一、利用真核表达载体构建表达PRV闽A株gE基因表位抗原编码区片段的重组质粒（论文文献综述）
童武[1]（2020）在《猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗及其载体疫苗的研制》文中研究说明猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）感染所引起的以妊娠母猪流产、仔猪表现神经症状及高死亡率为特征的一种传染性疾病。目前对猪伪狂犬病的防控与净化主要还是靠接种基因缺失疫苗并配合相应的血清学检测来完成。我国于上世纪70年代从匈牙利引进PRV弱毒活疫苗Bartha K61株,并在猪场中推广应用后,猪伪狂犬病疫情得到了有效的控制。但2011年以来,很多伪狂犬病疫苗免疫过的猪场,大面积爆发了伪狂犬病,原来已经净化的猪场也在短时间内变成伪狂犬病野毒阳性,给养猪业造成了巨大的经济损失。经研究发现,引发免疫猪场伪狂犬病疫情的是一种变异的PRV毒株,该变异株的毒力较经典强毒株有明显增强,且现有的疫苗不能为免疫猪群提供完全保护。因此,研制新一代针对变异株的疫苗对于控制新发伪狂犬病十分必要,且具有重要意义。1、猪伪狂犬病病毒g E/g I双基因缺失疫苗候选株的研制（1）猪伪狂犬病病毒变异株（JS-2012株）g E/g I双基因缺失株的构建:以实验室前期分离的PRV变异株（JS-2012株）为基础,将其经过两次同源重组,将主要毒力基因g E/g I进行缺失,成功构建g E和g I基因双缺失的重组伪狂犬病基因缺失株,命名为JS-2012-△g E/g I。（2）JS-2012-△g E/g I病毒的生物学特性分析:JS-2012-△g E/g I株在Vero细胞上连续传20代,未出现任何突变,表明其具有很好的稳定性。采用间接免疫荧光和Western blot进行g E蛋白表达检测,结果显示该疫苗候选株的g E蛋白成功失活。病毒生长曲线和蚀斑形态检查结果显示,JS-2012-△g E/g I与JS-2012在细胞上生长动力学相似,但JS-2012-△g E/g I形成的蚀斑要明显小于JS-2012。（3）JS-2012-△g E/g I病毒的安全性试验:结果表明,疫苗候选株对哺乳仔猪和妊娠母猪均具有很好的安全性;不能在猪群中水平传播,也不能通过母猪垂直传播;返祖试验证明该疫苗候选株不能在仔猪体内发生毒力返强。（4）JS-2012-△g E/g I病毒的免疫效力试验:免疫攻毒试验结果表明,该疫苗候选株免疫仔猪后针对PRV变异株和经典PRV强毒株攻击均能提供完全的免疫保护。被动免疫试验结果表明,该疫苗候选株免疫母猪后所产仔猪通过哺乳也能获得完全的免疫保护。2、含猪瘟病毒E2基因的重组PRV活载体疫苗株的研制（1）表达猪瘟病毒E2基因的重组PRV活载体疫苗株的构建:以本研究所构建的伪狂犬病基因缺失弱毒活疫苗（JS-2012-△g E/g I株）为骨架,经过两次同源重组,成功获得一株含猪瘟病毒E2基因的重组PRV活载体疫苗株,命名为JS-2012-△g E/g I-E2。（2）JS-2012-△g E/g I-E2病毒的生物学特性分析:JS-2012-△g E/g I-E2株在Vero细胞上连续传20代,E2基因均能在载体病毒JS-2012-△g E/g I中稳定存在,且未出现任何突变;采用间接免疫荧光和Western blot进行E2蛋白表达检测,结果证明该重组疫苗候选株中的E2蛋白在传代过程中均能稳定表达。病毒生长曲线和蚀斑形态结果显示,JS-2012-△g E/g I-E2与亲本病毒JS-2012-△g E/g I均具有高度的相似性。（3）JS-2012-△g E/g I-E2病毒的安全性试验:结果表明,重组疫苗候选株对仔猪和妊娠母猪均具有很好的安全性;该重组疫苗不能在猪群中水平传播,也不能通过母猪垂直传播。（4）JS-2012-△g E/g I-E2病毒的免疫效力试验:免疫攻毒试验结果表明,重组疫苗候选株JS-2012-△g E/g I-E2免疫阴性仔猪,能有效的抵抗PRV强毒株和猪瘟病毒强毒株的攻击,临床保护效率达100%。重组疫苗候选株免疫PRV母源抗体阳性仔猪,然后再攻猪瘟强毒,临床保护效率仍能达到80%,这表明该载体疫苗能够较好地抵抗母源抗体干扰。综上所述,本试验构建的两株伪狂犬病病毒基因工程疫苗候选株（JS-2012-△g E/g I株和JS-2012-△g E/g I-E2株）,对仔猪和妊娠母猪均安全、有效,且不具备水平和垂直传播能力。同时,这两种疫苗都具有标记疫苗的特征,在临床应用过程中可利用其相应的分子标记来区分野毒感染动物与疫苗免疫动物,从而有利于净化猪群中的PRV和猪瘟病毒。如此,这两种疫苗将具有广阔的临床应用前景。
李丹[2]（2020）在《PRRS GP5及PR gB基因二联表位预测疫苗的构建及其免疫效果评价》文中指出猪繁殖与呼吸障碍综合征（PRRS）是全世界养猪业很常见的一种病毒性传染病,可导致不同年龄、品种的猪只被感染,尤以怀孕母猪及仔猪为主。该病的主要表现为厌食、发热,妊娠母猪早产、晚期流产以及产死胎等症状,给全球养猪产业造成了极为严重的经济损失。PRRSV的特点是免疫抑制和继发感染。目前,PRRSV疫苗在PRRSV的预防和控制方面还不是很有效,病毒变异性较大,传统疫苗存在易返毒、易与野毒重组等情况,对该病的防控造成很大困难。猪伪狂犬病是一种由猪伪狂犬病病毒（PRV）所引起的猪急性传染病。该病在猪这一动物种群中呈暴发性流行状态,能够引起妊娠母猪流产、死胎,初生仔猪的大量死亡,育肥猪呼吸困难、生长停滞,公猪不育等症状,是危害全球养猪业的重大传染病之一。在PRRSV、PRV免疫保护中细胞免疫起着颇为重要的作用。将筛选后的PRRSV GP5的B、T细胞表位,与PRV gB蛋白表位密集片段相连,构建PRRS GP5基因及PR gB基因二联表位基因疫苗,为PRRSV和PRV的预防提供提供理论及试验基础。本试验通过对6株美洲型PRRSV毒株JL580、HENAN、VR2332、NADC30、JXA1、NADC30 Like的GP5蛋白序列进行同源性分析,对其保守区进行T细胞和B细胞表位预测,将预测获得的序列进行连接（命名为GRE序列）,使用生物信息学软件对该序列的二级结构、亲水性以及跨膜区进行分析。结果显示,GRE序列的二级结构较稳定,亲水性较好,存在两个跨膜区域;PRV gB基因全长较长不易扩增,本研究依据已有对该基因的研究,选择包含表位序列较多的一个片段（59aa289aa）进行扩增,构建真核表达载体pEGFP-GP5、pEGFP-GRE、pEGFP-gB、pEGFP-GP5gB、pEGFP-GRE-GP5gB,将重组后的细胞质粒转入感受态细胞XL-10Gold之中,构建出重组感受态细胞质粒,鉴定后转染Marc145及PK15细胞,结果显示,均观察到绿色荧光表达;提取RNA转染细胞后,RT-PCR均可出现目的条带;裂解细胞,Western Blotting结果显示,均获得特异性蛋白条带出现。转染结果显示重组表达载体对细胞无显着毒性作用;通过流式细胞术试验检测重组质粒对细胞周期的影响,结果显示重组质粒对PK15细胞周期无显着影响（P>0.05）;经CCK-8试验及转染后细胞形态学观察,重组质粒的细胞毒性可评定为安全性较高。对SD大鼠（雄性）每两周免一次疫,共免疫五次。五免后流式细胞试验结果显示,pEGFP-GP5gB、pEGFP-GRE-GP5gB免疫组大鼠外周血中CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞的比率相较于免疫前有不同程度的提升,且显着高于pEGFP-N1和PBS免疫组（P<0.05）。剖检并制备组织切片观察,pEGFP-GP5、pEGFP-GRE、pEGFP-gB、pEGFP-GP5gB、pEGFP-GRE-GP5gB免疫组与对照组相较,脏器并不存在显着的病理变化,显示构建的重组质粒安全性较高。ELISA试验结果显示,免疫后尽管处理组较对照组相比大鼠体内特异性抗体有所提高,但所诱导的特异性抗体未达阳性水平。上述结果表明,本课题所构建的重组表位二联疫苗安全性较高,对脏器无明显毒性作用,可显着提高动物机体免疫水平,为养猪业PRRS及PR的预防提供参考。
黄文祥[3]（2020）在《表达猪圆环病毒3型衣壳蛋白的重组伪狂犬病毒构建及伪狂犬病毒gC、gG蛋白单克隆抗体制备》文中研究指明伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus,PRV）属于疱疹病毒科疱疹病毒属,该病毒的天然宿主是猪,可引起母猪发生流产、产出死胎,并伴有呼吸障碍。自2011年以来,Ⅱ型PRV在我国出现并流行,给我国养猪业造成巨大经济损失。猪圆环病毒3型（Porcine circovirus type 3,PCV3）是2015年新出现的一种猪病毒性传染病病原,能够产生猪生殖障碍、心脏和多系统炎症等临床症状,其衣壳（Capsid,Cap）蛋白是唯一的结构蛋白,能刺激动物机体产生针对PCV3的血清抗体,也是研制基因工程疫苗理想的抗原蛋白。迄今为止,PRV和PCV3共感染情况在兽医临床上屡见不鲜,所以研制预防PRV和PCV3双重感染的重组病毒疫苗工作显得尤为迫切。本研究以II型PRVHD/c株为亲本株,选择非结构蛋白基因gC和gG作为靶标位点,设计特异性引物扩增针对两个基因缺失的同源重组臂片段,同时构建了表达GFP的荧光表达盒和带有CMV启动子的PCV3 Cap表达盒。采用经典的分子生物学方法将各片段依次连接到pUC18载体上,构建了针对两个位点的同源重组转移载体并进行了测序验证,并且验证了两个载体质粒能够在细胞水平上稳定表达PCV3 Cap蛋白,为后续构建表达PCV3 Cap的PRV重组病毒提供重要分子工具。同时,本研究以Ⅱ型PRV HD/c基因组为模板,扩增出囊膜蛋白gC和gG基因截短序列,并通过构建到pET-28a（+）载体上进行原核表达gC和gG的主要抗原表位区域。以变性纯化的重组His-gC和His-gG蛋白为免疫原分别免疫BALB/c小鼠和新西兰白兔,从而获得了 WB和IFA反应性良好的多克隆抗体。同时取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合,随后采用有限稀释法进行4次亚克隆筛选,分别获得了 3株稳定分泌gC和gG单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过WB和IFA检测可知,所制备的两种单克隆抗体分别与外源转染样品和PRV感染样品均有良好反应,并进行了抗原表位的初步鉴定。通过使用针对gC的单克隆抗体可用于临床检测PRV疫苗毒株与流行毒株,并且PRV gC和gG单克隆抗体的制备也为研究其生物学功能以及基因缺失疫苗株的鉴定提供了基本工具。
马小静[4]（2020）在《牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎二联核酸疫苗的构建及其免疫效应研究》文中提出牛病毒性腹泻（BVD）和牛传染性鼻气管炎（IBR）是危害牛和其他反刍动物的两种重大疾病,病原分别为牛病毒性腹泻病毒（BVDV）和牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）。BVDV和IBRV常混合感染牛群,引起腹泻、出血综合征、流产、肺炎、脑炎、鼻炎、眼炎等临床症状,给养牛业带来了巨大经济损失。目前,对这两类疫病的防控主要依靠灭活疫苗或弱毒疫苗,但在实际应用中存在免疫持续期短、病毒毒力易返强、保存和运输成本高等诸多缺陷。因此,具有持久免疫应答、制备工艺简单、应用安全等优点的核酸疫苗成为了当下疫苗研制的热点。本研究将BVDV和IBRV的优势抗原基因插入到pVAX1真核表达载体中,获得能同时表达两种抗原基因的重组载体并研究其免疫效果,旨在研制一种能有效预防BVD及IBR的核酸疫苗。主要工作如下:1.BVDV E0与IBRV gD目的基因的克隆及生物信息学分析:根据GenBank收录的BVDV和IBRV参考序列设计引物,PCR扩增BVDV E0基因和IBRV gD基因并测序;利用生物信息学方法对目的蛋白进行分析。结果表明扩增的BVDV E0基因、IBRV gD基因符合预期大小,其蛋白具有较好的免疫原性,可作为核酸疫苗的候选抗原基因。2.pVAX1-E0-IRES-gD真核表达载体的构建:PCR扩增IRES序列;将IRES、BVDVE0、IBRV gD基因片段依次连接至pVAX1载体中,构建pVAX1-E0-IRES-gD重组质粒。重组质粒经双酶切及DNA测序鉴定,结果显示,成功构建本研究所需真核表达载体pVAX1-E0-IRES-gD。3.重组质粒pVAX1-E0-IRES-gD中目的基因体外表达的检测:将质粒pVAX1-E0-IRES-gD用脂质体法转染至293T细胞中,48 h后采用一抗（BVDV、IBRV阳性血清）和二抗（兔抗牛IgG-FITC）进行间接免疫荧光检测。结果显示,荧光显微镜下可观察到绿色荧光,证明目标蛋白E0和gD在293T细胞中成功表达并具有良好反应原性。4.pVAX1-E0-IRES-gD二联核酸疫苗免疫效果研究:将pVAX1-E0-IRES-gD二联核酸疫苗以不同剂量免疫小鼠,首免14d后加强免疫一次。采用ELISA方法检测小鼠血清中抗E0、gD抗体水平以及IFN-γ、IL-4含量,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖能力。结果显示,在抗体和细胞因子水平以及脾淋巴细胞增殖能力这三个指标方面,核酸疫苗组均高于空载体和阴性对照组且差异极显着,200 μg高剂量免疫组优于100μg、50μg中、低剂量组;另外,200μg高剂量核酸疫苗免疫组与BVD-IBR灭活疫苗组相比无显着性差异。本研究成功构建了BVD-IBR二联核酸疫苗,体外表达检测证明目的蛋白具有良好反应原性,动物免疫试验证明其能刺激机体产生良好免疫应答,以上试验结果都为BVD-IBR二联核酸疫苗的研制提供了可靠的数据及理论支持。
唐雯[5]（2020）在《表达猪圆环病毒2衣壳蛋白的重组伪狂犬病毒构建》文中研究指明猪圆环病毒2（Porcine circovirus type 2,PCV2）可以导致几种猪病综合征。其中,危害最为严重的是猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）。PCV2的衣壳蛋白（Capsid,Cap）是它最重要的免疫保护性抗原,它可以引起机体产生针对PCV2的特异性抗体,所以Cap是用于研发基因工程疫苗的一种理想的靶抗原。伪狂犬病（Pseudorabies,PR）,又称作奥耶斯基氏病（Aujeszky’s disease,AD）,是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）导致的一种急性传染病。猪场一旦感染很难根除。猪圆环病毒2和伪狂犬病毒对我国养猪业造成的危害巨大。相较于普通的将PCV2及PRV病原进行混合而制成的二联疫苗,PCV2/PRV重组疫苗具有更好的安全性及免疫原性。但迄今为止还没有有效的表达猪圆环病毒2 Cap的重组伪狂犬病毒的二联疫苗研制成功,所以构建表达PCV2 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒对于上述疾病防治及技术的升级来讲非常重要。本研究选择以PRV复制非必需蛋白gI（US7）作为插入位点,以TK、gE缺失的HD/c株为亲本,利用CRISPR/Cas9技术结合经典的同源重组技术对重组病毒进行拯救,最终我们得到了 1株TK-/gE-/gI-/Cap+重组伪狂犬病毒。对拯救的重组病毒进行验证,结果显示PCV2b的cap基因已经正确插入到HD/c株基因组中,与亲本株相比,重组毒株和亲本HD/c株的一步生长曲线及蚀斑大小并无明显差异,表明PCV2 cap基因的插入并不影响重组病毒的复制。通过Western Blot及间接免疫荧光试验对Cap蛋白的表达进行验证,结果显示cap基因虽然成功插入到亲本株基因组中,但其并不能成功表达Cap蛋白,且EGFP表达盒的删除并不是影响Cap蛋白表达的原因,查阅文献推测可能的原因为依赖PRV自身的启动子不足以启动外源基因的表达,需要强大的启动子以确保外源基因的稳定表达。为了给重组伪狂犬病毒提供配套的检测工具,本研究制备了抗伪狂犬病毒囊膜gB糖蛋白的单克隆抗体。以伪狂犬病毒HD/c株为模板,扩增gB基因并将其构建到pET-28a原核表达载体上,并利用IPTG诱导表达gB蛋白。再以变性纯化的gB蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同品系小鼠的骨髓瘤细胞融合。通过亚克隆筛选出阳性杂交瘤细胞,得到3个能稳定分泌抗gB蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞。对制备的gB单克隆抗体的特性进行鉴定,结果显示制备的gB单克隆抗体能和原核表达、真核表达和病毒感染细胞中的gB蛋白具有良好的Western Blot及间接免疫荧光反应性,且3个单克隆抗体细胞株识别的抗原表位区域位于第63-124 aa区域。
郎巧利,吴梦,黄楠,何琦琳,葛良鹏,杨希[6]（2019）在《伪狂犬病毒的gE蛋白胞外区真核表达以及单克隆抗体制备》文中提出旨在构建gE基因胞外区真核表达载体,在HEK293F细胞中表达并纯化得到稳定的可溶性蛋白,并通过杂交瘤筛选获得表达gE蛋白的特异性单克隆抗体。生物信息学方法分析gE基因序列,构建gE胞外区真核表达载体pcDNA3.4-gE-6×His和pcDNA3.4-gE-m Fc,通过瞬时转染的方法在HEK293F细胞中进行表达并进一步纯化。通过Western blot和SDS-PAGE鉴定和比较gE-6×His和gE-mFc融合蛋白表达情况。利用伪狂犬灭活全病毒免疫小鼠,电融合获得杂交瘤融合细胞,通过gE-mFc蛋白和IFA筛选出稳定且特异性结合gE蛋白的阳性杂交瘤细胞株。结果表明,成功构建pcDNA3.4-gE-6×His和pcDNA3.4-gE-mFc表达载体,表达纯化得到gE-6×His和gE-mFc可溶性蛋白。比较发现gE-6×His蛋白表达量低,稳定性差。而gE-mFc蛋白表达量高,稳定性好,一次性纯化后纯度可达85%。进一步利用gE-mFc筛选获得9株稳定性和特异性高的阳性杂交瘤细胞株。首次利用哺乳动物细胞表达系统表达并获得稳定的可溶性gE蛋白,并利用其筛选获得g E特异性单克隆杂交瘤细胞株。
孔江南[7]（2019）在《核酸G四链体结构在伪狂犬病毒EPO基因的表达和病毒增殖中的作用》文中进行了进一步梳理富含鸟嘌呤碱基的DNA或者RNA能够形成一种特殊的核酸二级结构:G四链体结构。该结构广泛存在于真核生物、原核生物以及病毒的基因组中,具有重要的生物学功能,如影响DNA的复制、转录和翻译,参与了众多的生理病理过程。伪狂犬病（pseudorabies,PR）是由伪狂犬病毒（pseudorabies virus,PRV）引起的一种仔猪致死率高,怀孕母猪流产,并伴有神经紊乱症状的急性传染病。PRV基因组的GC含量高达70～80%,我们推测该病毒的基因组中存在形成G四链体结构的序列。EPO作为PRV的一个早期蛋白,对病毒其他基因的表达具有非常重要的调控作用,然而目前关于EPO基因的表达调控还知之甚少。通过生物信息学分析,我们发现EPO基因的启动子区域存在富含鸟嘌呤碱基的序列,该序列包含三个重叠的Sp1结合位点。圆二色光谱和凝胶电泳分析,发现该序列可以形成G四链体结构。硫酸二甲酯足迹保护试验和Taq聚合酶延伸阻滞试验表明,该序列的G四链体结构具有多态性。进一步利用FRET melting、凝胶电泳、以及Taq聚合酶延伸阻滞试验的方法,验证了小分子配体PDS可以诱导形成并且稳定G四链体结构。荧光素酶报告基因试验发现,G四链体结构对EPO启动子活性具有负调控作用。EPO启动子区域中的Sp1结合位点的突变导致了其启动子活性的降低。为了探索该机制,接下来我们检测细胞转录因子Sp1对含有G四链体结构和不含G 四链体结构DNA的识别和结合能力的差异。我们将Sp1基因与六种增加蛋白质可溶性的标签连接构建原核表达载体,并通过原核表达系统纯化目的蛋白,得到了纯度较高的融合蛋白 MBP-Sp1。通过凝胶迁移率试验（EMSA）发现:与不含G四链体结构的双链DNA和单链DNA相比,Sp1蛋白倾向结合含有G四链体结构的双链DNA和单链DNA。过表达或者敲减细胞内的细胞转录因子 Sp1基因,荧光素酶报告基因试验发现,细胞转录因子Sp1对EPO基因的表达具有重要的调节作用。最后我们检测小分子配体对PRV增值的影响。流式细胞仪分析发现小分子配体PDS和BRACO19主要抑制PRV生活周期中的复制阶段。在PRV HN-1201感染的细胞中加入PDS,发现PDS抑制立即早期基因IE180、早期基因EPO、TK以及毒力基因gB 的表达,并且降低病毒滴度,具有抗病毒作用。综上所述,EPO基因启动子的富含鸟嘌呤序列能够形成G四链体结构,该结构不仅对EPO启动子的活性具有负调控作用,而且影响细胞转录因子Sp1对其的识别和结合,小分子配体PDS能够稳定EPO启动子形成的G-四链体结构,并且抑制PRV在细胞内的复制。该研究首次从核酸结构的角度阐述调控EPO基因表达的分子机制,也为研究新型的抗PRV靶点提供理论基础。
张盼盼[8]（2019）在《猪伪狂犬病病毒单克隆抗体的制备及gE抗体阻断ELISA方法的建立》文中研究说明伪狂犬病（Pseudorabies,PR）,又称奥耶斯基氏病（Aujeszky’s Disease,AD）,是一种由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）感染引起的多种动物共患的传染病。我国是伪狂犬病病毒感染的高发地区之一,自20世纪70年代从国外引入gE基因缺失的Bartha-K61疫苗以来,PR得到很好地控制。但是,由于病毒的变异,2011年底,我国很多省份免疫猪群爆发PR,给我国生猪养殖造成巨大的经济损失。本研究首先对华东地区PRV疫苗免疫及感染情况进行调查发现,华东地区猪群免疫情况较好,但PRV野毒感染较为严重,尤其是母猪群。其次,以纯化的PRVZJ01粒子及其gB、gC和gE重组蛋白为免疫原,成功制备15株抗PRV的单克隆抗体（McAb）。然后,通过Western blot对单抗识别表位进行鉴定,并对表位的保守性及在3D结构模型中的特征及定位进行分析。最后,利用其中的一株单抗3E1,成功建立了检测PRV gE抗体的阻断ELISA方法,为该病的诊断、防控奠定了重要基础。具体研究内容包括:1.2017年华东地区猪伪狂犬病血清流行病学调查对2017年华东地区6个省份累计310个不同养殖场送检的10179份血清样品,应用PRV gB-ELISA和gE-ELISA抗体检测试剂盒进行检测发现:猪场gE抗体阳性率为80.00%（248/310）,gB抗体阳性率为100.00%（245/245）;血清样本gE抗体阳性率为 44.66%（4546/10179）,gB 抗体阳性率为 95.90%（7600/7925）。其中,山东省gE抗体样本阳性率最高,为62.16%,江苏省和安徽省最低,分别为28.21%和32.83%。对不同季节进行统计发现:春季样品阳性率最高,为55.21%,夏季和冬季偏低,分别为28.21%和32.83%。对不同饲养阶段进行统计发现:种母猪阳性率最高,为60.59%,其次是经产母猪,为54.69%,种公猪阳性率最低,为27.11%。结果表明,华东地区猪群免疫情况较好,各省差异不大,但是PRV野毒感染较为严重,尤其是山东省。2.猪伪狂犬病病毒ZJ01单克隆抗体的制备与鉴定以纯化的蛋白和病毒粒子为免疫原,成功获得15株单克隆抗体。其中2株为抗gB蛋白的单抗,分别命名为5A2和6G5;2株为抗gC蛋白的单抗,分别命名为6G5和5D10;6株为抗gE蛋白的单抗,分别命名为3E1、3H8、4D2、5E12、6H12和6E9,其它5株单抗分别命名为4B9、4F7、4C3、5E5和5E7。单抗细胞培养上清ELISA抗体效价为1:32～6400,腹水抗体效价为1:6400～1024000。抗体亚型鉴定结果为:5A2、6G5 和 5D10 属于 IgA;7C5 属于 IgG2b;3E1、3H8、4D2、5E12、6H12、6E9、4C3和 4F7 属于 IgG1;4B9、5E5 和 5E7 属于 IgG2a;轻链均为 k 型。Western blot和IFA显示,15株单抗均能与PRVZJ01发生特异性反应。这些单抗的研制为PRV功能蛋白的研究及诊断试剂盒的研发奠定了基础。3.猪伪狂犬病病毒gB、gC和gE蛋白B细胞表位的鉴定利用原核表达系统,表达一系列截短的重组gB、gC和gE蛋白,通过Western blot对10株分别抗gB、gC和gE蛋白的单抗所识别的抗原表位进行鉴定发现,gB蛋白这两株单抗识别的抗原表位在gB蛋白的576aa～582aa。针对gC蛋白的单抗5D10和7C5识别的抗原表位分别在gC蛋白134aa～138aa和143aa～153aa。针对gE蛋白这6株单抗识别相同的抗原表位,在gE蛋白151aa～155aa。并且以上表位在所参考毒株中高度保守。对上述表位在3D结构模型中的特征及定位进行分析发现,表位576SAVATAA582和151IGDYL155分别位于gB和gE蛋白α-螺旋的一部分,表位134GETFE138和 143RRGRFRSPDAD153均呈无规则卷曲状态,且只有表位143RRGRFRSPDAD153和151IGDYL155分别完全暴露于gC和gE蛋白表面,推测可能为该蛋白的优势抗原表位。4.猪狂犬病病毒gE抗体阻断ELISA方法的建立与应用利用纯化的重组gE蛋白作为包被抗原和HRP标记的3E1单抗建立检测PRV gE抗体的阻断ELISA方法。反应条件为:抗原包被浓度为0.75μg/mL,包被条件为4℃包被12h;2%明胶37℃封闭3h;待检血清不稀释,作用时间为37℃ 2h;酶标单抗稀释30000倍,孵育时间为37℃ 0.5 h。该方法与常见猪病的阳性血清均无交叉反应性,敏感性和特异性分别为85.14%和95.71%,与IDEXX PRV gE抗体检测试剂盒符合率达92.40%。523份临床血清样品检测结果显示,PRV gE抗体阳性率为28.7%。因此,该方法可用于鉴别PRV野毒感染与疫苗免疫。综上所述,我们调查了华东地区猪群PRV疫苗免疫及野毒感染情况,成功制备15株单克隆抗体,鉴定了这些单克隆抗体识别的表位,并以其中一株单抗成功建立用于检测PRV gE抗体的阻断ELISA方法。本研究为PRV蛋白结构和功能的研究、RR的诊断、流行病学调查及RR的防控奠定了基础。
潘慧[9]（2017）在《双表达gC基因的重组伪狂犬病毒gI/gE缺失株的构建及免疫效力评价》文中指出伪狂犬病毒（Pseudorabies viurs,PRV）又称猪疱疹病毒1型（Suid herpesvirus1）,属疱疹病毒科,α-疱疹病毒亚科,猪是其易感动物,可引起猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR）。疫苗免疫是防控该病最为有效的方法,但2011年以来国内许多猪场在使用疫苗后仍然爆发了伪狂犬病疫情。多位学者研究表明,现有PRV疫苗已不能对流行毒株的感染提供完全保护,因此有必要研究针对流行毒株的新疫苗。本研究拟以rPRV-AH-gI-/gE-/EGFP+株为亲本毒,利用同源重组技术在缺失gI、gE基因的部位插入PRV gC基因表达盒,构建双表达gC基因同时缺失gI、gE基因的重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/gC+,在此基础上研究该病毒的生物学特性及免疫原性。主要研究如下:1.重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/gC+的构建以PRV AH-China-2013（简称PRV-AH）gC基因编码区替换pEGFP-N1质粒中EGFP编码序列,通过PCR扩增获得PCMV-gC-SV40 polyA表达盒,将其插入pMD-LA-RA质粒中构建重组转移质粒pMD-LA-gC-RA。将该质粒转染至BHK-21细胞,然后接种rPRV-AH-gI-/gE-/EGFP+,使质粒和病毒基因组在细胞内发生同源重组,通过单细胞分离与空斑纯化获得重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/gC+。通过PCR检测及荧光观察证实重组到病毒中已成功插入gC基因表达盒,且去除EGFP标记基因。2.重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/gC+的生物学特性研究绘制PRV-AH、rPRV-AH-gI-/gE-/EGFP+和rPRV-AH-gI-/gE-/gC+三种病毒的一步生长曲线,表明这三种病毒有相似的生长动力学,其中三种病毒最高滴度分别为10-7.63 TCID50/mL、10-7.00 TCID50/mL和10-7.38TCID50/mL。通过q RT-PCR检测重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-和rPRV-AH-gI-/gE-/gC+的gC基因在mRNA转录水平上的差异,结果显示在接毒后第6 h重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/gC+的gC mRNA含量是rPRV-AH-gI-/gE-株的1.85倍,第12 h是35.93倍,第24 h是40.64倍。3.重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/gC+的免疫效力及攻毒保护效果评价采用100μL的105 TCID50/100μL、106 TCID50/100μLrPRV-AH-gI-/gE-/gC+灭活疫苗分别对小鼠进行两次免疫,间隔28 d,于免疫后不同时间采血测定中和抗体水平。二免后28 d用致死剂量的PRV经典毒株和PRV AH株进行攻毒。结果表明106 TCID50/100μL免疫组对两种PRV强毒的攻击都能100%保护;105TCID50/100μL免疫组对致死量的PRV AH株攻击具有100%保护率,对PRV经典毒株有87.50%的保护率。本研究成功构建了双表达gC基因同时缺失gI、gE基因的重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/gC+,且与rPRV-AH-gI-/gE-相比,gC基因mRNA转录水平显着提高。动物实验结果表明,rPRV-AH-gI-/gE-/gC+具有良好的免疫原性,且对PRV经典毒株和流行毒株均有良好的免疫保护效果,有望作为一种新的疫苗候选株用于控制当前国内伪狂犬病疫情。
乔涵[10]（2017）在《PEDV河南株的遗传进化分析及S基因中和表位区重组PRV的研究》文中认为猪流性腹泻病毒（PEDV）是引发猪流行性腹泻病（PED）的主要病原之一。2010年末,PED在中国多省市暴发,引发数以百万计的仔猪死亡,同时,该病同样在亚洲其他国家、美洲国家及欧洲国家广泛流行,其造成的经济损失难以估计。同时,临床流行病学研究发现,即使在疫苗免疫猪场,仍呈现了高水平的感染率和死亡率。为了解河南地区当前PEDV的遗传变异情况,本研究根据GeneBank中PEDV经典CV777株的全序列设计了20对特异性引物,采用RT-PCR方法对采集自河南省开封某猪场的PEDV流行株CH-HNKF-15的全基因组进行分段扩增、克隆和测序,并获得了CH-HNKF-15基因组的完整序列,其基因组中除去Poly（A）共有28038bp。进一步对本研究毒株进行全基因的序列分析,结果显示,除ORF3基因外,其余各编码基因的遗传进化分析显示,本研究毒株与经典毒株CV777、中国早年分离株CH-S、LZC及韩国DR13弱毒株均不处于一个进化分支。从全基因核苷酸相似性来看,本研究毒株与CV777株存在3.3%的差异,其中以S基因突变最为显着。在上述研究基础上,笔者对20142015年间采自河南省16地市不同猪场的30株疑似PEDV阳性病料样品进行RT-PCR鉴定,得到阳性率为73.3%（22/30）。进一步对此22株河南流行株的S基因进行了克隆及序列分析,其中,核苷酸和氨基酸序列比对结果显示,与经典毒株CV777相比,同源性分别为93.5%94.0%、92.7%93.5%。同时,22株流行株在S1区域第5962位插入4个氨基酸（QGVN）,在140位插入N,在第160位有一个G氨基酸的缺失,表明目前中国PEDV流行株已经发生了变异,且比对2010年以来的PEDV新毒株的S基因,其变异情况较为稳定。遗传进化分析结果显示,本研究毒株整体独立成支,与日本株、美国株亲缘较近,而与中国早年分离株、韩国早年分离株及经典CV777株亲缘关系较远。本研究从一定程度上解释了PEDV目前在猪群中普遍免疫失败的原因。前期研究表明,S蛋白基因的第636789氨基酸的S1D区域能够诱导中和抗体的产生,且制备的免疫血清能够中和PEDV的S天然蛋白。为此,笔者克隆了PEDV CH-HNKF-15株S1D区域,通过pET-28a原核表达系统进行截短表达。用猪源PEDV全病毒血清作一抗,Western blot结果显示本研究成功表达出分子量约为16 kDa的目的蛋白。对重组表达菌的诱导条件进行优化,重组蛋白经镍柱纯化后免疫新西兰大白兔,收取血清,Western blot结果显示融合蛋白和血清多抗可发生抗原抗体反应,表明本蛋白具有良好的生物活性。本研究为后续间接ELISA检测方法的建立、PEDV变异毒株S基因的功能研究及基因工程亚单位疫苗的研制提供了有力参考。猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）除了引发新生仔猪出现神经症状之外,还常常使妊娠母猪发生流产,产死胎或木乃伊胎,是当前制约中国养猪业发展的又一重要病原体。PRV基因组全长150 kb左右,含有多个与其复制无关的非必需基因,是常用的病毒活载体之一。因此,为了构建可以表达出PEDV S1D蛋白的重组PRV弱毒株,本试验用上游和下游引物均引入BamHI酶切位点的特异性引物扩增S1D,纯化回收,且将该目的基因插入到了PRV通用转移载体pG中gG启动子的下游,构建了重组伪狂犬转移质粒pGS1,并与PRV弱毒株基因组通过脂质体共转染ST细胞,经细胞内同源重组,获得了表达PEDV S1D基因的重组PRV弱毒株,命名为rPRV-pGS1株。结合绿色荧光观察、蚀斑纯化和PCR方法对重组病毒进行鉴定。经过5轮的蚀斑纯化,获得了纯化的重组PRV弱毒株rPRV-pGS1。经RT-PCR和Western免疫印迹检测表明PEDV S1D基因在重组病毒中获得了表达,表达出大小约为16 kDa的目的蛋白,并保持了其固有的生物学活性,结果表明本研究的重组病毒rPRV-pGS1株构建成功。本研究为PEDV和PRV联合防治提供了有效的理论和技术支持。
二、利用真核表达载体构建表达PRV闽A株gE基因表位抗原编码区片段的重组质粒（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、利用真核表达载体构建表达PRV闽A株gE基因表位抗原编码区片段的重组质粒（论文提纲范文）
（1）猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗及其载体疫苗的研制（论文提纲范文）
| 英文缩略词或符号表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 伪狂犬病概述 |
| 1.2 伪狂犬病病毒研究概况 |
| 1.2.1 伪狂犬病病毒的形态结构 |
| 1.2.2 伪狂犬病病毒的基因组结构 |
| 1.2.3 伪狂犬病病毒的基因功能 |
| 1.2.4 伪狂犬病病毒的理化特性 |
| 1.2.5 伪狂犬病病毒的复制与传播 |
| 1.3 伪狂犬病疫苗的研究现状及应用 |
| 1.3.1 猪伪狂犬病灭活疫苗 |
| 1.3.2 猪伪狂犬病常规活疫苗 |
| 1.3.3 猪伪狂犬病基因缺失活疫苗 |
| 1.3.4 猪伪狂犬病核酸疫苗 |
| 1.3.5 猪伪狂犬病病毒活载体疫苗 |
| 1.4 猪伪狂犬病的防控与净化 |
| 1.5 猪瘟病毒的流行现状及其疫苗的研究进展 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 主要设备及仪器 |
| 2.1.2 主要试剂耗材 |
| 2.1.3 试验动物 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 伪狂犬病病毒变异株(JS-2012 株)gE/gI双基因缺失毒株的构建 |
| 2.2.2 JS-2012-△gE/gI病毒的生物学特性分析 |
| 2.2.3 JS-2012-△gE/gI病毒的安全性试验 |
| 2.2.4 JS-2012-△gE/gI病毒的免疫效力试验 |
| 2.2.5 表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒的构建 |
| 2.2.6 JS-2012-△gE/gI-E2病毒的生物学特性分析 |
| 2.2.7 JS-2012-△gE/gI-E2病毒的安全性试验 |
| 2.2.8 JS-2012-△gE/gI-E2病毒的免疫效力试验 |
| 2.3 数据处理 |
| 3.结果 |
| 3.1 同源重组转移载体的构建 |
| 3.1.1 p EGFP-C3 质粒改造后的鉴定 |
| 3.1.2 同源重组臂的获得 |
| 3.1.3 同源重组转移载体的鉴定 |
| 3.2 同源重组转移载体转染条件的优化 |
| 3.3 JS-2012-△gE/gI-egfp病毒的构建 |
| 3.3.1 JS-2012-△gE/gI-egfp病毒的筛选及纯化 |
| 3.3.2 JS-2012-△gE/gI-egfp病毒的PCR鉴定 |
| 3.4 JS-2012-△gE/gI病毒的构建 |
| 3.4.1 JS-2012-△gE/gI病毒的筛选及纯化 |
| 3.4.2 JS-2012-△gE/gI病毒的PCR鉴定 |
| 3.5 JS-2012-△gE/gI病毒的生物学特性分析 |
| 3.5.1 JS-2012-△gE/gI病毒滴度及生长动力学 |
| 3.5.2 JS-2012-△gE/gI病毒的蚀斑形态学 |
| 3.5.3 JS-2012-△gE/gI病毒gE蛋白的表达情况 |
| 3.5.4 JS-2012-△gE/gI病毒的遗传稳定性 |
| 3.6 JS-2012-△gE/gI病毒的安全性 |
| 3.6.1 JS-2012-△gE/gI病毒对哺乳仔猪的致病性 |
| 3.6.2 JS-2012-△gE/gI病毒对妊娠母猪的致病性 |
| 3.6.3 JS-2012-△gE/gI病毒的水平传播能力 |
| 3.6.4 JS-2012-△gE/gI病毒的垂直传播能力 |
| 3.6.5 JS-2012-△gE/gI病毒在仔猪体内毒力返强能力 |
| 3.7 JS-2012-△gE/gI病毒的免疫效力 |
| 3.7.1 JS-2012-△gE/gI病毒对仔猪的主动免疫效力 |
| 3.7.2 JS-2012-△gE/gI病毒对仔猪的被动免疫效力 |
| 3.8 表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒的构建 |
| 3.8.1 表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒的获得 |
| 3.8.2 表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒的PCR鉴定 |
| 3.9 JS-2012-△gE/gI-E2 病毒的生物学特性 |
| 3.9.1 JS-2012-△gE/gI-E2病毒滴度及生长动力学 |
| 3.9.2 JS-2012-△gE/gI-E2病毒的蚀斑形态学 |
| 3.9.3 JS-2012-△gE/gI-E2病毒E2 蛋白的表达情况 |
| 3.9.4 JS-2012-△gE/gI病毒的遗传稳定性 |
| 3.10 JS-2012-△gE/gI-E2病毒的安全性 |
| 3.10.1 JS-2012-△gE/gI-E2病毒对哺乳仔猪的致病性分析 |
| 3.10.2 JS-2012-△gE/gI-E2病毒对妊娠母猪的致病性分析 |
| 3.10.3 JS-2012-△gE/gI-E2病毒的水平传播能力 |
| 3.10.4 JS-2012-△gE/gI-E2病毒的垂直传播能力 |
| 3.11 JS-2012-△gE/gI-E2 病毒的免疫效力 |
| 3.11.1 JS-2012-△gE/gI-E2病毒对母源抗体阴性仔猪的免疫效力 |
| 3.11.2 JS-2012-△gE/gI-E2病毒对PRV母源抗体阳性猪的免疫效力 |
| 4 讨论 |
| 4.1 伪狂犬病病毒变异株的抗原差异性与Bartha K61 免疫不完全保护的关系 |
| 4.2 伪狂犬病基因缺失活疫苗的安全性与缺失基因的关系 |
| 4.3 伪狂犬病基因缺失活疫苗的安全性与免疫原性的关系 |
| 4.4 伪狂犬病基因缺失活疫苗的鉴别诊断 |
| 4.5 猪瘟病毒的防控与净化 |
| 4.6 外源基因的插入位置与重组病毒特性的关系 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文 |
（2）PRRS GP5及PR gB基因二联表位预测疫苗的构建及其免疫效果评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸障碍综合征研究现状 |
| 1.1.1 PRRSV主要结构 |
| 1.1.2 PRRSV理化性质 |
| 1.1.3 PRRSV培养条件 |
| 1.2 PRRSV分子生物学特性 |
| 1.2.1 PRRSV的基因组结构 |
| 1.2.2 PRRSV主要蛋白及其功能 |
| 1.3 PRRSV流行病学及致病机理 |
| 1.3.1 PRRSV流行病学 |
| 1.3.2 PRRSV 致病机理 |
| 1.4 组织病理学检查 |
| 1.4.1 临床症状 |
| 1.4.2 组织学变化 |
| 1.5 猪伪狂犬病毒研究现状 |
| 1.5.1 PRV主要结构 |
| 1.5.2 PRV的培养条件 |
| 1.6 PRV分子生物学特性 |
| 1.6.1 PRV基因组结构 |
| 1.6.2 PRV主要蛋白及其功能 |
| 1.7 PRV致病机理 |
| 1.8 PRV病理学观察 |
| 1.8.1 临床病变 |
| 1.8.2 组织学病变 |
| 1.9 基因工程疫苗的研究现状 |
| 1.9.1 基因工程疫苗的分类 |
| 1.9.1.1 亚基因疫苗 |
| 1.9.1.2 肽疫苗 |
| 1.9.1.3 活体重组疫苗 |
| 1.9.1.4 多价DNA疫苗 |
| 1.9.2 DNA疫苗的作用机制 |
| 1.9.2.1 T淋巴细胞在DNA疫苗免疫中的作用 |
| 1.9.2.2 树突细胞在DNA疫苗免疫中的作用 |
| 第二章 GRE基因的设计与分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 GP5基因保守区的确定 |
| 2.1.2.2 GP5表位基因的设计 |
| 2.1.2.3 GP5表位基因预测结果 |
| 2.1.2.4 GP5表位基因设计结果 |
| 2.1.2.5 GP5表位基因偏好性密码子优化结果 |
| 2.2 讨论 |
| 2.3 小结 |
| 第三章 GRE GP5及gB基因真核表达质粒的构建与鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.1.1 菌株、载体及细胞系 |
| 3.1.1.2 主要试剂 |
| 3.1.1.3 主要仪器 |
| 3.1.1.4 培养基 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 感受态细胞的制备 |
| 3.1.2.2 引物设计 |
| 3.1.2.3 重组质粒PMD-GP5、PMD-GRE、PMD-gB、PMD-GP5gB、PMD-GRE-GP5gB的提取 |
| 3.1.2.4 真核表达载体PEGFP-N1及质粒的双酶切 |
| 3.1.2.5 产物胶回收 |
| 3.1.2.6 pEGFP-GP5、pEGFP-GRE、pEGFP-gB、pEGFP-GP5gB和pEGFP-GP5 -GP5gB转化感受态XL-10Glod |
| 3.1.2.7 pEGFP-GP5、pEGFP-GRE、pEGFP-gB、pEGFP-GP5gB、pEGFP-GRE-GP5gB的制备与鉴定 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 GP5、GRE、gB、GP5gB及GRE-GP5gB的基因扩增 |
| 3.2.2 pEGFP-GP5、pEGFP-GRE、pEGFP-gB、pEGFP-GP5gB、pEGFP-GRE-GP5gB重组表达质粒的鉴定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 重组感受态细胞的制备与鉴定 |
| 3.3.2 重组感受态细胞的稳定性检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 重组质粒在体外作用的研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.1.1 菌株,载体及细胞系 |
| 4.1.1.2 主要试剂及培养基 |
| 4.1.1.3 主要仪器 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.2.1 Marc145细胞培养 |
| 4.1.2.2 PK15细胞培养 |
| 4.1.2.3 重组质粒转染细胞 |
| 4.1.2.4 重组质粒的小量提取 |
| 4.1.2.5 重组质粒转染细胞 |
| 4.1.2.6 重组质粒转染细胞后总RNA的提取 |
| 4.1.2.7 RT-PCR检测重组质粒在细胞中的表达 |
| 4.1.2.8 Western Blotting检测 |
| 4.1.2.9 CCK-8 检测重组质粒对细胞增殖作用的影响 |
| 4.1.2.10 流式细胞术检测重组质粒对细胞周期的影响 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 转染细胞结果 |
| 4.2.1.1 重组质粒转染Marc145细胞结果 |
| 4.2.1.2 组质粒转染PK-15 细胞结果 |
| 4.2.2 重组质粒转染细胞RT-PCR鉴定 |
| 4.2.3 Western Blotting检测目的蛋白表达情况 |
| 4.2.4 重组质粒对细胞(PK15)增殖作用的影响 |
| 4.3 重组质粒对细胞周期的影响 |
| 4.3.1 重组质粒对Marc-l45细胞周期的影响 |
| 4.3.2 重组质粒对PK-15 细胞周期的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 重组质粒疫苗免疫效果评价及安全性检测 |
| 5.1 材料及方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.1.1 主要试剂 |
| 5.1.1.2 主要仪器 |
| 5.1.1.3 实验动物 |
| 5.1.1.4 质粒的大量抽提 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.1.2.1 DNA重组质粒的分组及剂量 |
| 5.1.2.2 免疫大鼠血清特异性抗体的测定 |
| 5.1.2.3 淋巴细胞分型试验 |
| 5.1.2.4 脏器组织石蜡切片 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 重组质粒疫苗对大鼠脏器的影响 |
| 5.2.2 血清中特异性抗体测定结果 |
| 5.2.3 T淋巴细胞分型实验结果 |
| 5.2.4 病理切片观察结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录一:英文缩略词表 |
| 附录二:测序报告 |
| 硕士期间发表的文章情况 |
（3）表达猪圆环病毒3型衣壳蛋白的重组伪狂犬病毒构建及伪狂犬病毒gC、gG蛋白单克隆抗体制备（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 猪圆环病毒3型研究概述 |
| 1 猪圆环病毒3型的生物学研究进展 |
| 1.1 PCV的起源与发现 |
| 1.2 PCV3的生物学特性 |
| 1.3 PCV3编码蛋白 |
| 1.3.1 结构蛋白 |
| 1.3.2 复制酶相关蛋白 |
| 2 猪圆环病毒3型的病原学及感染情况 |
| 2.1 PCV3的基因型分类及致病性 |
| 2.2 PCV3的感染情况 |
| 第二章 伪狂犬病病毒研究概述 |
| 1 伪狂犬病毒的生物学研究进展 |
| 1.1 PRV的起源与发现 |
| 1.2 PRV的生物学特性 |
| 1.2.1 基因组 |
| 1.2.2 衣壳蛋白 |
| 1.2.3 被膜蛋白 |
| 1.2.4 囊膜蛋白 |
| 2 PRV的流行病学 |
| 3 伪狂犬病毒的检测方法 |
| 3.1 核酸检测方法 |
| 3.1.1 环介导等温扩增法 |
| 3.1.2 纳米PCR法 |
| 3.1.3 实时荧光定量PCR法 |
| 3.2.4 多重PCR法 |
| 3.2 免疫学相关检测方法 |
| 3.2.1 酶联免疫吸附实验 |
| 3.2.2 免疫层析技术 |
| 4 伪狂犬病毒疫苗研究进展 |
| 4.1 灭活疫苗 |
| 4.2 弱毒活疫苗 |
| 4.3 基因工程疫苗 |
| 4.3.1 单基因缺失疫苗 |
| 4.3.2 双基因缺失疫苗 |
| 4.3.3 三基因缺失疫苗 |
| 4.4 重组病毒疫苗 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 表达PCV3 Cap的重组PRV转移载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器和器材 |
| 1.2 分子生物学试剂 |
| 1.3 毒株、菌株、细胞株以及载体 |
| 2 方法 |
| 2.1 PRV HD/c基因组抽提 |
| 2.2 感受态细胞的制备 |
| 2.3 重组载体设计与引物合成 |
| 2.4 PRV gC转移载体的构建 |
| 2.4.1 gC同源臂的扩增 |
| 2.4.2 EGFP荧光表达盒的设计 |
| 2.4.3 含有PCV3 Cap表达盒的设计 |
| 2.4.4 gC重组载体的分子构建及验证 |
| 2.5 PRV gG转移载体的构建 |
| 2.5.1 gG同源臂的扩增 |
| 2.5.2 GFP荧光表达盒的设计 |
| 2.5.3 含有PCV3 Cap表达盒的设计 |
| 2.5.4 gG重组载体的分子构建及验证 |
| 2.6 PCV3 Cap蛋白表达验证 |
| 3 结果 |
| 3.1 PRV gC转移载体的构建 |
| 3.1.1 gC同源臂扩增结果 |
| 3.1.2 EGFP表达盒扩增结果 |
| 3.1.3 PCV3 Cap表达序列扩增结果 |
| 3.2 PRV gG转移载体的构建 |
| 3.2.1 gG同源臂扩增结果 |
| 3.2.2 EGFP表达盒扩增结果 |
| 3.2.3 gG同源左臂和Cap融合序列获取 |
| 3.3 PRV重组表达载体鉴定 |
| 3.4 PCV3 Cap蛋白表达验证 |
| 4 讨论 |
| 第二章 猪伪狂犬病毒gC蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器和器材 |
| 1.2 分子生物学试剂 |
| 1.3 其他生物学相关试剂 |
| 1.4 毒株、菌株以及载体 |
| 1.5 实验动物和细胞 |
| 2 方法 |
| 2.1 PRV gC基因原核表达载体的构建 |
| 2.1.1 PRV gC基因分析 |
| 2.1.2 引物设计与合成 |
| 2.1.3 目的基因的获取 |
| 2.1.4 酶切、连接 |
| 2.1.5 菌液PCR鉴定 |
| 2.2 His-gC蛋白的表达与纯化 |
| 2.2.1 重组PRV gC蛋白的诱导表达 |
| 2.2.2 His-gC蛋白的可溶性分析 |
| 2.2.3 His-gC蛋白的纯化及验证 |
| 2.3 PRV gC多克隆抗体制备及鉴定 |
| 2.3.1 新西兰白兔的免疫 |
| 2.3.2 兔的多抗血清采取及反应性鉴定 |
| 2.4 PRV gC单克隆抗体的制备 |
| 2.4.1 BA LB/C小鼠免疫 |
| 2.4.2 杂交瘤细胞株的建立 |
| 2.4.3 杂交瘤细胞的选择性培养 |
| 2.5 阳性细胞株的筛选 |
| 2.5.1 ELISA法检测 |
| 2.5.2 IFA检测 |
| 2.5.3 阳性杂交瘤细胞株的亚克隆 |
| 2.6 单抗腹水的制备 |
| 2.7 单克隆抗体特性鉴定 |
| 2.7.1 ELISA检测腹水效价和抗体亚型 |
| 2.7.2 WB检测单抗的反应性 |
| 2.7.3 IFA检测单抗的反应性 |
| 2.7.4 PRV gC单克隆抗体可变区基因分析 |
| 2.8 单克隆抗体抗原表位的初步鉴定 |
| 2.8.1 PRV gC截短体构建 |
| 2.8.2 PRV gC单抗与截短载体转染样品的反应 |
| 2.9 PRV Ⅰ型和Ⅱ型病毒的通用性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 PRV gC基因原核表达载体的构建 |
| 3.1.1 PRV gC氨基酸序列分析 |
| 3.1.2 PRV gC基因的克隆 |
| 3.2 His-gC重组蛋白表达及鉴定 |
| 3.2.1 His-gC蛋白诱导表达及可溶性分析 |
| 3.2.2 His-gC蛋白纯化及阳性血清验证 |
| 3.3 His-gC小鼠多抗血清反应性鉴定 |
| 3.3.1 ELISA鉴定 |
| 3.3.2 WB鉴定 |
| 3.3.3 IFA鉴定 |
| 3.4 His-gC兔子多抗血清反应性鉴定 |
| 3.4.1 ELISA鉴定 |
| 3.4.2 WB鉴定 |
| 3.4.3 IFA鉴定 |
| 3.5 PRV gC单克隆抗体制备 |
| 3.5.1 单克隆抗体杂交瘤细胞筛选 |
| 3.5.2 单克隆抗体腹水制备 |
| 3.6 PRV gC单克隆抗体特性鉴定 |
| 3.6.1 间接ELISA鉴定 |
| 3.6.2 WB鉴定 |
| 3.6.3 IFA鉴定 |
| 3.7 PRV gC抗体基因可变区克隆与分析 |
| 3.7.1 抗体可变区基因的扩增 |
| 3.7.2 抗体可变区比对分析, |
| 3.8 PRV gC单抗表位的初步鉴定分析 |
| 3.8.1 PRV gC蛋白抗原性分析 |
| 3.8.2 PRV gC基因截短体的构建 |
| 3.8.3 WB鉴定分析 |
| 3.8.4 IFA鉴定分析 |
| 3.9 PRV Ⅰ型和Ⅱ型病毒的通用性检测 |
| 4 讨论 |
| 第三章 猪伪狂犬病毒gG蛋白单克隆抗体的制备以及鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 PRV gG基因原核表达载体的构建 |
| 2.1.1 PRV gG基因分析 |
| 2.1.2 引物设计与合成 |
| 2.1.3 PRV基因组DNA抽提 |
| 2.1.4 目的基因的获取 |
| 2.1.5 双酶切、连接和转化 |
| 2.1.6 菌液PCR鉴定 |
| 2.2 His gG蛋白的表达与纯化 |
| 2.3 PRV gG多克隆抗体制备及鉴定 |
| 2.3.1 新西兰白兔的免疫 |
| 2.3.2 兔血清的采取及反应性鉴定 |
| 2.4 PRV gG单克隆抗体的制备 |
| 2.4.1 BA LB/C小鼠免疫 |
| 2.4.2 杂交瘤细胞株的建立 |
| 2.5 阳性细胞株的筛选 |
| 2.5.1. ELISA检测 |
| 2.5.2 IFA检测 |
| 2.5.3 阳性杂交瘤细胞株的亚克隆 |
| 2.6 单抗腹水的制备 |
| 2.7 单克隆抗体特性鉴定 |
| 2.7.1 ELISA检测腹水效价和抗体亚型 |
| 2.7.2 WB检测单抗的反应性 |
| 2.7.3 IFA检测单抗的反应性 |
| 2.7.4 PRV gG单克隆抗体可变区基因分析 |
| 2.8 单克隆抗体抗原表位的初步鉴定 |
| 2.8.1 PRV gG截短体构建 |
| 2.8.2 PRV gG单抗与截短体转染样品的反应 |
| 3 结果 |
| 3.1 PRV gG基因原核表达载体的构建 |
| 3.1.1 PRV gG基因蛋白序列分析 |
| 3.1.2 PRV gG基因的克隆 |
| 3.2 His-gG重组蛋白表达及鉴定 |
| 3.2.1 His-gG蛋白诱导表达及可溶性分析 |
| 3.2.2 His-gG蛋白纯化及阳性血清验证 |
| 3.3 His-gG小鼠多抗血清反应性鉴定 |
| 3.3.1 ELISA鉴定 |
| 3.3.2 WB鉴定 |
| 3.3.3 IFA鉴定 |
| 3.4 His-gG兔子多抗血清反应性鉴定 |
| 3.4.1 ELISA鉴定 |
| 3.4.2 WB鉴定 |
| 3.4.3 IFA鉴定 |
| 3.5 PRV gG单克隆抗体制备 |
| 3.5.1 单克隆抗体杂交瘤细胞筛选 |
| 3.5.2 单克隆抗体腹水制备 |
| 3.6 PRV gG单克隆抗体特性鉴定 |
| 3.6.1 间接ELISA鉴定 |
| 3.6.2 WB鉴定 |
| 3.6.3 IFA鉴定 |
| 3.7 PRV gG抗体基因可变区克隆与分析 |
| 3.7.1 抗体可变区基因的扩增 |
| 3.7.2 抗体可变区分析 |
| 3.8 PRV gG单抗表位的初步鉴定分析 |
| 3.8.1 PRV gG蛋白抗原性分析 |
| 3.8.2 PRV gG基因截短体的构建 |
| 3.8.3 WB鉴定分析 |
| 3.8.4 IFA鉴定分析 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 常用缓冲液、试剂及培养基配方 |
（4）牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎二联核酸疫苗的构建及其免疫效应研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 牛病毒性腹泻(BVD)研究进展 |
| 1.1.1 BVD的病原学 |
| 1.1.2 BVD的流行病学 |
| 1.1.3 BVD疫苗研究进展 |
| 1.2 牛病毒性腹泻病毒(BVDV)研究进展 |
| 1.2.1 BVDV基因组结构 |
| 1.2.2 BVDV编码的结构蛋白及功能 |
| 1.3 牛传染性鼻气管炎(IBR)研究进展 |
| 1.3.1 IBR的病原学 |
| 1.3.2 IBR的流行病学 |
| 1.3.3 IBR疫苗研究进展 |
| 1.4 牛疱疹病毒1型(BHV-1)研究进展 |
| 1.4.1 BHV-1的基因组结构 |
| 1.4.2 BHV-1编码的结构蛋白及其功能 |
| 1.5 内部核糖体进入位点(IRES)研究进展 |
| 1.5.1 IRES简介 |
| 1.5.2 IRES结构特点及其在载体表达中的应用 |
| 1.6 试验目的及意义 |
| 第二章 BVDV E0和IBRV gD基因的克隆与生物信息学分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 毒株、菌株与细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 BVDV E0与IBRV gD基因的克隆 |
| 2.1.5 BVDV E0与IBRV gD基因生物信息学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 目的片段PCR扩增结果 |
| 2.2.2 目的基因测序结果 |
| 2.2.3 生物信息学分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 BVDV E0基因的选择 |
| 2.3.2 IBRV gD基因的选择与扩增 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 pVAX1-E0-IRES-gD真核表达载体的构建与体外表达检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株、质粒和细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 重组表达载体的设计 |
| 3.1.5 重组载体pVAX1-IRES的构建 |
| 3.1.6 重组载体pVAX1-EO-IRES的构建 |
| 3.1.7 重组载体pVAX1-E0-IRES-gD的构建 |
| 3.1.8 pVAX1-E0-IRES-gD载体中目的基因体外表达的检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 pVAX1-IRES真核表达载体的构建 |
| 3.2.2 pVAX1-E0-IRES真核表达载体的构建 |
| 3.2.3 pVAX1-E0-IRES-gD真核表达载体的构建 |
| 3.2.4 真核表达载体pVAX1-E0-IRES-gD在293T细胞中的表达情况 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 重组质粒的构建 |
| 3.3.2 目的蛋白的表达 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 pVAX1-E0-IRES-gD二联核酸疫苗免疫效果研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 质粒和二联灭活苗 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 大量抽提质粒DNA |
| 4.1.6 小鼠的分组与免疫 |
| 4.1.7 样品采集 |
| 4.1.8 免疫小鼠血清中E0抗体检测 |
| 4.1.9 免疫小鼠血清中gD抗体检测 |
| 4.1.10 细胞因子检测 |
| 4.1.11 脾淋巴细胞增殖实验(MTT法) |
| 4.1.12 数据处理 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 免疫小鼠血清中E0抗体检测结果 |
| 4.2.2 免疫小鼠血清中gD抗体检测结果 |
| 4.2.3 免疫小鼠血清中IFN-γ检测结果 |
| 4.2.4 免疫小鼠血清中IL-4检测结果 |
| 4.2.5 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 小鼠免疫试验后抗E0和gD IgG抗体含量变化 |
| 4.3.2 小鼠免疫试验后细胞因子含量变化 |
| 4.3.3 脾淋巴细胞反应 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（5）表达猪圆环病毒2衣壳蛋白的重组伪狂犬病毒构建（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 伪狂犬病毒的分子生物学特征 |
| 1.1 基因组 |
| 1.2 衣壳蛋白 |
| 1.3 被膜蛋白 |
| 1.4 囊膜蛋白 |
| 1.5 毒力相关基因 |
| 2 伪狂犬病毒的疫苗研究 |
| 2.1 灭活疫苗 |
| 2.2 弱毒活疫苗 |
| 2.3 基因缺失疫苗 |
| 2.4 重组伪狂犬病毒疫苗 |
| 2.4.1 PCV2/PRV重组病毒疫苗 |
| 2.4.2 PRRSV/PRV重组病毒疫苗 |
| 2.4.3 PPV/PRV重组病毒疫苗 |
| 2.4.4 CSFV/PRV重组病毒疫苗 |
| 2.4.5 FMDV/PRV重组病毒疫苗 |
| 2.4.6 SIV/PRV重组病毒疫苗 |
| 2.4.7 JEV/PRV重组病毒疫苗 |
| 2.4.8 RV/PRV重组病毒疫苗 |
| 3 伪狂犬病毒的单抗研究 |
| 3.1 抗伪狂犬病毒糖蛋白的单克隆抗体 |
| 3.1.1 抗gE糖蛋白的单克隆抗体 |
| 3.1.2 抗gB糖蛋白的单克隆抗体 |
| 3.1.3 抗gC糖蛋白的单克隆抗体 |
| 3.2 抗伪狂犬病毒其他蛋白的单克隆抗体 |
| 3.3 抗伪狂犬病毒全病毒的单克隆抗体 |
| 第二章 表达PCV2-Cap蛋白的重组伪狂犬病TK~-/gE~-/gI~-/Cap~+的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、毒株及质粒 |
| 1.2 试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计及合成 |
| 2.2 病毒基因组的提取 |
| 2.2.1 PRV-HD/c病毒基因组提取 |
| 2.2.2 PCV2-HZ0201病毒基因组提取 |
| 2.3 同源重组载体构建 |
| 2.3.1 同源臂的扩增与连接 |
| 2.3.2 EGFP表达盒的扩增与连接 |
| 2.3.3 cap基因的扩增与融合 |
| 2.4 CRISPR/Cas9基因编辑载体构建 |
| 2.5 重组伪狂犬病毒的拯救 |
| 2.6 重组伪狂犬病毒TK~-/gE~-/gI~-/Cap~+/EGFP~+株的蚀斑纯化 |
| 2.7 EGFP表达盒的删除 |
| 2.8 重组伪狂犬病毒TK~-/gE~-/gI~-/Cap~+的蚀斑纯化 |
| 2.9 PRV-TK~-/gE~-/gI~-/Cap~+毒株基因组中插入cap基因的鉴定 |
| 2.10 重组伪狂犬病毒遗传稳定性的鉴定 |
| 2.11 重组伪狂犬病毒复制能力的鉴定 |
| 2.11.1 一步生长曲线的测定 |
| 2.11.2 蚀斑的鉴定 |
| 2.12 间接免疫荧光试验鉴定Cap蛋白的表达 |
| 2.13 Western Blot鉴定Cap蛋白的表达 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 同源重组质粒的构建 |
| 3.2 同源重组转移载体pUC18-L-Cap-EGFP-R的鉴定 |
| 3.3 重组伪狂犬病毒的拯救 |
| 3.4 重组伪狂犬病毒的蚀斑纯化 |
| 3.5 EGFP表达盒的删除鉴定 |
| 3.6 HD/c基因组中插入cap基因的鉴定 |
| 3.7 重组伪狂犬病毒遗传稳定性鉴定 |
| 3.8 重组伪狂犬病毒复制能力的鉴定 |
| 3.8.1 一步生长曲线的测定 |
| 3.8.2 蚀斑的测定 |
| 3.9 间接免疫荧光试验及Western Blot鉴定Cap蛋白的表达 |
| 4 讨论 |
| 第三章 表达PCV2 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒的同源重组载体构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒、载体及菌株 |
| 1.2 试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计及合成 |
| 2.2 病毒基因组的提取 |
| 2.3 同源重组载体构建 |
| 2.3.1 同源臂的扩增与连接 |
| 2.3.2 Cap表达盒的扩增与连接 |
| 2.4 辅助筛选载体构建 |
| 2.5 CRISPR/Cas9基因编辑载体构建 |
| 2.6 重组伪狂犬病毒的拯救及蚀斑纯化 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 同源重组质粒和辅助筛选质粒的构建 |
| 3.2 重组伪狂犬病毒的拯救 |
| 3.3 重组伪狂犬病毒的拯救 |
| 4 讨论 |
| 第四章 伪狂犬病毒gB蛋白单克隆抗体的制备 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒、菌株及质粒 |
| 1.2 细胞和实验动物 |
| 1.3 酶与试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 PCR扩增gB基因 |
| 2.2 原核表达载体的构建 |
| 2.2.1 PCR纯化产物的双酶切与纯化 |
| 2.2.2 空载的制备 |
| 2.2.3 目的片段的连接 |
| 2.2.4 pET-28a-gB的转化和鉴定 |
| 2.3 gB蛋白的诱导、纯化及鉴定 |
| 2.3.1 gB蛋白的表达 |
| 2.3.2 gB蛋白的纯化 |
| 2.4 纯化后蛋白SDS-PAGE鉴定 |
| 2.5 纯化后蛋白Western Blot分析 |
| 2.6 BALB/c小鼠的免疫 |
| 2.7 杂交瘤细胞株的建立 |
| 2.7.1 制备饲养细胞 |
| 2.7.2 细胞融合 |
| 2.8 阳性细胞株的筛选 |
| 2.8.1 采用间接酶联免疫吸附试验法检测筛选 |
| 2.8.2 Western Blot检测杂交瘤细胞分泌抗体的反应性 |
| 2.8.3 间接免疫荧光试验检测杂交瘤细胞分泌抗体的反应性 |
| 2.8.4 阳性杂交瘤细胞株的亚克隆 |
| 2.9 单抗腹水的制备 |
| 2.10 单克隆抗体ELISA反应性的鉴定 |
| 2.11 单克隆抗体Western Blot和间接免疫荧光实验反应性鉴定 |
| 2.11.1 gB蛋白真核表达载体的构建 |
| 2.11.2 Western Blot反应性测定 |
| 2.11.3 间接免疫荧光的反应性测定 |
| 2.12 gB蛋白抗体识别的抗原区域鉴定 |
| 2.13 单抗亚类的鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 gB基因的扩增 |
| 3.2 重组质粒的鉴定 |
| 3.3 重组蛋白的表达与鉴定 |
| 3.4 三免后血清ELISA的检测结果 |
| 3.5 筛选获得单克隆细胞株 |
| 3.6 单克隆抗体腹水的制备 |
| 3.7 单克隆抗体反应性鉴定 |
| 3.7.1 Western Blot反应性的检测 |
| 3.7.2 间接免疫荧光试验反应性的检测 |
| 3.8 gB蛋白抗体识别的抗原表位区域鉴定 |
| 3.8.1 pEGFP-C3-gB-A/B/C截短基因的扩增 |
| 3.8.2 gB蛋白抗体识别的抗原表位区域鉴定 |
| 3.9 单克隆抗体亚类鉴定 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 常用试剂与配方 |
| 作者简历 |
（6）伪狂犬病毒的gE蛋白胞外区真核表达以及单克隆抗体制备（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒、病毒、细胞及实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 g E-6×His重组蛋白真核表达载体的构建 |
| 1.2.2 gE-mFc重组蛋白真核表达载体的构建 |
| 1.2.3 重组gE蛋白的表达、纯化和鉴定 |
| 1.2.4 小鼠免疫 |
| 1.2.5 单克隆抗体的制备 |
| 1.2.6 间接免疫荧光试验（IFA）鉴定单克隆抗体 |
| 2 结果 |
| 2.1 gE蛋白序列生物信息学分析 |
| 2.2 表达载体的鉴定 |
| 2.3 gE-6×His蛋白表达、纯化和鉴定 |
| 2.4 gE-mFc蛋白表达、纯化和鉴定 |
| 2.5 杂交瘤细胞株的获得 |
| 2.6 IFA鉴定gE单克隆抗体特异性 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（7）核酸G四链体结构在伪狂犬病毒EPO基因的表达和病毒增殖中的作用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 伪狂犬病(Pseudorabies,PR) |
| 1.1 伪狂犬病的简介 |
| 1.2 伪狂犬病的流行特点 |
| 1.3 伪狂犬病的防控现状 |
| 1.4 伪狂犬病疫苗的研究进展 |
| 2 伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PRV)的分子生物学特性 |
| 2.1 PRV的主要理化性质 |
| 2.2 PRV基因组 |
| 2.3 PRV的主要蛋白 |
| 2.4 PRV的复制周期 |
| 2.5 PRV EPO基因研究进展 |
| 3 G四链体结构的结构特征以及生物学功能 |
| 3.1 G四链体的结构特征 |
| 3.2 G四链体结构的生物学功能 |
| 3.2.1 对DNA复制的影响 |
| 3.2.2 对DNA转录的影响 |
| 3.2.3 对mRNA翻译的影响 |
| 3.2.4 对表观遗传的影响 |
| 3.2.5 对前体RNA剪接的影响 |
| 3.2.6 对病理学过程的影响 |
| 3.2.7 对端粒酶活性的影响 |
| 4 G四链体结构在病毒中的研究 |
| 4.1 G四链体结构在DNA病毒中的研究 |
| 4.2 G四链体结构在RNA病毒中的研究 |
| 5 G四链体结构小分子配体 |
| 6 小结 |
| 第二章 EPO基因启动子序列中G四链体的结构和功能鉴定 |
| 1 前言 |
| 2 材料与试剂配制方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 主要试剂配制方法 |
| 3 方法 |
| 3.1 生物信息学分析 |
| 3.2 双链DNA的制备及回收 |
| 3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) |
| 3.3.1 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 3.3.2 尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 3.4 硫酸二甲酯足迹保护试验(DMS Footprinting) |
| 3.5 Taq聚合酶延伸阻滞试验 |
| 3.6 圆二色光谱分析(CD) |
| 3.7 PDS与双链DNA |
| 3.8 FRET melting |
| 3.9 MTT检测细胞活性 |
| 3.10 载体构建 |
| 3.11 无内毒素的质粒中量提取 |
| 3.12 质粒转染 |
| 3.13 荧光素酶报告基因试验 |
| 3.14 BCA法测蛋白浓度 |
| 4 结果 |
| 4.1 伪狂犬病毒EPO基因启动子序列的生物信息学分析 |
| 4.2 不同条件对双链DNA形成G四链体结构的影响 |
| 4.2.1 FAM标记的双链DNA的制备 |
| 4.2.2 钾离子对G4形成的影响 |
| 4.2.3 PEG200对G4形成的影响 |
| 4.2.4 不同离子对G4形成的影响 |
| 4.3 富含G的单链DNA形成稳定的G四链体结构 |
| 4.3.1 变性聚丙烯酰胺凝胶 |
| 4.3.2 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 4.3.3 圆二色光谱分析(CD) |
| 4.4 EPO启动子的富含G区域可以形成多种G四链体结构 |
| 4.4.1 硫酸二甲酯足迹保护试验鉴定参与G四链体结构形成的鸟嘌呤碱基 |
| 4.4.2 Taq聚合酶延伸阻滞试验验证G四链体结构的多样性 |
| 4.5 小分子配体可以促进并稳定G四链体结构的形成 |
| 4.5.1 FRET melting |
| 4.5.2 Taq聚合酶延伸阻滞试验 |
| 4.5.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 4.6 G四链体结构对EPO启动子的负调控 |
| 4.6.1 含有EPO启动子质粒的构建 |
| 4.6.2 野生型和G4突变的启动子活性 |
| 4.6.3 PDS对野生型和G4突变的启动子活性 |
| 4.6.4 MTT检测PDS对细胞活性的影响 |
| 5 讨论与结论 |
| 第三章 Sp1蛋白的原核表达及其与G-四链体结构的关系探究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与试剂配制方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 主要试剂配制方法 |
| 3 方法 |
| 3.1 引物设计与合成 |
| 3.2 PCR扩增 |
| 3.3 PCR产物纯化回收 |
| 3.4 重组表达载体的构建 |
| 3.5 重组质粒的诱导表达及鉴定 |
| 3.5.1 最佳诱导表达条件的筛选 |
| 3.5.2 SDS-PAGE鉴定目的蛋白 |
| 3.5.3 重组融合蛋白的可溶性分析 |
| 3.6 融合蛋白的纯化 |
| 3.6.1 融合蛋白大量诱导表达 |
| 3.6.2 融合蛋白的纯化 |
| 3.7 电泳迁移率试验(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA) |
| 3.7.1 双链DNA的扩增与回收 |
| 3.7.2 退火形成G四链体结构 |
| 3.7.3 双链DNA与Sp1蛋白结合试验 |
| 3.7.4 单链DNA与Sp1蛋白结合试验 |
| 4 结果 |
| 4.1 Sp1基因的克隆 |
| 4.2 六种不同标签原核表达载体的构建 |
| 4.3 六种表达载体的最优表达条件探究 |
| 4.3.1 重组载体Grifin-Sp1的诱导条件优化 |
| 4.3.2 重组载体GST-Sp1的诱导条件优化 |
| 4.3.3 重组载体MBP-Sp1的诱导条件优化 |
| 4.3.4 重组载体SUMO-Sp1的诱导条件优化 |
| 4.3.5 重组载体Thioredoxin-Sp1的诱导条件优化 |
| 4.3.6 重组载体Arsc-Sp1的诱导条件优化 |
| 4.4 六种融合蛋白的可溶性分析 |
| 4.5 融合蛋白的纯化 |
| 4.6 G四链体结构促进了Sp1与EPO启动子的结合 |
| 4.6.1 Sp1蛋白与双链DNA形成的G四链体结构的关系 |
| 4.6.2 Sp1蛋白与单链DNA形成的G四链体结构的关系 |
| 5 结论与讨论 |
| 第四章 稳定G-四链体结构的小分子配体的抗病毒研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与试剂配制方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 主要试剂及配制方法 |
| 3 方法 |
| 3.1 Sp1基因细胞内的过表达 |
| 3.1.1 Sp1基因的引物设计 |
| 3.1.2 PCR以及双链DNA的回收 |
| 3.1.3 过表达载体的构建 |
| 3.1.4 中提质粒 |
| 3.1.5 质粒的转染 |
| 3.2 Sp1过表达对EPO启动子活性的影响 |
| 3.2.1 过表达质粒与启动子活性检测质粒的共转染 |
| 3.2.2 荧光素酶报告基因试验 |
| 3.3 Sp1基因敲减细胞系的建立 |
| 3.3.1 shRNA的设计 |
| 3.3.2 慢病毒载体的构建 |
| 3.3.3 慢病毒的包装 |
| 3.3.4 稳定敲减细胞系的建立 |
| 3.4 Sp1敲减后对EPO启动子活性的影响 |
| 3.5 病毒的扩增以及TCID50的测定 |
| 3.5.1 病毒的扩增 |
| 3.5.2 病毒TCID50的测定 |
| 3.6 流式细胞仪检测细胞中PRV-GFP病毒感染的细胞数 |
| 3.7 小分子配体PDS以及BRACO19对细胞的毒性 |
| 3.8 小分子配体对PRV的抗病毒效果最优条件的探索 |
| 3.9 不同浓度PDS在不同时间点对PRV-GFP病毒滴度的影响 |
| 3.10 小分子配体对PRV病毒生活周期的影响 |
| 3.10.1 病毒灭活试验 |
| 3.10.2 病毒入侵试验 |
| 3.10.3 预处理试验 |
| 3.10.4 复制试验 |
| 3.10.5 吸附试验 |
| 3.10.6 全过程加药 |
| 3.11 PDS对PRV HN-1201病毒生长曲线的影响 |
| 3.12 细胞RNA的提取 |
| 3.13 反转录 |
| 3.14 荧光定量PCR |
| 3.15 细胞总蛋白的提取及定量 |
| 3.16 Western blotting检测 |
| 3.16.1 SDS-PAGE胶分离蛋白 |
| 3.16.2 转膜 |
| 3.16.3 抗体孵育 |
| 3.16.4 显影 |
| 4 结果 |
| 4.1 过表达Sp1对EPO启动子活性的影响 |
| 4.1.1 Sp1过表达载体的构建 |
| 4.1.2 过表达Sp1后EPO启动子活性增强 |
| 4.2 Sp1敲减后对EPO启动子活性的影响 |
| 4.2.1 敲减载体的构建 |
| 4.2.2 敲减效率的测定 |
| 4.2.3 Sp1敲减后EPO启动子活性降低 |
| 4.3 小分子配体PDS和BRACO19的细胞毒性 |
| 4.4 小分子配体PDS对PRV-GFP病毒的影响 |
| 4.5 小分子配体PDS以及BRACO19对PRV-GFP病毒周期的影响 |
| 4.5.1 PDS对PRV-GFP在Vero细胞中生活周期的影响 |
| 4.5.2 PDS对PRV-GFP在PK15细胞中生活周期的影响 |
| 4.5.3 BRACO19对PRV-GFP在Vero细胞中生活周期的影响 |
| 4.6 PDS对PRV HN-1201生长曲线的影响 |
| 4.7 PDS对PRV HN-1201毒株基因组中基因的影响 |
| 4.7.1 Vero细胞中PDS对PRV HN-1201毒株基因组中基因的影响 |
| 4.7.2 PK15细胞中PDS对PRV HN-1201毒株基因组中基因的影响 |
| 5 讨论与结论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 附录1 攻读博士期间发表文章及个人荣誉 |
| 附录2 英文缩略词表 |
（8）猪伪狂犬病病毒单克隆抗体的制备及gE抗体阻断ELISA方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 伪狂犬病病毒研究进展 |
| 1 病原学 |
| 1.1 伪狂犬病毒的结构 |
| 1.2 病毒基因组与编码蛋白 |
| 2 流行病学 |
| 3 致病机理 |
| 4 诊断方法 |
| 4.1 病毒分离鉴定 |
| 4.2 动物接种试验 |
| 4.3 免疫学诊断方法 |
| 4.4 分子生物学诊断方法 |
| 5 免疫与疫苗 |
| 5.1 灭活疫苗 |
| 5.2 弱毒疫苗 |
| 5.3 亚单位疫苗 |
| 5.4 重组活载体疫苗 |
| 5.5 DNA疫苗 |
| 参考文献 |
| 第二章 2017年华东地区猪伪狂犬病血清流行病学调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 血清样品 |
| 1.2 血清样品的处理 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 总体情况 |
| 2.2 空间分布 |
| 2.3 季度分布 |
| 2.4 畜间分布 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 猪伪狂犬病病毒单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株、细胞、病毒及试验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 PRV ZJ01株病毒的制备 |
| 1.4 重组抗原的制备 |
| 1.5 动物免疫 |
| 1.6 间接ELISA筛选方法的建立 |
| 1.7 细胞融合 |
| 1.8 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 1.9 阳性杂交瘤细胞的克隆化 |
| 1.10 单克隆抗体细胞株的稳定性试验 |
| 1.11 单抗腹水的制备及效价测定 |
| 1.12 单抗的鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒的纯化 |
| 2.2 PRV gC和gE基因的PCR扩增 |
| 2.3 重组质粒的菌液PCR鉴定 |
| 2.4 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.5 PRV gC和gE基因的序列测定与分析 |
| 2.6 重组蛋白的鉴定 |
| 2.7 重组蛋白的可溶性分析 |
| 2.8 重组蛋白的纯化 |
| 2.9 免疫小鼠血清抗体效价的测定 |
| 2.10 阳性杂交瘤细胞株的建立 |
| 2.11 杂交瘤细胞株分泌McAbs的稳定性及腹水效价的测定 |
| 2.12 单克隆抗体亚型的鉴定 |
| 2.13 Western blot鉴定单抗的特异性 |
| 2.14 单抗的间接免疫荧光鉴定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 猪伪狂犬病病毒gB、gC及g蛋白B细胞表位的鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 基因分段克隆引物的设计与合成 |
| 1.3 目的基因的扩增与重组表达载体的构建和鉴定 |
| 1.4 重组蛋白的表达与鉴定 |
| 1.5 Western blot鉴定gB、gC和gE蛋白的B细胞表位 |
| 1.6 抗原表位的保守性分析 |
| 1.7 表位的3D模型分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 抗gB蛋白单克隆抗体B细胞表位的鉴定 |
| 2.2 抗gC蛋白单克隆抗体B细胞表位的鉴定 |
| 2.3 抗gE蛋白单克隆抗体B细胞表位的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 猪伪狂犬病病毒g抗体阻断ELISA方法的建立与应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞、试剂及实验动物 |
| 1.2 标准血清及样品 |
| 1.3 重组抗原的制备与纯化 |
| 1.4 单克隆抗体的纯化及辣根过氧化物酶(HRP)标记 |
| 1.5 阻断ELISA步骤 |
| 1.6 阻断ELISA最佳反应条件的筛选 |
| 1.7 判定标准的确定 |
| 1.8 重复性试验 |
| 1.9 特异性及敏感性试验 |
| 1.10 交叉反应性试验 |
| 1.11 符合率试验 |
| 1.12 临床样本检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组蛋白的纯化 |
| 2.2 单克隆抗体的纯化和3E1-HRP工作浓度筛选 |
| 2.3 反应条件的优化 |
| 2.4 判定标准的确定 |
| 2.5 重复性试验 |
| 2.6 特异性及敏感性试验 |
| 2.7 交叉反应性试验 |
| 2.8 符合率试验 |
| 2.9 临床样本检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（9）双表达gC基因的重组伪狂犬病毒gI/gE缺失株的构建及免疫效力评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词 |
| 1 前言 |
| 1.1 伪狂犬病病原学 |
| 1.1.1 伪狂犬病毒概述 |
| 1.1.2 伪狂犬病毒理化特性 |
| 1.1.3 伪狂犬病毒gE、gI和gC基因的研究 |
| 1.2 伪狂犬病的流行病学 |
| 1.3 伪狂犬病的防控措施 |
| 1.3.1 合理免疫 |
| 1.3.2 定期监测净化猪群 |
| 1.3.3 加强管理 |
| 1.4 猪伪狂犬病疫苗研究进展 |
| 1.4.1 灭活疫苗 |
| 1.4.2 弱毒疫苗 |
| 1.4.3 基因工程疫苗 |
| 1.5 病毒重组的研究方法 |
| 1.6 研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 细胞培养用溶液 |
| 2.1.4 病毒DNA抽提相关溶液 |
| 2.1.5 细菌培养基及常用溶液 |
| 2.1.6 琼脂糖凝胶电泳缓冲液 |
| 2.1.7 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 BHK-21 细胞培养 |
| 2.2.2 PRV-AH株的病毒增殖 |
| 2.2.3 大肠杆菌DH5α 感受态细胞的制备 |
| 2.2.4 病毒基因组DNA的抽提 |
| 2.2.5 主要引物设计 |
| 2.2.6 重组质粒pgC-N1的构建及鉴定 |
| 2.2.7 转移载体pMD-LA-gC-RA的构建及鉴定 |
| 2.2.8 转移载体pMD-LA-gC-RA与rPRV-AH- gI~-/gE~-/EGFP~+的同源重组 |
| 2.2.9 重组病毒rPRV-AH- gI~-/gE~-/gC~+的筛选与鉴定 |
| 2.2.10 重组病毒一步生长曲线的绘制 |
| 2.2.11 PRV gC基因qPCR检测 |
| 2.2.12 重组病毒rPRV-AH- gI~-/gE~-/gC~+灭活疫苗的制备 |
| 2.2.13 小鼠免疫与攻毒 |
| 2.2.14 血清中和抗体检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 PRV gC编码区序列的扩增 |
| 3.2 pEGFP-N1骨架的扩增 |
| 3.3 重组质粒pgC-N1的酶切鉴定 |
| 3.4 转移载体pMD-LA-gC-RA的酶切鉴定 |
| 3.5 重组病毒rPRV-AH- gI~-/gE~-/gC~+的PCR与测序鉴定 |
| 3.6 重组病毒在荧光显微镜下的观察 |
| 3.7 病毒一步生长曲线的绘制 |
| 3.8 重组病毒rPRV-AH- gI~-/gE~-/gC~+中gC基因mRNA表达检测 |
| 3.8.1 重组质粒pMD-qgC的鉴定 |
| 3.8.2 实时荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 3.8.3 病毒基因组DNA去除结果检验 |
| 3.8.4 重组病毒gC mRNA表达水平检测 |
| 3.9 rPRV-AH- gI~-/gE~-/gC~+疫苗毒灭活效果检测 |
| 3.10 小鼠免疫与攻毒保护效果检测 |
| 3.10.1 免疫小鼠血清中和抗体检测结果 |
| 3.10.2 免疫小鼠攻毒保护效果检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 重组病毒的构建与纯化 |
| 4.2 重组病毒rPRV-AH- gI~-/gE~-/gC~+中gC基因mRNA转录水平检测 |
| 4.3 重组病毒的稳定性和免疫原性 |
| 5 总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（10）PEDV河南株的遗传进化分析及S基因中和表位区重组PRV的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 文献综述一 |
| 文献综述二 |
| 试验一 PEDV CH-HNKF-15 株全基因组序列测定与分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 试验二 2014~2015年PEDV河南流行株S基因的分子流行病学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 试验三 PEDV中和表位区基因S1D的截短表达及多抗制备 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 试验四 PEDV中和表位区S1D重组PRV的构建与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 附录:作者读研期间已发表文章 |
四、利用真核表达载体构建表达PRV闽A株gE基因表位抗原编码区片段的重组质粒（论文参考文献）
- [1]猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗及其载体疫苗的研制[D]. 童武. 东北农业大学, 2020(04)
- [2]PRRS GP5及PR gB基因二联表位预测疫苗的构建及其免疫效果评价[D]. 李丹. 天津农学院, 2020
- [3]表达猪圆环病毒3型衣壳蛋白的重组伪狂犬病毒构建及伪狂犬病毒gC、gG蛋白单克隆抗体制备[D]. 黄文祥. 浙江大学, 2020(01)
- [4]牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎二联核酸疫苗的构建及其免疫效应研究[D]. 马小静. 宁夏大学, 2020
- [5]表达猪圆环病毒2衣壳蛋白的重组伪狂犬病毒构建[D]. 唐雯. 浙江大学, 2020(01)
- [6]伪狂犬病毒的gE蛋白胞外区真核表达以及单克隆抗体制备[J]. 郎巧利,吴梦,黄楠,何琦琳,葛良鹏,杨希. 生物技术通报, 2019(11)
- [7]核酸G四链体结构在伪狂犬病毒EPO基因的表达和病毒增殖中的作用[D]. 孔江南. 河南农业大学, 2019(04)
- [8]猪伪狂犬病病毒单克隆抗体的制备及gE抗体阻断ELISA方法的建立[D]. 张盼盼. 南京农业大学, 2019(08)
- [9]双表达gC基因的重组伪狂犬病毒gI/gE缺失株的构建及免疫效力评价[D]. 潘慧. 华南农业大学, 2017(08)
- [10]PEDV河南株的遗传进化分析及S基因中和表位区重组PRV的研究[D]. 乔涵. 河南农业大学, 2017(01)