一、7690-Xu荧光染色法在泌尿系统疾病的应用研究（论文文献综述）
吴子健[1]（2021）在《通腑逐瘀法指导下抵当汤加减调控AQP4表达治疗大鼠急性脊髓损伤的作用机制研究》文中认为目的 本次研究结合急性脊髓损伤（acute spinal cord injury,ASCI）的研究现状和热点,基于导师的临床经验,以通过抑制水通道蛋白4（aquaporin 4,AQP4）的表达从而减轻ASCI后脊髓水肿为切入点,旨在探讨通腑逐瘀法治则指导下抵当汤加减治疗ASCI的可能作用机制,以期为推广通腑逐瘀法治疗ASCI提供理论依据。方法 第一部分:10周龄SD大鼠30只,按随机数字表法随机分为假手术组（A组）、自制打击器2cm组（B1组）、自制打击器4cm组（B2组）、NYU组1.25cm组（C1组）、NYU组2.5cm组（C2组）,每组各6只。除Sham组外,其余各组采用改良Allen’s法造模。B1、B2组将9g打击杆分别从2cm、4cm处自由坠落撞击T10脊髓,C1、C2组使用NYU打击器分别从1.25cm、2.5cm处撞击T10脊髓。各组造模完成后分别于1、3、5、7d进行BBB评分和Reuter评分,7d后行灌注取材,石蜡包埋切片,尼氏染色,观察各组组织受损程度和神经元存活率。第二部分:10周龄SD大鼠60只按随机分配方法随机分为假手术组（Sham）、模型组（Model）、抵当汤组（DDD）、TGN-020组（TGN-020）和抵当汤联合TGN-020组（DDD+TGN-020）,每组各12只。Sham组仅打开椎板暴露脊髓但不损伤脊髓;其余各组均采用自制脊髓打击器从40mm高度对脊髓进行打击。Sham组和Model组术后不予任何治疗措施干预,DDD组于术后3d予以抵当汤加减每日灌胃,持续3d,根据大鼠与人用药剂量体表面积换算法,DDD组大鼠每日用药剂量为5.04g/kg,采用蒸馏水进行稀释一定比例配制后予以灌胃处理,每日早晚各1次。TGN-020组处理方法:腹腔注射给药,每日用药剂量为5mg/kg,给药时间为3d。DDD+TGN-020组处理方法:予TGN-020腹腔注射给药,随后给予DDD灌胃处理。干预结束后进行行为学评价（BBB评分、斜板实验及Reuter评分）观察大鼠神经功能恢复情况,取材后进行脊髓组织大体观察和含水率检测、HE染色观察组织受损程度,尼氏染色观察神经元形态,免疫荧光检测各组脊髓组织AQP4、GFAP共表达的阳性细胞个数,Western Blot法检测各组脊髓组织中AQP4、GFAP、CSPG、PCNA、NGF、BDNF、GAP-43蛋白的表达量,q PCR法检测各组脊髓组织中CSPG、PCNA基因的表达量,电镜下观察各组髓鞘和神经元组织形态,高尔基染色观察树突和树突棘形态。第三部分:8周龄SD大鼠40只随机分为空白血清组和含药血清组,含药血清组给予5.04g/kg DDD灌胃,持续3d,空白血清组予等剂量超纯水灌胃,持续3d,干预结束后提取血清备用。每次取胚胎大鼠8-12只,通过机械-酶消化法提取星形胶质细胞（Astrocytes,AS）,细胞采用10%的高糖培养基培养,观察细胞传代至第3代进行后续实验。首先,免疫荧光鉴定细胞中GFAP含量,随后进行实验分组:空白组（Control group,CG）、模型组（Model group,MG）、空白血清组（Blank serum group,BSG）、DDD含药血清组（DDD）、TGN-020干预组（TGN-020）、DDD联合TGN-020组（DDD+TGN-020）,除MG外,其余各组均以划痕法进行造模,造模完成后DDD予以含药血清干预,BSG予以等剂量空白血清干预,TGN-020予以100nm TGN-020干预,DDD+TGN-020先予TGN-020干预后再予DDD干预。MTT法检测DDD含药血清干预AS的安全干预浓度、最佳干预时间和干预浓度,MTT法检测各组对RAS活性的影响,免疫荧光染色法检测RAS中AQP4和GFAP共表达的细胞数,Western Blot法检测各组RAS中AQP4、GFAP和NGF、BDNF、GAP-43蛋白的表达量,镜下观察DDD含药血清对RAS迁移率的影响。统计学方法:实验所得数据均使用SPSS21.0软件进行统计学处理,计量资料以均值±标准误（`X±S）表示,所得数据均经过正态性分布检测,若符合正态分布,则采用单因素方差分析,方差齐则采用LSD法,方差不齐则采用Games-Howell法;若不符合正态分布,则采用非参检验。以P<0.05提示差异具有统计学意义。结果 第一部分:自制脊髓打击器与NYU打击器建立脊髓损伤模型研究1.各组脊髓外观形态比较A组T10节段处硬脊膜完整,脊髓组织呈均匀乳白色,形态饱满圆润;B1、B2、C1、C2组T10节段处硬脊膜均完整,颜色呈不同程度的鲜红色或暗红色,损伤处可见水肿、瘀血及瘢痕组织增生,相对于B1、C1组,B2、C2组水肿更严重、瘀血范围更广、颜色更深、瘢痕组织更多。2.行为学评分比较BBB评分结果显示,A组术后除因手术致运动量减少外,未出现双下肢功能异常的表现,评分为21分;其余各组均出现不同程度的运动功能障碍,具体表现为:B2与B1、C2与C1相比,BBB评分显着降低,差异具统计学意义（P<0.05）;B1与C1、B2与C2相比,BBB评分无显着差异（P>0.05）。Reuter评分结果显示,A组术后未发现感觉功能异常现象;其余各组术后均出现不同程度的感觉功能异常现象,具体表现为B2、C2组术后1d牵张反射消失,肌力、肌张力减弱或消失,疼痛回缩反射迟钝,背部感觉存在或消失;B1、C1组术后1d除肌力消失外,牵张反射、肌张力、疼痛回缩反射、背部感觉均存在,术后3d肌力开始恢复。B2与B1、C2与C1相比,Reuter评分显着降低,差异具统计学意义（P<0.05）。B1与C1、B2与C2相比,Reuter评分无显着差异（P>0.05）。3.尼氏染色尼氏染色结果显示,A组脊髓组织结构完整,灰白质边界清晰,神经元细胞形态规则、胞核大、核仁清晰可见、数量多,胞质内可见斑块样尼氏体。相比A组,其余各组结构破坏更严重,灰白质结构不清,组织空白间隙更大,损伤处可见细胞呈空泡样改变或细胞皱缩、体积减小,神经元数量减少,尼氏体模糊或消失。4.脊髓受损面积比结果表明,A组未见受损区域,比值为0,其余各组均高于A组,差异具有统计意义（P<0.05）;相对于B1和C1,B2和C2损伤面积比值明显升高,差异具有统计意义（P<0.05）;B1与B2、C1与C2损伤面积比值差异不具有统计意义（P>0.05）。5.各组脊髓前、后角神经元损伤程度比较通过分析前、后角神经元阳性细胞数结果显示,A组神经元数目多,尼氏体含量多,其余各组均少于A组,差异具有统计意义（P<0.05）;相对于B1和C1,B2和C2神经元阳性细胞数明显减少,差异具有统计意义（P<0.05）;B1与B2、C1与C2神经元阳性细胞数差异不具有统计意义（P>0.05）。第二部分:抵当汤加减调节AQP4表达对SCI大鼠脊髓水肿的作用研究1.各组脊髓组织的大体观察从大体观察上来看,Sham组脊髓组织颜色鲜白,组织完整,未见瘀血部位和水肿;Model组在打击损伤部位可见明显的瘀血区域,瘀血颜色深红,瘀血范围较大,并可见明显脊髓水肿;DDD组在打击损伤部位可见较小的瘀血区域,瘀血部位颜色淡红,可见轻度水肿;DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组大体观察相似,肉眼见无显着差异。2.各组脊髓组织含水率与Sham组相比,其余各组脊髓组织含水率均显着增高（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组脊髓组织含水率均显着降低（P<0.05）;DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组组间比较,脊髓组织含水率没有显着差异（P>0.05）。3.行为学观察结果各组大鼠BBB评分、斜板实验结果以及Reuter评分显示,与Sham组相比,其余各组BBB评分和斜板实验得分均显着降低（P<0.05）,Reuter评分均显着升高（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组BBB评分均显着升高（P<0.05）,Reuter评分均显着降低（P<0.05）;DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组组间比较无显着差异（P>0.05）。4.HE染色Sham组组织结构完整,神经元等细胞形态结构良好,未见瘢痕组织或空洞形成,未见瘀血区域或炎性物质渗出。Model组损伤部位可见组织结构离乱,大量瘢痕组织和脊髓空洞的形成,可见明显的瘀血区域,并伴有大量的炎性细胞浸润,神经元等细胞皱缩,数量减少。其余三组可见组织形态结构较完整,可见少量脊髓空洞的形成,瘀血区域范围较小,炎性细胞清润较少,神经元等细胞形态结构较完整。使用Image J软件对各组空洞面积进行定量分析,结果显示,与Sham组相比,Model组脊髓空洞面积显着增加（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组脊髓空洞面积显着降低（P<0.05）;DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组脊髓空洞面积组间比较不具有显着差异（P>0.05）。5.尼氏染色观察各组神经元形态Sham组脊髓形态结构完整,灰质呈蝴蝶状,灰白质界限清晰,可见较多的神经元分布,神经元胞质内可见染色清晰的斑块状尼氏体,神经元胞体饱满,细胞核大,核仁明显。Model组脊髓组织破坏严重,结构不完整,灰、白质界限不清,可见大量的炎性细胞浸润,神经元皱缩、液化、坏死,形成较多的空泡,尼氏体较小或消失。相对Model组,DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组脊髓结构较完整,隐约可见灰白质界限,神经元仍可见,数量较多,空泡样改变减少,尼氏体数量较多、较饱满。但相对于Sham组,神经元仍存在固缩,胞浆减少,核变小,尼氏体减少等病理改变。6.免疫荧光检测各组AQP4、GFAP的阳性细胞表达量AQP4阳性细胞表达呈绿色,GFAP阳性细胞表达呈红色,DAPI染色呈深蓝色,AQP4+/GFAP+细胞表达呈黄色树枝状,各组染色背景干净,表达清晰,细胞核数量无显着差异（P>0.05）,具有可比性。Sham组少见或未见明显的AQP4+/GFAP+细胞,Model组可见较多的AQP4+/GFAP+细胞,且细胞亮度高,胞体肿胀程度严重。与模型组相比,DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组细胞数量较少,亮度较低,细胞肿胀程度减轻。对各组的AQP4+/GFAP+细胞进行计数和统计,与Sham组相比,其余各组AQP4与GFAP的阳性细胞占比均显着增高（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组AQP4与GFAP的阳性细胞占比显着降低（P<0.05）;DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组间相比较,AQP4与GFAP的阳性细胞占比无显着差异（P>0.05）。7.Western Blot法检测各组AQP4、GFAP、PCNA、CSPG、NGF、BDNF、GAP-43的蛋白表达量各组蛋白条带背景清晰,无杂带现象,蛋白表达量趋势明显,具有可比性。与Sham组相比,各组脊髓组织中AQP4、GFAP、PCNA、CSPG蛋白的灰度值显着增高（P<0.05）,NGF、BDNF、GAP-43蛋白的灰度值显着降低（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组脊髓组织中AQP4、GFAP、PCNA、CSPG蛋白的灰度值显着降低（P<0.05）,NGF、BDNF、GAP-43蛋白的灰度值显着增高（P<0.05）;DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组组间比较结果显示,各组脊髓组织中AQP4、GFAP、PCNA、CSPG、NGF、BDNF、GAP-43蛋白的灰度值差异不具有统计学意义（P>0.05）。8.各组脊髓组织中PCNA和CSPG基因表达量各组基因检测的扩增曲线变化平稳,溶解曲线为平滑的单峰形态,说明引物设计好,模板未见污染,实验结果具有可比性。各组目的基因相对表达量结果显示,与Sham组相比,各组脊髓组织中PCNA、CSPG基因的表达量显着增高（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组脊髓组织中PCNA、CSPG基因的表达量显着降低（P<0.05）;DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组组间比较结果显示,各组脊髓组织中PCNA、CSPG基因的表达量差异不具有统计学意义（P>0.05）。9.透射电子显微镜观察髓鞘和神经元组织形态Sham组脊髓组织在透射电镜下可见髓鞘外形规则,厚薄均一,形似同心圆状,结构完整,未见破裂、缺失等改变,板层结构均匀致密,胞内线粒体丰富,胞浆饱满,清晰可见。Model组髓鞘结构不规则,部分髓鞘断裂缺失,厚薄不一,局部可见褶皱卷曲,板层结构松散、融合,线粒体肿胀,甚至部分溶解消失;DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组可见髓鞘结构较完整,形态部分不规则但较Model组改善,部分髓鞘可见卷曲、厚薄不一,板层结构较均匀,虽有部分缺失,但松散程度相对Model组较轻,仍可见清晰的线粒体,但数量较Sham组少,胞体较小。10.电镜观察树突和树突棘形态各组脊髓经高尔基染色后结果显示:Sham组脊髓树突结构完整、形态规则、长度较长,树突上密布树突棘,树突棘分布整齐、均匀致密、数量较多;Model组脊髓树突形态不规则,部分断裂缺失,长度较短,较为纤细,树突棘数量少,稀疏分布,排列紊乱;与Model组相比,DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组脊髓树突形态有所改善、树突较长、结构较完整、周经较粗,树突棘数量较多,排列更为规则、整齐。对各组脊髓树突长度及树突棘进行定量分析,结果显示,与Sham组相比,Model组树突长度明显降低（P<0.05）,树突棘数量明显减少（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组树突长度明显增加（P<0.05）,树突棘数量显着增多（P<0.05）;DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组组间相比,差异不具有统计学意义（P>0.05）。第三部分:抵当汤加减含药血清对反应性星形胶质细胞的活化、迁移及神经生长相关细胞因子分泌的作用1.原代AS镜下观察原代细胞培养2d,镜下可见AS细胞呈不规则形状散在分布,部分细胞形似星形,细胞核大、呈椭圆形,细胞胞浆丰富,从胞体向四周发出长而有分支的突起;将原代细胞传代至第三代可见细胞生长状态良好,适宜进行后续实验。2.AS鉴定免疫荧光染色结果显示,GFAP染色呈阳性,阴性对照组未见任何阳性染色,提示GFAP呈特异性表达,所提取的细胞为AS。3.DDD含药血清对AS的安全干预浓度,以及干预RAS的最佳干预时间和最佳干预浓度DDD含药血清干预AS的安全浓度范围为:0-15%,DDD含药血清干预RAS最佳的干预浓度为10%,最佳干预时间为48h。4.DDD含药血清对RAS活性的影响MTT结果显示,与CG组相比,其余各组RAS活性均降低（P<0.05）;与MG相比,BSG组RAS活性无显着差异（P>0.05）,DDD、TGN-020和DDD+TGN-020组RAS活性均显着下降（P<0.05）;DDD、TGN-020和DDD+TGN-020组间比较无显着差异（P>0.05）。5.DDD含药血清对RAS迁移率的影响损伤24h后,各组RAS与对侧细胞完全分离,中间形成一条空白的划痕区域,划痕区未见或少见RAS;48h后部分细胞开始向对侧延伸突触,划痕区域出现部分肥大的RAS,细胞胞浆丰富,胞体呈球形,发亮,细胞加速分裂;72h后划痕区域缩小,部分RAS与对侧RAS突触交织,划痕开始愈合。在整个愈合过程中,24h各组划痕区域面积比无显着差异（P>0.05）;自48h开始,与MG组相比,BSG划痕区域面积比无显着差异,其余各组均明显较大（P<0.05）。DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组组间比较无显着差异（P>0.05）。72h后,MG组与BSG组划痕区域面积比无显着差异（P>0.05）。与MG组相比,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组划痕区域面积比明显较大（P<0.05）,组间比较无显着差异（P>0.05）。以上划痕区域面积比的改变反映了RAS在损伤发生后向受损区域的迁移速率。6.各组对RAS中AQP4、GFAP荧光表达量的影响使用免疫荧光染色法对RAS中AQP4、GFAP和细胞核进行了标记。染色结果显示,AQP4+细胞呈绿色,GFAP+细胞呈红色,细胞核呈蓝色,荧光双标的细胞呈黄色的不规则树枝状。其中,CG组仅见12个零星分布的AQP4+/GFAP+细胞;MG组和BSG可见较多的AQP4+/GFAP+细胞,亮度较高,细胞肿胀程度严重;DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组可见较少的AQP4+/GFAP+细胞,亮度较低,细胞肿胀程度较轻。对AQP4+/GFAP+细胞进行计数统计,结果表明,与CG相比,其他各组阳性细胞占比显着增多（P<0.05）;与MG相比,除BSG组无显着差异外（P>0.05）,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组阳性细胞占比显着减少（P<0.05）;DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组阳性细胞占比组间相比无显着差异（P>0.05）。7.各组对RAS中AQP4、GFAP和NGF、BDNF、GAP-43蛋白表达量的影响结果显示,与CG组相比,其余各组AQP4和GFAP蛋白表达量均显着增高（P<0.05）,NGF、BDNF、GAP-43蛋白表达量均显着降低（P<0.05）;与MG组相比,除BSG组无明显差异外（P>0.05）,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组AQP4和GFAP蛋白表达量均显着降低（P<0.05）,NGF、BDNF、GAP-43蛋白表达量均显着增高（P<0.05）,3组组间比较无显着差异（P>0.05）。结论 1.自制简易脊髓打击器从20mm、40mm高处垂直撞击脊髓组织具有和NYU打击器从12.5mm、25mm处打击脊髓损伤程度相似的脊髓损伤动物模型,自制简易脊髓打击器安全性高,稳定性好,操作简便,价格低廉,可供科研工作者参考。2.通腑逐瘀法治则指导下抵当汤加减可有效消除SCI大鼠损伤处水肿,促进神经功能康复。其具体的作用机制为:通过抑制AQP4的表达可抑制反应性星形胶质细胞活化,减少胶质瘢痕形成,提高神经营养因子、神经生长因子及细胞膜生长相关蛋白的表达,促进神经功能康复。3.DDD含药血清能通过抑制AQP4的表达,有效减轻RAS水肿,减少RAS活化和减缓RAS迁移,促进RAS中神经营养因子的分泌。
王培莉[2]（2021）在《colibactin毒性相关基因在E.coli致脑膜炎中的作用》文中研究指明禽致病性大肠杆菌（Avain pathogenic Escherichia coli,APEC）是肠外致病性大肠杆菌（Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli,ExPEC）的重要成员,APEC 能引起家禽局部或全身性感染,危害养禽业的发展。基因毒素colibactin是一种杂合非核糖体肽/聚酮化合物次级代谢产物。携带pks毒力岛的细菌能够合成colibactin,colibactin相关毒性作用主要表现为遗传毒性,能使细菌感染的真核细胞发生DNA双链损伤、细胞形态异常增大和细胞周期阻滞于G2/M期。禽致脑膜炎大肠杆菌菌株APECXM（O2:K1）为APEC强毒株,2007年自山东新民患败血症/脑膜炎雏鸭脑组织中分离,携带pks毒力岛及多个ExPEC特征性毒力基因,能感染新生大鼠、新生小鼠和雏鸡并引起脑膜炎,对养禽业有较大危害性。目前,与colibactin毒性相关的基因对APEC XM致脑膜炎的能力和涉及的分子机制尚不明确。本研究采用双转录组测序法检测APEC XM感染bEnd.3细胞3 h后双方的转录谱变化,发现pks毒力岛上19个基因均发生显着变化;通过λ-Red同源重组技术和无缝克隆技术构建clbH、clbK、clbF、clbI或clbG的缺失株与相应回补株;通过美兰染色、免疫荧光和流式细胞术比较不同菌株对bEnd.3细胞的遗传毒性作用;采用荧光定量、Western blot、临床观察、血常规、MRI、病理组织切片及免疫组化等观测方法,以bEnd.3细胞为体外研究模型并结合小鼠体内试验,检测脑膜炎相关指标的变化,探索与colibactin毒性相关的基因（clbG和clbH）对APEC XM致脑膜炎能力的影响及涉及的分子机制。主要研究内容如下:1.APEC XM感染bEnd.3细胞3 h后双方的转录谱变化。以bEnd.3细胞构建血脑屏障体外模型,通过双转录组测序法检测APEC XM感染细胞3 h后双方的转录谱变化,荧光定量验证转录谱结果的准确性。测序结果显示,bEnd.3细胞转录谱的变化主要表现为细胞连接复合体的破坏、肌动蛋白细胞骨架重排、细胞外基质降解和免疫反应激活;APECXM转录谱的变化则主要为毒力因子的上调以及蛋白质输出系统和氨基酸代谢的增强。首次发现APEC XM携带的pks毒力岛上19个基因在感染细胞后均发生极显着变化（p<0.01）,提示与colibactin毒性相关的基因可能是APEC XM重要的毒力因子。2.clbH、clbK、clbF、clbI或clbG缺失对colibactin基因毒性的影响。ClbH是colibactin装配线上的一个非核糖体肽合成酶,ClbI是装配线上的一个聚酮类合成酶,他们共同参与环丙烷（C3H3）的合成。ClbG是酰基转移酶,ClbF是酰基辅酶A的脱氢酶,他们共同参与氨基丙二酰（Aminomalonyl-acyl carrier protein,AM）的合成与修饰。ClbK是合成噻唑环上的含硫和氮杂环结构的关键酶。C3H3、AM和噻唑环是colibactin发挥遗传毒性的关键组分。本文通过λ-Red同源重组技术和无缝克隆技术分别构建clbH、clbK、clbF、clbI或clbG的缺失株与相应的回补株。细菌生长曲线试验和黏附侵袭bEnd.3细胞试验的结果显示,clbH、clbK、clbF、clbI或clbG缺失不影响细菌的正常生长和粘附侵袭bEnd.3细胞的能力。通过美兰染色、免疫荧光和流式细胞术检测clbH、clbK、clbF、clbI或clbG缺失对细菌产生colibactin相关遗传毒性的影响。试验结果显示,与APEC XM感染的细胞相比,clbH、clbK、clbF、clbI或clbG缺失株组bEnd.3细胞感染后细胞形态和细胞周期正常（p<0.01）,细胞γH2AX蛋白表达极显着低于APEC XM组（p<0.01）。结果表明clbH、clbK、clbF、clbI或clbG是与colibactin毒性相关的重要基因,缺失后会导致菌株colibactin的毒性作用丧失。3.与colibactin毒性相关的基因（clbG和clbH）对APEC XM致脑膜炎能力的影响及涉及的分子机制。以bEnd.3细胞构建体外模型,并结合小鼠体内模型,通过荧光定量、Western blot、临床观察、血常规、MRI、病理组织切片及免疫组化等方法检测脑膜炎相关指标的变化。在bEnd.3细胞体外模型中,荧光定量结果显示,与APEC XM组相比,APEC XM ΔclbG组与APEC XM ΔclbH组中bEnd.3细胞相关炎性因子（IL-6、IL-1β和TNF-α）相对表达量极显着下降（p<0.01）;Western blot结果显示,与APEC XM 组相比,APEC XM ΔclbG 组与 APEC XM ΔclbH组中 bEnd.3 细胞 Occludin、Claudin-5和ZO-1蛋白表达水平的下降得到不同程度的缓解（p<0.01;p<0.05）。在4周龄ICR小鼠脑膜炎模型中,与APEC XM感染组相比,APEC XM ΔclbG组与APEC XM ΔclbH组小鼠角弓反张等神经症状明显减轻或消失,脑部影像学及病理组织学异常明显减弱或消失,血脑屏障通透性极显着下降（p<0.01;p<0.05）,脑等组织脏器载菌量极显着下降（p<0.01）,脑组织中相关炎性因子（IL-6、IL-1β和TNF-α）的相对表达量极显着下降（p<0.01）,脑部紧密连接蛋白Claudin-5、ZO-1和Occludin蛋白表达水平下降也得到极显着缓解（p<0.01;p<0.05）。以上结果表明,与colibactin毒性相关的基因（clbG和clbH）影响APEC XM致脑膜炎能力,clbG和clbH是APEC XM重要的毒力因子。综上所述,clbH、clbK、clbF、clbI或clbG的缺失会导致菌株与colibactin相关的毒性作用丧失,与colibactin毒性相关的基因（clbG和clbH）影响APEC XM致脑膜炎过程中宿主先天免疫系统的激活（启动炎性反应）与血脑屏障的破坏,进而加剧宿主脑部的病理性损伤,它们是APEC XM重要的毒力因子。
于文晓[3]（2021）在《头花蓼类中药对草酸钙结石的临床疗效观察及作用机制研究》文中提出背景:尿石症是泌尿外科的常见病,其发病率和复发率居高不下,对患者的身心健康造成了严重影响,也困扰着众多的临床医生。其发病机制目前尚无定论,对其深入研究是必要且急迫的。骨桥蛋白（OPN）与尿石症的发生、PI3K-AKT通路与肾小管上皮细胞的转化和代谢是目前尿石症领域研究的热点,其中骨桥蛋白作为一种有机大分子,被认为是结石形成的基质组分之一,在结石形成阶段必不可少,但针对骨桥蛋白作用通路的研究尚处于探索阶段。肾小管细胞损伤是结石形成的重要危险因素这一观点已被越来越多学者所认同。同时,多项研究也表明PI3K-AKT通路在肾小管上皮细胞的转化和代谢中起到了重要作用。清热利湿法被广泛应用于尿石症的治疗,众多研究表明苗药头花蓼治疗尿石症效果确切。本研究以头花蓼类中药对草酸钙结石的临床疗效观察及作用机制研究作为基础,探索骨桥蛋白与PI3K-AKT通路之间的关系,这或可成为尿石症机制研究新的突破口。目的:基于清热利湿法,探讨头花蓼类中药对草酸钙结石的临床疗效及作用机制,为头花蓼类中药治疗尿石症提供实验依据。方法:（1）第一部分:采用随机对照临床试验设计方法,选取尿石症患者72例,使用随机数字表进行随机分组分为治疗组和对照组,比较克淋通胶囊联合坦索罗辛与坦索罗辛单药辅助体外冲击波碎石治疗尿石症的疗效,观察克淋通胶囊在促进结石清除、减少二次碎石、减少肾绞痛发作、减少抗生素及止痛药使用等方面的作用。（2）第二部分:围绕PI3K-AKT与骨桥蛋白的关系,选用雄性SD大鼠42只,随机分为正常组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、克淋通组、枸橼酸组7组,当大鼠适应环境一周以后,采用乙二醇造模法诱导大鼠草酸钙结石形成,以头花蓼低、中、高剂量、克淋通进行干预,通过ELISA、HE染色、Western Blotting、免疫组化等方法,观察大鼠24h尿液中尿素氮、肌酐、尿酸、尿钙、尿枸橼酸、草酸的变化、肾小管管腔内结石结晶情况、PI3K-AKT通路相关蛋白及OPN蛋白变化情况,从而探讨头花蓼对大鼠草酸钙结石的作用机制。结果:（1）第一部分:从促进排石效果上看,克淋通组的总有效率明显高于对照组（P<0.05）;从第二次碎石率上看,克淋通组的二次碎石率明显低于对照组（P<0.05）;从结石排净所需的天数上看,克淋通组的排石时间明显低于对照组（P<0.05）;从抗生素使用率及使用天数上看,克淋通组的抗生素使用率及使用天数明显低于对照组（P<0.05）;从止痛药使用率上看,克淋通组的止痛药使用率低于对照组（P<0.05）;从中医临床症状评分上看,克淋通组对腰腹部及会阴部疼痛、排尿情况、血尿、肾区叩击痛及输尿管行程压痛症状的改善程度优于对照组（P<0.05）;从肾绞痛发作率上看,两组对照无明显差异（P>0.05）;从不良事件发生率上看,两组对照无明显差异（P>0.05）。（2）第二部分:从大鼠一般状态上看,成石模型建立后大鼠体重降低,饮食量减少,体毛变稀疏,体毛光泽度降低,活动量减少,打斗现象减少,精神变差。从大鼠24小时尿液分析结果上看,低、中、高剂量头花蓼组和克淋通组的钙、草酸、肌酐、尿素氮、尿酸含量低于模型组（P<0.05）,枸橼酸含量高于模型组（P>0.05）;从HE染色结果上看,低、中、高剂量头花蓼组和克淋通组的结晶评分低于模型组（P<0.05）,尤其是高剂量组和克淋通组。从Western Blotting检测结果上看,低、中、高剂量头花蓼组和克淋通组的PI3K表达明显高于模型组（P<0.0001）;低、中、高剂量头花蓼组和克淋通组的AKT表达高于模型组（P<0.05）,尤其是高剂量组（P<0.0001）;低、中、高剂量头花蓼组和克淋通组的OPN表达低于模型组（P<0.05）,尤其是高剂量组（P<0.0001）。从免疫组化检测结果上看,中、高剂量头花蓼组和克淋通组的PI3K表达高于模型组（P<0.05）,尤其是高剂量组（P<0.0001）;中、高剂量头花蓼组和克淋通组的AKT表达高于模型组（P<0.05）,尤其是高剂量组（P<0.0001）;中、高剂量头花蓼组和克淋通组的OPN表达低于模型组（P<0.05）,尤其是高剂量组（P<0.0001）。结论:（1）克淋通胶囊辅助体外冲击波治疗尿石症（湿热瘀阻证）的排石疗效明显,可在一定程度上降低体外碎石治疗后二次排石率和抗生素使用率,同时可缓解排石过程中出现的疼痛,对中医证候（腰腹部及会阴部疼痛、排尿情况、血尿、肾区叩击痛及输尿管行程压痛症状）改善明显;（2）头花蓼及头花蓼类中药可以降低草酸钙结石大鼠的尿草酸及钙浓度,增加尿枸橼酸浓度,减轻肾近曲小管上皮细胞损害,进而产生保护肾脏的作用;（3）头花蓼及头花蓼类中药防治草酸钙结石的作用机制可能与其下调OPN表达相关;（4）头花蓼及头花蓼类中药减轻肾近曲小管上皮细胞损害,进而产生保护肾脏的作用,与上调PI3K、AKT的表达相关。
王子龙[4]（2021）在《肿瘤相关巨噬细胞通过IL-4/STAT6通路上调膀胱癌组织中PSMA表达的研究》文中研究表明一、研究背景膀胱癌90%以上病理类型为移行细胞癌。随着人口老龄化加剧以及环境污染日益严重,膀胱癌已成为严重危害人类健康的恶性肿瘤。尽管非肌层浸润性移行细胞癌（NMIBC）为大多数患者的初诊类型,但肌层浸润性移行细胞癌（MIBC）的进展率为30%,膀胱全切术后5年生存率约为50%、10年生存率约为36%。由此可见,深入研究膀胱癌精准靶向治疗方案具有非常紧迫的现实意义。巨噬细胞（macrophages,MΦ）是固有免疫以及适应性免疫系统的主要免疫细胞,而肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages,TAMs）是肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）中的重要组成部分,具有两种亚型:由脂多糖（LPS）和干扰素γ（IFN-y）通过STAT1和STAT3磷酸化诱导的M1型Mφ,以及由IL-4和IL-13通过STAT6磷酸化诱导的M2型Mφ。然而,TAM及其极化状态与前列腺特异性膜抗原（prostate-specific membrane antigen,PSMA）表达之间的关系,未发现有明确研究。因此,本研究对肿瘤相关巨噬细胞通过IL-4/STAT6通路上调膀胱癌组织新生血管中PSMA表达进行相关的研究。前列腺特异性膜抗原（PSMA）是主要表达在前列腺癌上皮细胞上的Ⅱ型跨膜糖蛋白,同样也在肾癌、甲状腺癌、乳腺癌等实体肿瘤的新生血管内皮细胞中表达,但PSMA在膀胱移行细胞癌新生血管上皮细胞中表达的研究却具有争议:Samplaski等对167例膀胱癌患者的病理切片进行研究发现,PSMA在浸润性膀胱癌组织中的表达量与肿瘤病理分型相关,但所有类型的肿瘤新生血管内皮细胞中均表达PSMA,预示PSMA与肿瘤血管生成和预后密切相关。然而,Campbell等对3例转移性膀胱癌患者进行影像学和病理学分析,PSMA在膀胱癌中低表达导致PSMAPET/CT的影像学诊断受限,但由于样本数量少且病例数量只有3例导致争议和临床不确定性。因此针对这一争议,探究PSMA在浸润性膀胱移行细胞癌中的表达及与肿瘤新生血管之间的关系,寻找PSMA抑制剂抗新生血管靶向治疗的机制,具有重要的临床意义。二、研究目的本研究应用人膀胱移行细胞癌细胞系T24与人单核巨噬细胞系THP-1作为共培养细胞模型,建立人膀胱移行细胞癌裸鼠皮下移植瘤模型,收集人浸润性膀胱移行细胞癌病理标本,探讨膀胱癌表达和分泌IL-4,激活肿瘤微环境（TME）巨噬细胞中STAT6磷酸化促进其向M2型Mφ极化,M2型Mφ通过分泌内皮素4D（Sema4D）促进TME中CD31表达,导致PSMA表达增高的机制;应用PSMA抑制剂2-PMPA可以抑制肿瘤组织中CD31表达,探讨抑制膀胱移行细胞癌的生长和增殖的机制。三、材料与方法1、膀胱移行细胞癌细胞通过分泌IL-4促进STAT6磷酸化诱导巨噬细胞向M2表型极化的机制研究（1）将人单核巨噬细胞系THP-1细胞应用佛波酯（PMA）诱导为M0型Mφ,向M0型Mφ中加入重组LPS及IFN-γ诱导为M1型Mφ,向M0型Mφ中加入重组人IL-4及IL-13诱导为M2型Mφ。（2）人膀胱移行细胞癌细胞系T24与M0组、M0（+IL-4R）组、M0（+AS1517499）组共培养。（3）Western blot、实时荧光定量PCR检测M0、M1、M2型Mφ与共培养M0组、M0（+IL-4R）组、M0（+AS1517499）组中生物标志物CD80、iNOS、CD163、Arg-1、pSTAT6、Sema4D的表达。（4）酶联免疫吸附试验（ELISA）检测M0、M1、M2型Mφ与共培养M0组、M0（+IL-4R）组、M0（+AS1517499）组中IL-4、Sema4D的表达。2、PSMA抑制剂2-PMPA下调CD31与Sema4D表达的裸鼠皮下移植瘤模型研究（1）应用膀胱移行细胞癌细胞系T24构建人膀胱移行细胞癌裸鼠皮下移植瘤模型。并随机将10只裸鼠分为实验组（2-PMPA）和对照组,每组5只。每5日用游标卡尺测量裸鼠皮下肿瘤的最大径和用电子质量称测量裸鼠重量。在给药第30天实验结束时,颈椎脱臼处死裸鼠,剥取皮下肿瘤进行下一步实验。（2）免疫组化测量实验组和对照组肿瘤中PSMA、CD31、Sema4D、Plexin-B1的表达量。（3）免疫荧光双标法测量实验组和对照组肿瘤中CD163与Sema4D、CD31与PSMA的表达量。3、PSMA与CD31表达在膀胱移行细胞癌分期和预后中的临床研究（1）收集行根治性膀胱全切除术治疗的原发性膀胱移行细胞癌的患者37例。收集患者的年龄、CTU、泌尿系超声、膀胱镜检查、肿瘤大小、病理分级、TNM分期及所用化疗药物等临床资料,收集患者肿瘤组织和癌旁正常组织的空白病理标本和切片进行后续实验。（2）免疫组化染色法测量肿瘤及癌旁正常组织中PSMA、CD31、IL-4、pSTAT6、CD 163、Sema4D、Plexin-B1的表达量。（3）免疫荧光双标法测量肿瘤及癌旁正常组织中Ki-67与IL-4、CD163与Sema4D、CD31 与Plexin-B1、CD31 与PSMA的表达量。四、结果1、膀胱移行细胞癌细胞系通过分泌IL-4促进STAT6磷酸化诱导巨噬细胞极化为M2型 Mφ。光学显微镜观察发现THP-1细胞为悬浮细胞,表现为形态规则、大小一致、无伪足的小圆形细胞。M0型Mφ为贴壁细胞,表现为形态不规则的多边形细胞,体积略增大。M1型Mφ细胞表现为体积增大、多角的长梭形细胞。M2型Mφ细胞表现为体积增大的枝杈状细胞。Western blot、RT-PCR检测M1型Mφ中CD80和iNOS表达增加,CD163和Arg-1表达较低;M2型Mφ和T24+M0共培养组中CD163和Arg-1表达增加,CD80和iNOS表达较低。加入IL-4R和STAT6抑制剂AS1517499后,CD163表达降低。ELISA结果显示M2以及T24+M0组细胞培养上清液中IL-4含量较高,M0和M1组中IL-4含量均较低。2、M2型Mφ促进促血管生成因子Sema4D的表达和分泌。RT-PCR、ELISA检测M2、T24+M0组中Sema4D表达升高,加入IL-4R或AS1517499后Sema4D表达降低。免疫组化结果显示肿瘤组织中Sema4D表达率明显高于癌旁正常组织。免疫荧光结果表明,CD163+细胞（M2型Mφ）中Sema4D在肿瘤组织中表达率明显高于癌旁正常组织。3、PSMA抑制剂2-PMPA抑制肿瘤组织中CD31表达和M2型Mφ浸润性及其Sema4D 表达。应用PSMA抑制剂2-PMPA,移植瘤中位增长体积和重量明显低于对照组,30天后实验组裸鼠移植瘤体积明显低于对照组。免疫组化染色法显示实验组中CD31、Plexin-B1、CD163、Sema4D表达率明显低于对照组,免疫荧光双标法显示,实验组中PSMA在CD31+肿瘤新生血管表达率明显低于对照组,Sema4D在CD163+M2型Mφ中表达率明显低于对照组,表明2-PMPA可以减少肿瘤组织中微血管密度（CD31+细胞）以及M2型Mφ浸润性及其Sema4D表达。4、膀胱癌组织中PSMA和CD31表达率与肿瘤TNM分期和病理分级呈正相关,可能是膀胱癌患者预后的影响因素。免疫组化结果表明,高级别病理分级肿瘤患者中CD31+细胞计数明显高于低级别,且CD31+细胞计数随T分期增加而增加,即T4期最高,T3期次之,T2期最低。免疫荧光双标法结果揭示肿瘤新生血管中PSMA表达呈现相同的结果,高级别患者中PSMA表达率明显高于低级别,且T4期PSMA表达率最高,T3期和T2期较低。单因素和多因素分析显示,PSMA和CD31表达率是影响膀胱癌患者预后的影响因素,但彼此之间有相互影响作用。5、T2和T3期膀胱癌组织中M2型Mφ上调CD31和PSMA表达,而T4期中上皮-间质转化（EMT）程度上调CD31和PSMA表达。免疫组化结果显示T3期中CD163+细胞计数最高,而T2、T4期较低,表明M2型Mφ浸润程度在T3期最高,T2和T4期较低。免疫荧光显示N-cadherin/ZO-1比例在T4期最高,T3和T2期较低,表明T4期肿瘤发生上皮-间质转化（EMT）。因此,结合PSMA与CD31表达率在T分期中的表达规律,T2和T3期中M2型Mφ上调CD31和PSMA表达,T4期中上皮-间质转化（EMT）程度促进CD31和PSMA表达。五、结论1、膀胱移行细胞癌细胞分泌IL-4,促进肿瘤微环境巨噬细胞中STAT6磷酸化,上调Arg-1表达,诱导极化为M2型Mφ,从而表达和分泌Sema4D。2、PSMA表达与肿瘤组织中CD31表达密切相关,从而辅助评估膀胱移行细胞癌患者的预后。3、T2期和T3期,M2型Mφ通过分泌Sema4D并表达Plexin-B1,上调肿瘤组织中CD31和PSMA表达。而在T4期,上皮-间充质转化（EMT）程度上调肿瘤组织中CD31和PSMA表达。
周招莲[5]（2020）在《液基真菌富集制片靶向荧光染色法对外阴阴道假丝酵母菌病诊断价值的研究》文中研究说明目的:研究液基真菌富集制片靶向荧光染色法对外阴阴道假丝酵母菌病诊断的临床价值。方法:收集2019年6月至2019年9月因外阴阴道瘙痒、分泌物增多、分泌物有异味等临床表现就诊于江西省人民医院妇科门诊,临床诊断为阴道炎患者共300例。每例患者均同时取阴道分泌物行液基真菌富集制片靶向荧光染色法（简称液基荧光法）、生理盐水湿片镜检法（简称湿片法）、白色念珠菌免疫荧光检测试剂盒方法（简称免疫荧光法）和真菌培养法（简称培养法）检测,以培养法作为诊断金标准,对液基荧光法、湿片法、免疫荧光法以及液基荧光法+湿片法、免疫荧光法+湿片法、液基荧光法+湿片法+免疫荧光法的检测结果进行统计分析。结果:1.液基荧光法、湿片法、免疫荧光法、培养法的阳性率分别为:27.7%/18%/41.3%/34%,差异有统计学意义,P<0.05。2.与培养法比较,液基荧光法、湿片法、免疫荧光法的灵敏度、特异度、诊断符合率、Kappa值（一致性检验）、约登指数分别为:77.45%/48.04%/83.33%;97.98%/97.47%/80.30%;91%/80.67%/81.33%;0.790/0.514/0.605;0.7543/0.4551/0.6363。3.与培养法比较,液基荧光法+湿片法、免疫荧光法+湿片法、液基荧光法+湿片法+免疫荧光法的灵敏度、特异度、诊断符合率、Kappa值、约登指数分别为:81.37%/83.33%/89.22%;95.96%/78.79%/78.28%;91%/80.33%/82%;0.794/0.602/0.627;0.7733/0.6212/0.675。4.液基荧光法+湿片法与培养法比较,阳性率差异无统计学意义,P>0.05。而液基荧光法、湿片法、免疫荧光法、免疫荧光法+湿片法、液基荧光法+湿片法+免疫荧光法与培养法比较,阳性率差异有统计学意义,P<0.05。结论:1.液基荧光法的准确性高于湿片法、免疫荧光法;2.液基荧光法+湿片法的准确性高于免疫荧光法+湿片法、液基荧光法+湿片法+免疫荧光法;3.液基荧光法+湿片法对外阴阴道假丝酵母菌检测效果最佳。
刘海洋[6]（2020）在《污水中典型抗生素、耐药菌及耐药基因的分布及其电催化降解研究》文中研究指明近年来,由于抗生素的大量使用,导致不同环境介质中抗生素频繁检出。由抗生素残留诱导的抗生素耐药性问题愈发严重。抗生素耐药性已经成为危害人类健康和生态系统安全的新兴污染物,被列为对公共卫生的三大威胁之一。然而,污水处理厂中传统的污水处理工艺旨在去除水体中有机物、氮、磷等常规污染物,对抗生素、耐药菌（ARB）及耐药基因（ARGs）的去除十分有限。因此,急需建立一种高效彻底的抗生素及耐药性去除技术。本文主要研究内容及结果如下:（1）以长春市采用不同工艺的三家污水处理厂作为研究对象,对各主要处理单元中抗生素、ARB及ARGs的分布水平进行调查。以环境中频繁检出的6类（12种）抗生素作为研究目标,采用固相萃取结合HPLC-MS/MS分析对抗生素的残留情况进行检测。结果显示氯霉素类抗生素（氯霉素、甲砜霉素）检出频率最低,四环素类（四环素（TCH）、土霉素）、β-内酰胺类（氨苄青霉素（AMP）、阿莫西林）、罗红霉素及环丙沙星抗生素的检出频率为100%,浓度范围为41.13-638.27 ng/L,出水中仍处于41.63-488.95 ng/L的浓度水平;基于抗生素检出情况,以四环素耐药菌(ARBTCH)和氨苄青霉素耐药菌(ARBAMP)为例,通过选择培养法对污水处理厂中ARB的分布及去除情况进行分析,结果表明经过污水处理,水体中ARB含量有所减少,但出水中仍残留着0-2.62 log CFU/m L的ARBTCH及0-2.86 log CFU/m L的ARBAMP;此外,以16S r RNA作为内参基因,通过高通量测序法对上述污水处理厂中50种目标ARGs丰度进行测定,结果显示污水处理过程中部分ARGs丰度有所下降,但出水中耐药基因丰度仍为5-6log copies/m L。调查结果表明经过污水处理厂处理后,出水中仍残留大量的抗生素、ARB及ARGs,进一步证实了传统的污水处理工艺不能完全去除水体中的抗生素及其耐药性。（2）以碳纳米管（CNTs）、琼脂糖（AG）为前驱体,钛网（Ti）为基底,采用溶胶凝胶法成功制备CNTs/AG/Ti电极。通过扫描电子显微镜、X射线能谱、透射电子显微镜、红外光谱、X射线衍射分析、拉曼光谱等对CNTs/AG/Ti电极进行了表征,结果表明CNTs不规则的分散在AG凝胶薄膜内,部分CNTs裸露于薄膜外;CNTs/AG/Ti电极由C、O及Ti元素组成,纯度较高,且在电催化降解反应前后无明显官能团变化,具有良好的化学稳定性。（3）基于污水处理厂中抗生素检出情况,以TCH和AMP为目标抗生素,基于制备的CNTs/AG/Ti电极,探究了不同实验条件对电催化降解抗生素的影响,以获得最佳的催化降解条件,并分析了电催化降解机理及反应体系的毒性变化。TCH在最佳的电催化降解条件下（4 V、p H=7、5 wt%及10 mg/L）,30 min的去除效率可达97.9%;AMP在最佳条件下（8 V、p H=8、7 wt%及5 mg/L）,电催化降解60 min去除效率为94.0%;自由基捕获实验表明·O2-在电催化降解TCH及AMP过程中均起到了重要作用;结合液质分析,对电催化降解TCH及AMP的反应途径及机理进行探究,推测了目标抗生素的降解途径;基于QSAR模型及对大肠埃希氏菌（E.coli）ATCC25922的生长抑制情况,对母体抗生素及降解中间产物的毒性进行预测,结果表明电催化降解目标抗生素的过程中生成了毒性较高的中间产物,但随着降解时间的延长,电催化降解体系毒性逐渐减小。（4）以TCH和AMP耐药性E.coli（AR E.coli）为目标ARB,探究了电催化灭活AR E.coli的性能及机理。最佳的实验条件下,电催化处理10 min,AR E.coli的灭活效率为7.82 log,30 min内AR E.coli全部失活。扫描电子显微镜结果表明电催化灭活过程中,AR E.coli表面发生褶皱及塌陷,细胞膜完整性受到严重破坏;反应体系内K+浓度随着反应进行逐渐升高,说明AR E.coli的细胞膜通透性发生改变,导致体内细胞质组分发生泄露;二乙酸荧光素/碘化丙啶（FDA/PI）双荧光染色法分析结果表明随着电催化灭活反应的进行,体系中活细胞逐渐减少且死细胞增多;以2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）为荧光探针,探究了电催化灭活过程中耐药菌体内活性氧物种（ROS）的水平变化,结果表明体内ROS浓度随电催化反应的进行而升高;采用DNA提取结合q PCR（实时荧光定量聚合酶链式反应）分析发现在电催化灭活AR E.coli的过程中,胞外ARGs能够得到快速的电催化降解,胞内及总ARGs在反应的前10 min内降解速率较快。（5）以同时编码四环素耐药基因（tet A）和氨苄青霉素耐药基因(bla TEM-1)的p BR322质粒为目标ARGs,探究了电催化降解ARGs的去除效率及降解机理。p BR322初始浓度为1.0 ng/μL时,外加偏压为3 V,240 min内双蒸水（dd H2O）中tet A和bla TEM-1的降解效率分别为7.45和8.47 log;磷酸盐缓冲液（PBS）中tet A和bla TEM-1（1.0 ng/μL、2 V）在30 min内降解效率分别可达7.58和8.42 log。HPLC分析发现,在电催化降解p BR322过程中无单碱基生成;采用PCR扩增与琼脂糖凝胶电泳相结合的方法检测tet A和bla TEM-1降解时的DNA片段变化,结果显示使用长扩增子均较短扩增子检测的ARGs降解速度快,且生成大量较短的DNA片段,其中bla TEM-1较tet A的降解效率更高;重测序分析发现电催化降解p BR322过程中无SNP（单核苷酸多态性）及In Del（插入/缺失）变化;水平转化实验表明经过电催化降解处理后tet A和bla TEM-1编码的耐药性能丧失,说明电催化降解技术可以有效地降低抗生素耐药性的传播扩散。在抗生素、ARB及ARGs的共存体系中,240 min时目标抗生素及AR E.coli完全降解或灭活,通过12 h的电催化处理,ARGs的去除效率可达5.61-5.98 log。综上所述,基于长春市污水处理厂中典型抗生素及其耐药性的检出情况,建立了温和高效的电催化降解体系,考察了不同实验因素对电催化降解抗生素、ARB及ARGs的影响,获得最佳的电催化降解条件,探究了电催化降解途径及机理。本研究结果可为水体中抗生素及其耐药性的有效去除提供基础数据及可借鉴的方法,以实现水环境质量的改善。
李朋[7]（2020）在《逼尿肌Cx43分布和表达异常在DCP膀胱形成中的作用》文中研究表明目的:检测逼尿肌组织缝隙链接蛋白43（Connexin43,Cx43）在豚鼠糖尿病膀胱（Diabetic cystopathy,DCP）中的分布及表达情况,研究Cx43在糖尿病膀胱形成中的作用。方法:2-3月龄健康雄性豚鼠60只,随机分为实验组（n=40）、正常对照（normal control,NC）组（n=20）。实验组豚鼠单次腹腔注射溶于p H4.4、浓度0.1mmol/L枸橼酸钠的链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）诱导建立糖尿病豚鼠模型,利用尿动力学检测筛选出糖尿病膀胱豚鼠纳入DCP组（n=10）,未形成糖尿病膀胱豚鼠纳入NDCP组（n=10）;NC组（n=10）豚鼠单次腹腔注射枸橼酸钠溶液。HE染色观察DCP组、NDCP组和NC组三组膀胱逼尿肌组织病理学变化,通过免疫荧光染色法观察Cx43在三组膀胱逼尿肌中的定位及分布,采用Western blot技术检测三组膀胱逼尿肌组织内Cx43蛋白的表达。结果:HE染色发现:DCP组豚鼠膀胱逼尿肌肌束形态相对不规则,各肌纤维之间间距增宽且分布稀疏,可见疏松纤维结缔组织数量增加且呈无序不规则排列。NDCP组和NC组豚鼠膀胱逼尿肌肌束形态规则,肌纤维排列紧密有序。免疫荧光染色结果显示:逼尿肌组织细胞膜和细胞质内Cx43被标记荧光特异染为红色,表明Cx43主要表达在细胞膜和细胞质中,细胞核上未见Cx43表达。DCP组豚鼠逼尿肌组织Cx43荧光染色强度明显低于NDCP组和NC组。NDCP组和NC组之间阳性染色强度对比无明显差异。Western blot检测发现,DCP组膀胱组织Cx43蛋白表达（0.52±0.02）低于NC组（0.68±0.02）和NDCP组（0.70±0.01）（P<0.01）,NDCP组与NC组膀胱组织Cx43蛋白表达对比,差异无统计学意义（P>0.01）。结论:DCP膀胱逼尿肌Cx43表达明显减少,Cx43的表达降低或许是导致DCP发病的重要因素之一。
谢诗怡[8]（2020）在《八宝丹对胆汁淤积小鼠肝脏的保护作用及机制研究》文中提出研究背景胆汁淤积指肝内外各种原因造成胆汁形成和（或）排泄障碍,反流入血液的所引起一系列临床症状及肝损伤的临床综合症,可进展为肝纤维化、肝硬化甚至肝衰竭。根据胆汁淤积的发生部位可将其分为肝内和肝外胆汁淤积两大类,肝内胆汁淤积疾病主要有病毒性肝炎、酒精或非酒精性脂肪性肝炎、药物性肝损伤、妊娠肝内胆汁淤积、各种病因导致肝硬化、原发性胆汁性肝硬化/原发性硬化性胆管炎、原发性硬化性胆管炎及合并自身免疫性肝炎、药物性胆管病等;肝外胆汁淤积主要疾病和病因有胆管结石、先天性肝外胆管闭锁、胆总管/Oddi括约肌狭窄、胆管寄生虫病、胆总管囊肿、胆管及周围组织肿瘤压迫、胰腺癌、胰腺囊肿和慢性胰腺炎等。胆汁淤积使引起毒性胆汁代谢物质蓄积于肝内,出现胆汁淤积性病变,在多种细胞因子持续刺激下,肝实质细胞进一步受损,可发展为肝组织纤维化。肝纤维化主要病理改变为肝组织内细胞外基质的过度沉积,炎症反应是其重要机制之,在炎症因子作用下,纤维化介质与肝星状细胞膜上受体结合,实现肝星状细胞活化、增殖、转型,促进胶原、糖蛋白的合成,从而重构细胞外基质,导致肝纤维化,各种纤维化介质对细胞外基质的代谢有重要的调节作用,尤其是转化生长因子β1（transforming growth factor β1,TGF—β1）、肿瘤坏死因子-α、血小板源生长因子以及IL-6等,在促进细胞的增殖、迁移和转化过程中起重要作用,同时激活的肝星状细胞释放活性氧类物质而反过来继续激活肝星状细胞以促进纤维化的发展。TGF—β1被认为是最强的促肝纤维化因子,在促肝纤维化中占关键地位,其纤维化作用为对细胞外基质的形成产生一定的刺激作用,降低细胞外基质蛋白酶的活化,胶原酶的活性,减少其降解,使成纤维细胞发生趋化作用,从而促进诱发组织器官逐渐发生纤维化,目前研究认为,TGF—β1主要通过TGF/Smad信号转导通路来发挥促纤维化的作用。Smads蛋白是目前所知的唯一TGF-β受体的胞内激酶底物,是TGF-β信号跨细胞膜传入细胞核内的关键下游蛋白,调节核内靶基因的转录,从而发挥TGF-β1的生物效应。八宝丹是我国治疗肝胆系疾病的重要中成药,具有清利湿热,活血解毒,去黄止痛的功效,近年来已有多项研究发现,八宝丹可保护肝脏细胞,降低血清肝功能、肝纤维化指标水平,改善黄疽,且不良反应较少,在临床上广泛应用于防治传染性病毒性肝炎、肝硬化等肝胆系疾病。进一步研究发现八宝丹可以改善肝纤维化大鼠的炎症反应及变性坏死,逆转肝纤维化,其抗纤维化机制尚未明确,是否通过影响转化生长因子β1实现肝纤维的逆转尚未有研究。Masson染色法利用胶原纤维含有碱性氨基酸,能与酸性染料进行结合而着色的特点对胶原纤维着色,光镜下胶原纤维呈亮蓝色或绿色,已有学者发现在Masson染色的作用下,慢性肝炎患者肝组织汇管区周围的Ⅰ型胶原蛋白比HE染色可更清晰的显示,进一步准确展示出慢性肝炎发展至肝纤维化的进程,可直观判定肝纤维化程度与范围。目前认为,肝脏纤维化主要与Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维有关,运用苦味酸-天狼星红染色法（Picric Sirius red,PSR）,在偏振光法显微镜下能够在一张切片上对不同类型的胶原纤维定性及定量诊断,明确胶原纤维的种类及分布,可早期及时诊断肝组织纤维化病理状态,如:Ⅰ型胶原表现为橘黄色或红色,镜下可见其纤维排列紧密,具有很强的双折光性;Ⅲ型胶原纤维为绿色的细纤维,为疏松网状结构,具有较弱的双折光性。作为常用的两种方法,其在评价肝脏纤维化方面的比较尚未见报道。故本研究以ANIT诱导小鼠建立胆汁淤积性肝病模型,应用上述两种不同的染色方法观察胶原沉积情况,初步比较苦味酸-天狼猩红染色法和Masson染色法两种方法在评价肝纤维化中的应用价值,并以八宝丹治疗,探讨其对胆汁淤积症小鼠的保护作用,通过免疫组织化学、RT-PCR研究TGF/Smad在小鼠肝组织中的表达情况,探讨八宝丹对TGF/Smad信号转导通路的影响,阐明其作用机制。目的观察八宝丹对胆汁淤积小鼠肝脏的保护作用及探讨其可能机制,为八宝丹治疗胆汁淤积性肝病提供理论依据。方法将15只昆明种雄性小鼠随机分为3组:空白对照组、胆汁淤积组、八宝丹治疗组,每组5只。除空白对照组小鼠外,其余两组小鼠均一次性予灌胃1%α—萘异硫氰酸酯（α-Naphthyl isothiocyanate,ANIT）橄榄油溶液,按照 100mg/Kg剂量建立胆汁淤积模型。空白对照组每日予生理盐水灌胃1次,胆汁淤积组每日予生理盐水灌胃1次,八宝丹治疗组每日予八宝丹生理盐水混悬液灌胃1次。给药10d后麻醉后取血及肝组织。检测各组小鼠血清中总胆汁酸（total bile acids,TBA）、总胆红素（total bilirubin,TBil）、直接胆红素（direct bilirubin,DBil）、谷氨酸氨基转移酶（alanine transaminase,ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate transaminase,AST）、碱性怜酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、谷氨酰转肽酶（丫-glutamyl transpeptidase,GGT）、白蛋白（albumin,ALB）、透明质酸（hyaluronic acid,HA）,层粘连蛋白（laminin,LN）,Ⅲ型前胶原（type Ⅲ procollagen,PC-Ⅲ）,Ⅳ型胶原（type Ⅳ collagen,C-Ⅳ）水平。肝组织采用苏木素-伊红染色（Hematoxylin and eosin,HE染色）、Masoon染色、苦味酸-天狼星红染色法观察其病理形态学改变;免疫组织化学法检测肝组织TGF-β1、Smad3蛋白表达;RT-PCR 检测肝组织 TGF-β1、Smad3 mRNA 表达。结果血清学指标（1）肝功能指标:空白对照组、胆汁淤积组、八宝丹治疗组相比:ALT（42.44±4.93vs400.33±65.49 vs 144.16±38.66）、AST（171.09±22.30 vs 656.95±118.17 vs 315.81±75.65）、TBIL（6.31±0.91 vs 53.12±7.51vs 19.42±1.81）、DBIL（4.54±0.86 vs 48.49±7.08 vs 14.26±2.07）、ALP（158.82±39.18 vs 953.64±282.86 vs 535.99±131.42）、GGT（29.58±3.49 vs 159.49±24.78 vs 81.53±13.59）、TBA（39.01±3.05vs 339.47±167.73 vs 238.28±103.87）,各组间差异有统计学意义,P<0.01;ALB（30.77±2.24 vs 22.47±2.03 vs 25.14±2.38）,空白对照组与胆汁淤积组之间有统计学差异P<0.01,八宝丹治疗组与胆汁淤积组之间无统计学差异,P>0.01。（2）肝纤维化指标:空白对照组、胆汁淤积组、八宝丹治疗组相比:HA（302.16±45.95vs 644.21±71.69 vs 443.79±47.06）、LN（135.13±49.31vs417.55±37.76 vs224.33±48.61）、PC-Ⅲ（12.15±1.87vs 24.94±2.02vs 16.15±1.03）、C-Ⅳ（37.12±2.00 vs74.98±4.34vs 54.92±4.44）,各组间差异有统计学意义,P<0.01。肝脏组织学（1）HE染色:空白对照组肝组织结构基本正常,肝细胞呈整齐排列;胆汁淤积组肝细胞大面积坏死,肝小叶结构大多破坏。八宝丹治疗组肝细胞形态结构较清晰,肝损伤明显改善,肝坏死面积减少。（2）Masoon染色:空白对照组可见少量胶原纤维。胆汁淤积组肝组织内大量蓝色胶原纤维沉积,已形成假小叶。八宝丹治疗组胶原纤维介于空白对照组及胆汁淤积组之间。空白对照组、胆汁淤积组、八宝丹治疗组纤维化面积（6.18±0.98vs39.37±3.89vs25.65±2.24）,各组间差异有统计学意义,P<0.01。（3）苦味酸-天狼星红染色:空白对照组小鼠肝组织少量Ⅰ、Ⅲ型胶原显色。胆汁淤积组:肝组织中可见明显增多的橘红色Ⅰ型胶原粗纤维,形成小叶间分隔,Ⅲ型胶原增多。八宝丹治疗组主要为绿色细丝纤维的Ⅲ型胶原增多,Ⅰ型胶原较胆汁淤积组少。空白对照组、胆汁淤积组、八宝丹治疗组纤维化面积（5.56±0.61vs38.21±3.28vs20.65±2.01）,各组间差异有统计学意义,P<0.01。免疫组化结果显示TGF—β1、Smad3蛋白在空白对照组肝组织中基本无阳性表达,胆汁淤积组表达显着增强,八宝丹治疗组阳性颗粒明显减少,染色程度减轻。空白对照组、胆汁淤积组、八宝丹治疗组相比:TGF—β1蛋白（0.95±0.21 vs6.52±1.01vs4.17±0.72）;Smad3 蛋白（1.05±0.52vs6.89±1.29vs4.85±0.93）,各组间差异有统计学意义（P<0.01）。RT-PCR结果显示TGF—β1、Smad3 mRNA在空白对照组肝组织表达较少,胆汁淤积组表达显着增多,八宝丹治疗组表达升高。空白对照组、胆汁淤积组、八宝丹治疗组相比:TGF—β1 mRNA（0.44±0.05vs1.00±0.06vs0.66±0.02）;Smad3 mRNA（0.63±0.04vs0.93±0.05vs0.79±0.03）,各组间差异有统计学意义（P<0.01）。结论1.八宝丹可以降低ANIT诱导的胆汁淤积肝病小鼠血清中肝功能（TBA、TBil、DBil、ALT、AST、ALP、GGT）、肝纤维化指标（HA、LN、PC-Ⅲ C-Ⅳ）水平,减轻肝细胞病变及坏死,对胆汁淤积症有积极的治疗作用;减少肝胶原纤维沉积,预防肝纤维化。2.八宝丹可显着抑制的TGF—β1、Smad3 mRNA及蛋白的表达,抑制TGF-β1/Smad信号通路激活,与八宝丹的护肝作用有关。3.采用组织学染色法与HE染色评价肝纤维化程度,可同时明确当前肝脏损伤情况及肝纤维化程度。对比Masson染色法,苦味酸-天狼猩红染色对胶原纤维有更好的特异性,结果明显,利于分型,是一种较好的胶原纤维染色方法,具有更大的优势。
孙碧韶[9]（2019）在《尿源干细胞及其外泌体在化疗药物导致的泌尿系损伤中的应用研究》文中提出背景及目的:化疗药物的临床应用常伴随着一系列的不良反应,造成多器官、多系统损伤,严重影响患者的化疗疗效和预后。在泌尿系统,化疗药物导致的损伤主要表现为急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）和出血性膀胱炎（hemorrhagic cystitis,HC）,具有代表性的化疗药物分别是顺铂和环磷酰胺。目前临床上针对AKI和HC的治疗手段疗效有限,以间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）应用为代表的干细胞技术为其治疗带来了希望,然而MSCs在泌尿系统的应用仍存在障碍。尿源干细胞（urine-derived stem cells,USCs）是相比于MSCs更适用于泌尿系疾病的种子细胞,USCs及USCs分泌的外泌体（exosomes secreted from urine-derived stem cells,USCs-Exo）在多种泌尿系疾病中具有治疗作用,而在化疗药物导致的AKI、HC等泌尿系损伤中的应用尚缺乏探索。本研究旨在探索USCs及USCs-Exo在化疗药物导致的泌尿系损伤中的应用效果,并初步探讨其机制,为临床治疗这类疾病提供新的思路与参考。方法:第一部分:探索USCs在顺铂诱导的大鼠AKI模型中的治疗作用并初步探讨其机制收集6名健康男性的无菌尿液用于USCs的提取及培养。CCK-8实验检测USCs的生长曲线;流式细胞术、免疫荧光检测USCs的表面标志物表达;诱导分化实验检测USCs的多向分化能力;绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）慢病毒转染USCs用于示踪。取30只野生型雌性Sprague-Dawley大鼠随机分为对照组、模型组及治疗组,通过单次腹腔注射顺铂（5 mg/kg）的方式诱导大鼠AKI模型,模型建立后第1天通过尾静脉注射应用2×106 USCs作为治疗。第2、4天各处死1只大鼠,共聚焦显微镜下检测肾组织中GFP标记的USCs,第4天处死所有大鼠,摘眼球取血,取肾组织。血生化检测大鼠血清（serum creatinine,SCr）及尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）的水平;HE及PAS染色观察大鼠肾组织学损伤变化,采用肾小管损伤评分、肾小球损伤计数、PAS阳性面积比评估大鼠肾组织学损伤程度;透射电镜观察大鼠肾脏超微结构的改变;Ki67免疫组化、TUNEL染色观察大鼠肾组织增殖及凋亡的变化;Western Blot实验检测大鼠肾组织TNF-α、IL-6、NF-κB、BCL-2、BAX、cleaved caspase-3的表达变化。采用梯度浓度的顺铂诱导大鼠肾上皮NRK-52E细胞损伤,CCK-8实验检测顺铂的细胞毒性,流式细胞术检测细胞周期,选取合适的浓度诱导后续细胞损伤模型;细胞模型构建后与USCs共培养,CCK-8实验检测损伤细胞增殖活性的变化、流式细胞术检测细胞周期及凋亡的变化。第二部分:探索USCs-Exo在环磷酰胺诱导的小鼠膀胱炎模型中的治疗作用并初步探讨其机制用去除外泌体的胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）的培养基培养USCs,2天后收集上清,超速离心法提取USCs-Exo,透射电镜观察外泌体形态;粒径分析检测外泌体粒径分布;Western Blot实验检测外泌体标志蛋白。取45只野生型雌性C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组及治疗组,通过隔日注射1次,共4次的方式腹腔注射80 mg/kg的环磷酰胺诱导小鼠膀胱炎模型。模型建立后的第1天,通过尾静脉注射含100μg总蛋白的USCs-Exo悬液作为治疗,第4天处死所有小鼠取膀胱。HE染色观察膀胱组织学损伤变化,软件测量膀胱上皮厚度及黏膜下层的距离;甲苯胺蓝染色观察膀胱组织肥大细胞浸润变化;Ki67免疫组化观察膀胱黏膜增殖的变化;TUNEL染色观察膀胱黏膜凋亡的变化;扫描电镜观察膀胱黏膜管腔面上皮超微结构改变;Western Blot实验检测膀胱组织中TNF-α、IL-6、IL-10、NOX2、cleaved caspase-3的表达变化;尿动力学实验检测膀胱排尿功能变化。用100 ng/mL的脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导人膀胱上皮SV-HUC-1细胞的炎症模型,用PKH67染色的USCs-Exo与SV-HUC-1共培养,激光共聚焦显微镜下观察LPS诱导的SV-HUC-1对USCs-Exo的吸收;CCK-8实验检测SV-HUC-1细胞增殖活性的变化,划痕实验检测SV-HUC-1细胞迁移能力的变化。提取USCs-Exo及相应USCs中的RNA,small RNA测序探讨可能的机制。结果:1.我们提取的USCs呈指数生长,可快速增殖;表达与MSCs类似的表面标志物CD44、CD73、CD105、CD133;不表达造血干细胞表面标志物CD31、CD34、CD45;表达胚胎干细胞表面标志物SSEA4;表达肾周细胞表面标志物CD146、PDGFRB、NG2;能向平滑肌和上皮细胞分化。在USCs治疗后,大鼠血清BUN、SCr水平显着降低;肾小管损伤评分、肾小球损伤计数、PAS阳性面积比明显降低;大鼠肾脏超微结构明显改善;肾小管上皮细胞增殖增加、凋亡减少;在第2、第4天均可在肾组织中发现GFP标记的USCs;TNF-α、IL-6、NF-κB、BAX、cleaved caspase-3的表达水平明显降低,BCL-2的表达水平明显升高。梯度浓度的顺铂均可导致NRK-52E细胞增殖活性降低、细胞周期阻滞。选择10μM、20μM诱导体外模型,与USCs共培养后,诱导的NRK-52E细胞增殖活性显着升高、细胞周期阻滞改善,细胞凋亡率显着下降。2.我们提取的USCs-Exo电镜下呈典型的“杯盘状”形态;粒径分布在80200 nm;表达外泌体标志蛋白CD9、CD63。在USCs-Exo治疗后,小鼠膀胱黏膜上皮厚度减少、黏膜下层距离明显降低;肥大细胞浸润明显减少;黏膜上皮增殖率降低、凋亡率减少;膀胱上皮管腔面的超微结构明显改善;TNF-α、IL-6、cleaved caspase-3及NOX2的表达水平均下降、而IL-10的表达水平升高;小鼠排尿间隔延长、最大排尿压下降。LPS诱导的SV-HUC-1细胞可吸收USCs-Exo,与USCs-Exo共培养后,增殖活性增强、迁移能力增强。small RNA测序提示USCs-Exo中的microRNA可能是其发挥治疗作用的机制所在。结论:1.USCs可通过减轻炎症反应,抑制肾小管上皮细胞凋亡,促进肾小管上皮细胞增殖,从而在体内和体外减轻顺铂诱导的AKI大鼠模型的肾损伤;2.USCs对AKI大鼠模型的治疗作用可能是通过USCs直接向肾组织归巢分化或通过旁分泌方式发挥作用;3.USCs-Exo可通过减轻炎症反应及氧化应激、抑制膀胱上皮细胞的病理性增生及凋亡、及促进膀胱上皮细胞的迁移及分化,从而减轻环磷酰胺诱导的小鼠膀胱炎,促进其排尿功能的恢复;4.USCs-Exo对膀胱炎小鼠模型的治疗作用很可能与其所含有的microRNA有关。
尉春晓[10]（2019）在《核糖体组装调控因子PNO1基因通过mTOR通路调控膀胱癌增殖的机制研究》文中研究说明研究背景膀胱癌的发病率在泌尿生殖系统恶性肿瘤中位居前列,每年全世界大约有43万人被诊断为膀胱癌。如此庞大的患病人群,不仅对泌尿外科、肿瘤科等相关领域的临床和基础工作者提出了严峻的挑战,更是对经济社会发展造成了巨大的负担。因此,如何更早期准确的诊断、更精准有效的治疗成为摆在膀胱癌基础和临床工作者面前的一道难题。膀胱癌的发生、发展、对各种治疗方案的疗效反应和预后,均与其分子生物学特征密切相关。目前,膀胱癌的分子生物学研究已经进入了一个崭新的发展阶段,这得益于膀胱癌基因组学、转录组学和蛋白质组学方面基础理论的不断完善和相关实验技术的迅猛发展。目前膀胱癌的诊断仍主要依赖于膀胱镜检查,但是作为一种有创性检查,膀胱镜检查不仅给患者身体带来不可避免的痛苦,增加了患者的心理负担,而且有尿路感染、出血和尿道损伤的风险。因此,临床上急需一种创伤小、敏感性和特异性均高的无创性检查方法来协助膀胱癌的诊断。尿液脱落细胞学检查作为一种无创性的诊断方法,一开始被寄予厚望,但是由于其敏感性和特异性均不高,尚无法取代膀胱镜在膀胱癌诊断中的主导地位。随着膀胱癌分子生物学研究的不断进展,分子肿瘤标记物在膀胱癌无创性诊断中的研究也日新月异,但是目前尚无一种标记物被指南推荐可以取代膀胱镜检查的地位,仍需更多更加深入细致的基础和临床研究来寻找和筛选理想的膀胱癌分子标记物。对于转移性膀胱癌等晚期患者,目前临床上的治疗以全身化疗为主,但是20多年以来膀胱癌的一线全身化疗药物主要是基于顺铂的方案,无明显进展。随着膀胱癌分子生物学研究的不断进展,膀胱癌的靶向治疗迎来了发展的新阶段。靶向治疗的目标是干扰肿瘤特异性的信号通路,其中一些靶向治疗的药物已经进入临床试验阶段。但是由于膀胱癌的多样性和个体差异,单纯一种或几种靶向药物无法有效治疗所有的晚期膀胱癌。因此,仍需更多的基础和转化研究来为临床治疗提供更多更有效的靶向药物。PNO1基因位于人染色体2p14,由7个外显子和6个内含子组成,其编码的PNO1蛋白是一种核仁蛋白。核糖体是细胞合成蛋白质的场所,被誉为“细胞的蛋白质工厂”,由大小两个亚基组成,许多蛋白都参与到了核糖体小亚基成熟的晚期阶段,其中就包括PNO1蛋白。目前有关PNO1基因的基础研究非常少,而该基因在人膀胱癌中的表达情况和作用机制,目前尚无深入系统的研究。本研究力求通过研究PNO1基因在膀胱癌中的表达情况和作用机制,能为膀胱癌的分子肿瘤标记物诊断和靶向治疗提供新的、有价值的理论依据和实验基础。研究目的本研究拟通过检测PNO1基因在膀胱癌临床标本和细胞系中的表达情况,分析其与膀胱癌病理分级和临床分期的关系;拟利用RNA干扰技术靶向干扰PNO1基因,然后进行体内外实验以研究其对膀胱癌细胞生物学行为的影响,并探究可能的下游基因和相关通路。实验方法1.PN01基因在人膀胱癌临床标本和细胞系中的表达研究1.1免疫组织化学染色法检测膀胱癌标本中PN01蛋白的表达将石蜡包埋的人膀胱癌临床标本进行免疫组织化学染色,然后在显微镜下观察组织切片,进行视野拍照,并采集图像。根据显微镜下观察到的染色范围和染色程度这两个方面进行评分来判定蛋白表达情况,并研究其与肿瘤的病理分级和临床分期之间的关系。1.2实时定量PCR检测膀胱癌细胞系中PN01基因的表达首先设计合适的PCR反应所需要的引物,再提取人膀胱癌细胞系T24和5637中的RNA,同时提取对照细胞系人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1中的RNA,反转录获得cDNA,在配置完成反应体系后,进行实时定量PCR（Real-time PCR）检测,最后采用仪器自带软件进行数据分析。2.干扰PN01基因对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响和其下游基因及调控通路研究2.1 PN01基因的RNA干扰靶点设计、慢病毒载体构建首先以PNO1基因为模板,设计干扰靶点,再根据干扰靶点序列设计shRNA干扰序列,进行RNA干扰慢病毒载体的构建,获得携带RNA干扰靶点序列的慢病毒载体。2.2 PN01基因的RNA干扰慢病毒包装首先进行质粒转染,然后进行慢病毒收获与浓缩:收集转染后的293T细胞上清液,经高速离心等处理后收获上清,获得PNO1-shRNA慢病毒颗粒,按要求分装在病毒管中,-80℃保存。2.3 PN01-shRNA慢病毒感染5637和T24人膀胱癌细胞将GFP（绿色荧光蛋白）标记的PNO1-shRNA慢病毒和对照组病毒感染5637和T24人膀胱癌细胞,感染后72 h左右,使用荧光显微镜观察GFP的表达情况,筛选出细胞状态良好的感染效率合格组,用于下游检测。2.4检测PN01基因干扰的5637和T24人膀胱癌细胞中PN01基因的表达情况（1）实时定量PCR检测mRNA水平PNO1基因敲减效率将5637和T24人膀胱癌细胞分为两个实验组:shCtrl组（阴性对照病毒感染组）和shPNO1组（PNO1基因shRNA慢病毒感染组）。然后采用实时定量PCR方法检测PNO1基因干扰后其mRNA的表达量。（2）Western Blotting检测靶点干扰后PN01基因的蛋白水平表达将5637和T24人膀胱癌细胞分为shCtrl组和shPNO1组两个实验组,然后将细胞样本裂解后提取细胞内的总蛋白,再进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹（转膜）、抗体杂交,最后行X光显影。2.5检测干扰PN01基因对5637和T24人膀胱癌细胞生长和增殖的影响（1）Cel igo细胞计数检测细胞生长将处于对数生长期的shCtrl组和shPNO1组细胞经过胰酶消化后进行铺板,每天用Celigo细胞计数仪检测一次,准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量,根据细胞计数值和时间点,绘制基于细胞计数值的细胞生长曲线和基于细胞增殖倍数的生长曲线。（2）细胞活力检测先将经过胰酶消化后处于对数生长期的shCtrl组和shPNO1组细胞悬液进行铺板、培养,然后依次加入噻唑兰（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide,MTT）和二甲基亚砜（DMSO）溶解甲瓒颗粒,最后用酶标仪检测其吸收值,进行数据统计分析。（3）细胞克隆形成检测先将处于对数生长期的shCtrl组和shPNO1组细胞经过胰酶消化后,制成细胞悬液、进行接种培养,荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照。最后用多聚甲醛固定细胞、GIEMSA染液染色,用数码相机拍照、计算克隆数。2.6流式细胞仪检测干扰PNO1基因对膀胱癌细胞凋亡的影响首先将shCtrl组和shPNO1组细胞接种于6孔板上,常规培养,诱导凋亡,于感染后第5天用胰酶消化,制成细胞悬液,再进行离心、Annexin V-APC染色,最后上机检测处于凋亡状态的细胞数量来检验PNO1基因与细胞凋亡的关系。2.7筛查PNO1基因的下游基因并进行Western Blotting验证分别提取shCtrl组和shPNO1组的总RNA,体外反转扩增后置入基因芯片中进行杂交、洗染、扫描,获得数据,筛选出有显着差异表现的基因,利用IPA（Ingenuity Pathway Analysis）分析软件对差异基因结果进行分析,初步筛查出PNO1基因调控的下游基因,并绘制出基因网络图。最后对筛查出的PNO1基因的下游基因进行Western Blotting验证。2.8研究PNO1基因的下游调控通路使用IPA基因通路分析软件,对基因芯片分析的差异基因和该软件数据库所收集归纳的800条信号、代谢通路进行整合分析,初步筛查出差异基因富集的信号通路。然后使用 PathScan（?）Intracellular Signaling Antibody Array Kit（信号通路蛋白抗体芯片）检测和比较shCtrl组和shPNO1组中信号通路关键信号分子的变化,研究PNO1基因在膀胱癌中的相关调控通路。实验步骤包括细胞裂解、孵育,与抗体检测液、HRP、化学发光试剂反应,显影成像和分析。2.9实时定量PCR检测PN01基因干扰后膀胱癌细胞系中mTOR基因的表达采用实时定量PCR方法检测PNO1基因干扰后膀胱癌细胞系中mTOR基因mRNA的表达情况,以验证mTOR通路是PNO1基因调控的下游通路。3.干扰PNO1基因对裸鼠膀胱癌移植瘤细胞增殖和凋亡的影响及机制研究3.1建立膀胱癌的裸鼠移植瘤模型将处于对数生长期的shCtrl组和shPNO1组成瘤细胞经过胰酶消化后,完全培养基重悬成细胞悬液,按照每组10只裸鼠将准备好的成瘤细胞注射至裸鼠右侧腋下的皮下组织内,仔细喂养裸鼠并观察生长状况。3.2移植瘤体积重量测量和活体成像检测每周收集两次常规观察指标的数据,包括裸鼠重量、移植瘤瘤体长短径等。在皮下注射成瘤细胞36天后进行活体成像检测,结束后处死裸鼠,取出肿瘤,拍摄裸鼠和移植瘤照片,称重、测量、整理数据。3.3免疫组织化学染色法检测移植瘤组织中Ki-67蛋白的表达情况先将瘤体组织进行石蜡包埋固定,再进行切片、脱蜡和水化处理,然后对瘤体切片进行Ki67抗体标记,经显色与封片后于显微镜下观察,拍照,然后进行数据整理和分析。3.4实时定量PCR检测移植瘤组织中Bcl-2和Bax基因的mRNA表达情况采用实时定量PCR方法检测膀胱癌移植瘤组织中Bcl-2和Bax基因的mRNA表达情况,以研究干扰PNO1基因对移植瘤组织细胞凋亡的影响。3.5实时定量PCR检测干扰PNO1基因对移植瘤组织中mTOR基因mRNA表达的影响采用实时定量PCR方法检测干扰PNO1基因对膀胱癌移植瘤组织中mTOR基因mRNA表达的影响,在体内条件下验证mTOR通路是PNO1基因调控的下游通路。4.统计分析使用SPSS 25.0对数据进行统计分析。根据数据类型选择相应的统计分析方法,计数资料选用卡方检验或Fisher精确检验,计量资料选用方差分析或t检验。以平均值±标准差表示计量资料,P<0.05为差异具有统计学意义。实验结果1.1 PN01蛋白在膀胱癌组织中均阳性表达并且与病理分级和临床分期有关免疫组化染色显示PNO1蛋白在正常膀胱组织中表达很少,而在低级别和高级别膀胱癌组织中则均阳性表达。分别按照临床分期和病理分级将膀胱癌标本进行分组对比研究,结果显示临床分期越晚,病理分级越高,PNO1蛋白的表达越高。1.2 T24和5637人膀胱癌细胞中PN01基因的mRNA表达升高采用实时定量PCR方法检测了 T24和563 7这两种膀胱癌细胞中PNO1基因的mRNA表达量,通过与人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1中PNO1基因的mRNA表达量进行对比分析,结果显示在T24和5637细胞中PNO1基因均有高丰度的mRNA表达。2.1 PN01基因干扰的5637和T24人膀胱癌细胞系的构建成功利用RNA干扰技术构建了 PNO1基因敲减质粒,经慢病毒包装、感染,从而建立了 PNO1低表达的5637和T24膀胱癌细胞系模型。2.2 PN01基因干扰的5637和T24人膀胱癌细胞中PN01基因的表达明显下调（1）实时定量PCR方法检测PN01基因干扰的5637和T24人膀胱癌细胞中其mRNA的表达量显着下降实时定量PCR检测结果显示,经PNO1基因shRNA慢病毒感染后,与shCtrl组相比,shPNO1组5637细胞和T24细胞中PNO1基因在mRNA水平的表达量均受到抑制,敲减效率分别达到58.6%和71.5%。（2）Western Blott i ng方法检测PN01基因干扰的5637和T24人膀胱癌细胞中其蛋白表达量显着下降Western Blotting方法检测PNO1基因干扰后5637和T24人膀胱癌细胞中相应蛋白的表达量,结果显示shPNO1组中PNO1蛋白表达水平较shCtrl组显着降低,具有统计学差异。2.3 PN01基因干扰的5637和T24人膀胱癌细胞的生长和增殖受到明显抑制（1）Celi go细胞计数检测细胞生长Celigo细胞计数仪观察结果显示,自扫板观察的第3天开始,shPNO1组的细胞数量开始逐渐下降,而shCtrl组细胞数量仍然持续增加,表明shPNO1组膀胱癌细胞的增殖受到明显的抑制。（2）细胞活力检测MTT法检测结果显示,shPNO1组膀胱癌细胞在酶标仪对波长490nm光的吸收率明显低于shCtrl组,提示shPNO1组膀胱癌细胞的增殖活力受到明显的抑制。（3）细胞克隆形成检测shPNO1组的克隆形成数量和平均克隆数明显低于shCtrl组,具有统计学差异,表明在5637和T24人膀胱癌细胞中,shPNO1组细胞的克隆形成能力受到明显的抑制,提示干扰PNO1基因对膀胱癌细胞增殖有抑制作用。2.4 PN01基因干扰的5637和T24人膀胱癌细胞的细胞凋亡率明显增加流式细胞仪检测结果显示,shPNO1组的细胞凋亡率明显高于shCtrl组,具有统计学差异（p<0.01）。这表明在5637和T24人膀胱癌细胞中,shPNO1组的细胞凋亡数量增加,提示PNO1基因有抑制膀胱癌细胞凋亡的作用。2.5基因芯片联合IPA分析初步筛查出PNO1基因的下游基因采用基因芯片技术初步筛选出了在shCtrl组和shPNO1组中基因表现有显着差异的基因,结果显示,与shCtrl组相比,shPNO1组的上调基因数有675,下调基因数868。然后在IPA数据分析软件中输入基因芯片分析的差异基因结果,初步筛查出了 PNO1基因调控的下游基因CD44,PTGS2,CCND1,CDK1,F3,CXCL8 和 FOSL1。2.6 Western Blotting验证后确定PN01基因的下游基因Western Blotting方法检测结果显示,与shCtrl组相比,shPNO1组中除F3蛋白外,CD44蛋白、CCND1蛋白、FOSL1蛋白、PTGS2蛋白、CDK1蛋白和CXCL8蛋白表达均显着下调。这提示PNO1基因在T24膀胱癌细胞通过调控CD44,PTGS2,CCND1,CDK1,CXCL8 和 FOSL1 基因发挥作用,F3 基因则被排除。2.7 PNO1基因通过mTOR通路调控膀胱癌细胞的增殖通过IPA分析软件整合分析基因芯片分析的差异基因和该软件数据库所收集归纳的信号通路,初步筛查出包括mTOR信号通路在内的十大信号通路。然后使用抗体芯片检测,结果显示shPNO1组中的多个信号通路关键蛋白均下调,其中mTOR和p70 S6激酶的表达水平显着下调,具有统计学意义。这提示PNO1基因通过调控mTOR、p70 S6激酶所在的mTOR信号通路进而对膀胱癌细胞的增殖产生影响。2.8 PN01基因干扰后膀胱癌细胞系中mTOR基因mRNA的表达下调实时定量PCR检测结果显示,PNO1基因干扰后5637和T24膀胱癌细胞中shPNO1组的mTOR基因mRNA的表达量明显低于shCtrl组。3.1干扰PNO1基因可抑制T24人膀胱癌裸鼠移植瘤的生长定期观察shCtrl组和shPNO1组裸鼠的生长状况、测量裸鼠的体重和肿瘤大小,结果显示,随着时间的延长,两组移植瘤模型之间肿瘤体积的差距逐渐加大。shPNO1组的肿瘤体积和肿瘤重量均明显小于shCtrl组,表明体内条件下抑制PNO1基因的表达,可导致膀胱癌细胞在体内增殖速度减低,同时致瘤能力也受到抑制。3.2活体成像显示干扰PN01基因后T24人膀胱癌裸鼠移植瘤的生长受到抑制对两组裸鼠进行了活体成像检测,获得了每只实验裸鼠的区域内总荧光表达量等相关观察指标。结果显示shPNO1组的区域内总荧光表达量为明显低于shCtrl组,具有统计学差异,提示干扰PNO1基因可在体内条件下抑制膀胱癌细胞的增殖和移植瘤的生长。3.3干扰PNO1基因后移植瘤中Ki67蛋白表达明显下调利用免疫组化染色法对裸鼠移植瘤瘤体组织中细胞增殖标记物Ki67蛋白表达情况进行了对比分析,结果显示shPNO1组瘤体组织中Ki67阳性细胞百分比明显低于shCtrl组,表明干扰PNO1基因会使膀胱癌细胞在体内的增殖受到抑制。3.4干扰PNO1基因后移植瘤组织中Bcl-2基因mRNA表达下调,Bax基因mRNA表达升高实时定量PCR结果显示,与shCtrl组相比,shPNO1组瘤体组织中Bcl-2基因mRNA表达下调,Bax基因mRNA表达升高,提示干扰PNO1基因可在体内条件下促进细胞凋亡。3.5干扰PN01基因后移植瘤组织中mTOR基因mRNA表达下调实时定量PCR结果显示,shPNO1组瘤体组织中mTOR基因mRNA表达量明显低于shCtrl组,提示在体内条件下PNO1基因通过调控mTOR通路对移植瘤的生长增殖产生影响。实验结论1.在人膀胱癌临床标本和细胞系中,PNO1基因均阳性表达,并且肿瘤的临床分期和病理分级越高,PNO1蛋白的表达量也越高。2.体外实验中干扰PNO1基因后膀胱癌细胞的生长状况、细胞活力和克隆形成能力均受到显着抑制,而凋亡数量明显增加,表明PNO1基因在膀胱癌中具有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的作用。进一步的机制研究表明,PNO1基因通过调控mTOR信号通路对膀胱癌细胞的生长增殖产生影响,并且CD44,PTGS2,CCND1,CDK1,CXCL8和FOSL1等基因参与其中。3.体内实验中干扰PNO1基因后裸鼠膀胱癌移植瘤的生长状况和活体荧光表达量受到显着抑制,瘤体组织的Ki67蛋白表达水平明显降低,Bcl-2基因mRNA表达下调,Bax基因mRNA表达升高,mTOR基因mRNA表达下调,表明体内条件下干扰PNO1基因可通过调控mTOR信号通路,有效抑制膀胱癌细胞的增殖、促进凋亡。
二、7690-Xu荧光染色法在泌尿系统疾病的应用研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、7690-Xu荧光染色法在泌尿系统疾病的应用研究（论文提纲范文）
（1）通腑逐瘀法指导下抵当汤加减调控AQP4表达治疗大鼠急性脊髓损伤的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 自制脊髓打击器与NYU打击器建立脊髓损伤模型研究 |
| 1.目的 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 6.不足和展望 |
| 第二部分 抵当汤加减调节AQP4 表达对SCI大鼠脊髓水肿的作用研究 |
| 1.目的 |
| 2.材料 |
| 3.方法 |
| 4.实验结果 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 7.不足与展望 |
| 第三部分 抵当汤加减含药血清对反应性星形胶质细胞的活化、迁移及神经生长相关细胞因子分泌的作用 |
| 1.目的 |
| 2.材料 |
| 3.实验方法 |
| 4.实验结果 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 7.不足和展望 |
| 本研究的创新点 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 附件1 自制简易打击器与NYU打击器 |
| 附件2 脊髓打击损伤模型 |
| 附录3 BBB评分 |
| 附录4 Reuter评分 |
| 附录5 综述 水通道蛋白在急性脊髓损伤中的作用机制 |
| References |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）colibactin毒性相关基因在E.coli致脑膜炎中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 大肠杆菌性脑膜炎研究进展 |
| 1.1 致病性大肠杆菌概况 |
| 1.2 大肠杆菌性脑膜炎流行情况 |
| 1.3 致脑膜炎大肠杆菌毒力因子 |
| 1.4 脑膜炎的发生机制 |
| 2 基因毒素colibactin研究进展 |
| 2.1 colibactin的发现与生物合成 |
| 2.2 colibactin的毒性与检测方法 |
| 2.3 pks毒力岛的分布与高毒力性 |
| 3 双转录组测序(dual RNA-seq)技术研究进展 |
| 3.1 原理与发展 |
| 3.2 应用 |
| 4 研究目的与意义 |
| 5 参考文献 |
| 第二章 双转录组检测筛选APEC致脑膜炎相关毒力基因的研究 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 细胞及菌株 |
| 1.2 主要试剂及试剂盒 |
| 1.3 培养液及主要溶液的配制 |
| 1.4 试验仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 bEnd.3细胞培养与传代 |
| 2.2 细胞与细菌感染互作 |
| 2.3 dual RNA-seq样品的制备 |
| 2.4 cDNA文库的构建 |
| 2.5 测序 |
| 2.6 原始数据过滤及质量评估 |
| 2.7 序列比对到参考基因组 |
| 2.8 基因的差异表达及富集分析 |
| 2.9 dual RNA-seq结果验证 |
| 3 结果 |
| 3.1 dual RNA-seq数据的总体概况 |
| 3.2 dual RNA-seq数据准确性的验证结果 |
| 3.3 bEnd.3细胞转录组数据分析 |
| 3.4 APEC XM转录组数据分析 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 APEC XM clbH、 clbK、 clbF、 clbI或clbG基因缺失株及其回补株的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 培养基和主要试剂 |
| 1.3 试验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 PCR引物设计 |
| 2.2 融合PCR产物的扩增与纯化 |
| 2.3 APEC XM-pKD46感受态细胞的制备 |
| 2.4 融合PCR产物的电转化 |
| 2.5 一次重组菌的鉴定 |
| 2.6 温度敏感型质粒pKD46的消除 |
| 2.7 FLP重组酶介导的二次重组 |
| 2.8 二次重组菌的鉴定 |
| 2.9 回补菌株的构建 |
| 3 结果 |
| 3.1 融合cat基因的PCR产物鉴定 |
| 3.2 一次重组菌鉴定 |
| 3.3 二次重组菌鉴定 |
| 3.4 回补株的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 APEC XM中clbH、clbK、 clbF、clbI或clbG缺失对colibactin相关毒性的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株与细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 细菌生长曲线的测定 |
| 2.2 细菌粘附与侵袭力的检测 |
| 2.3 细菌对bEnd.3细胞毒性的测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 clbH、 clbK、clbF、clbI或clbG基因缺失对APEC XM生长的影响 |
| 3.2 clbH、 clbK、clbF、clbI或clbG基因缺失对细菌粘附与侵袭细胞的能力影响 |
| 3.3 clbH、clbK、clbF、clbI或clbG缺失株感染对bEnd.3细胞形态的影响 |
| 3.4 clbH、 clbK、clbF、clbI或clbG缺失株感染对bEnd.3细胞γH2AX表达的影响 |
| 3.5 clbH、 clbK、 clbF、clbI或clbG基因缺失株感染对bEnd.3细胞周期的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第五章 clbG或clbH缺失株感染对bEnd.3细胞相关炎性因子和紧密连接蛋白影响的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠脑微血管内皮细胞感染模型 |
| 2.2 实时荧光定量PCR法检测相关炎性因子的表达 |
| 2.3 Western Blot法检测紧密连接蛋白的表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 clbG和clbH缺失株对感染细胞相关炎性因子基因表达的影响 |
| 3.2 clbG和clbH缺失株对感染细胞相关紧密连接蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第六章 clbG和clbH在APEC致小鼠脑膜炎中的作用研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和小鼠 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 实验动物饲养 |
| 2.2 小鼠脑膜炎模型的建立 |
| 2.3 临床检查、全血细胞计数和血脑屏障通透性观测 |
| 2.4 脑脊液的涂片镜检 |
| 2.5 血液、肺组织和脑组织细菌载量的测定 |
| 2.6 核磁共振检查 |
| 2.7 脑部病理组织学观察与紧密连接蛋白免疫组化检测 |
| 2.8 实时荧光定量PCR法检测脑组织炎性因子的基因表达 |
| 2.9 Western Blot法检测紧密连接蛋白的表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 clbG或clbH缺失株感染小鼠的脑膜炎临床相关指标变化 |
| 3.2 clbG或clbH缺失株感染小鼠的器官细菌载量变化 |
| 3.3 clbG或clbH缺失株感染小鼠的脑部病变 |
| 3.4 clbG或clbH缺失株感染小鼠的脑部相关炎性因子基因表达的变化 |
| 3.5 clbG或clbH缺失株感染小鼠的血脑屏障变化 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 全文结论 |
| 本文创新点 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附录（一） |
（3）头花蓼类中药对草酸钙结石的临床疗效观察及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 一、中医学对尿石症的认识 |
| 参考文献 |
| 二、现代医学对尿石症的认识 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一章 克淋通胶囊治疗尿石症的随机对照临床研究 |
| 第一节 临床资料 |
| 第二节 诊疗标准 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第二章 头花蓼对大鼠草酸钙结石的作用机制研究 |
| 第一节 材料和方法 |
| 第二节 实验方案 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
（4）肿瘤相关巨噬细胞通过IL-4/STAT6通路上调膀胱癌组织中PSMA表达的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一章 膀胱移行细胞癌细胞通过分泌IL-4促进STAT6磷酸化诱导巨噬细胞向M2表型极化的机制研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第二章 PSMA抑制剂2-PMPA下调CD31与Sema4D表达的裸鼠皮下移植瘤模型研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第三章 PSMA与CD31表达在膀胱移行细胞癌分期和预后中的临床研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 研究总结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（5）液基真菌富集制片靶向荧光染色法对外阴阴道假丝酵母菌病诊断价值的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 第2章 资料与方法 |
| 2.1 资料来源 |
| 2.2 取材方法 |
| 2.3 实验室检查 |
| 2.3.1 液基荧光法 |
| 2.3.2 湿片法 |
| 2.3.3 免疫荧光法 |
| 2.3.4 培养法 |
| 2.3.5 联合检测(液基荧光法+湿片法、免疫荧光法+湿片法、液基荧光法+湿片法+免疫荧光法)结果判读 |
| 2.4 统计学分析方法 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 各种检测方法的阳性率 |
| 3.2 液基荧光法、湿片法、免疫荧光法检测结果比较 |
| 3.3 液基荧光法+湿片法、免疫荧光法+湿片法、液基荧光法+湿片法+免疫荧光法检测结果比较 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 外阴阴道假丝酵母菌病的病因 |
| 4.2 外阴阴道假丝酵母菌病的发病机制 |
| 4.3 外阴阴道假丝酵母菌病的检测方法 |
| 第5章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 外阴阴道假丝酵母菌病诊断的研究进展 |
| 参考文献 |
（6）污水中典型抗生素、耐药菌及耐药基因的分布及其电催化降解研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩写 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 抗生素概述 |
| 1.1.1 抗生素类药物简介 |
| 1.1.2 环境中的抗生素污染 |
| 1.1.3 抗生素的危害 |
| 1.2 抗生素耐药菌及耐药基因概述 |
| 1.2.1 抗生素耐药菌 |
| 1.2.2 抗生素耐药基因 |
| 1.2.3 抗生素耐药性的环境水平 |
| 1.2.4 抗生素耐药性的传播扩散 |
| 1.2.5 抗生素耐药性的危害 |
| 1.3 水中抗生素及其耐药性的去除 |
| 1.3.1 传统污水处理技术 |
| 1.3.2 高级氧化技术 |
| 1.3.3 电化学高级氧化技术 |
| 1.3.4 电催化降解体系 |
| 1.3.5 毒性分析 |
| 1.4 论文的选题依据、研究目标、研究内容和技术路线 |
| 1.4.1 选题依据 |
| 1.4.2 研究目标 |
| 1.4.3 研究内容 |
| 1.4.4 技术路线 |
| 第二章 污水处理厂中抗生素及其耐药性的分布调查 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验材料、试剂及仪器 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 污水处理厂水样的基本水质 |
| 2.3.2 污水处理厂中抗生素 |
| 2.3.3 污水处理厂中抗生素耐药菌 |
| 2.3.4 污水处理厂中抗生素耐药基因 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 电极材料的制备及表征 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验材料、试剂及仪器 |
| 3.2.2 电极的制备 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 表征方法 |
| 3.3.2 表征结果 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 电催化降解典型抗生素 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验材料、试剂及仪器 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 电催化降解四环素的影响因素 |
| 4.3.2 电催化降解四环素的机理探究 |
| 4.3.3 电催化降解四环素中间产物的毒性分析 |
| 4.3.4 电催化降解氨苄青霉素的影响因素 |
| 4.3.5 电催化降解氨苄青霉素的机理探究 |
| 4.3.6 电催化降解氨苄青霉素中间产物的毒性分析 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 电催化灭活抗生素耐药菌 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 实验材料、试剂及仪器 |
| 5.2.2 抗生素耐药菌的转化培养 |
| 5.2.3 实验方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 外加偏压对电催化灭活耐药菌的影响 |
| 5.3.2 电催化灭活耐药菌的机理探究 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 电催化降解抗生素耐药基因 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 实验材料、试剂及仪器 |
| 6.2.2 实验方法 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 电催化降解抗生素耐药基因 |
| 6.3.2 电催化降解抗生素耐药基因的机理探究 |
| 6.3.3 电催化降解抗生素及其耐药性 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 结论、创新点与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间公开发表论文及着作情况 |
（7）逼尿肌Cx43分布和表达异常在DCP膀胱形成中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语表 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 主要液体配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 建立动物模型 |
| 2.2 尿动力学检测 |
| 2.3 采集实验标本 |
| 2.4 HE染色 |
| 2.5 免疫荧光染色观察逼尿肌Cx43 的分布情况 |
| 2.6 Western blot法检测逼尿肌组织Cx43 蛋白的表达 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3.技术路线 |
| 实验结果 |
| 1.尿动力学检查结果 |
| 2.HE染色结果 |
| 3.免疫荧光染色结果 |
| 4.Western blot结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
（8）八宝丹对胆汁淤积小鼠肝脏的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略表 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（9）尿源干细胞及其外泌体在化疗药物导致的泌尿系损伤中的应用研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 USCs在顺铂诱导的大鼠AKI模型中的治疗作用及机制初探 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 USCs-Exo在环磷酰胺诱导的小鼠膀胱炎模型中的治疗作用及机制初探 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 尿源干细胞研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（10）核糖体组装调控因子PNO1基因通过mTOR通路调控膀胱癌增殖的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 PNO1基因在人膀胱癌临床标本和细胞系中的表达研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 结果讨论 |
| 实验结论 |
| 第二部分 干扰PNO1基因对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响和其下游基因及调控通路研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 结果讨论 |
| 实验结论 |
| 第三部分 干扰PNO1基因对裸鼠膀胱癌移植瘤细胞增殖和凋亡的影响及机制研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 结果讨论 |
| 实验结论 |
| 研究总结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 综述 膀胱癌的分子生物学研究进展及其应用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
四、7690-Xu荧光染色法在泌尿系统疾病的应用研究（论文参考文献）
- [1]通腑逐瘀法指导下抵当汤加减调控AQP4表达治疗大鼠急性脊髓损伤的作用机制研究[D]. 吴子健. 湖北中医药大学, 2021(01)
- [2]colibactin毒性相关基因在E.coli致脑膜炎中的作用[D]. 王培莉. 扬州大学, 2021
- [3]头花蓼类中药对草酸钙结石的临床疗效观察及作用机制研究[D]. 于文晓. 北京中医药大学, 2021
- [4]肿瘤相关巨噬细胞通过IL-4/STAT6通路上调膀胱癌组织中PSMA表达的研究[D]. 王子龙. 山东大学, 2021(11)
- [5]液基真菌富集制片靶向荧光染色法对外阴阴道假丝酵母菌病诊断价值的研究[D]. 周招莲. 南昌大学, 2020(01)
- [6]污水中典型抗生素、耐药菌及耐药基因的分布及其电催化降解研究[D]. 刘海洋. 东北师范大学, 2020(04)
- [7]逼尿肌Cx43分布和表达异常在DCP膀胱形成中的作用[D]. 李朋. 石河子大学, 2020(08)
- [8]八宝丹对胆汁淤积小鼠肝脏的保护作用及机制研究[D]. 谢诗怡. 南方医科大学, 2020(01)
- [9]尿源干细胞及其外泌体在化疗药物导致的泌尿系损伤中的应用研究[D]. 孙碧韶. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [10]核糖体组装调控因子PNO1基因通过mTOR通路调控膀胱癌增殖的机制研究[D]. 尉春晓. 山东大学, 2019(02)