一、转移早期囊胚期细胞制备嵌合体鸡（论文文献综述）
康宇[1]（2020）在《非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究》文中指出哺乳动物的胚胎早期发育开始于精子和卵子融合形成合子,之后经历卵裂、囊胚孵化、子宫定植等过程最终发育为完整个体。胚胎植入前发育的过程中会发生一系列重要的生物学事件,如母源——合子转化、合子基因激活、细胞谱系分化等。这些事件的有序发生均依赖于细胞内复杂的分子调控机制,并且极易受到环境应激因素的影响,如高温和内分泌干扰素都会干扰发育中的配子和胚胎正常发育,甚至产生可遗传的表观遗传变异。非人灵长类（NHPs）由于与人类极高的相似性,对其植入前胚胎发育机制的研究有助于解答人类早期胚胎发育的重要问题,同时,非人灵长类也是人类疾病研究的重要动物模型。本论文以猕猴和食蟹猴为对象,利用体外受精技术,开展植入前胚胎发育的转录调控机制和转化研究。研究通过收集猕猴植入前胚胎各个发育阶段的胚胎单细胞样本进行转录组测序,建立了完整的猕猴体外受精胚胎植入前发育转录组图谱。之后经过深入分析胚胎植入前发育过程的转录调控模式,发现灵长类早期胚胎发育中存在转录阻滞现象,桑葚胚时期的胚胎中有部分细胞的转录组停滞在合子基因激活之前阶段。在研究中还构建了体细胞核移植胚胎和单性生殖胚胎,这两类胚胎是研究合子基因组重编程机制及父源/母源印记基因调控的重要材料,通过获取这些胚胎的植入前发育单细胞转录组数据并与正常体外受精胚胎进行比较,发现体细胞核移植（SCNT）和单性生殖（孤雄/孤雌）胚胎的转录模式存在更为普遍的延迟,分析表明这种延迟主要是由异常的表观遗传修饰而导致的合子基因组激活不完全,胚胎发育率下降。通过外源手段消除体细胞核移植胚胎异常的H3K9me3,可以提高体细胞核移植胚胎发育率并且获得克隆动物。非人灵长类是研究人类疾病的理想动物模型。本论文利用CRISPR/Cas9技术进行了食蟹猴植入前胚胎的靶向基因编辑,获得DAX1基因突变猴模型。模型动物出现人类患者肾上腺发育不全（AHC）和低促性腺素性功能减退症（HH）的相关表型,经分析发现Wnt/β-catenin信号通路的异常激活导致的血管发生缺陷可能是DAX1基因突变胎儿时期肾上腺发育不良的主要原因。研究同时发现雄性食蟹猴DAX1缺陷导致的肾上腺和性腺发育缺陷在胎儿期性腺决定阶段就已经开始。通过食蟹猴植入前胚胎的干细胞嵌合实验,证明了非人灵长类胚胎干细胞（ESC）、诱导多能干细胞（i PS）和体细胞核移植来源的胚胎干细胞（NT-ESC）都可以实现食蟹猴胚胎和成体水平嵌合,并且具有三胚层及胚外组织分化潜能。通过收集分析嵌合胚胎的单细胞转录组数据发现,食蟹猴多能干细胞的胚胎嵌合效率差异与其自身的多能性状态密切相关,并且受到嵌合胚胎微环境的调控。综上,本论文研究了非人灵长类胚胎早期发育的转录调控,并构建了疾病动物模型以及嵌合体,从而开展疾病机制和干细胞多能性研究。首次绘制了完整的灵长类植入前发育转录图谱,是对灵长类早期发育调控研究领域的重要补充;利用CRISPR/Cas9技术构建的疾病猴模型表现了其它物种不能出现的、与病人高度相似的表型,是人类复杂疾病研究的理想动物模型。
相立峰[2]（2020）在《人胚胎原肠前动态发育研究》文中指出伴随工业水平的进步和生活水平的提高,不良的生活环境、不健康的饮食习惯和日益增加的生存压力等导致育龄夫妇的精子与卵子质量急速下降,不孕不育已成为威胁生殖健康的一个重要问题。当胚胎发育至第7天,人胚胎需植入母体的子宫中才能继续存活和发育。这个阶段胚胎在子宫体内发生的变化以及导致这些变化的关键细胞和分子事件,由于材料的无法获得以及缺乏相应技术导致这些问题仍处在黑匣子状态。胚胎植入失败以及在此阶段的发育异常是导致早期流产的主要原因。因此,对人胚胎原肠前发育过程的研究将为我们理解生命起源、探索早期胚胎发育动态变化过程和分子调控机制提供重要的理论依据。2016年的两篇报道在小鼠胚胎体外培养的基础上,建立了着床后人胚胎体外2D培养体系,该体系能够将胚胎在体外培养至13天,并观察到一些谱系分离的现象。然而2D条件下胚胎存在一些重要缺陷,如2D培养的胚胎是扁平的,缺乏体内3D的拓扑结构;虽然2D培养胚胎的滋养外胚层12天后仍在继续存活,但整个胚胎结构发生了坍塌和出现了发育的紊乱,导致很多细胞类型（羊膜上皮）、腔（羊膜腔、卵黄囊）和结构（基底膜、前后轴、原条）无法在2D培养的胚胎中清楚地观测到。因此,这些缺陷限制了2D体系很难真正模拟体内胚胎的发育,无法揭示胚胎在该阶段的发育事件和机制。为了克服以上这些缺陷,我们开展了本论文的研究。我们在获得严格的伦理允许和病人知情同意的条件下,利用临床上捐献的胚胎,通过改善培养基和培养方法,开发了一个三维（3D）人囊胚培养体系,并采用该体系首次将人囊胚在3D条件下培养到原条原基阶段。这些3D胚胎能高度地模拟体内胚胎的发育,经历不同形态的发育并自发组装成2D条件下无法产生的3D结构,包括胚胎双层胚盘、羊膜（amnion）、基底膜（basal membrane）、初级和灵长类独特的次级卵黄囊、前后轴和原条前体。利用这个体系,我们揭示了人原肠前胚胎的关键发育事件:（1）通过单细胞转录表达谱的分析,揭示了上胚层细胞、下胚层细胞和滋养层细胞谱系分化和发育的动态和分子调控网络。（2）羊膜上皮细胞（AME）是上胚层细胞分离出来的第一类细胞系,不同于啮齿类动物,人AME发生于原条形成之前,但其特性和分子机制不清楚。我们发现:与上胚层细胞相比,AME显着地下调多能性基因,其形成与基底膜的缺失显着相关,并有独特的分子表达谱。（3）首次阐明细胞滋养层（cytotrophoblast）、绒毛外细胞滋养层（extravillous cytotrophoblast）和合胞体滋养细胞（syncytiotrophoblast）在胚胎着床后的分化以及引起分化的信号和转录因子,揭示了绒毛外细胞滋养层在早期胚胎中不同于中、后期胎盘的功能。（4）揭示了上胚层细胞（PSCs,多能干细胞）着床后将很快从naive到primed状态的转变。PSCs从着床至第14天期间保持相对的稳定状态,而其发育和转化是由不同的多能因子协调作用所决定的。（5）通过人和非人灵长类胚胎的转录组分析,发现非人灵长类和人上胚层细胞在代谢上具有明显差异,而在维持干细胞多能性以及发育的关键分子和信号通路上具有保守性。本论文利用独创的人胚胎体外3D培养体系详细阐述了胚胎在发育过程中谱系的分离、羊膜腔的形成、羊膜上皮的分离、卵黄囊的形成、胚胎极性的产生和原条的形成等发育学事件。本论文回答了EPI多能性的维持和转化、羊膜上皮的形成机制、滋养层分化发育的机制等科学问题。本研究成果为胚胎的早期发育和干细胞的相关研究提供了新的模型,为组织再生和器官再生提供了研究的理论基础,为研究胚胎因素的着床失败和早期流产提供了理论支持,为不孕症治疗和辅助生殖技术中现存问题的解决提供了研究思路和研究方向。
卢琴[3]（2020）在《孤雌生殖人类胚胎干细胞技术的专利适格性研究》文中指出传统人类胚胎干细胞（HESC）技术不可避免需要破坏人胚胎才能获取HESC。随着干细胞技术的发展,开始出现回避伦理争议的新技术。其中,孤雌生殖HESC技术通过孤雌激活人卵母细胞,无需精子参与就能形成孤雌囊胚,从中获取HESC。大多数国家认为该技术回避了传统技术破坏胚胎的伦理争议,并且具有重大的医学价值。随着科学和伦理的发展变化,2019年11月我国新修正的《专利审查指南》放宽了HESC技术的专利审查标准,但仅仅规定了“利用未经体内发育的受精14天以内的人胚胎”获取HESC的相关发明不违背社会公德,可以授予专利。却未提及孤雌生殖HESC技术在我国能否具备专利适格性的问题。因此,本文将对该新技术的专利适格性问题进行研究。首先,介绍孤雌生殖HESC技术相比其他技术的优势。分析2016年我国知识产权局判定孤雌囊胚属于人胚胎,孤雌生殖HESC技术违背社会公德,因而不具备专利适格性而引发的争议案例。指出2019年《专利审查指南》修正后依然未能解决争议问题。其次,通过分析传统HESC技术与孤雌生殖HESC技术专利适格性审查中具有代表性的司法案例,梳理新旧技术发展的脉络,考察干细胞技术发达的美、欧、中、澳等国家对新旧两类技术的专利适格性认定,同时从传统技术的专利审查中获取对新技术有益的借鉴经验。再次,从我国利益平衡、伦理道德、干细胞产业政策导向和产业发展需要等方面出发,为论证我国应当授予孤雌生殖HESC技术专利权保护的正当性和必要性提供依据。最后,得出孤雌生殖HESC技术在我国具备专利适格性的结论。我国对该新技术的专利审查经验尚不成熟。笔者结合我国的实际情况,以前文作为基础和铺垫,为我国《专利审查指南》提供相应的完善建议。
戴旭[4]（2020）在《PGT-A应用于复发性流产伴不孕患者妊娠结局的回顾性研究》文中研究表明目的:复发性流产（Recurrent spontaneous abortion,RSA）是指连续两次或以上的临床妊娠流产,在人群中的发生率为3%-5%。有许多夫妇经过一系列RSA相关病因学检查,仍未找到导致流产的原因。近年来,随着对流产物染色体检查,发现50%以上的流产物存在染色体异常。因此,有学者提出对于RSA患者,可采用胚胎植入前非整倍体检测技术（Preimplantation Genetic Testing for aneuploidy,PGT-A）筛选整倍体胚胎移植,以达到提高临床妊娠率、降低早期流产率的目的。但在临床上PGT-A技术用于RSA患者的治疗存在很大争议。本研究通过回顾性分析比较不明原因复发性流产伴不孕患者行单精子卵胞浆内注射（ICSI）+PGT-A助孕和行常规IVF/ICSI妊娠结局,探讨PGT-A对改善RSA患者妊娠结局的有效性,从而为临床上该类患者的助孕治疗提供依据。方法:回顾性分析2017年1月至2019年5月在西北妇女儿童医院生殖中心助孕的RSA患者的临床资料。RSA伴不孕患者纳入标准:临床妊娠流产≥2次同时伴有夫妻双方性生活正常未采取避孕措施同居1年未妊娠者。排除标准:1.夫妻双方染色体异常;2.生殖道解剖异常;3.内分泌异常;4.免疫学检查异常;5.血栓前状态;6.生殖道感染;7.男方精液检查异常;8.夫妻双方生活环境中存在导致流产高危因素。患者符合以上纳入排除标准参考2018年《胚胎植入前遗传学诊断/筛查技术专家共识》中PGT-A可应用于不明原因反复自然流产2次及以上。根据接受辅助生殖助孕患者是否选择进行PGT-A分为PGT-A组和常规IVF/ICSI助孕对照组,PGT-A组最终纳入患者132例,常规IVF/ICSI助孕对照组最终纳入患者564例。比较两组患者的临床妊娠率、流产率和活产率。结果:1.基线资料:PGT-A组和对照组相比,PGT-A组女方年龄低于对照组（30.13±3.99 VS 32.39±3.84 P<0.001）,差异有统计学意义;对照组因盆腔输卵管因素导致不孕周期数多于PGT-A组（50.71%VS 39.39%P=0.019）,差异有统计学意义;两组间男方年龄、流产次数、女方BMI、男方BMI、基础窦卵泡数、基础FSH值、基础LH值、基础E2值,差异均无统计学意义（P>0.05）。2.控制性超促排卵及胚胎发育情况:两组间促排卵药物（Gn）使用天数、Gn总用量、HCG日激素水平、HCG日>14mm卵泡数、实际获卵数、受精率、卵裂率、D3可用胚胎率、D3优胚率、囊胚形成率,差异均无统计学意义（P>0.05）。3.PGT-A组胚胎染色体非整倍性检测结果:PGT-A组共活检469枚胚胎、成功活检胚胎数目452枚,胚胎整倍体率为44.35%,非整倍体率为49.47%,嵌合体率为2.56%、扩增失败率（N/A）为3.62%。将PGT-A组患者按年龄分为2组,年龄≥35岁患者胚胎非整倍体率高于年龄<35岁患者胚胎非整倍体率（56.92%VS 44.48%P=0.008）,差异有统计学意义。4.妊娠结局:PGT-A组的临床妊娠率（68.94%VS 44.33%P<0.001）、活产率（53.03%VS 31.91%P<0.001）高于对照组,差异均有统计学意义。流产率低于对照组（23.08%VS 28%P>0.05）,但差异无统计学意义。Logistic回归分析显示:调整女方年龄后,PGT-A组的临床妊娠率和活产率仍高于对照组（P<0.001）,差异有统计学。将两组患者按年龄分为2组,女方年龄<35岁组中:PGT-A组的临床妊娠率（69.61%VS 57.24%P=0.029）高于对照组,差异有统计学意义。但活产率（55.88%VS 44.88%P>0.05）高于对照组以及流产率（19.72%VS 21.6%P>0.05）低于对照组,差异均无统计学意义。女方年龄≥35岁组,PGT-A组的临床妊娠率（66.67%VS31.32%P<0.001）、活产率（43.33%VS 18.86%P=0.022）均高于对照组,差异均有统计学意义。流产率（35%VS 39.77%P>0.05）低于对照组,差异无统计学意义。因PGT-A组均采用单囊胚移植,将PGT-A组与对照组中单囊胚移植周期妊娠结局相比,PGT-A组的妊娠率（68.94%VS 55.47%P=0.023）与活产率（53.03%VS 40.88%P=0.046）仍高于对照组,差异有统计学意义。流产率低于对照组（23.08%VS 26.32%P>0.05）,差异无统计学意义。结论:1.不明原因RSA伴不孕患者进行ICSI+PGT-A助孕与行常规IVF/ICSI助孕相比临床妊娠率以及活产率显着提高。2.按照年龄分组分析:ICSI+PGT-A助孕可明显改善年龄≥35岁高龄患者妊娠结局。3.与常规IVF/ICSI助孕中单囊胚移植周期妊娠结局相比,PGT-A组临床妊娠率、活产率显着升高。4.PGT-A可以降低不明原因RSA伴不孕患者的流产率,但与对照相比,差异无统计学意义。
王莎莎[5]（2019）在《囊胚补偿法制备人-猪嵌合胚的研究》文中进行了进一步梳理解决器官相关致死性疾病最有效方法是器官移植,但是可被用于移植供体的相应器官来源、数量十分有限,因此提出设想,用囊胚补偿法在动物体内制备出特定的人源化猪器官/组织,用来减缓出现的器官供应短缺的阻碍。由于猪,特别是小型猪和人类在众多生理生化、身体结构等方面相似性十分高,因此利用经基因编辑过的具有发育“空位”的小型猪与可在特定部位进行补偿的囊胚补偿法制备可培育出特定的人源化器官或组织的嵌合体猪,可被使用解决移植用供体器官数量严重不足的问题,同时减缓因为移植出现的免疫排斥反应。1.缺乏延胡索酸乙酰乙酸水解酶（Fumarylacetoacetatehydrolase,FAH）会引起遗传性酪氨酸血症I型（Hereditary tyrosinemia typel,HTI）,致使患者的肝脏细胞出现凋亡现象,进而呈现出肝损伤表现。本研究利用 α-1,3-半乳糖基转移酶基因（α-1,3-galactosyltransferase,GGT41）敲除巴马猪的组织样本作为研究基础材料,利用CRISPR/Cas9和体细胞核移植技术制备FAH基因敲除（FAH+/-、FAH-/-）猪,并分析其健康与繁育状况。采集FAH+/-巴马猪血液,检测其血生化与血常规指标;当F0代FAH+/-巴马猪公猪性成熟后,与野生型（wild type,WT）母猪配种,以其产仔数评价繁育能力状况。通过WestemBlot检测FAH+/-巴马猪FAH蛋白表达量有所下降。此FAH+/-巴马猪的成功获得为后续制备HTI疾病模型猪及人源化器官的研究提供了可靠的数据及材料。2.KITLG（KIT ligand）又称干细胞因子（SCF）,是一种结合CD117（C-kit）的细胞因子,是造血干/祖细胞生存、增生和分化的重要生长因子。由于KITLG基因的敲除会使机体造血系统发育出现障碍,使得该基因敲除猪无法在母体内正常生长发育,因此48d时杀猪取胚胎,10只胚胎中只有一只保持较为完整的形态,其余均退化剩余部分肉糜状组织。提取胚胎基因组DNA鉴定突变类型均为KITLG-/-,KITLG-/-胚胎与相似发育阶段野生型胚胎比较,体型明显小于野生型且肝脏也小于野生型的且呈现出灰白色;HE染色后观察KITLG-/-胚胎肝脏切片中缺少血管内皮血细胞。由于KITLG基因的敲除会造成该基因克隆猪造血功能缺陷使其无法存活,因此获得相关早期胚胎,为后续制备可生产人血液嵌合体猪奠定研究基础。3.本研究通过囊胚补偿法,利用可造成机体特定器官发育受阻的FAH和KITLG基因的敲除胚胎作为实验组,通过显微注射将人类胚胎干细胞注入来填补发育空缺,在理论上增加嵌合体的嵌合成功率与嵌合程度。KITLG-/-胚胎在注射H9-td Tomato细胞后并未像FAH-/-胚胎和孤雌胚胎一样可正常发育到囊胚阶段;在随后观察各组桑椹胚期及囊胚期注射H9-td Tomato细胞胚胎时,发现它们的桑椹胚数及囊胚数与对照组未进行注射的相比,数目均有所下降。由于人、猪之间物种差异极大,通过荧光显微镜观察,猪囊胚与H9-td Tomato细胞嵌合率极低。总之,本研究探索了利用囊胚补偿法制备人-猪嵌合胚,为将来获得人源化器官,推进了异种嵌合体及异种移植的研究并提供了可供参考的有价值基础理论研究数据。本研究将畜牧学与医学相结合,是畜牧学应用于医学的研究。
莫丽芬[6]（2019）在《鸡Dazl荧光报告基因追踪生殖细胞迁移和分化的研究》文中研究指明诱导多能干细胞（Induced Pluripotent stem Cell,iPSC）具有分化成多种类型细胞的潜能。其中iPSC在体外诱导分化成生殖细胞对于畜禽保种育种、转基因动物以及发育生物学研究具有重要的意义。Dazl是调控生殖细胞发育与分化的关键因子,是生殖细胞鉴定的主要标志物。由于Dazl在iPSC不表达,因此可以作为报告基因追踪iPSC诱导分化为生殖细胞的过程。本研究利用 CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）技术介导的同源末端连接（Homology-Mediated End Joining,HMEJ）将红色荧光蛋白基因mCherry定点敲入鸡内源Dazl基因第10个内含子处,通过Dazl启动子驱动mCherry表达,从而精确追踪内源Dazl在iPSC分化为原始生殖细胞（Primordial germ cell,PGC）的过程中的表达情况。具体研究结果如下:（1）DAZL在鸡PGC和iPSC细胞中的表达鉴定。我们首先克隆鸡Dazl基因,制备DAZL多克隆抗体。纯化的抗体对鸡PGC进行Western blot,结果显示DAZL抗体能识别PGC中的特异性条带,相对分子量为33KDa,与预测分子量一致,说明DAZL抗体特异性高。q-PCR和免疫荧光染色结果显示DAZL在iPSC中不表达,在PGC中高表达,说明Dazl能作为报告基因追踪生殖细胞的特异性。（2）Dazl荧光报告载体的构建和定点敲入验证。首先针对Dazl基因设计和构建hpl80-sgRNA-spCas9表达载体和打靶供体质粒pDazl-HMEJ donor。然后将hpl80-sgRNA-spCas9转染DF-1细胞,验证CRISPR/Cas9系统的切割Dazl基因的效率。T7E1酶切鉴定证明hp180-sgRNA-spCas9质粒有效靶向目的位点实现基因敲除。而后将hpl80-sgRNA-spCas9表达载体和pDazl-HMEJ donor报告载体共转染PGC和iPSC,成功建立Dazl-mCherry+/EGFP+ PGC细胞系和Dazl-mCherry/EGFP+ iPSC细胞系。（3）Dazl荧光报告系统示踪PGC细胞迁移和iPSC细胞分化。本实验将Dazl-mCherry+/EGFP+标记的PGC细胞移植到15HH的鸡胚血液系统,结果显示细胞会随着血脉系统迁移并归巢到性腺,并且在新生鸡的睾丸继续发育。说明Dazl荧光报告系统能追踪生殖细胞的迁移。最后,我们将Dazl-mCherry/EGFP+标记的iPSC制作类配体（Embryoid body,EB）,并用EB培养液诱导,3天后形成的EB同时表达mCherry和EGFP。将EB收集检测生殖细胞特异性基因的和多能性相关基因的表达,q-PCR结果显示生殖细胞特异性基因显着上调,多能性相关基因显着下调。说明Dazl荧光报告系统在iPSC体外诱导分化过程中可起指示作用。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9技术建立鸡Dazl荧光报告系统,追踪生殖细胞的迁移和体外分化。通过可视化诱导iPSC获得生殖细胞,将为进一步利用iPSC进行珍稀禽类保种育种、转基因鸡制备以及发育生物学研究的奠定基础。
崔文耀[7]（2019）在《CRISPR/Cas9介导的四带无须魮eomesa突变体的构建》文中研究表明四带无须魮（Puntigrus tetrazona）是一种小型鲤科热带观赏鱼,为对该物种进行遗传改造,本研究对其繁育、早期胚胎发育、染色体数目、DNA含量和系统发育地位等基础生物学进行了研究。取得如下结果:四带无须魮性成熟时间约为6个月,其适宜生存水温20-30℃,pH=6.5的酸性老水;繁殖最佳条件为水温28-29℃、养殖水与纯净水1:1、雌雄比例1:1,配鱼过程中需要避光处理12-15h。与斑马鱼（Danio rerio）胚胎发育相似,四带无须魮胚胎发育经历了卵裂期、囊胚期、原肠期、神经胚期、器官形成期和出膜期等阶段;与斑马鱼胚胎48h出膜且开始形成色素不同,四带无须魮24h胚胎开始出膜且不形成色素,有利于早期器官形成和发育的观察。四带无须魮体细胞染色体数目2n=50,以公鸡血红细胞DNA含量2.30pg/2c为标准计算,其DNA含量为1.50pg/2c。以线粒体13个蛋白编码基因的氨基酸序列构建的鲃亚科系统发育树显示四带无须魮在鲃亚科鱼类的进化史上属于出现较早的鱼类。对模式鱼类鳍发育相关基因的研究显示,T-box转录因子eomesa基因突变导致斑马鱼背鳍缺失,钾离子通道蛋白kcnk5b基因的突变促进斑马鱼鳍异速生长,shh基因增强子ZRS大片段缺失影响青鳉鱼（Oryzias latipes）胸鳍或背鳍形成;金鱼（Carassius auratus）chordinA基因突变造成双尾鳍表型。为对四带无须魮鳍性状进行改造,本研究克隆了四带无须魮eomesa基因、ZRS增强子序列、kcnk5b和chordin基因的编码区序列。结果如下:kcnk5b基因编码区全长1347 bp,编码448个氨基酸;chordin基因编码区全长2826 bp,编码氨基酸长度941;eomesa基因包含六个外显子,全长4413 bp,编码区长2004 bp,编码氨基酸长度667;克隆ZRS增强子全长4756 bp。kcnk5b、chordin和eomesa基因编码区序列与斑马鱼对应基因编码区序列核苷酸相似性分别为81%、84%和88%,氨基酸相似性为79%、87%和95%。与鲃亚科滇池金线鲃（Sinocyclocheilus grahami）对应基因序列比较显示,kcnk5b、chordin和eomesa基因编码区核苷酸相似为91%、91%和92%,氨基酸相似性88%、94%和95%。为构建无背鳍“蛋种”四带无须魮,利用CRISPR/Cas9技术,设计3个靶点,分别敲除eomesa基因,利用T7E1酶切方法和TA克隆测序方法检测效率,结果显示基因敲除效率在48%-64%之间。目前为止,共获得eomesa F0嵌合体65尾,F1杂合子11尾;在F0和F1个体中未发现背鳍发育缺失表型,其背鳍缺失表型需待F2纯合子进行确认。本研究不仅在四带无须魮繁殖、胚胎发育、染色体倍性和基因组大小等基础生物学方面积累了一些材料,而且在四带无须魮基因组编辑育种方面进行了探索。本研究为观赏鱼的遗传改良提供了新的思路。
相金柱[8]（2018）在《小鼠多能干细胞分泌Activin A提高其向囊胚EPI嵌合能力的研究》文中研究说明小鼠多能干细胞（Pluripotent stem cells,PSCs）不仅可为探讨组织发生和细胞分化等发育生物学问题提供理想的研究模型,还可用于转基因动物的生产,因此具有重要的研究及应用价值。目前,使用PSCs进行转基因小鼠生产的技术主要是胚胎注射,依据受体胚胎发育时期的不同,可分为囊胚注射、4细胞或8细胞期胚胎注射、2细胞期胚胎注射及1细胞期胚胎注射等,其中最为常用的是4细胞或8细胞期胚胎注射和囊胚注射。与囊胚注射相比,4细胞或8细胞期胚胎注射能够得到嵌合效率更高的嵌合体小鼠,甚至可在F0代获得几乎完全由PSCs发育来的小鼠个体（PS-小鼠）。然而,通过4细胞或8细胞期胚胎注射获得F0代PS-小鼠的机制尚需深入研究。研究表明,注射到早期胚胎中的PSCs会影响受体胚胎的发育命运,而分泌蛋白是细胞之间相互调节所依赖的重要成分之一。因此,本研究以PSCs分泌蛋白为切入点探讨其对早期胚胎发育命运的影响。为减少8细胞期胚胎致密化的影响,本研究主要以4细胞期胚胎为研究对象。首先,本研究通过4细胞期胚胎注射,证实了注射到胚胎中的外源PSCs会阻碍受体胚胎上胚层（Epiblast,EPI）的发育,进而替代受体胚胎EPI发育为胎儿个体。其次,采用PSCs条件培养基对4细胞期胚胎进行处理,发现PSCs条件培养基能够阻碍胚胎EPI的发育,表明PSCs可能通过分泌某些蛋白的方式调控早期胚胎发育的命运。为明确PSCs条件培养基中阻碍受体胚胎EPI细胞发育的有效成分,本研究使用质谱技术对PSCs条件培养基进行检测,经分析及筛选发现Activin A是PSCs分泌蛋白中的重要有效成分。为了探讨Activin A对早期胚胎发育的影响,本研究将4细胞期胚胎置于含有Activin A的培养基中进行培养,待其发育到囊胚时,通过免疫荧光染色及转录组测序等方法对其EPI、滋养外胚层（Trophectoderm,TE）和原始内胚层（Primitive Endoderm,PE）的标记基因及蛋白进行检测。结果表明,Activin A能够阻碍胚胎EPI的发育,并对TE的发育具有促进作用。此外,本研究还分析了Activin A的主要受体ALK4等在小鼠附植前胚胎中的表达模式。数据显示,ALK4等在各时期胚胎中均有表达,但在囊胚中的表达量低于其他时期胚胎。随后本研究探讨了 Activin A对胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）在嵌合体中嵌合比率的影响。结果显示:与对照组相比,注射到Activin A处理后囊胚中的ESCs不仅更易于嵌合到胚胎期（Embryonic day,E）4.5天囊胚的EPI细胞中,且在E10.5胎儿个体中的贡献率也更高。将注射ESCs的4细胞期胚胎置于Activin A中培养,可使ESCs更易于嵌合到E4.5胚胎的EPI中。这表明,Activin A可通过阻碍受体胚胎EPI的发育,来提高外源ESCs向EPI嵌合的能力,甚至替代受体胚胎发育为胎儿个体。综上所述,本研究探索了 PSCs分泌蛋白对早期胚胎发育命运的影响,并以Activin A为例探讨了 4细胞期胚胎注射获得嵌合体小鼠的嵌合效率高于囊胚注射的机理。与囊胚相比,4细胞等较早时期的胚胎中由于各受体表达量较高使其对PSCs分泌蛋白具有较为灵敏的应答,更易于使其发育命运发生改变（阻碍其EPI细胞的发育）,从而提高PSCs在EPI及嵌合体中的嵌合效率。因此,本研究不仅可为进一步优化嵌合体生产系统提供理论基础,也拓展了人们对PSCs分泌蛋白Activin A在小鼠附植前胚胎发育过程中调控作用的认识。
李亚芳[9]（2018）在《表达禽流感病毒HA蛋白鸡输卵管生物反应器研究》文中进行了进一步梳理转基因鸡作为生物反应器因其世代间隔短,蛋白产量和糖基化程度高等卓越的优势成为生物科学领域的研究热点之一。禽类独特的生殖系统结构使得禽类转基因技术研究进程远远落后于哺乳动物,限制了转基因鸡生物反应器的研究进展。随着慢病毒载体的广泛应用和鸡原始生殖细胞培养技术的发展,已实现外源蛋白在家禽输卵管中高效、特异表达。血凝素（HA）蛋白是禽流感病毒（AIV）中最重要的保护性抗原,免疫原性强,基于HA蛋白的基因工程疫苗已表现出良好的免疫效果和应用前景。本研究以EGFP为报告基因,构建鸡卵清蛋白（Ovalbumin,OV）启动子真核表达载体,转染原代输卵管上皮细胞与CHO细胞,筛选得到1.1 kb的高效OV启动子。构建1.1 kb OV启动子表达H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白真核表达载体p OV1.1k-HA,转染CHO细胞。PCR、RT-PCR鉴定结果证明HA基因整合至CHO细胞基因组,并进行转录;SDS-PAGE、Western blot及血凝试验结果证明HA蛋白在CHO细胞内的表达,并具有免疫反应性和血凝活性。以纯化的HA蛋白免疫4周龄SPF鸡,2周后加强免疫一次,加强免疫3周HI抗体水平为6.3log2;以106EID50 H5N1（A/Goose/Guangdong/1/96）亚型禽流感病毒鼻腔接种SPF鸡,免疫组100%存活,喉拭子和泄殖腔拭子均未分离到病毒,对照组100%死亡。结果表明,筛选的1.1 kb OV启动子可有效驱动HA蛋白表达,表达的HA蛋白免疫SPF鸡对禽流感病毒攻击提供完全保护。为了建立表达HA蛋白的输卵管生物反应器,我们首先采用瞬时表达的方法分析OV启动子在鸡输卵管内的表达活性,将重组载体p OV1.1k-HA经聚乙烯亚胺包裹后,经翅静脉注射产蛋高峰期母鸡,连续注射2天后收集所产鸡蛋,分离蛋清,通过Western blot分析,在70 KD处检测到HA蛋白条带,血凝试验结果证明HA蛋白具有血凝活性。结果表明,筛选的1.1 kb OV启动子可有效驱动HA蛋白在产蛋鸡输卵管中表达,为进一步获得转基因鸡输卵管生物反应器奠定基础。在成功建立输卵管瞬时表达模型的基础上,构建1.1 kb OV启动子表达HA的慢病毒载体,包装慢病毒,测定病毒滴度为9.8×107 Tu/m L;利用赤道开窗法,将重组慢病毒注射到受精鸡胚的胚盘（X期）下腔,以获得转基因鸡。共注射鸡胚219枚,孵化得到出雏鸡39只,孵化率为17.8%。通过PCR鉴定,获得14只基因组中有HA基因整合的G0代鸡,转基因阳性率为35.8%。结果表明,利用慢病毒介导的基因转移技术成功获得整合HA基因的转基因鸡。本研究首先筛选到1.1 kb OV启动子,在细胞水平表达HA蛋白,纯化的HA蛋白免疫鸡后对禽流感病毒攻击提供100%保护。在成功建立瞬时表达模型的基础上,通过慢病毒介导的基因转移技术,获得整合HA基因的转基因鸡,为鸡输卵管生物反应器表达保护性抗原和珍贵药物蛋白的研究奠定了基础。
吴宝江[10]（2018）在《利用新型胚胎干细胞探索构建小鼠人造胚胎模型》文中研究说明胚胎干细胞（Embryonic stem cell,ESCs）具有自我更新能力和高度分化潜能,是细胞治疗以及体外器官再生良好的细胞来源,在多种疾病的治疗方面有很大应用价值。目前已成功建立并获得小鼠、大鼠和人类各种类型的胚胎干细胞。在我国,小鼠和人类干细胞研究取得了多项世界领先水平的研究成果。体外分离建系的小鼠ESCs细胞从发育特征上接近着床前囊胚的ICM细胞,通过嵌合体实验证明ESCs具有贡献胚胎的所有组织,包括生殖嵴,但是不具备胚外外胚层的贡献能力。利用小鼠胚胎干细胞生产人造配子的研究取得突破性进展,但是关于人造胚胎的研究进展相对较慢。因此,本研究利用小鼠八倍体胚胎作为人造胚胎的发育框架,探究小鼠人造胚胎模型。由于ESCs不能形成胎盘,所以本文建立一种具有发育形成胎盘能力的小鼠囊胚来源的新型胚胎干细胞（Advanced pluripotent stem cells,ASCs）。并进一步结合 ASCs 和 8N 胚胎探索建立小鼠人造胚胎发育模型。本研究共分为三个部分,主要的研究结果如下:一、制备小鼠八倍体胚胎发育模型关于以小鼠为代表的哺乳动物多倍体胚胎（4N和8N）发育阻滞的可能机制,虽然从细胞水平和分子水平进行了部分探索,但是还没有形成明确和完整的科学结论。所以我们以小鼠4N和8N的多倍体胚胎作为研究对象,以体内外发育为基础,主要从分子水平探讨其发育阻滞的可能机制。实验结果显示,8N胚胎在体外培养条件下可发育到囊胚阶段,但是不能正常发育到原肠胚。检测发现8N胚胎细胞胚层分化、细胞凋亡、细胞自噬和表观遗传修饰等发生了改变。这些变化可能影响小鼠8N胚胎发育,并成为8N胚胎不能正常发育的可能原因。正由于8N胚胎能形成着床点,而不能发育形成正常的个体,因此可以利用8N胚胎框架进一步探讨小鼠人造胚胎发育模型的研究。二、小鼠新型胚胎干细胞系的诱导及分子鉴定在本实验我们通过两步法诱导建系小鼠囊胚来源的新型胚胎干细胞ASCs。现将小鼠囊胚用化学成分明确的含有激活素A和成纤维细胞生长因子的培养液中,然后再把培养液换成含有激活素A,骨形成蛋白4,CHIR99021和白血病抑制因子的培养液中,从而获得ASCs细胞系。体外培养条件下ASCs细胞具有维持自我更新能力。RNA-Seq和全基因组DNA甲基化测序分析结果显示ASCs与ESCs呈现明显不同的基因表达模式和DNA甲基化水平。从转录组测序结果可以看出,ASCs同时表达多能性基因（Oct4,Sox2和Nanog等）和中胚层分化基因（Eomes,Eras,Tdgf1,Evx1,hand1和Wnt5α等）。而从DNA甲基化水平上ASCs更接近EpiSCs,近50%的甲基化位点与EpiSCs相同,这表明ASCs可稳定的维持基因组高甲基化状态。但是雌性ASCs细胞两条X染色体均处于活化状态,正好与EpiSCs细胞相反。更重要的是,ASCs细胞具有完整的印记基因表达模式,ASCs中印记基因的表达水平显着比ESCs高。因此,ASCs细胞从转录水平,表观遗传修饰和多能性方面存在独特的特征,以上的特征确保ASCs细胞的强大的稳定性和多能性。这些特征足以证明ASCs与ESCs和EpiSCs存在明显不同的自我更新机制。我们获得ASCs细胞对进一步探索构建小鼠人造胚胎提供干细胞来源。三、ASCs多能性鉴定及利用ASCs探索构建人造胚胎模型在胚胎干细胞多能性方面,ASC细胞中cMyc的细胞核定位信号显着高于ESCs细胞,而其他的多能性蛋白定位情况基本与ESCs细胞相一致。ASCs是一种新型的具有独特的自我更新能力的小鼠多能性胚胎干细胞,它的干性正处于ESCs和EpiSCs两种小鼠胚胎干细胞的中间状态。ASCs除了具有维持自我更新能力以外还具备较高的发育潜能。嵌合体实验显示,ASC细胞除了贡献胎儿组织、生殖嵴和卵黄囊以外同时可贡献胎盘迷路滋养层组织,但是不能贡献胎盘巨细胞滋养层部分的能力。而且通过四倍体补偿技术获得高效率的ASCs小鼠,这对胚胎干细胞的研究提供新思路和新的研究工具。同时,我们利用ASCs细胞和8N胚胎的框架相结合,尝试重构小鼠人造胚胎发育模型。我们建立的ASCs细胞和8N重构胚胎模型能在体外培养条件下支持着床前胚胎的发育,但是着床后不能发育形成胎儿组织。所以对研究人造胚胎方面具有一定的应用价值。今后我们将进一步完善ASCs细胞和8N重构胚胎模型的研究。
二、转移早期囊胚期细胞制备嵌合体鸡（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、转移早期囊胚期细胞制备嵌合体鸡（论文提纲范文）
（1）非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 非人灵长类胚胎早期发育 |
| 1.2.1 配子形成 |
| 1.2.2 受精 |
| 1.2.3 卵裂 |
| 1.2.4 囊胚形成 |
| 1.2.5 植入 |
| 1.2.6 早期胚胎发育的分子调控 |
| 1.2.7 早期胚胎发育与环境应激 |
| 1.3 非人灵长类胚胎早期发育调控研究 |
| 1.3.1 单细胞组学技术揭示胚胎早期发育的分子调控 |
| 1.3.2 利用体细胞核移植研究胚胎重编程过程 |
| 1.4 非人灵长类疾病模型研究 |
| 1.4.1 非人灵长类基因组编辑研究现状 |
| 1.4.2 基因编辑技术的安全性问题 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 基于单细胞转录组测序的猕猴胚胎植入前发育研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验设计 |
| 2.3 实验材料与方法 |
| 2.3.1 动物来源 |
| 2.3.2 实验主要试剂 |
| 2.3.3 实验主要仪器 |
| 2.3.4 卵母细胞采集 |
| 2.3.5 建立体外受精/体细胞核移植/孤雌激活/孤雄发育胚胎 |
| 2.3.6 胚胎培养 |
| 2.3.7 单细胞样本收集 |
| 2.3.8 单细胞转录组数据分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 单精子注射、体细胞核移植、单性生殖胚胎的植入前转录图谱 |
| 2.4.2 猕猴胚胎植入前发育的转录阻滞 |
| 2.4.3 猕猴植入前胚胎转录组的母源—合子转化 |
| 2.4.4 表观遗传调控相关基因的异常表达与胚胎阻滞相关 |
| 2.4.5 通过降低核移植胚胎中异常的H3K9me3修饰提高胚胎发育率 |
| 2.5 讨论及小结 |
| 第三章 建立DAX1基因靶向编辑的食蟹猴模型 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验设计 |
| 3.3 实验材料与方法 |
| 3.3.1 实验主要试剂和仪器 |
| 3.3.2 动物来源、卵采集、体外受精 |
| 3.3.3 建立DAX1基因靶向编辑食蟹猴 |
| 3.3.4 编辑效率检测:T7酶切及测序 |
| 3.3.5 脱靶检测 |
| 3.3.6 H&E染色 |
| 3.3.7 免疫组化和免疫荧光检测 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 建立DAX1基因靶向修饰的食蟹猴模型 |
| 3.4.2 Cas9介导的模型猴生殖系细胞DAX1基因靶向突变 |
| 3.4.3 DAX1基因突变引起模型猴猴睾丸发育异常 |
| 3.4.4 DAX1基因突变不会导致支持细胞发育异常 |
| 3.4.5 DAX1基因突变导致Wnt/β-catenin信号通路异常上调 |
| 3.4.6 DAX1基因突变引起模型猴肾上腺发育异常 |
| 3.5 讨论及小结 |
| 第四章 食蟹猴胚胎的干细胞嵌合研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验设计 |
| 4.3 实验材料与方法 |
| 4.3.1 食蟹猴多能干细胞系的建立 |
| 4.3.2 多能干细胞的荧光标记 |
| 4.3.3 干细胞体外分化实验 |
| 4.3.4 构建嵌合体胚胎 |
| 4.3.5 胚胎培养/延迟培养及胚胎移植 |
| 4.3.6 免疫组化染色 |
| 4.3.7 胚胎移植、孕检、胎儿及新生猴组织样本采集 |
| 4.3.8 胎猴/新生猴组织处理 |
| 4.3.9 特异性基因PCR检测 |
| 4.3.10 单细胞RNA-seq |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 建立多能干细胞嵌合猴胚胎 |
| 4.4.2 建立多能干细胞嵌合食蟹猴 |
| 4.4.3 通过基因表达谱分析揭示多能干细胞的嵌合机制 |
| 4.4.4 食蟹猴pESCs在成体猴生殖系的嵌合 |
| 4.4.5 胚胎微环境影响多能干细胞嵌合效率 |
| 4.5 讨论及小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读博士期间发表论文目录 |
| 附录 B 实验动物伦理审批表 |
| 附录 C 其他需要说明的内容 |
（2）人胚胎原肠前动态发育研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 环境因素与生殖健康 |
| 1.1.1 环境污染与生殖健康 |
| 1.1.2 生活方式与配子发生 |
| 1.1.3 胚胎体外培养环境压力与表观遗传改变 |
| 1.2 早期胚胎发育概述 |
| 1.2.1 早期胚胎发育 |
| 1.2.2 多能干细胞与胚胎发育 |
| 1.3 着床前胚胎发育 |
| 1.3.1 辅助生殖技术现状 |
| 1.3.2 着床前胚胎发育过程 |
| 1.3.3 着床前胚胎基因调控 |
| 1.4 着床后胚胎发育 |
| 1.4.1 胚胎2D体外培养体系的建立 |
| 1.4.2 着床后胚胎发育过程 |
| 1.4.3 着床后胚胎发育转录因子调控 |
| 1.4.4 人类胚胎干细胞模型 |
| 1.5 信号通路在胚胎发育及干细胞中的研究 |
| 1.5.1 Wnt信号通路与胚胎发育 |
| 1.5.2 TGF-β/Activin/Nodal信号通路对胚胎发育的作用 |
| 1.6 论文的立题依据及主要研究内容 |
| 第二章 实验材料及方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 材料来源 |
| 2.1.2 主要试剂及配制方法 |
| 2.1.3 使用抗体 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.1.5 耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 胚胎样品的准备 |
| 2.2.2 胚胎体外培养 |
| 2.2.3 Matrigel浓度的选择 |
| 2.2.4 全胚染色 |
| 2.2.5 胚胎冰冻切片及切片染色 |
| 2.2.6 共聚焦显微镜拍照 |
| 2.2.7 单细胞消化分离 |
| 2.2.8 细胞测序过程 |
| 2.2.9 测序结果分析 |
| 第三章 人胚胎原肠前动态发育研究实验结果 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 人胚胎体外3D培养体系的建立 |
| 3.2.1 人胚胎体外培养体系探索 |
| 3.2.2 着床后胚胎发育过程是谱系动态变化的过程 |
| 3.3 EPI动态发育研究 |
| 3.3.1 EPI发育过程是naive向 primed转变的过程 |
| 3.3.2 EPI发育阶段互相联系又各自表达不同基因 |
| 3.3.3 人类与非人灵长类EPI发育既有差异又有保守性 |
| 3.4 着床后胚胎关键结构的形成 |
| 3.4.1 羊膜上皮是从EPI中迁移出来的一群独特的细胞 |
| 3.4.2 胚胎前后轴及原条前体的形成 |
| 3.5 滋养层细胞发育是分化发育的过程 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 人胚胎体外培养体系的突破 |
| 4.2 本研究填补了着床后人胚胎发育分子机制的空白 |
| 4.3 胚胎发育过程是多能性细胞从naive到 primed态转变过程 |
| 4.4 人类胚胎与其他物种胚胎发育的差异 |
| 4.5 人胚胎发育过程中特殊结构的形成 |
| 4.6 滋养层细胞发育分化 |
| 4.7 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 论文的创新性 |
| 5.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读博士期间取得的科研成果及奖励 |
| 附录 B 医学伦理证明 |
（3）孤雌生殖人类胚胎干细胞技术的专利适格性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 第一节 选题背景及意义 |
| 第二节 文献综述 |
| 一、国内研究现状 |
| 二、国外研究现状 |
| 第三节 研究内容及研究方法 |
| 一、研究内容 |
| 二、研究方法 |
| 第四节 创新点 |
| 第二章 我国孤雌生殖HESC技术的专利审查及现存问题 |
| 第一节 孤雌生殖HESC技术与传统技术的比较 |
| 一、孤雌生殖HESC技术的相关概念 |
| 二、HESC的获取来源 |
| 三、孤雌生殖HESC技术的优势 |
| 四、孤雌生殖HESC技术在我国的专利授权情况 |
| 第二节 《专利审查指南》修改前对孤雌生殖HESC技术的专利适格性认定 |
| 一、湖南光琇公司孤雌生殖HESC技术的专利复审案 |
| 二、专利适格性判断的法律依据 |
| 第三节 《专利审查指南》修改后依然存在的问题 |
| 一、新修正条款 |
| 二、最大的亮点 |
| 三、现存的问题 |
| 本章小结 |
| 第三章 传统与孤雌生殖HESC技术的专利适格性争议 |
| 第一节 干细胞领域专利适格性的判断模式 |
| 一、欧洲模式 |
| 二、美国模式 |
| 第二节 传统HESC技术的专利适格性争议 |
| 一、传统HESC技术的伦理争议 |
| 二、WARF案发明在美、欧、中的专利适格性认定 |
| 三、城户常雄案发明在美、欧、中的专利适格性认定 |
| 第三节 孤雌生殖HESC技术的专利适格性争议 |
| 一、孤雌生殖HESC技术的伦理争议 |
| 二、欧洲认定孤雌生殖HESC技术具有专利适格性 |
| 三、澳大利亚认定孤雌生殖HESC技术具有专利适格性 |
| 四、孤雌生殖HESC技术在其他国家的专利授权情况 |
| 本章小结 |
| 第四章 我国授予孤雌生殖HESC技术专利权保护的正当性与必要性 |
| 第一节 授予专利权保护的正当性 |
| 一、符合利益平衡要求 |
| 二、符合中国伦理指南的指导原则 |
| 三、符合不断变化的社会公德内涵 |
| 第二节 授予专利权保护的必要性 |
| 一、干细胞产业的政策导向 |
| 二、干细胞产业发展的需要 |
| 本章小结 |
| 第五章 对我国孤雌生殖HESC技术专利审查制度的完善建议 |
| 第一节 孤雌生殖HESC技术在我国具有专利适格性 |
| 一、不属于科学发现 |
| 二、不属于疾病的诊断和治疗方法 |
| 三、HESC及其制备方法不属于不可专利的主题 |
| 四、不属于人胚胎的工商业目的的运用 |
| 第二节 对《专利审查指南》的完善建议 |
| 一、在专利审查中将14天研究期限适用于孤雌囊胚 |
| 二、允许以现存孤雌干细胞系进行研究的成果可专利 |
| 三、对具体条款的修改建议 |
| 本章小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（4）PGT-A应用于复发性流产伴不孕患者妊娠结局的回顾性研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1 RSA概述 |
| 1.1 女方年龄 |
| 1.2 夫妻双方染色体核型 |
| 1.2.1 染色体平衡易位 |
| 1.2.2 染色体罗伯逊易位 |
| 1.2.3 染色体倒位 |
| 1.3 生殖道解剖异常 |
| 1.4 内分泌因素 |
| 1.5 血栓前状态 |
| 1.6 免疫因素 |
| 1.7 感染等其它相关因素 |
| 1.8 男方因素 |
| 1.9 不明原因 |
| 2 PGT-A概述 |
| 2.1 胚胎活检技术 |
| 2.1.1 极体活检 |
| 2.1.2 卵裂期活检 |
| 2.1.3 囊胚期活检 |
| 2.1.4 非侵入性植入前遗传筛查(NIPGS) |
| 2.2 活检后胚胎冷冻 |
| 2.3 PGT测序技术的发展 |
| 2.3.1 荧光原位杂交技术(FISH) |
| 2.3.2 微阵列比较基因组杂交技术(a CGH) |
| 2.3.3 单核苷酸多态性分析微阵列(SNP array) |
| 2.3.4 二代测序技术(NGS) |
| 3 PGT-A在复发性流产患者中的应用 |
| 3.1 复发性流产患者使用PGT-A适应证 |
| 3.2 复发性流产患者行PGT-A助孕的流程 |
| 3.2.1 充分评估和知情同意书的签署 |
| 3.2.2 超促排卵以及胚胎活检 |
| 3.2.3 高通量测序和获取染色体检测结果报告 |
| 4 复发性流产患者进行PGT-A的争议 |
| 4.1 赞同方 |
| 4.1.1 PGT-A提高了RSA患者的妊娠率和单胚胎移植率 |
| 4.1.2 高龄女性可从PGT-A中受益 |
| 4.1.3 使用PGT-A节省治疗成本 |
| 4.1.4 减少异常胚胎的冻存 |
| 4.2 反对方 |
| 4.2.1 PGT活检中嵌合体胚胎的存在可能影响结果的准确性 |
| 4.2.2 活检对胚胎的损伤 |
| 4.2.3 PGT-A治疗周期长 |
| 4.2.4 卵巢储备功能低下患者无整倍体胚胎移植可能性增加 |
| 4.2.5 染色体异常的胚胎早期发育终止 |
| 1 资料与方法 |
| 1.1 研究对象与分组 |
| 2 方法 |
| 2.1 卵母细胞和精子获取 |
| 2.2 常规IVF和 ICSI授精 |
| 2.3 胚胎观察 |
| 2.4 囊胚评级和活检 |
| 2.5 PGT-A检测 |
| 2.6 胚胎移植 |
| 2.7 评价指标 |
| 2.8 统计学方法 |
| 2.9 流程图 |
| 3 结果 |
| 3.1 两组基线数据统计学分析 |
| 3.2 控制性超促排卵及实验室胚胎发育情况统计学分析 |
| 3.3 PGT-A组胚胎染色体非整倍体检测结果 |
| 3.4 两组患者临床妊娠结局对比 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（5）囊胚补偿法制备人-猪嵌合胚的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 嵌合体制备人源化猪器官/组织的研究 |
| 1.1 异种移植简介 |
| 1.2 嵌合体简介 |
| 1.3 嵌合体研究进展 |
| 1.4 人-猪嵌合体研究现状 |
| 1.4.1 hiPSC的全能性及新干细胞的发现 |
| 1.4.2 对宿主猪进行基因改造 |
| 1.5 人-猪嵌合体面临的问题 |
| 1.5.1 低嵌合效率 |
| 1.5.2 嵌合过程中细胞贡献的不可控性 |
| 1.5.3 道德问题的进一步开放 |
| 第二章 FAH基因及KITLG基因研究进展 |
| 2.1 FAH基因相关研究 |
| 2.1.1 FAH基因与HTI相关性研究进展 |
| 2.1.2 NTBC作用机制研究 |
| 2.1.3 遗传性酪氨酸血症1型相关疾病模型研究进展 |
| 2.2 KITLG基因相关研究 |
| 研究目的及意义 |
| 第二部分 实验内容 |
| 第一章 FAH基因敲除巴马猪的制备 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.1.1 动物性材料 |
| 1.1.1.2 相关仪器与耗材 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.1.3.1 CRISPR/Case 9载体的设计与构建 |
| 1.1.3.2 猪耳成纤维细胞系的建立 |
| 1.1.3.3 sgRNA敲除效率检测 |
| 1.1.3.4 单细胞克隆的获得及鉴定 |
| 1.1.3.5 FAH基因敲除猪的制备及鉴定 |
| 1.1.3.6 仔猪血常规与血生化检测 |
| 1.1.3.7 Western Blot检测 |
| 1.1.3.8 FAH~(+/-)猪繁育能力统计 |
| 1.1.3.9 数据统计与分析 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.2.1 打靶载体构建及效率检测 |
| 1.2.2 单细胞克隆突变类型鉴定 |
| 1.2.3 FAH基因敲除猪制备及鉴定 |
| 1.2.4 仔猪血液检测 |
| 1.2.5 Western Blot检测 |
| 1.2.6 FAH~(+/-)猪繁育能力分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 KITLG基因敲除五指山猪胚胎制备 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.1.1 动物性材料 |
| 2.1.1.2 相关仪器与耗材 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.1.3.1 打靶载体设计与构建 |
| 2.1.3.2 猪耳成纤维细胞系复苏与转染 |
| 2.1.3.4 sgRNA敲除效率检测 |
| 2.1.3.5 单细胞克隆的获得及鉴定 |
| 2.1.3.6 KITLG基因敲除猪胚胎的制备及鉴定 |
| 2.1.3.7 石蜡切片及HE染色观察 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 sgRNA打靶载体的构建及基因突变效率检测 |
| 2.2.2 单细胞克隆鉴定 |
| 2.2.3 KITLG基因敲除猪胚胎的制备及鉴定 |
| 2.2.4 石蜡切片及HE染色观察 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 囊胚补偿法制备人-猪嵌合囊胚 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.1.1 动物性材料 |
| 3.1.1.2 相关仪器与耗材 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.1.3.1 单克隆细胞复苏与培养 |
| 3.1.3.2 孤雌囊胚的制备 |
| 3.1.3.3 FAH~(-/-)、KITLG~(-/-)体细胞核移植胚胎的制备 |
| 3.1.3.4 人胚胎干细胞H9无滋养层培养 |
| 3.1.3.5 注射法制备嵌合囊胚 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 孤雌及重构胚胎制备 |
| 3.2.2 人胚胎干细胞H9无滋养层培养 |
| 3.2.3 显微注射制备嵌合囊胚 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 总结论 |
| 参考文献 |
| 附录 英文缩略词 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
（6）鸡Dazl荧光报告基因追踪生殖细胞迁移和分化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 附录：缩略词（中英文对照） |
| 第一部分 综述 |
| 前言 |
| 1 家禽种质资源的保存 |
| 1.1 利用胚盘细胞制备生殖系嵌合体 |
| 1.2 利用ESC制备生殖系嵌合体 |
| 1.3 利用PGC制备生殖系嵌合体 |
| 2 转基因鸡的产生 |
| 3 iPSC的研究进展 |
| 3.1 iPSC的概述 |
| 3.2 禽类iPSC的研究进展 |
| 3.3 诱导多能干细胞分化为生殖细胞的研究进展 |
| 4 Dazl的研究进展 |
| 4.1 DAZ基因家族的起源与结构 |
| 4.2 Dazl在生殖细胞发育中的作用 |
| 5 基因组定点编辑技术 |
| 5.1 基因组定点编辑技术的分类 |
| 5.2 CRISPR/Cas9技术 |
| 5.3 CRISPR/Cas9的在转基因动物中的应用 |
| 5.4 脱靶效应 |
| 6 本研究的目的和意义 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第一章 DAZL在鸡PGC和iPSC细胞中的表达鉴定 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 DAZL多克隆抗体的制备 |
| 2.2 DAZL在鸡PGC和iPSC细胞中的表达鉴定 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 鸡Dazl荧光报告载体的构建和定点敲入验证 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 CRISPR/Cas9表达载体的构建与敲除效率验证 |
| 2.2 Dazl荧光报告基因载体的构建 |
| 2.4 荧光报告载体在PGC打靶Dazl的验证 |
| 2.5 荧光报告载体在iPSC打靶Dazl的验证 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 Dazl荧光报告基因示踪PGC细胞迁移和iPSC分化 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 Dazl荧光标记PGC的迁移归巢鉴定 |
| 2.2 鸡Dazl报告基因示踪iPSC分化 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 总结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
（7）CRISPR/Cas9介导的四带无须魮eomesa突变体的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1 四带无须魮的研究进展 |
| 1.1 四带无须魮分类与分布 |
| 1.2 四带无须魮的命名和形态学特征 |
| 1.3 四带无须魮的国内外研究进展 |
| 2 鱼类早期胚胎发育 |
| 3 染色体的研究进展 |
| 4 DNA含量的的研究进展 |
| 5 鱼类线粒体的研究进展 |
| 6 CRISPR/Cas9 基因编辑系统 |
| 7 鱼类鳍相关突变体的研究进展 |
| 8 研究目的意义 |
| 第二章 四带无须魮基础生物学研究 |
| 1 实验材料的来源、人工养殖和繁殖 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 四带无须魮的人工养殖 |
| 1.3 四带无须魮的人工繁殖 |
| 2 实验试剂与设备 |
| 2.1 实验仪器 |
| 2.2 实验试剂 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 四带无须魮胚胎发育的观察 |
| 3.2 四带无须魮染色体的数目分析 |
| 3.3 四带无须魮DNA含量的测定 |
| 3.4 四带无须魮线粒体系统发育分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 四带无须魮DNA含量测定 |
| 4.2 染色体数目分析 |
| 4.3 四带无须魮系统发育分析 |
| 4.4 四带无须魮胚胎发育 |
| 5 讨论 |
| 5.1 四带无须魮的DNA含量 |
| 5.2 四带无须魮染色体 |
| 5.3 四带无须魮系统发育分析 |
| 5.4 四带无须魮胚胎发育时序 |
| 第三章 四带无须魮其相关基因的克隆 |
| 1 材料、试剂、仪器与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验设备 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 RNA提取和cDNA模板的制备。 |
| 1.4.2 DNA基因组制备 |
| 1.4.3 引物设计 |
| 1.4.4 PCR引物优化及电泳检测 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 四带无须魮kcnk5b CDS的克隆 |
| 2.2 四带无须魮eomesa基因的克隆 |
| 2.3 四带无须魮chordin CDS的克隆 |
| 2.4 四带无须魮ZRS增强子的克隆 |
| 3 讨论 |
| 第四章 CRISPR/Cas9 介导的四带无须魮突变体的构建 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 四带无须魮的来源 |
| 1.2 质粒 |
| 1.3 实验试剂与实验设备 |
| 1.3.1 实验所需试剂 |
| 1.3.2 实验设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 四带无须魮基因的克隆 |
| 2.2 设计g RNA及靶点检测引物 |
| 2.3 gRNA的合成 |
| 2.4 显微注射 |
| 2.5 检测敲除效率 |
| 3 CRISPR/Cas9 介导的四带无须魮eomesa突变体的构建 |
| 3.1 靶点及引物设计 |
| 3.2 g RNA的合成 |
| 3.3 敲除及检测结果 |
| 3.4 eomesa T1 F0 可遗传性检测 |
| 4 CRISPR/Cas9 介导的四带无须魮ZRS突变体构建的部分工作 |
| 4.1 靶点及引物设计 |
| 4.2 gRNA合成 |
| 5 讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 攻读硕士期间发表过的论文 |
| 致谢 |
（8）小鼠多能干细胞分泌Activin A提高其向囊胚EPI嵌合能力的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 多能干细胞研究进展 |
| 1.1.1小鼠PSCs研究概述 |
| 1.1.2 大鼠等动物以及人类PSCs研究概述 |
| 1.1.3 PSCs应用前景 |
| 1.2 嵌合体制备的研究概况 |
| 1.2.1 小鼠囊胚注射 |
| 1.2.2 小鼠4细胞或8细胞期胚胎注射 |
| 1.2.3 小鼠嵌合体制备的其他方法 |
| 1.2.4 影响小鼠PSCs在嵌合体中嵌合比率的因素 |
| 1.2.5 大鼠等物种嵌合体和异种嵌合体研究概况 |
| 1.2.6 嵌合体制备的研究意义 |
| 1.3 小鼠胚胎发育历程 |
| 1.3.1 TE和ICM细胞谱系的分化 |
| 1.3.2 PE和EPI细胞谱系的分化 |
| 1.3.3 影响小鼠胚胎发育命运的其他因素 |
| 1.4 分泌蛋白概述 |
| 1.4.1 分泌蛋白的转运 |
| 1.4.2 分泌蛋白的功能 |
| 1.5 Activin A概述 |
| 1.5.1 Activin蛋白的组成及结构 |
| 1.5.2 Activin蛋白作用的受体及信号通路 |
| 1.5.3 Activin A的生物学功能 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料与设备 |
| 2.2 实验试剂及配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验分析工具 |
| 2.5 数据分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 小鼠PSCs发育潜能及其对受体胚胎EPI发育的影响 |
| 3.1.1 小鼠PSCs发育潜能的检测 |
| 3.1.2 不同PSCs发育潜能的比较 |
| 3.1.3 小鼠ESCs阻碍早期胚胎EPI的发育 |
| 3.2 小鼠PSCs条件培养基蛋白成分的检测及其筛选 |
| 3.2.1 小鼠PSCs条件培养基阻碍EPI的发育 |
| 3.2.2 小鼠PSCs条件培养基中蛋白成分的检测 |
| 3.2.3 小鼠PSCs分泌蛋白的筛选 |
| 3.3 小鼠PSCs分泌蛋白ActivinA阻碍EPI的发育 |
| 3.3.1 ActivinA能够减少EPI细胞数 |
| 3.3.2 ActivinA抑制剂SB431542能增加EPI细胞数 |
| 3.3.3 ActivinA处理囊胚使其ESCs原代克隆的获得效率降低 |
| 3.4 ActivinA处理后胚胎的转录组分析 |
| 3.5 ActivinA促进TE的发育 |
| 3.6 ActivinA提高囊胚注射ESCs的嵌合能力 |
| 3.6.1 ActivinA增加ESCs在E4.5囊胚EPI中的嵌合比率 |
| 3.6.2 ActivinA增加ESCs在E10.5胎儿中的嵌合比率 |
| 3.7 ActivinA提高4细胞期胚胎注射ESCs向囊胚EPI嵌合的能力 |
| 3.8 小结与讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）表达禽流感病毒HA蛋白鸡输卵管生物反应器研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 家禽卵清蛋白基因的研究 |
| 1.1.1 卵清蛋白基因的表达调控 |
| 1.1.2 卵清蛋白启动子的研究进展 |
| 1.2 输卵管生物反应器的研究 |
| 1.2.1 输卵管生物反应器的优势 |
| 1.2.2 输卵管生物反应器的研究进展 |
| 1.3 转基因鸡的研究 |
| 1.3.1 母鸡特殊的生殖系统及早期胚胎发育 |
| 1.3.2 转基因鸡技术研究进展 |
| 1.4 禽流感疫苗的研究 |
| 1.5 存在问题与展望 |
| 1.6 本研究目的及意义 |
| 第2章 表达HA输卵管特异表达载体的构建及体外表达 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒与毒株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 实验动物与细胞 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 表达载体的构建 |
| 2.2.2 卵清蛋白基因启动子的筛选 |
| 2.2.3 HA基因的表达及免疫保护性分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 原代鸡输卵管细胞的培养结果 |
| 2.3.2 原代输卵管上皮细胞转染结果 |
| 2.3.3 CHO细胞转染结果 |
| 2.3.4 表达载体的构建及在CHO细胞中表达 |
| 2.3.5 血凝试验结果 |
| 2.3.6 HA蛋白的免疫保护性试验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 输卵管特异表达HA瞬时生物反应器的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 主要配制试剂及缓冲液 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 质粒复合物的制备 |
| 3.2.2 重组质粒注射产蛋鸡 |
| 3.2.3 蛋白的初步纯化 |
| 3.2.4 Western blot分析 |
| 3.2.5 血凝试验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组质粒注射产蛋鸡 |
| 3.3.2 Western blot分析 |
| 3.3.3 血凝试验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 输卵管特异表达HA转基因鸡制备 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 质粒、细胞、菌株、新生种蛋 |
| 4.1.2 主要仪器和耗材 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 慢病毒表达载体构建策略 |
| 4.2.2 引物设计与合成 |
| 4.2.3 慢病毒表达载体的构建 |
| 4.2.4 重组慢病毒滴度的测定 |
| 4.2.5 受精蛋胚盘注射及孵化 |
| 4.2.6 G0代转基因鸡的鉴定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 慢病毒表达的构建结果 |
| 4.3.2 重组慢病毒滴度的测定 |
| 4.3.3 鸡胚慢病毒注射及出雏分析 |
| 4.3.4 G0代鸡胚的鉴定 |
| 4.3.5 G0代出雏鸡检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）利用新型胚胎干细胞探索构建小鼠人造胚胎模型（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 小鼠四倍体胚胎发育的研究进展 |
| 1 哺乳动物四倍体胚胎的制备方法 |
| 1.1 受精卵核移植方法 |
| 1.2 抑制细胞分裂方法 |
| 1.3 卵裂球融合方法 |
| 2 小鼠四倍体胚胎的发育 |
| 2.1 四倍体细胞的增殖特征 |
| 2.2 四倍体胚胎的基因表达情况 |
| 2.3 小鼠四倍体胚胎的发育潜能 |
| 2.4 小鼠4N:2N嵌合体的制备及发育特征 |
| 2.5 体外模拟重建“人造胚胎”的研究现状 |
| 第二章 小鼠胚胎干细胞的研究进展 |
| 1 小鼠胚胎干细胞的多能性 |
| 1.1 早期胚胎发育与胚层分化 |
| 1.2 胚胎干细胞与多能性 |
| 1.3 胚胎干细胞多能性与全能性 |
| 2 小鼠胚胎干细胞自我更新调控网络 |
| 2.1 胚胎干细胞多能性的分子特征 |
| 2.2 胚胎干细胞全能性和基因调控网络 |
| 2.3 胚胎干细胞多能性和全能性的评价 |
| 2.4 建立新型胚胎干细胞的方法 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第三章 制备小鼠八倍体胚胎发育模型 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 抗体和主要试剂 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要试剂的配制 |
| 1.4 实验动物 |
| 1.5 小鼠胚胎的获得 |
| 1.6 小鼠4N和8N胚胎的制备 |
| 1.7 胚胎移植及E6.5-7.5天胚胎的收集 |
| 1.8 胚胎干细胞的免疫荧光染色 |
| 1.9 小鼠胚胎的TUNEL染色 |
| 1.10 RNA提取与反转录 |
| 1.11 实时荧光定量PCR |
| 1.12 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 小鼠8N胚胎的着床前后发育情况 |
| 2.2 小鼠8N胚胎的细胞谱系分化 |
| 2.3 小鼠8N胚胎的表观遗传修饰状态 |
| 2.4 小鼠8N胚胎的细胞凋亡和自噬的变化 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 小鼠新型胚胎干细胞系的诱导及分子鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要试剂的配制 |
| 1.4 实验动物 |
| 1.5 小鼠胚胎的获得 |
| 1.6 建立小鼠AFSCs细胞系 |
| 1.7 诱导建立小鼠ASCs细胞系 |
| 1.8 碱性磷酸酶染色 |
| 1.9 RNA-seq文库的准备 |
| 1.10 RNA-seq分析 |
| 1.11 BS-seq文库的准备 |
| 1.12 BS-seq分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 小鼠AFSCs和ASCs细胞的诱导建系 |
| 2.2 小鼠AFSCs和ASCs细胞的转录物组分析 |
| 2.2.1 小鼠ASCs和AFSCs细胞的整体基因表达谱 |
| 2.2.2 小鼠ASCs和ESCs细胞之间的差异表达基因分析 |
| 2.3 小鼠ASCs和ESCs细胞的全基因组甲基化分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 ASCs多能性鉴定及利用ASCs探索构建人造胚胎模型 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 抗体和主要试剂 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要试剂的配制 |
| 1.4 实验动物 |
| 1.5 小鼠胚胎的获得 |
| 1.6 碱性磷酸酶染色 |
| 1.7 小鼠胚胎的免疫荧光染色 |
| 1.8 嵌合体小鼠的制备及不同发育阶段胚胎的收集 |
| 1.9 四倍体补偿方法制备ASCs小鼠 |
| 1.10 核型分析 |
| 1.11 构建小鼠人造胚胎 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 小鼠AFSCs和ASCs细胞的多能性鉴定 |
| 2.2 小鼠ASCs细胞的体内发育潜能检测 |
| 2.3 利用小鼠ASCs探索构建人造胚胎模型 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 创新性 |
| 参考文献 |
| 附录1: 博士期间研究成果示意图 |
| 附录2: 攻读博士期间发表文章情况 |
| 致谢 |
四、转移早期囊胚期细胞制备嵌合体鸡（论文参考文献）
- [1]非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究[D]. 康宇. 昆明理工大学, 2020(04)
- [2]人胚胎原肠前动态发育研究[D]. 相立峰. 昆明理工大学, 2020(04)
- [3]孤雌生殖人类胚胎干细胞技术的专利适格性研究[D]. 卢琴. 华南理工大学, 2020(07)
- [4]PGT-A应用于复发性流产伴不孕患者妊娠结局的回顾性研究[D]. 戴旭. 西安医学院, 2020(08)
- [5]囊胚补偿法制备人-猪嵌合胚的研究[D]. 王莎莎. 广西大学, 2019(01)
- [6]鸡Dazl荧光报告基因追踪生殖细胞迁移和分化的研究[D]. 莫丽芬. 广西大学, 2019(01)
- [7]CRISPR/Cas9介导的四带无须魮eomesa突变体的构建[D]. 崔文耀. 上海海洋大学, 2019(07)
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