂类药物的细胞株的关系,为下一步实验打下基础。方法:应用PCR及测序方法筛查ERCC1、XPA、XPC、XPD、XPG外显子单核苷酸多态性在卵巢癌耐铂类药物的细胞株和敏感细胞株中的分布差异,序列读解采用ChromaS软件,并结合NCBISNP数据库寻找和验证SNP位点,筛选出的SNP用于下一步实验。结果: DNA测序分析发现XPGHis46His及XPGHis1104Asp两个SNP位点在细胞株中存在分布差异。结论:核苷酸切除修复系统中XPGHis46His及XPG His1104Asp遗传多态可能与卵巢癌患者对铂类药物耐药性相关。XPG遗传多态与卵巢癌患者铂类药物敏感性关系目的:研究核苷酸切除修复基因XPG单核苷酸多态性与卵巢癌患者对铂类药物敏感性的关系。方法:对接受含铂类药物化疗的102例晚期卵巢癌患者进行临床疗效评价。以聚合酶链-限制性片段长度多态性（ PCR- RFLP）的方法检测接受含铂类药物化疗的102例卵巢癌患者XPGHis46His及XPG His1104Asp的多态基因型,并比较不同基因型与化疗敏感性的关系。结果: His1104Asp多态在卵巢癌铂类药物化疗敏感组中分布与耐药组差异不显着。XPGHis46His在化疗敏感组T/T,T/C,C/C的基因型频率明显高于耐药组,二者差异有统计学意义（p=0.016）,与携带XPG46T/T基因型比较,携带至少一个46C等位基因（即T/C和C/C基因型）的卵巢癌患者对铂类药物化疗敏感可能性增加3.096倍（95%CI:1.330-7.208）。XPG His46His及His1104Asp基因多态与临床病理特征之间的比较差异无显着意义（P>0.05）。T/T基因型组生存期短于T/C+C/C基因型组,差异有统计学意义（P<0.05）;COX风险比例回归模型结果显示病理分级是卵巢癌患者的独立预后因素（P<0.05）。结论:核苷酸切除修复系统中XPGHis46His遗传多态可能与卵巢癌患者对铂类药物敏感性相关。RNAi阻断XPG基因表达对卵巢上皮性癌细胞顺铂耐药性影响的体外实验研究目的:通过构建人XPG基因的shRNA表达载体,转染卵巢癌SKOV3耐DDP细胞,检测其对XPG基因的干扰效率。继而筛选出稳定干扰的细胞株,进行一系列功能实验,以了解XPG在卵巢癌耐药细胞株中的作用。方法:针对XPG mRNA的不同区域构建了不同的siRNA载体,应用脂质体法转染SKOV3耐DDP细胞,实时定量PCR检验干扰效率,选择抑制率最高的siRNA构建shRNA表达载体,转染SKOV3耐DDP细胞,G418筛选后经western-blot鉴定确认获得稳定转染的SKOV3耐DDP细胞株,然后进行细胞生长特性、细胞周期变化、细胞药敏试验及细胞内药物浓度的实验。结果:用荧光定量PCR对不同siRNA干扰载体的干扰效果进行检测,实验结果显示:在XPG-733组XPG的相对拷贝数为1.050±0.0230,与对照组相比有统计学意义,抑制率为52.05%。构建shRNA表达载体转染SKOV3耐DDP细胞,获得的该组稳定干扰表达株,western-blot检验其XPG蛋白表达明显减少。流式细胞仪对细胞检测结果显示实验组处于增殖状态（S+G2+M）的细胞为34%,G1期为66%,阴性对照组则相应为41.3%和58.7 %,其处于增殖周期的细胞有减少的趋势。实验组与阴性对照组的IC50差别有均统计学意义（P<0.05）,经化疗药处理后,用高效液相色谱仪检测其细胞内药物浓度,实验组细胞内药物浓度低于对照组细胞（P<0.05）。结论:采用构建shRNA表达载体对XPG基因进行干扰,SKOV3耐DDP细胞的生长特性、细胞周期无明显变化。干扰后SKOV3耐DDP细胞对顺铂的化疗耐药性明显下降,我们推测这种改变可能与促进细胞对DNA-DDP加合物切除修复能力下降相关。
冯同富[10]（2008）在《卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间差异表达蛋白与基因的筛选鉴定研究》文中提出卵巢上皮癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤。临床上,以铂类为基础的联合化疗是其最重要和最主要的治疗方法。尽管在化疗的最初阶段,卵巢上皮癌对抗癌药物表现出较好的敏感性,但是随着化疗的进行其逐渐获得多药耐药性,因而其五年生存率一直徘徊在30—50%。为了更好的认识卵巢癌的多药耐药机制,我们用卡铂对卵巢浆液性囊腺癌细胞SKOV3进行间断、大剂量冲击,建立了卵巢癌耐药细胞株SKOV3/CB,并且从蛋白和基因两个水平筛选、鉴定了两种细胞间的差异分子。第一部分:卵巢上皮癌铂类耐药细胞株相关生物学指标的检测验证研究目的:对铂类耐药细胞株SKOV3/CB进行相关生物学指标的检测验证。方法:MTT法检测SKOV3/CB对卡铂的耐药指数及对CTX、5-FU、ADM、VP-16、泰素和DDP的交叉耐药性;采用21天细胞计数法绘制细胞的生长曲线并计算其倍增时间;流式细胞术检测细胞的凋亡率和周期分布。结果:SKOV3/CB对卡铂的RI为3.09,对CTX、VP-16、泰素和DDP有不同程度的耐药性,但对5-FU和ADM仍然敏感;同SKOV3相比其凋亡率和S期细胞明显增加,但生长速度却显着降低。结论:SKOV3/CB表现出典型的多药耐药特征,该耐药模型十分稳定达到了后续的蛋白和基因实验的实验要求。第二部分:卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间差异表达蛋白筛选鉴定研究研究目的:比较卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间的蛋白表达差异,并进行相关蛋白的筛选和鉴定。方法:提取卵巢癌耐卡铂细胞SKOV3/CB和亲本细胞SKOV3的总蛋白,用蛋白二维液相分离色谱技术(ProtemeLabTMPF-2D)总蛋白进行分级分离,然后用其自带的Proteovue和Deltavue分析软件进行两种细胞间差异蛋白的筛选;用电喷雾离子化串联质谱（ESI-MS/MS）结合数据库比对进行差异蛋白的鉴定。结果:共分离筛选出差异蛋白54个,其中SKOV3/CB表达上调的34个,SKOV3表达上调的20个。鉴定出SKOV3/CB比SKOV3表达上调的差异蛋白15个,即人假想镁离子转运体（humanputative magnesium transporter protein,HPT）、人亮氨酸拉链样蛋白（Leucinezipper-like protein）、超氧化物歧化酶-1（Superoxide dismutase,SOD-1）、硫氧还原蛋白（Thioredoxin,Trx）、Immunoglobulin heavy chain variable region、SMYD2、周期蛋白依赖激酶6抑制因子（cyclin-dependent kinase 6 inhibitor）、MYL9（Myosinregulatory light polypeptide 9）、垂体腺苷酸环化酶促多肽（pituitary adenylatecyclase-activating polypeptide,PACAP）、stanniocalcin homolog、G蛋白信号通路的调节因子（human regulator of G-protein signalling,RGS）、T cell receptor betachain、TADAl protein和AX887247 NID。这些蛋白涉及离子转运、信号转导、氧化还原、增殖分化、免疫、甲基化、周期和凋亡调控等多方面。结论:PF-2D结合ESI-MS/MS是一种进行能够差异蛋白筛选、鉴定的有效方法。鉴定出的蛋白通过多种复杂机制介导了卵巢癌对铂类的耐药性的产生,这些蛋白有可能成为疗效预测分子或新的治疗靶标。第三部分:卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间差异表达基因筛选鉴定研究研究目的:比较卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间的基因表达差异,并进行相关基因的筛选和鉴定。方法:采用人类全基因组表达谱芯片对卵巢癌耐卡铂细胞SKOV3/CB和亲本细胞SKOV3进行差异基因的筛选和分析;用半定量逆转录聚合酶联反应（RT-PCR）对芯片结果进行核对验证。结果:共分离筛选出差异基因3506个,SKOV3/CB比SKOV3上调的差异基因共有1712个,其中上调10倍以上的共有163个,SKOV3比SKOV3/CB上调的差异基因共有1794个,其中上调10倍以上的共有70个。SKOV3/CB比SKOV3上调10倍以上的6个差异基因,即ANXA6、UGDH、ZNF198、ERCC5、TWIST2和BIRC3经半定量RT-PCR验证,表明上述6个基因在耐药细胞株中的表达的确高于敏感细胞株,证明基因芯片的结果是可信的。结论:基因芯片是分析肿瘤差异基因的一种高通量的强有力工具。卵巢癌的多药耐药是一个多种基因参与的复杂过程。
二、拓扑替康与顺铂对bcl-2及fas在卵巢癌细胞系3AO及其耐药系3AO/cDDP表达的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、拓扑替康与顺铂对bcl-2及fas在卵巢癌细胞系3AO及其耐药系3AO/cDDP表达的影响（论文提纲范文）
（1）PGC1α通过HSP70/HK2/VDAC1途径参与卵巢癌顺铂耐药机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 卵巢癌与顺铂耐药 |
| 1.1.1 卵巢癌的概述 |
| 1.1.2 卵巢癌的治疗 |
| 1.1.3 卵巢癌顺铂耐药机制 |
| 1.2 线粒体生物合成与癌症 |
| 1.2.1 线粒体生物合成 |
| 1.2.2 PGC1α与线粒体生物合成 |
| 1.2.3 PGC1α与癌症 |
| 1.3 HK2与肿瘤生存 |
| 1.3.1 HK2与癌症 |
| 1.3.2 HK2与VDAC1的结合在癌症进展中的作用 |
| 1.4 热休克蛋白70 |
| 1.4.1 HSP70与线粒体 |
| 1.4.2 HSP70与癌症 |
| 第2章 实验部分 |
| 2.1 特异性敲减PGC1α增加卵巢癌细胞对顺铂的敏感性 |
| 2.1.1 前言 |
| 2.1.2 材料与方法 |
| 2.1.3 实验结果 |
| 2.1.4 小结 |
| 2.2 HK2是PGC1α调节MPTP促进卵巢癌顺铂耐药的关键分子 |
| 2.2.1 前言 |
| 2.2.2 材料与方法 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 2.2.4 小结 |
| 2.3 HSP70是PGC1α介导线粒体HK2调节MPTP的分子伴侣 |
| 2.3.1 前言 |
| 2.3.2 材料与方法 |
| 2.3.3 实验结果 |
| 2.3.4 小结 |
| 第3章 讨论 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）USP48在卵巢癌化疗耐药中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 一、前言 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 卵巢癌流行病学统计 |
| 1.2 卵巢癌分类与治疗 |
| 1.3 化疗耐药机制研究 |
| 1.4 DUB在肿瘤中的研究 |
| 1.5 USP48研究现状 |
| 2 研究目的及方向 |
| 2.1 研究目的 |
| 2.2 研究方向 |
| 3 研究结果 |
| 二、材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 菌株、质粒与载体构建 |
| 1.3 相关引物序列 |
| 1.4 试剂盒 |
| 1.5 抗体 |
| 1.6 常用试剂 |
| 1.7 仪器设备 |
| 1.8 实验动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 数据库临床数据分析 |
| 2.2 分子生物学实验 |
| 2.3 细胞实验 |
| 2.4 Western Blot实验 |
| 2.5 动物实验 |
| 2.6 免疫组化及芯片数据分析 |
| 2.7 内源IP |
| 2.8 Co-IP实验 |
| 2.9 数据的获取及分析 |
| 三、研究结果 |
| 1 USP48高表达与卵巢癌化疗耐药显着相关 |
| 2 USP48敲降及过表达细胞的筛选 |
| 3 敲降USP48表达增加了卵巢癌细胞对卡铂的敏感性 |
| 4 敲降USP48表达显着减弱卵巢癌细胞的侵袭迁移能力 |
| 5 敲降USP48表达对细胞的增殖无明显影响 |
| 6 过表达USP48不影响卵巢癌细胞对卡铂的敏感性及侵袭迁移能力 |
| 7 敲降USP48表达增加体内卵巢癌细胞对卡铂的敏感性 |
| 8 敲降USP48表达显着抑制卵巢癌细胞体内腹腔转移 |
| 9 USP48促卵巢癌耐药及转移的机制探索 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 六、参考文献 |
| 七、致谢 |
| 八、附录 |
（3）MiR-34a通过调控HDAC1抑制卵巢癌细胞增殖和顺铂耐药性机制的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 MiR-34a在不同卵巢组织中的表达及意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 组织标本 |
| 1.2 主要试剂、仪器品牌及来源 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 组织中总RNA的提取 |
| 2.2 RNA质量检测 |
| 2.3 逆转录 |
| 2.4 实时荧光定量检测 |
| 2.5 统计学分析 |
| 实验结果 |
| 1 MiR-34a在卵巢肿瘤及正常卵巢组织中的表达 |
| 2 卵巢癌组织中miR-34a表达与多种临床病理特征的关系 |
| 实验讨论 |
| 实验结论 |
| 第二部分 miR-34a对卵巢癌细胞的增殖能力及顺铂耐药性作用的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器和耗材 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞复苏、传代及冻存 |
| 2.2 体外抗药性细胞模型SKOV3cp的建立 |
| 2.3 细胞转染 |
| 2.4 实时定量PCR |
| 2.5 MTT细胞增殖检测 |
| 2.6 统计学分析 |
| 实验结果 |
| 1 miR-34a模拟物对卵巢癌细胞存活率的影响 |
| 2 miR-34a模拟物对卵巢癌细胞集落形成的影响 |
| 3 miR-34a抑制物对卵巢癌细胞生长抑制的影响 |
| 4 miR-34a抑制物对卵巢癌细胞集落形成的影响 |
| 5 SKOV3和SKOV3cp细胞中的miR-3 4a的表达水平 |
| 6 短期顺铂(浓度4 μg/m1+48h)处理对miR-34a表达的影响 |
| 7 miR-34a过表达对于顺铂处理抗药性的影响 |
| 8 miR-34a表达抑制对于顺铂处理抗药性的影响 |
| 实验讨论 |
| 实验结论 |
| 第三部分 HDAC1对于miR-34a的靶标功能及对细胞增殖和顺铂耐药性作用的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器和耗材 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞转染 |
| 2.2 实时定量PCR |
| 2.3 MTT细胞增殖检测 |
| 2.4 荧光素酶活性检测 |
| 2.5 免疫印迹分析 |
| 2.6 TargetScan软件分析heat map |
| 2.7 计学分析 |
| 实验结果 |
| 1 miR-34a疑似基因筛选与分析 |
| 2 miR-34a对HDAC1表达的抑制作用 |
| 3 卵巢癌细胞HDAC1表达特性以及与miR-34a的调控关系 |
| 4 HDAC1基因表达对卵巢癌细胞活性影响 |
| 5 HDAC1基因表达对顺铂药物在卵巢癌细胞灵敏性影响 |
| 6 HDAC1过表达对miR-34a转染的SKOV3和SKOV3 cp细胞增殖的影响 |
| 实验讨论 |
| 实验结论 |
| 研究不足 |
| 创新点与前景展望 |
| 综述: MicroRNAs与卵巢癌研究进展 |
| 综述一 MicroRNAs对卵巢癌细胞的增殖及化疗耐药的影响 |
| 综述二 MiR-34a与卵巢癌细胞的增殖、侵袭及迁移的影响 |
| 综述三 MiR-34a对卵巢癌细胞的化疗耐药的影响 |
| 综述四 MiR-34a与肿瘤治疗 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文 |
（4）二氢叶酸还原酶与卵巢上皮癌多药耐药关系的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 卵巢癌多药耐药的研究进展(文献综述) |
| 1.卵巢上皮癌一线化疗模式及存在的问题 |
| 1.1 卵巢上皮癌一线化疗方案选择 |
| 1.2 一线化疗方案总体疗效评价 |
| 1.3 卵巢上皮癌一线化疗存在的问题 |
| 2.卵巢癌多药耐药的概念 |
| 3.卵巢癌多药耐药的临床表现 |
| 4.卵巢癌多药耐药的诊断 |
| 4.1 血清CA125对卵巢癌多药耐药的诊断价值 |
| 4.2 血清HE4对卵巢癌多药耐药的诊断价值 |
| 4.3 其他肿瘤标志物 |
| 5.卵巢癌多药耐药发生的机理 |
| 5.1 卵巢癌多药耐药发生的相关临床病理因素 |
| 5.2 影响卵巢癌一线化疗疗效的相关临床病理因素 |
| 5.3 卵巢癌多药耐药发生的分子机理 |
| 5.3.1 细胞内化疗药物的外排机制 |
| 5.3.2 细胞内化疗药物代谢解毒增加 |
| 5.3.3 细胞内DNA修复增加 |
| 5.3.4 信号传导通路障碍的机制 |
| 5.3.5 细胞凋亡异常的机制 |
| 5.3.6 其它机制 |
| 6.卵巢癌多药耐药的治疗 |
| 6.1 降低卵巢癌多药耐药发生的化疗对策探索 |
| 6.1.1 一线标准方案中加入其它化疗药物的RCT结果 |
| 6.1.2 一线标准方案用药途径改变的RCT结果 |
| 6.1.3 一线标准方案用药时间及强度改变的RCT结果 |
| 6.1.4 一线标准化疗完成后巩固化疗的RCT结果 |
| 6.1.5 术前新辅助化疗的RCT结果 |
| 6.2 卵巢癌多药耐药的预防 |
| 6.3 卵巢癌多药耐药的临床分型及治疗目的 |
| 6.4 卵巢癌多药耐药的手术治疗 |
| 6.4.1 卵巢癌多药耐药患者手术的适应征与禁忌征 |
| 6.4.2 卵巢癌多药耐药患者手术的主要方式与疗效评价 |
| 6.4.3 影响卵巢癌多药耐药患者手术疗效的临床病理因素 |
| 6.5 卵巢癌多药耐药的化疗 |
| 6.5.1 卵巢癌多药耐药患者化疗的适应征与禁忌征 |
| 6.5.2 单纯的CA125升高是否适合化疗 |
| 6.5.3 卵巢癌多药耐药患者化疗的方案选择与疗效评价 |
| 6.5.4 影响卵巢癌多药耐药患者化疗疗效的临床病理因素 |
| 6.6 卵巢癌多药耐药的靶向治疗 |
| 6.6.1 EGFR(表皮生长因子受体)拮抗剂 |
| 6.6.2 血管生长阻滞剂（贝伐单抗等） |
| 6.6.3 信号转导抑制剂 |
| 6.6.4 抗FRA人源化单克隆抗体 |
| 6.6.5 mTOR抑制剂 |
| 6.6.6 PARP抑制剂 |
| 6.6.7 DNA甲基转化酶抑制剂 |
| 6.7 卵巢癌多药耐药的其它治疗 |
| 6.7.1 抗肿瘤MDR基因治疗 |
| 6.7.2 多药耐药的逆转耐药治疗 |
| 7.二氢叶酸还原酶与肿瘤多药耐药关系的研究 |
| 7.1 二氢叶酸还原酶结构与生物学作用 |
| 7.2 二氢叶酸还原酶与肿瘤多药耐药的关系 |
| 7.3 二氢叶酸还原酶抑制剂的研究 |
| 8.本研究的目的和意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 卵巢癌组织中二氢叶酸还原酶基因的表达及临床意义 |
| 1.材料及方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 组织标本 |
| 1.1.2 载体及菌株 |
| 1.1.3 实验主要的仪器设备 |
| 1.1.4 主要试剂 |
| 1.1.5 部分试剂的配置 |
| 1.1.6 用具处理 |
| 1.1.7 引物的设计 |
| 1.2 实验方法及步骤 |
| 1.2.1 卵巢组织总RNA提取 |
| 1.2.2 cDNA合成 |
| 1.2.3 DHFR及GAPDH基因扩增(RT—PCR) |
| 1.2.4 PCR产物的纯化与回收 |
| 1.2.5 回收的PCR产物与EZ-Blunt载体连接 |
| 1.2.6 感受肽大肠杆菌DH-5α的制备 |
| 1.2.7 连接产物转化至感受态DH-5α |
| 1.2.8 挑选阳性克隆 |
| 1.2.9 质粒DNA小提 |
| 1.2.10 检测连接是否成功 |
| 1.2.10.1 PCR法 |
| 1.2.10.2 测序 |
| 1.2.11 测序结果序列分析 |
| 1.2.12 制备标准品 |
| 1.2.13 实时荧光定量PCR |
| 1.2.14 数据整理 |
| 1.2.15 统计分析 |
| 1.2.16 PCR检测基因突变 |
| 2.结果 |
| 2.1 DHFR基因和重组GAPDH基因质粒构建结果 |
| 2.2 实时荧光定量PCR检测卵巢癌DHFR mRNA的标准曲线与融解曲线的建立 |
| 2.3 DHFR测定的实时荧光扩增熔解曲线 |
| 2.4 各类卵巢组织中DHFR mRNA表达量的比较 |
| 2.5 卵巢癌组织中DHFR mRNA表达量与其临床病理因素的关系 |
| 2.6 卵巢癌患者组织中DHFR mRNA表达量与其转移关系 |
| 2.7 卵巢癌组织DHFR mRNA表达含量及其治疗疗效和耐药的相关性 |
| 2.8 卵巢癌组织中DHFR mRNA表达与其预后的关系 |
| 2.9 PCR检测耐药患者及敏感患者的基因突变 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 二氢叶酸还原酶基因表达上调对卵巢上皮癌细胞生物学特性的影响的体外实验研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1质粒与菌株、细胞 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 仪器 |
| 1.1.4 试剂的配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 DHFR慢病毒表达系统的构建 |
| 1.2.1.1 DHFR全长的扩增及回收 |
| 1.2.1.2 PCR产物的纯化和回收 |
| 1.2.1.3 DHFR的定量 |
| 1.2.1.4 载体的准备 |
| 1.2.1.4.1 PmeI酶切pWPI |
| 1.2.1.4.2 pWPI去磷酸化 |
| 1.2.1.5 DHFR与pWPI的连接 |
| 1.2.1.6 连接产物转化大肠杆菌DH-5α |
| 1.2.1.7 挑选阳性克隆 |
| 1.2.1.8 重组质粒的初步鉴定 |
| 1.2.1.9 质粒DNA的提取 |
| 1.2.1.10 重组质粒的PCR鉴定 |
| 1.2.1.11 重组质粒的测序 |
| 1.2.1.12 测序结果的序列分析 |
| 1.2.2 DHFR-pWPI转染293T细胞 |
| 1.2.3 病毒滴度测定 |
| 1.2.4 不同卵巢癌细胞株DHFR的表达量 |
| 1.2.5 病毒颗粒感染SKOV3细胞 |
| 1.2.6 转染效率的检测 |
| 1.2.7 慢病毒介导SKOV3细胞DHFR表达前后细胞中DHFR含量的变化 |
| 1.2.7.1 荧光定量PCR(2~(-△△Ct)法)检测三组细胞中DHFR的含量 |
| 1.2.7.2 Western Blot检测三组细胞中DHFR的含量 |
| 1.2.8 慢病毒介导SKOV3细胞DHFR表达前后细胞耐药性的生物学影响实验 |
| 1.2.8.1 MTT法检测IC50 |
| 1.2.8.2 不同药物浓度、不同时间段的凋亡变化 |
| 1.2.8.3 IC50顺铂浓度6.0(Vg/mO不同时间段的周期变化 |
| 1.2.8.4 不同药物浓度.不同时间段的细胞内外的铂类药物浓度变化 |
| 1.2.8.5 不同时间段的IC50药物浓度的超微结构变化 |
| 2.结果 |
| 2.1 重组质粒DHFR-pWPI PCR电泳结果 |
| 2.2 重组质粒DHFR-pWPI PCR测序结果 |
| 2.3 不同卵巢癌细胞株DHFR的表达量 |
| 2.4 DHFR-pWPI转染293T细胞结果 |
| 2.5 病毒滴度测定结果 |
| 2.6 病毒颗粒转染SKOV3细胞 |
| 2.7 转染效率的检测 |
| 2.8 慢病毒介导SKOV3细胞DHFR表达前后细胞中DHFR含量的变化 |
| 2.9 慢病毒介导SKOV3细胞DHFR表达前后细胞耐药性的生物学影响实验 |
| 2.9.1 MTT法检测IC50 |
| 2.9.2 不同药物浓度.不同时间段的凋亡变化 |
| 2.9.3 IC50顺铂浓度(6.0μg/ml)不同时间段的周期变化 |
| 2.9.4 不同药物浓度.不同时间段的细胞内外的铂类药物浓度变化 |
| 2.9.5 不同时间段的IC50药物浓度的超微结构变化 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 siRNA沉默DHFR基因对卵巢上皮癌生物学特性影响体外实验研究 |
| 第一节 RNA干扰质粒载体的构建及鉴定 |
| 1 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 干扰细胞系的选择 |
| 1.2.2 脂质体介导的DHFR-siRNA的转染 |
| 1.2.3 构建DHFR-pGPU6载体重组质粒 |
| 1.2.4 DHFR-pGPU6-768转染SKOV3细胞 |
| 1.2.5 携带干扰重组质粒的SKOV3细胞的筛选 |
| 1.2.6 携带干扰重组质粒的SKOV3细胞的克隆 |
| 1.2.7 RT-PCR及western-blot检测干扰效果的表达 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同种类卵巢癌细胞的DHFR基因表达情况 |
| 2.2 转染条件的确定 |
| 2.3 DHFR-pGPU6-768siRNA表达载体构建结果 |
| 2.4 DHFR-pGPU6-768载体转染SKOV3细胞结果 |
| 2.5 荧光PCR检测干扰后三种不同细胞株的DHFR表达量 |
| 2.6 DHFR-pGPU6-768-SKOV3和pGPU6-SKOV3细胞筛选 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 DHFR慢病毒干扰载体的构建及其在卵巢上皮癌细胞中的生物学特性影响 |
| 1 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒与菌株、细胞 |
| 1.1.1.1 质粒 |
| 1.1.1.2 试剂 |
| 1.1.1.3 仪器 |
| 1.2 实验方法及步骤 |
| 1.2.1 实验总流程 |
| 1.2.1.1 siRNA 靶点设计 |
| 1.2.1.2 合成单链DNA oligo |
| 1.2.1.3 引物退火形成带双链DNA oligo |
| 1.2.1.4 pGCSIL/GFP质粒载体的线性化 |
| 1.2.2 重组pGCSIL/GFP质粒载体的构建和扩增 |
| 1.2.3 DHFR-PGCSIL/GFP转染 |
| 1.2.4 病毒滴度测定 |
| 1.2.5 不同卵巢癌细胞株DHFR的表达量 |
| 1.2.6 病毒颗粒感染SKOV3细胞 |
| 1.2.6.1 MOI值的预测 |
| 1.2.6.2 感染步骤 |
| 1.2.6.3 转染效率的检测 |
| 1.2.7 慢病毒干扰SKOV3细胞DHFR表达前后细胞中DHFR含量的变化 |
| 1.2.7.1 荧光定量PCR(2~(-△△Ct)法)检测三组细胞中DHFR的含量 |
| 1.2.7.2 Western Blot检测三组细胞中DHFR的含量 |
| 1.2.8 慢病毒干扰SKOV3细胞DHFR表达前后细胞耐药性的生物学影响实验 |
| 1.2.8.1 MTT法检测IC50 |
| 1.2.8.2 不同药物浓度.不同时间段的凋亡变化 |
| 1.2.8.3 IC50顺铂浓度(4.4μg/ml)不同时间段的周期变化 |
| 1.2.8.4 不同时间段的IC50药物浓度的超微结构变化 |
| 1.2.8.5 不同药物浓度.不同时间段的细胞内外的铂类药物浓度变化 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 pGCSIL/GFP质粒载体酶切图及构建图 |
| 2.2 RNAi重组质粒测序结果 |
| 2.3 慢病毒包装图及病毒滴度的测定 |
| 2.4 病毒颗粒感染SKOV3细胞 |
| 2.5 不同卵巢癌细胞株DHFR的表达量 |
| 2.6 转染效率的检测 |
| 2.7 慢病毒干扰SKOV3细胞DHFR表达前后细胞中DHFR含量的变化 |
| 2.8 慢病毒干扰SKOV3细胞DHFR表达前后细胞耐药性的生物学影响实验 |
| 2.8.1 MTT法检测不同时间段的IC50 |
| 2.8.2 不同药物浓度.不同时间段的凋亡变化 |
| 2.8.4 IC50顺铂浓度(4.4μg/ml)不同时间段的周期变化 |
| 2.8.5 不同时间段的IC50药物浓度的超微结构变化 |
| 2.8.6 不同药物浓度.不同时间段的细胞内外的铂类药物浓度变化 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 全文创新点 |
| 本研究存在的问题 |
| 第五章 二氢叶酸还原酶与卵巢癌多药耐药关系研究的进一步计划 |
| 1.立题依据 |
| 2.研究内容 |
| 3.技术路线 |
| 4.本项目的特色与创新之处 |
| 5.研究的基础与可行性 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（5）WWOX与P73a基因慢病毒表达载体的构建及其在卵巢癌细胞中的表达（论文提纲范文）
| 主要缩略词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞和质粒 |
| 1.2 主要试剂和引物 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 部分试剂的配置 |
| 2 方法 |
| 2.1 获得WWOX,P73a基因 |
| 2.1.1 引物设计 |
| 2.1.2 聚合酶链反应(PCR) |
| 2.1.3 鉴定PCR产物 |
| 2.2 WWOX-PEGM-T和P73a-PEGM-T质粒的构建 |
| 2.2.1 PCR产物的纯化与回收 |
| 2.2.2 WWOX、P73a基因片段与PEGM-T easy载体的连接 |
| 2.2.3 连接产物的转化 |
| 2.2.4 TA克隆的酶切鉴定 |
| 2.3 WWOX、P73a基因片段的亚克隆 |
| 2.3.1 亚克隆原理 |
| 2.3.2 载体片段与WWOX、P73a基因片段的获得 |
| 2.3.3 慢病毒载体与目的基因片段连接 |
| 2.3.4 重组亚克隆的鉴定 |
| 2.4 重组慢病毒的包装、浓缩及滴度测定 |
| 2.4.1 WWOX-PCDH、P73a-PCDH分别转染293T细胞包装并浓缩慢病毒颗粒 |
| 2.4.2 病毒滴度测定 |
| 2.5 慢病毒介导的人卵巢癌细胞(PEO1)WWOX、P73a的表达 |
| 2.5.1 介导细胞系的选择 |
| 2.5.2 慢病毒介导的人卵巢癌细胞(PEO1)WWOX、P73a的表达 |
| 2.5.3 检测感染效率 |
| 2.5.4 慢病毒介导感染PEO1细胞后WWOX、P73a mRNA表达测定 |
| 2.5.5 慢病毒介导感染PEO1细胞后其WWOX、P73a蛋白表达测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 WWOX及P73a基因片段的扩增 |
| 3.2 TA克隆质粒酶切鉴定结果 |
| 3.3 慢病毒重组质粒酶切鉴定结果 |
| 3.4 慢病毒重组质粒WWOX-PCDH、P73a-PCDH PCR测序及比对结果 |
| 3.5 四质粒包装系统转染293T细胞GFP表达及病毒滴度测定 |
| 3.5.1 WWOX-PCDH转染293T细胞结果 |
| 3.5.2 慢病毒滴度测定结果 |
| 3.6 重组慢病毒介导感染PEO1细胞后GFP的表达与感染效率 |
| 3.7 鉴定慢病毒颗粒Lenti WWOX与Lenti P73a感染卵巢癌PEO1细胞后表达 |
| 3.7.1 感染慢病毒颗粒后各组PEO1细胞mRNA表达结果 |
| 3.7.2 感染慢病毒颗粒后各组PEO1细胞Western Blotting表达情况 |
| 4 讨论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）抑癌基因PDCD4和PDCD5在卵巢癌中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 PDCD4在卵巢癌中的作用及其机制 |
| 第一节 PDCD4在人卵巢癌中的表达状态及其作用 |
| 前言 |
| 一、PDCD4的发现和生物学特点 |
| 二、PDCD4与肿瘤发生的关系 |
| 三、研究目的 |
| 材料 |
| 方法 |
| 一、卵巢癌细胞系的培养 |
| 二、RT-PCR |
| 三、Western blot |
| 四、免疫组化 |
| 五、外源性PDCD4转染卵巢癌细胞系及稳定克隆的建立 |
| 六、PDCD4对卵巢癌细胞在裸鼠体内成瘤能力的影响 |
| 七、统计学分析 |
| 结果 |
| 一、PDCD4在人卵巢癌细胞系和原发卵巢癌组织中的表达 |
| 二、外源性PDCD4的表达能够明显抑制卵巢癌细胞的生长及克隆形成能力 |
| 三、外源性PDCD4表达降低了卵巢癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二节 PDCD4对卵巢癌化疗敏感性的影响及其机制研究 |
| 前言 |
| 一、卵巢癌的化疗药物和化疗敏感性 |
| 二、PDCD4的作用机制与化疗敏感性 |
| 三、研究目的 |
| 材料 |
| 方法 |
| 一、卵巢癌细胞系的培养及转染 |
| 二、RT-PCR检测PDCD4的表达 |
| 三、Western blot方法检测PDCD4及细胞凋亡相关分子的表达 |
| 四、免疫组织化学方法检测PDCD4及凋亡相关分子的表达 |
| 五、MTT法对卵巢癌细胞化疗敏感性进行测定 |
| 六、小干扰RNA的转染 |
| 七、细胞周期的检测 |
| 八、细胞凋亡的检测 |
| 九、体内荷瘤检测PDCD4在体内对顺铂化疗敏感性的影响 |
| 十、统计学分析方法 |
| 结果 |
| 一、PDCD4表达水平与卵巢癌化疗敏感性的关系 |
| 二、PDCD4在体外过表达可以增强卵巢癌的化疗敏感性 |
| 三、沉默表达PDCD4减低了卵巢癌对顺铂的化疗敏感性 |
| 四、PDCD4和顺铂在体内联合治疗能明显抑制卵巢癌的生长 |
| 五、PDCD4过表达能够明显增强顺铂诱导的细胞凋亡,但对细胞周期的改变没什么影响 |
| 六、PDCD4增强顺铂诱导的细胞凋亡主要通过死亡受体介导的凋亡通路 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三节 PDCD4在细胞发生自噬过程中的作用及其机制研究 |
| 前言 |
| 一、自噬的发生过程 |
| 二、自噬的信号通路 |
| 三、自噬的检测方法 |
| 四、研究目的 |
| 材料 |
| 方法 |
| 一、PCR |
| 二、Western blot |
| 三、小鼠腹腔巨噬细胞的分离 |
| 四、小鼠骨髓细胞的分离和骨髓来源的巨噬细胞的诱导 |
| 五、自噬的诱导 |
| 六、荧光显微镜下观察GFP-LC3的表达 |
| 七、流式细胞术检测ROS活性 |
| 结果 |
| 一、PDCD4过表达有抑制卵巢癌细胞发生自噬的作用 |
| 二、PDCD4-/-小鼠的巨噬细胞在自噬诱导因素下自噬明显增强 |
| 三、PDCD4-/-小鼠的巨噬细胞在LPS诱导下ROS活性没有明显变化 |
| 四、PDCD4抑制LPS诱导的自噬可能是通过p38MAPK通路 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 PDCD5在卵巢癌中的表达状态及临床意义 |
| 前言 |
| 一、PDCD5的发现及生物学功能 |
| 二、PDCD5与肿瘤的关系 |
| 三、研究目的 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 一、PDCD5mRNA和蛋白在人卵巢癌细胞系中的表达 |
| 二、PDCD5mRNA和蛋白在人浆液性囊腺癌组织中的表达 |
| 三、PDCD5在浆液性囊腺癌的低表达状态和卵巢癌的FIGO分期相关 |
| 四、PDCD5在浆液性囊腺癌的低表达或缺失和病人的预后密切相关 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文及编着目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 附件1 英文文章1 |
| 附件2 英文文章2 |
| 附件3 英文文章3 |
（7）hMLH1基因对人卵巢癌耐药细胞株顺铂敏感性的研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 hMLH1 基因对人卵巢癌耐药细胞株SKOV3 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 hMLH1基因影响人卵巢癌耐药细胞株SKOV3 研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 实验图片 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文 |
（8）卵巢癌耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证与结构和表型变化研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 卵巢上皮恶性肿瘤多药耐药研究现况(文献综述) |
| 1 卵巢恶性肿瘤概述 |
| 1.1 卵巢癌的发病情况简述 |
| 1.1.1 卵巢癌的发病率及生存率 |
| 1.1.2 流行病学与致病因素 |
| 1.2 卵巢上皮恶性肿瘤的主要临床表现及诊断 |
| 1.2.1 肿瘤标志物 |
| 1.2.2 影像学检查 |
| 1.2.3 细胞学检查 |
| 1.2.4 腹腔镜探查术 |
| 1.2.5 联合诊断 |
| 1.3 卵巢上皮性癌一线常规治疗现况 |
| 1.3.1 卵巢癌手术治疗的研究近况 |
| 1.3.1.1 早、中期卵巢癌的手术治疗现状 |
| 1.3.1.1.1 全面分期手术的定义与价值 |
| 1.3.1.1.2 早期卵巢癌的手术切除范围及注意事项 |
| 1.3.1.1.3 阑尾切除在卵巢上皮性癌治疗中的价值 |
| 1.3.1.1.4 大网膜切除在卵巢癌治疗中的价值 |
| 1.3.1.1.5 腹膜后淋巴结清扫在卵巢癌治疗中的价值 |
| 1.3.1.1.6 卵巢癌的保守性手术现状 |
| 1.3.1.1.6.1 保守性手术的适应症与禁忌症 |
| 1.3.1.1.6.2 保守性手术的手术范围 |
| 1.3.1.1.6.3 保守性手术的价值 |
| 1.3.2 晚期卵巢癌的手术治疗现状 |
| 1.3.2.1 肿瘤细胞减灭术的原由及范围 |
| 1.3.2.2 肿瘤细胞减灭术的注意事项 |
| 1.3.2.3 影响肿瘤细胞减灭术的因素及在晚期卵巢癌临床治疗中的价值 |
| 1.3.2.4 复发卵巢癌的手术治疗 |
| 1.3.2.4.1 手术的目的与意义 |
| 1.3.2.4.2 手术的适应症,禁忌症及范围 |
| 1.3.2.4.3 影响手术效果的预后因素 |
| 1.3.3 化疗 |
| 1.3.3.1 一线化疗药物及方案的选择 |
| 1.3.3.1.1 一线化疗的指征 |
| 1.3.3.1.2 一线化疗药物以及方案的选择 |
| 1.3.3.2 腹腔化疗 |
| 1.3.3.3 维持或巩固化疗的临床价值 |
| 1.3.3.4 新辅助化疗 |
| 1.3.3.5 影响化疗疗效的临床病理因素 |
| 1.3.3.5.1 FIGO 分期 |
| 1.3.3.5.2 病理类型 |
| 1.3.3.5.3 残余灶的大小 |
| 1.3.3.5.4 化疗的用药剂量 |
| 1.3.3.5.5 肿瘤细胞产生耐药性 |
| 1.3.3.5.6 其它因素 |
| 1.3.4 影响腹腔化疗临床应用的因素 |
| 1.3.5 影响化疗疗效的分子病理因素 |
| 1.4 生物治疗 |
| 1.4.1 免疫治疗 |
| 1.4.2 过继性免疫治疗 |
| 1.4.3 抗体 |
| 1.4.4 细胞因子 |
| 1.4.5 肿瘤疫苗 |
| 1.5 基因治疗 |
| 1.5.1 自杀基因治疗 |
| 1.5.2 癌基因与抑癌基因治疗 |
| 1.5.3 免疫基因治疗 |
| 1.5.4 耐药基因治疗 |
| 1.5.5 抗肿瘤血管生成基因治疗 |
| 2 卵巢上皮恶性肿瘤的多药耐药 |
| 2.1 卵巢上皮恶性肿瘤多药耐药的原因及机理 |
| 2.1.1 卵巢癌多药耐药的分子机理 |
| 2.1.1.1 细胞内化疗药物浓度降低 |
| 2.1.1.2 P-糖蛋白 |
| 2.1.1.3 多药耐药相关蛋白 |
| 2.1.1.4 肺耐药蛋白 |
| 2.1.1.5 乳腺耐药蛋白 |
| 2.1.2 细胞内化疗药物代谢解毒增加 |
| 2.1.3 DNA 损伤修复能力增加 |
| 2.1.4 抗凋亡能力增加 |
| 2.1.5 p53 基因突变 |
| 2.1.6 信号传导通路 |
| 2.1.7 其它机制 |
| 2.1.7.1 细胞间连接 |
| 2.1.7.2 DNA 聚合酶 |
| 2.1.7.3 ATP7B |
| 2.2 卵巢上皮恶性肿瘤多药耐药的诊断 |
| 2.2.1 卵巢癌多药耐药的诊断 |
| 2.2.1.1 MDR-1 基因 |
| 2.2.1.2 肺耐药蛋白 |
| 2.2.1.3 GST-π |
| 2.2.1.4 mtP53 |
| 2.2.1.5 c-erbB-2 基因(HER-2 基因) |
| 2.2.1.6 DNA 错配修复基因 |
| 2.2.1.7 ATP7B |
| 2.2.1.8 多药耐药基因 SNPs 的检测 |
| 2.2.1.9 细胞凋亡相关基因 |
| 2.2.1.10 多基因联合检测在诊断多药耐药的价值 |
| 2.3 卵巢上皮恶性肿瘤多药耐的治疗 |
| 2.3.1 卵巢癌多药咐药的分型及治疗原则和目的 |
| 2.3.1.1 卵巢癌多药耐药的分型 |
| 2.3.1.2 卵巢癌多药耐药的治疗原则 |
| 2.3.1.3 治疗的目标及价值 |
| 2.3.2 多药耐药的化疗 |
| 2.3.2.1 二线化疗药物及方案的选择及疗效评价 |
| 2.3.2.2 顽固型卵巢癌的治疗 |
| 2.3.2.3 耐药型和难治型卵巢癌的治疗 |
| 2.3.2.4 影响二线化疗疗效的主要因素 |
| 2.3.2.5 常规化疗药物疗效预测分子靶向化疗 |
| 2.3.2.6 自体骨髓移植加大剂量化疗在卵巢癌多药耐药治疗中的应用 |
| 2.3.3 多药耐药的逆转耐药治疗 |
| 2.3.3.1 反义核酸技术 |
| 2.3.3.2 反义 RNA 技术 |
| 2.3.3.3 RNA 干涉技术 |
| 2.3.3.4 核酶基因转移技术 |
| 2.3.3.5 细胞因子基因逆转技术 |
| 2.3.3.6 针对 P-gp 的增敏治疗 |
| 2.3.3.7 针对 MRP 的增敏治疗 |
| 2.3.3.8 针对 BCRP 的增敏剂 |
| 2.3.4 多药耐药的手术治疗 |
| 2.3.5 多药耐药的的基因治疗 |
| 2.3.5.1 药物敏感基因 |
| 2.3.5.2 肿瘤免疫基因治疗 |
| 2.3.5.3 骨髓细胞修饰 |
| 2.3.6 多药耐药的综合治疗方案筛选及临床验证 |
| 2.3.6.1 单克隆抗体 |
| 2.3.6.2 腺病毒载体 |
| 2.3.6.3 中药治疗 |
| 2.3.6.4 亚致死量陡脉冲 |
| 3 卵巢上皮癌多药耐药差异表达基因研究现况 |
| 3.1 卵巢上皮癌多药耐药差异表达基因筛选鉴定技术 |
| 3.1.1 基因芯片技术 |
| 3.1.2 DDRT-PCT |
| 3.1.3 比较基因组杂交法 |
| 3.1.4 表达序列标签 |
| 3.1.5 基因表达的系列分析 |
| 3.1.6 消减杂交基因克隆技术 |
| 3.1.7 差异显示技术衍生的方法 |
| 3.1.8 差异基因的鉴定技术 |
| 3.2 卵巢上皮癌多药耐药差异表达基因筛选鉴定现况及临床价值 |
| 3.2.1 基因芯片应用 |
| 3.3 卵巢上皮癌多药耐药差异表达基因筛选鉴定存在问题 |
| 4 卵巢上皮癌多药耐药与基因甲基化的关系 |
| 4.1 基因甲基化的定义及主要检测手段 |
| 4.1.1 基因甲基化定义 |
| 4.1.2 主要检测手段 |
| 4.1.2.1 高效液相色谱柱(HPLC)及相关方法 |
| 4.1.2.2 SssI 甲基转移酶法 |
| 4.1.2.3 免疫化学法 |
| 4.1.2.4 氯乙醛法 |
| 4.1.2.5 特异性位点的 DNA 甲基化的检测 |
| 4.1.2.5.1 甲基化敏感性限制性内切酶法 |
| 4.1.2.5.2 直接测序法 |
| 4.1.2.5.3 甲基化特异性的 PCR |
| 4.1.2.5.4 甲基化敏感性单核苷酸引物延伸 |
| 4.1.2.5.5 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法 |
| 4.1.2.5.6 甲基化敏感性单链构象分析 |
| 4.1.2.5.7 甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳 |
| 4.1.2.5.8 荧光法 |
| 4.1.2.5.9 DNA 微阵列法 |
| 4.1.2.5.10 甲基化敏感性斑点分析 |
| 4.1.2.5.11 甲基化特异性多连接依赖性探针扩增 |
| 4.2 卵巢上皮癌多药耐药与基因甲基化的关系 |
| 4.3 卵巢上皮癌多药耐药基因甲基化检测的临床意义 |
| 4.3.1 治疗反应的标志物 |
| 4.3.2 化疗耐药和预后 |
| 5 卵巢上皮癌多药耐药与基因突变的关系 |
| 5.1 基因突变的定义及主要检测手段 |
| 5.1.1 基因突变的定义 |
| 5.1.2 基因突变主要检测手段 |
| 5.1.2.1 直接 DNA 序列分析法 |
| 5.1.2.2 单链构象多态性分析技术 |
| 5.1.2.3 温度梯度凝胶电泳分析 |
| 5.1.2.4 变性梯度凝胶电泳分析 |
| 5.1.2.5 变性高效液相色谱 |
| 5.1.2.6 异源双链分析 |
| 5.1.2.7 核酸分子杂交 |
| 5.1.2.8 核糖核酸酶切法 |
| 5.1.2.9 限制性内切酶酶谱分析 |
| 5.1.2.10 蛋白截短试验 |
| 5.1.2.11 聚合酶链反应—限制性片段长度多态性分析 |
| 5.1.2.12 等位基因特异性扩增法 |
| 5.1.2.13 等位基因特异性寡核苷酸分析法 |
| 5.1.2.14 毛细管电技术 |
| 5.2 卵巢上皮癌多药耐药与基因突变的关系 |
| 5.3 卵巢上皮癌多药耐药基因突变检测的临床意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 卵巢上皮癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 卵巢上皮癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因甲基化检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 卵巢上皮癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞筹异表达基因突变检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因表达与临床病理的关系研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）核苷酸切除修复基因多态性与卵巢癌铂类药物耐药相关性研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 核苷酸切除修复基因多态性与卵巢癌铂类药物耐药相关性研究进展 |
| 1. 卵巢癌的概况 |
| 1.1 卵巢癌的发病率及可能的致病因素 |
| 1.2 卵巢癌化疗的一线模式及存在的问题 |
| 2. 卵巢癌的多药耐药 |
| 2.1 卵巢癌多药耐药的主要分子机理 |
| 2.1.1 细胞内药物外排增加的机制 |
| 2.1.2 细胞内化疗药物代谢解毒增加的机制 |
| 2.1.3 DNA 损伤修复能力增加的机制 |
| 2.1.4 信号传导通路障碍的机制 |
| 2.1.5 细胞凋亡异常的机制 |
| 2.1.6 其它机理 |
| 2.2 卵巢恶性肿瘤多药耐药的临床特点 |
| 2.3 卵巢恶性肿瘤多药耐药的分子诊断 |
| 2.4 卵巢癌多药耐药的治疗 |
| 2.4.1 卵巢癌多药耐药的分型及治疗原则和目的 |
| 2.4.2 多药耐药的逆转耐药治疗 |
| 2.4.3 多药耐药的化疗 |
| 2.4.3.1 二线化疗药物及方案的选择及疗效评价 |
| 2.4.3.2 常规化疗药物疗效预测分子靶向化疗 |
| 2.4.3.3 自体骨髓移植加大剂量化疗在卵巢癌多药耐药治疗中的应用 |
| 2.4.3.4 多药耐药的的基因治疗 |
| 2.4.3.5 多药耐药的靶向治疗 |
| 2.4.3.6 多药耐药的综合治疗方案筛选及临床验证 |
| 3. 基因多态性概述 |
| 3.1 基因多态性及SNP 位点的定义 |
| 3.2 SNP 位点形成的分子机理 |
| 3.3 SNP 位点检测的不同技术及优缺点 |
| 3.4 SNP 位点检测对肿瘤诊断，预防，治疗及预后的价值 |
| 4. 核苷酸切除修复基因多态性与卵巢癌铂类药物耐药相关性研究现况 |
| 4.1 铂类药物抗肿瘤的分子药理机理 |
| 4.2 铂类-DNA 加合物的识别和信号传导 |
| 4.3 正常组织DNA 修复过程及分子机理 |
| 4.4 核苷酸切除修复途径及其在修复DNA-加合物中的作用 |
| 4.5 核苷酸切除修复基因多态性与卵巢癌铂类药物耐药相关性 |
| 4.5.1 核苷酸切除修复酶类基因与卵巢铂类药物耐药 |
| 4.5.2 核苷酸切除修复酶类基因多态性与恶性肿瘤铂类药物耐药 |
| 4.5.2.1 ERCC1 基因多态性 |
| 4.5.2.2 XPA 基因多态性 |
| 4.5.2.3 XPC 基因多态性 |
| 4.5.2.4 XPD 基因多态性 |
| 4.5.2.5 XPG 基因多态性 |
| 4.5.3 核苷酸切除修复酶类通路各基因多态性之间以及与其它通路的基因多态性之间的联合作用及其对化疗的影响 |
| 4.6 目前卵巢癌多药耐药研究中存在的问题及本研究的目地和意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 卵巢上皮癌铂类耐药与非耐药细胞间核苷酸切除修复酶类基因多态性的检测与比较 |
| 1、前言 |
| 2、材料与方法 |
| 3、结果 |
| 4、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 ERCC5 遗传多态与卵巢癌患者铂类药物敏感性关系 |
| 1、前言 |
| 2、材料与方法 |
| 3、结果 |
| 4、讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 ERCC5 基因表达RNAi 阻断对卵巢上皮性癌细胞顺铂耐药性影响的体外实验研究 |
| 1、前言 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 致谢 |
（10）卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间差异表达蛋白与基因的筛选鉴定研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 卵巢上皮癌多药耐药研究进展 |
| 1.卵巢上皮癌化疗概述 |
| 1.1 一线化疗药物及方案的选择 |
| 1.1.1 一线化疗的指征 |
| 1.1.2 一线化疗药物的选择 |
| 1.1.2.1 常规药物 |
| 1.1.2.2 新应用的药物 |
| 1.1.3 一线化疗方案的选择 |
| 1.1.3.1 常用的一线化疗方案 |
| 1.1.3.2 实验中的一线化疗 |
| 1.1.3.3 腹腔化疗 |
| 1.1.3.4 维持或巩固化疗的临床价值 |
| 1.1.3.5 新辅助化疗 |
| 1.2 影响化疗疗效的临床病理因素 |
| 1.2.1 手术分期 |
| 1.2.2 细胞分化程度 |
| 1.2.3 病理类型 |
| 1.2.4 残余灶的大小 |
| 1.2.5 化疗的用药剂量 |
| 1.2.5.1 化疗剂量强度的影响 |
| 1.2.5.2 化疗总剂量的影响 |
| 1.2.5.3 化疗剂量密度的影响 |
| 1.2.6 肿瘤细胞产生耐药性 |
| 1.2.7 其它因素 |
| 1.2.8 影响腹腔化疗临床应用的因素 |
| 1.3 影响化疗疗效的分子病理因素 |
| 2.卵巢上皮癌多药耐药概述 |
| 2.1 卵巢癌多药耐药的分子机理 |
| 2.1.1 细胞内化疗药物浓度降低 |
| 2.1.2 细胞内化疗药物代谢解毒增加 |
| 2.1.3 DNA损伤修复能力增加 |
| 2.1.4 抗凋亡能力增加 |
| 2.1.5 p53基因突变 |
| 2.1.6 信号传导通路 |
| 2.1.7 其它机制 |
| 2.2 卵巢癌多药耐药的诊断 |
| 2.3 卵巢癌多药耐药的治疗 |
| 2.3.1 卵巢癌多药耐药的分型及治疗原则和目的 |
| 2.3.1.1 卵巢癌多药耐药的分型 |
| 2.3.1.2 卵巢癌多药耐药的治疗原则 |
| 2.3.1.3 治疗的目标及价值 |
| 2.3.2 多药耐药的化疗 |
| 2.3.2.1 二线化疗药物及方案的选择及疗效评价 |
| 2.3.2.2 常规化疗药物疗效预测分子靶向化疗 |
| 2.3.2.3 自体骨髓移植加大剂量化疗在卵巢癌多药耐药治疗中的应用 |
| 2.3.3 多药耐药的逆转耐药治疗 |
| 2.3.4 多药耐药的增敏治疗 |
| 2.3.5 多药耐药的手术治疗 |
| 2.3.6 多药耐药的的基因治疗 |
| 2.3.7 多药耐药的综合治疗方案筛选及临床验证 |
| 2.4.多药耐药的预防 |
| 3.卵巢癌多药耐药差异表达基因与蛋白的筛选鉴定 |
| 3.1 卵巢癌多药耐药差异表达基因与蛋白筛选鉴定的主要方法 |
| 3.1.1 卵巢癌多药耐药差异表达基因筛选鉴定的主要方法 |
| 3.1.1.1 基因芯片技术 |
| 3.1.1.2 DDRT—PCT |
| 3.1.1.3 比较基因组杂交法 |
| 3.1.1.4 表达序列标签 |
| 3.1.1.5 基因表达的系列分析 |
| 3.1.1.6 消减杂交基因克隆技术 |
| 3.1.1.7 差异显示技术衍生的方法 |
| 3.1.1.8 差异基因的鉴定技术 |
| 3.1.2 卵巢癌多药耐药差异表达蛋白筛选鉴定的主要方法 |
| 3.1.2.1 噬菌体全套抗体库技术 |
| 3.1.2.2 双向凝胶电泳 |
| 3.1.2.3 差异凝胶电泳泳 |
| 3.1.2.4 蛋白芯片表面增强激光解析/电离飞行时间质谱法 |
| 3.1.2.5 二维液相色谱法 |
| 3.1.2.6 同位素编码亲和标签 |
| 3.1.2.7 毛细管电泳技术 |
| 3.1.2.8 蛋白质鉴定分析技术 |
| 3.2 卵巢癌多药耐药差异表达基因与蛋白筛选鉴定现况 |
| 3.2.1 卵巢癌多药耐药差异表达基因筛选鉴定现况 |
| 3.2.1.1 cDNA微阵列的应用 |
| 3.2.1.2 DD-PCR的应用 |
| 3.2.1.3 CGH的应用 |
| 3.2.1.4 SSH的应用 |
| 3.2.2 卵巢癌多药耐药差异表达蛋白筛选鉴定现况 |
| 3.2.2.1 2-DE的应用 |
| 3.2.2.2 DIGE的应用 |
| 3.2.2.3 Protein Chip/SELDT-TOF-MS的应用 |
| 3.2.2.4 ICAT的应用 |
| 3.3 结语 |
| 第二章 卵巢上皮癌铂类耐药细胞株相关生物学指标的检测验证 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞来源 |
| 2.1.2 主要药物及试剂 |
| 2.1.3 主要仪器及设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞株的培养 |
| 2.2.2 耐药细胞株耐药指数的检测验证 |
| 2.3 交叉耐药性的检测验证 |
| 2.4 细胞生长曲线及倍增时间的检测 |
| 2.5 细胞生长周期的检测 |
| 2.6 细胞凋亡的检测 |
| 2.6.1 流式细胞仪检测细胞凋亡的原理 |
| 2.6.2 细胞凋亡率的检测 |
| 2.6.3 细胞凋亡的形态学观察 |
| 2.7 统计学处理 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 耐药株的形态学改变 |
| 3.2 耐药细胞的IC50及RI |
| 3.3 耐药细胞交叉耐药的IC50及RI |
| 3.4 细胞的生长曲线及倍增时间 |
| 3.5 细胞生长周期 |
| 3.6 细胞的凋亡率 |
| 3.7 细胞凋亡的形态学改变 |
| 4.讨论 |
| 第三章 卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间差异表达蛋白筛选鉴定研究 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 设备与仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 总蛋白的提取 |
| 2.2.2 Bradford法测定蛋白浓度 |
| 2.2.3 差异蛋白的分离 |
| 2.2.4 差异蛋白的筛选 |
| 2.2.5 差异蛋白的鉴定 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 SKOV3/CB细胞和SKOV3细胞总蛋白的浓度测定结果 |
| 3.1.1 BSA标准曲线的绘制 |
| 3.1.2 SKOV3/CB细胞和SKOV3细胞总蛋白的浓度 |
| 3.2 SKOV3/CB细胞和SKOV3细胞总蛋白一维分离结果 |
| 3.2.1 SKOV3细胞总蛋白一维分离结果 |
| 3.2.2 SKOV3/CB细胞总蛋白一维分离结果 |
| 3.2.3 SKOV3/CB-1和SKOV3-1一维分离结果对比 |
| 3.3 SKOV3/CB细胞和SKOV3细胞总蛋白二维分离结果 |
| 3.3.1 总蛋白的二维分离结果记录图 |
| 3.3.2 蛋白二维分离的良好重复性 |
| 3.4 SKOV3/CB细胞和SKOV3细胞间差异表达蛋白筛选 |
| 3.4.1 SKOV3/CB细胞和SKOV3细胞间差异蛋白记录图 |
| 3.4.2 SKOV3/CB细胞和SKOV3细胞间的差异蛋白 |
| 3.5 SKOV3/CB细胞和SKOV3细胞间差异表达蛋白鉴定 |
| 4.讨论 |
| 第四章 卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间差异表达基因筛选鉴定研究 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器及用具处理 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 SKOV3/CB和SKOV3细胞间差异表达基因的筛选及生物信息学分析 |
| 2.2.2 SKOV3/CB细胞和SKOV3细胞间差异表达基因的验证 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 SKOV3/CB细胞与SKOV3细胞的基因芯片结果 |
| 3.1.2 基因芯片荧光标记图分析结果 |
| 3.1.3 基因芯片结果的直方图分析结果 |
| 3.1.4 基因芯片杂交信强度散点图分析结果 |
| 3.1.5 基因芯片MA plot图分析结果 |
| 3.1.6 基因芯片分层聚类图分析结果 |
| 3.2 SKOV3/CB细胞和SKOV3细胞间差异表达基因的筛选及生物信息学分析结果 |
| 3.2.1 SKOV3/CB细胞比SKOV3细胞上调的差异基因 |
| 3.2.2 SKOV3细胞比SKOV3/CB细胞上调的差异基因 |
| 3.2.3 SKOV3/CB细胞耐药相关基因的功能分类 |
| 3.2.4 进行RT-PCR验证的差异基因的确定 |
| 3.3 半定量RT-PCR验证差异表达基因mRNA在卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间的表达结果分析 |
| 3.3.1 提取细胞RNA的浓度及质量检测 |
| 3.3.2 PCR循环次数的确定 |
| 3.3.3 ANXA6、UGDH、ZNFl98、ERCC5、TWIST2和BIRC3在SKOV3和SKOV3/CB中的表达 |
| 4.讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
四、拓扑替康与顺铂对bcl-2及fas在卵巢癌细胞系3AO及其耐药系3AO/cDDP表达的影响（论文参考文献）
- [1]PGC1α通过HSP70/HK2/VDAC1途径参与卵巢癌顺铂耐药机制的研究[D]. 李艳青. 吉林大学, 2021(01)
- [2]USP48在卵巢癌化疗耐药中的功能研究[D]. 雷雪萌. 贵州大学, 2020(02)
- [3]MiR-34a通过调控HDAC1抑制卵巢癌细胞增殖和顺铂耐药性机制的实验研究[D]. 吕腾. 山东大学, 2019(03)
- [4]二氢叶酸还原酶与卵巢上皮癌多药耐药关系的研究[D]. 李状. 广西医科大学, 2012(09)
- [5]WWOX与P73a基因慢病毒表达载体的构建及其在卵巢癌细胞中的表达[D]. 王桂玲. 广西医科大学, 2011(08)
- [6]抑癌基因PDCD4和PDCD5在卵巢癌中的作用及其机制研究[D]. 张霞. 山东大学, 2011(12)
- [7]hMLH1基因对人卵巢癌耐药细胞株顺铂敏感性的研究[D]. 舒丹. 重庆医科大学, 2011(11)
- [8]卵巢癌耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证与结构和表型变化研究[D]. 唐兆前. 广西医科大学, 2010(08)
- [9]核苷酸切除修复基因多态性与卵巢癌铂类药物耐药相关性研究[D]. 吴飞翔. 广西医科大学, 2009(09)
- [10]卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间差异表达蛋白与基因的筛选鉴定研究[D]. 冯同富. 广西医科大学, 2008(10)