一、酵母α-半乳糖苷酶组成型表达基因的重组构建及转化（论文文献综述）
谷新晰[1]（2021）在《嗜热烟曲霉HBHF5魔芋葡甘聚糖降解酶系解析及协同机制研究》文中认为魔芋低聚糖（konjac oligosaccharides,KOS）是一种功能性低聚糖,在食品、饲料和医药等行业有广泛的应用价值和前景,近几年倍受国内外学者关注。在寡糖的制备方法中,绿色、高效的生物酶解魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan,KGM）是最具前景的生产方式。而作为底物的魔芋葡甘聚糖在水溶液中具有较高的粘度,以至无法靠增大底物浓度的方式提高产量。β-甘露聚糖酶和β-甘露糖苷酶等几个常用的甘露聚糖降解酶可以发挥一定的水解作用,但依然存在水解效率低,产物具有聚合度偏好性等问题,极大限制了魔芋低聚糖工业化生产的发展。本研究针对魔芋葡甘聚糖复杂结构,挖掘并优化有工业应用价值的高效降解魔芋葡甘聚糖酶系,以期探究生物降解魔芋葡甘聚糖全貌,促进魔芋低聚糖高质高效制备。为此,本研究拟从我国酿酒大曲中筛选高效降解魔芋葡甘聚糖的嗜热真菌;进而利用转录组和蛋白组学技术,分析嗜热真菌菌株在魔芋葡甘聚糖降解过程中降解酶系组成,并确定魔芋葡甘聚糖降解关键基因;最终对关键基因进行异源表达及酶学特性的表征,探究关键降解酶协同降解魔芋葡甘聚糖的作用,以期为魔芋葡甘聚糖大分子酶降解提供理论支持,为魔芋低聚糖制备工业提供优良的酶系资源。主要研究结果如下:1.酿酒大曲中高效降解魔芋葡甘聚糖嗜热真菌的筛选、鉴定及评估本研究以中、高温大曲为试验对象,从中筛选嗜热真菌,并依据形态学观察及ITS序列对菌株进分类鉴定。通过对粗酶液反应温度,甘露聚糖酶酶活力,及降解魔芋葡甘聚糖产物的粘度、聚合度等变化评估各菌株在魔芋葡甘聚糖降解中的能力,最后采用转录组学技术对性状优良的菌株进行产酶谱测定分析,全面评价嗜热真菌的产酶潜力。从中、高温大曲样品中共分离出20株产甘露聚糖酶的嗜热真菌,经形态学观察和ITS序列同源性分析后对其鉴定,发现这些菌株分别属于Lichtheimia ramosa,Rhizomucor pusillus,Rhizomucor tauricus,Rasamsonia composticola,Thermoascus crustaceus,Aspergillus fumigatus和Rhizopus microsporus。进一步研究发现Aspergillus fumigatus HBHF5的胞外发酵液水解魔芋胶可以使其黏度下降35.8%,水解产物的总还原糖（TRS）、直接还原糖（DRS）分别为1.88mg/m L、0.96mg/m L,水解产物的平均聚合度（DP）为1.97。在麸皮诱导条件下,共有239个CAZymes类基因表达,主要为淀粉、纤维素、半纤维素降解相关酶类。综上可知,A.fumigatus HBHF5可降解魔芋葡甘聚糖且糖苷水解酶系丰富,是一株有巨大应用潜力的产酶菌株。2.烟曲霉HBHF5魔芋葡甘聚糖降解酶系的研究以葡萄糖或魔芋葡甘聚糖为唯一碳源培养的嗜热真菌A.fumigatus HBHF5为样品,利用转录组和蛋白质组技术进行A.fumigatus HBHF5的组学研究,解析该菌在魔芋粉诱导下差异表达基因相关信息,并参考A.fumigatus AF293基因组注释信息,探究该真菌在魔芋葡甘露聚糖降解需所酶的种类,为后续研究提供指导。经分析,该菌在转录组水平共鉴定9449个基因,其中显着上调644个基因,下调588个基因。在蛋白质组水平共鉴定到629个蛋白,其中156个蛋白上调表达,348个蛋白下调表达。两个组学差异表达的基因数为106个,其中56个基因上调表达,50个基因下调表达。进一步分析发现这些上调差异表达基因多为碳水化合物酶（CAZymes）,如纤维素酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、果胶酶、糖苷酶及辅助酶等,这一发现扩展了对甘露聚糖降解酶系的认知。3.降解魔芋葡甘聚糖关键酶的酶学特性表征及协同作用研究依据组学分析结果,将甘露聚糖降解酶基因进行真核异源表达、纯化及酶学性质分析,为后续研究提供试验材料。利用获得的酶蛋白分子进行魔芋低聚糖的制备研究,分析其降解活力和魔芋低聚糖成份的组成,筛选出制备魔芋低聚糖的相关酶。对获得的酶进行协同作用分析,筛选出具有协同制备魔芋低聚糖的酶类。从烟曲霉HBHF5降解魔芋葡甘聚糖上调差异表达基因谱中,成功对13个基因进行了异源表达,包括2个甘露聚糖酶（AfMan5A、AfMan5B）,3个果胶酶（AfPly C、AfPly A、AfPGL）,5个纤维素酶（AfCel5A、AfCel5B、AfEn,Afhp、AfPGL）,1个几丁质酶（AfChi）,1个单宁酶（AfTan）和1个膨胀素（AfSwol）,并对其进行了酶学特性表征及协同作用的分析研究。经测定,其中甘露聚糖酶AfMan5A、AfMan5B,果胶酶AfPGL,纤维素酶AfCel5A、AfCel5B、AfEn、Afhp以及膨胀素AfSwol,8个酶为典型嗜热酶,最适温度在60℃及以上,特别是纤维素酶AfCel5B,最适温度达到80℃。重组嗜热酶均具有良好的热稳定性,如AfMan5A在60℃条件下,保温处理60min,能保留95%酶活力;AfCel5B在70℃条件下,保温处理60min,能保留95%酶活力。重组酶同时具有宽阔的p H稳定范围,如嗜热酶AfEn,Afhp,AfCel5B,AfPGL在p H3-10能够保持80%以上的酶活力,特别是嗜热纤维素酶AfCel5B,在p H3-11范围内活性始终保持100%,基本不发生变化。唯一嗜碱酶为果胶裂解酶AfPly A,最适p H为8.0,在p H8-10能维持80%酶活力。重组酶与AfMan5B协同作用研究的结果表明,纤维素酶和β-甘露聚糖酶在共同降解魔芋葡甘聚糖时表现出良好协同作用,协同效率在1.30-3.96,特别是当AfCel5B先作用于魔芋葡甘聚糖底物后,甘露聚糖酶AfMan5B水解产物中总还原糖释放量提高了约300%。单宁酶也具有明显的促降解效果,最高可使水解效率提升70%。本研究首次发现,膨胀素也在魔芋葡甘聚糖降解中发挥积极作用（之前未见报道）,可以提升10～30%的水解效率;三个重组果胶酶均表现出不同程度的促进水解效果,协同效率在1.19-1.25,多聚半乳糖醛酸酶AfPGL最高可提升25%还原糖释放量。因此可以推断,若实现魔芋葡甘聚糖大分子高效降解,除需要β-甘露聚糖外,还应有纤维素酶、单宁酶、膨胀素、果胶酶等多酶系的共同作用。以上发现为魔芋葡甘聚糖的酶解提供了新的思路,丰富了现有的甘露聚糖降解理论。本研究从酿酒大曲中成功获得了一株产魔芋葡甘聚糖降解酶系的嗜热真菌Aspergillus fumigatus HBHF5,掌握了Aspergillus fumigatus HBHF5在魔芋葡甘聚糖降解过程中的双组学上调蛋白表达谱,并成功表达了13个重组魔芋甘露聚糖降解关键酶,明确了甘露聚糖酶AfMan5B与其他重组蛋白在魔芋葡甘聚糖降解过程中的协同作用关系,从理论上拓展了对甘露聚糖降解中协同作用酶系的认知,也为魔芋葡甘聚糖的酶解提供了新的思路。
安建鲁[2]（2021）在《嗜热真菌埃默森篮状菌糖苷水解酶的功能解析》文中研究表明木质纤维素类生物质资源是地球上含量最丰富的可再生资源,基于木质纤维素资源降解的生物质炼制技术在以生物乙醇为代表的生物基产品及其它大宗生物产品生产领域具有广阔的应用前景和巨大的社会经济价值。木质纤维素在组成和结构上具有高度复杂性和异质性,其被有效水解需要多种糖苷水解酶组分的协同作用,且水解过程中对酶的热稳定性和催化能力等性质也有较高要求。因此,寻找和开发更多具备优良酶学特性和较高催化效率的新糖苷水解酶是目前木质纤维素降解研究的重点之一。目前研究最为深入的木质纤维素酶生产的真菌菌株包括里氏木霉、草酸青霉和粗糙脉孢霉等,它们均属于嗜温真菌,所产生的木质纤维素酶的最适反应温度较低,热稳定性较弱,在实际生产应用中仍受到诸多的限制。耐热酶或嗜热酶由于具有较高的稳定性和催化活性,可明显提高对生物质资源的降解转化效率,在工业生产上具有很多中温酶不具备的优势。因此挖掘和开发具备优秀热稳定性的新型糖苷水解酶具有重要的应用价值。埃默森篮状菌（Rasamsonia emersonii）是一株具有丰富糖苷水解酶编码潜力的嗜热丝状真菌,其可以在40-45℃环境下生长,具有较为完整的纤维素及半纤维素降解酶系,是开发耐热糖苷水解酶最具潜力的菌株之一。本论文以埃默森篮状菌为研究对象,对其胞外糖苷水解酶表达合成情况进行了系统分析,并在此基础上围绕挖掘新型耐热糖苷水解酶这一目标开展了系统研究,主要研究成果如下:1.对埃默森篮状菌胞外酶系进行了系统的活性分析和质谱鉴定,确认该菌糖苷酶资源丰富,可在胞外分泌高达22种糖苷酶水解酶家族的酶类,主要糖苷酶类具有显着的耐热性。埃默森篮状菌在45℃条件下在木聚糖、葡萄糖或麸皮碳源下生长状态良好。在木聚糖及麸皮碳源条件下,在埃默森篮状菌的胞外发酵液中检测到了纤维素外切酶、纤维素内切酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-半乳糖苷酶的活性,对粗酶液活性检测分析显示,这些酶的最适反应温度均在70-80℃之间,具有显着的耐热性。分析还表明,埃默森篮状菌发酵液中纤维素外切酶及纤维素内切酶的活性虽然较低,但β-葡萄糖苷酶的活性较高,其活性最高可达约1.5 Uml-1,且β-葡萄糖苷酶存在一定程度的组成型表达。埃默森篮状菌的胞外木聚糖酶和β-木糖苷酶活性较为突出,在麸皮碳源下,该菌的胞外木聚糖酶活性可以达到约10.53 U ml-1,在木聚糖碳源下,胞外β-木糖苷酶活性最高达到0.097U ml-1。在麸皮及木聚糖碳源条件下的胞外发酵液中还检测到了 0.071 U ml-的α-阿拉伯呋喃糖苷酶和0.177 U ml-1的α-半乳糖苷酶活性。通过质谱鉴定和分析发现,在微晶纤维素、麸皮及微晶纤维素麸皮混合碳源条件下,埃默森篮状菌胞外可分泌的糖苷水解酶种类繁多,分布在从GH1家族到GH93家族的22个糖苷水解酶家族中,包括大量未得到表征的酶类,其中半纤维素酶类在胞外总产酶中占12.14%-18.63%。除了糖苷水解酶外,还在胞外鉴定到了多种漆酶等与木质纤维素降解相关的酶类及大量未知蛋白。该工作为后续对这些酶的异源表达和酶学性质表征工作以及开发应用奠定了基础。2.成功对耐热α-半乳糖苷酶ReGal2进行了异源表达纯化与酶学性质表征,表明ReGal2具有高热稳定性、高催化活性及对多种金属离子及蛋白变性剂的突出耐受力,有重要的应用开发价值。通过质谱鉴定和基因组数据分析,发现埃默森篮状菌基因组中存在5个α-半乳糖苷酶编码基因,并对尚未报道的4个基因进行了异源表达。活性检测分析显示,4个重组酶的最适反应温度在50-80℃之间,其中ReGal2的最适反应温度最高。酶学性质表征显示,ReGal2的活性形式为同源6聚体蛋白,单体分子量为66kDa。ReGal2的最适反应温度为80℃,最适pH为4.0。ReGal2在70℃下保存60 h后活性未受到任何影响,在80℃下孵育3 h后其活性也几乎没有损失,在85℃下孵育60 min仍能保持60%的活性,通过微量差示扫描量热仪测定其Tm值为97.9℃,是目前表征的热稳定性最强的α-半乳糖苷酶。ReGal2测得的α-半乳糖苷酶活性为935 U mg-1,对合成底物pNPGal的动力学常数Km、kcat和kcat/Km分别为0.19 mM,623.1 s-1,3279-s-1mM1,表明其具有非常高的催化转化能力。同时ReGal2也表现出了对多种金属离子,化学试剂及高浓度盐的耐受力。进一步研究发现,ReGal2能够有效水解豆粕中的棉子糖和水苏糖等抗营养成分,在70℃下反应24 h后,豆粕中的水苏糖、棉子糖等抗营养成分可被ReGal2完全水解。综上所述,ReGal2具有高热稳定性、高催化活性及对多种金属离子及蛋白变性剂的高耐受力,表明该酶具有高抗不良环境的能力,在食品、饲料加工等领域具有广阔的应用潜力。此外,我们还对其中一个α-N-乙酰半乳糖苷酶ReGal4进行了纯化和酶学性质表征。ReGal4的分子量为90kDa,其最适反应条件为60℃,pH 4.0.。eGal4在50℃下孵育3 h后活性几乎没有损失,在55℃下孵育30 min后仍能保持42%的初始活性,与已报道的其它α-N-乙酰半乳糖苷酶相比具有更强的耐热性。ReGal4的活性受到多种金属离子和酶抑制剂的影响。ReGal4在最适条件下测得的酶活为34.9 U mg-1,对合成底物4-NPGalNAC的催化动力学常数 Vmax、Km、kcat/Km分别为 59.33Umg-1,61.69 s-1,237.26mg s-1 ml-1,与同类酶相比也表现出较强的水解活性。3.完成了埃默森篮状菌耐热阿拉伯聚糖降解酶Abn93和Abf2的异源表达纯化与酶学性质表征,表明两个酶都具有较高的热稳定性,且Abn93具有高催化活性和高pH稳定性。对埃默森篮状菌的胞外阿拉伯聚糖降解酶进行了分离纯化,通过质谱鉴定该酶为GH93家族的外切阿拉伯聚糖酶。对该外切阿拉伯聚糖酶Abn93和从基因组筛选得到的GH51家族α-阿拉伯呋喃糖苷酶Abf2进行了异源表达、纯化和酶学性质研究。Abn93的分子量为70 kDa,最适反应温度为70℃,最适pH为4.0,在70℃下孵育3 h后仍能保持68.04%的活性,通过微量差示扫描量热仪测定其Tm为80.49℃,是目前耐热性最强的外切阿拉伯聚糖酶。酶活性表征表明,Abn93表现出具有较强和较宽的pH耐受性,在pH3.0-9.0的条件下孵育6h后,其仍能保持89.03%以上的活性。Abn93催化水解能力强,特异性降解线性脱支阿拉伯聚糖,比酶活性为466.08 U mg-1,Km和kcat/Km分别为1.89 mg ml-1和163.98 mg s-1 ml-1。Abn93催化水解脱支阿拉伯聚糖时从其末端切割,产物为阿拉伯二糖。对基因组筛选得到的GH51家族α-阿拉伯呋喃糖苷酶Abf2的酶学性质表征表明,Abf2的分子量为70 kDa,最适反应温度为70℃,最适pH为4.0。Abf2对合成底物 pNPX 的 Vmax 和Km分别为69.94 U mg-1,8.70 mg ml-1。Abf2在70℃下孵育3 h后仍能保持40.78%的活性,Tm值为79.02℃,表现出了较强的热稳定性。Abf2的活性受金属离子和化学试剂影响较大。4.实现了埃默森篮状菌耐热木聚糖酶Xyn1OA的异源表达纯化并完成了酶学性质表征,结果表明该酶具有高催化活性和高耐热性,且具有多种糖苷酶功能。通过质谱分析,在埃默森篮状菌的木聚糖诱导所产胞外酶系中鉴定到了一个GH10家族的木聚糖酶Xyn10A,在埃默森篮状菌基因组中克隆了该酶基因,并将其在毕赤酵母中进行了异源表达和纯化。检测分析显示该重组酶Xyn1OA对木聚糖具有高水解活性和高耐热性,最适温度是80℃,最适pH为4.0左右,比酶活性为2589.59 U mg-1,在70℃条件下孵育3h后仍维持原有活性,其催化性能和耐热性能优于多数已报道的木聚糖酶。酶活分析还表明,Xyn10A是一种多功能酶,除能够水解木聚糖外,还同时表现出β-木糖苷酶和α-阿拉伯呋喃糖苷酶的活性,其比酶活分别为1.612 U mg-1和0.2638 U mg-1。Xyn10A的活性受到多种金属离子、化学试剂的抑制。本论文主要对埃默森篮状菌胞外糖苷水解酶系进行了系统分析和鉴定,确认了该菌拥有丰富的糖苷水解酶资源,在此基础上对鉴定到的五个新型耐热糖苷水解酶进行了克隆表达,并对其基本酶学性质、水解模式、底物特异性及工业应用前景进行了深入的研究。发现的这些具有高热稳定性和催化能力的新型糖苷水解酶,为食品、饲料、能源等领域提供了性质优秀的耐热酶资源,具有巨大的工业应用潜力。
张金吉[3]（2021）在《3种碱性α-半乳糖苷酶在黄瓜果实水苏糖分解中的作用》文中研究说明光合同化物向果实库端的运输和卸出是形成果菜类蔬菜产量和品质的重要物质基础。黄瓜（Cucumis sativus L.）是葫芦科中的重要经济作物,与大多数高等植物不同,它以水苏糖作为体内光合产物的主要运输形式,水苏糖经过韧皮部长距离运输到达库端果实后在果柄处分解。α-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.22）是催化水苏糖分解的重要酶,黄瓜基因组中共有6个基因编码α-半乳糖苷酶,其中3个编码酸性α-半乳糖苷酶（CsGAL1,CsGAL2和CsGAL3）,另3个编码碱性α-半乳糖苷酶（CsAGA1,CsAGA2和CsAGA3）。前人研究认为,在果柄处起催化水苏糖分解主要是CsAGAs,我们前期研究结果表明该环节起主要作用的可能是CsAGA2。为进一步查明3种CsAGAs在黄瓜果柄水苏糖分解中的作用,本试验在前期构建CsA GA1RNAi和CsAGA2 RNAi化学诱导载体的基础上,继续构建CsAGA3 RNAi载体,转化津优35号黄瓜,获得RNAi株。使用17-β-雌二醇处理果柄诱导RNAi,进一步对比了野生型和RNAi株果柄中3种CsAGA基因表达、果把组织中水苏糖含量以及果实生长速度。所得结果如下:1、成功构建CsAGA3 RNAi载体并转化黄瓜。选择化学诱导表达载体pX6进行RNAi载体构建,电泳和测序结果表明CsAGA3 RNAi载体构建成功,可用于后期研究CsAGA3的功能。通过农杆菌介导法将CsAGA3 RNAi载体转化黄瓜,T0代在基因组水平和转录水平的的检测中,阳性率分别达到66.67%和46.25%。2、建立了黄瓜不同部位应用17-β-雌二醇诱导RNAi的合适方法。试验先后采用涂抹法和喷施法施用不同浓度的17-β-雌二醇处理CMGA2 RNAi植株叶片背面,结果发现黄瓜叶片适合喷施法,最佳施用浓度为50μmol/L。而黄瓜叶柄和果柄适合用包裹法进行17-β-雌二醇处理,最佳施用浓度分别为100和150μmol/L。3、用 150μmol/L17-β-雌二醇分别处理CsAGA1、CsAGA2和 CsAGA3 RNAi 植株果柄后,果柄中靶基因表达均被特异性抑制。化学处理后,CsAGA2RNAi黄瓜果柄中CsA GA2表达水平被显着特异性抑制,果把组织中水苏糖含量显着升高,葡萄糖和果糖含量显着下降,果实鲜重和干重显着下降,CsAGA1 RNAi黄瓜的果实干鲜重显着下降,而CsAGA3 RNAi植株上述指标均未受显着影响。表明CsAGA2可能是催化分解水苏糖的关键酶。试验结果证实CsAGA2在黄瓜果实水苏糖分解过程中起关键作用。该结论可为进一步探明黄瓜同化物的卸载机理提供线索,为生产中制定黄瓜高产优质栽培和育种策略提供依据。
王亚伟[4]（2019）在《胡萝卜软腐果胶杆菌苎麻脱胶增效的关键酶及应用研究》文中研究说明苎麻纤维是最好的天然植物纤维,其纤维最长、强度大,具有吸湿透气、防霉耐磨等多种功能,使苎麻纤维织物在国内外高端市场广受欢迎。苎麻纤维是由苎麻韧皮脱胶获得,习惯将苎麻纤维以外的果胶、半纤维素和木质素等成分统称为胶质。对比目前普遍使用的高温强碱脱胶工艺,生物脱胶能大幅节能减排,并显着提高纤维品质,是目前的研究重点和难点。本课题组前期筛选获得苎麻高效脱胶菌株胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum HG-49,其脱胶率达82.2%,去除了苎麻韧皮中95%果胶、70%半纤维素,残留的主要胶质为半纤维素,仍需一定量的碱进行高温碱煮才能去除,分析发现残胶中的甘露聚糖含量较高。为了进一步提高P.carotovorum HG-49脱胶效果,减少碱的用量和高温能耗,本研究对降解甘露聚糖的关键半纤维素酶进行了筛选和脱胶效果评价,并构建相应的高效工程菌,以期显着提高脱胶效果,取得的主要研究结果如下:（1）筛选鉴定并高效表达了苎麻脱胶关键酶—甘露聚糖酶（Man B）,发现该酶与P.carotovorum HG-49协同脱胶能提高苎麻韧皮的半纤维素去除率。依据苎麻半纤维素中甘露聚糖含量较高的特征,以及P.carotovorum HG-49脱胶过程中监测p H变化由中性逐渐升高至碱性,确定以耐碱的甘露聚糖酶为关键半纤维素酶的筛选目标。对已发表的甘露聚糖酶进行了筛选,获得一种能特异性水解甘露聚糖的耐碱典型甘露聚糖酶。对该酶的密码子进行优化,使其适用于毕赤酵母表达系统,合成优化后的酶基因序列并命名为Man B（Gen Bank accession No.KJ806638.1）。构建了高产重组菌株6×Man B-P.pastoris GS115,并在30 L发酵罐中高密度发酵后,上清液中酶活力达1649 IU/m L,蛋白质浓度达3.34 g/L。Man B的最适反应温度为70-75oC,最适反应p H为7-9,在p H 6-10能够维持稳定。Man B对角豆胶和魔芋粉水解活力最高,比活力分别为494.0 IU/mg和152.8 IU/mg。将不同浓度的Man B与P.carotovorum HG-49联合使用对苎麻韧皮进行原位脱胶处理,发现添加400 IU/m L Man B时苎麻韧皮脱胶率提高到85.6%。（2）分析P.carotovorum HG-49基因组中糖苷水解酶,发现了一种能显着提高苎麻韧皮脱胶效果且具有较高甘露聚糖酶活性的酶（Cel5M）,并鉴定了该酶的特性和功能。通过分类注释P.carotovorum HG-49基因组中所有糖苷水解酶,仅发现一种N端催化域分类于糖苷水解酶第五家族（GH5）、C端分类于碳水化合物第三家族（CBM3）的酶具有较高甘露聚糖酶活力,尤其是对以葡甘聚糖为主的魔芋粉水解活性最高,故命名为葡甘聚糖酶Cel5M（Gen Bank accession No.MH544226.1）。利用重组酶Cel5M与P.carotovorum HG-49联合脱胶,发现添加400 IU/m L Cel5M时脱胶率提高至88.9%,特别是,半纤维素去除率显着提高。Cel5M最适反应温度为65o C,最适反应p H为6.5,在p H 5.0-9.0能够维持较高的稳定性。该酶具有较宽广的底物水解谱,对魔芋粉、羧甲基纤维素钠、木聚糖、角豆胶和瓜尔豆胶等水溶性底物均具有较高的水解活力,比活力依次为1061.1 IU/mg、647.3 IU/mg、563.4 IU/mg、315.1IU/mg和297.1 IU/mg。以魔芋粉作为底物时,Cel5M的热稳定性与酸碱耐受性较高。另外,Cel5M的CBM3能显着提高催化域的比活力,并降低对金属离子等的敏感性。（3）以P.carotovorum HG-49为表达受体,构建了过表达工程菌,提高了苎麻韧皮脱胶效果。将携带信号肽的Cel5M基因与载体p UC18-YJ重组后,转化原始菌P.carotovorum HG-49,获得Cel5M的组成型表达工程菌。分析比较工程菌与原始菌分别在富营养条件下和苎麻脱胶过程中的生长状态和酶活力,发现工程菌具有明显的生长和产酶优势。工程菌将脱胶率由原始的82.2%提高到87.7%,提高了苎麻韧皮的脱胶效果。本研究发现甘露聚糖酶能显着提高P.carotovorum HG-49苎麻脱胶效果,通过构建同源过表达Cel5M的高效脱胶工程菌,大幅降低了苎麻生物脱胶过程中半纤维素的残留,促进了苎麻生物脱胶绿色技术的应用。
刘阳[5]（2018）在《海洋硫氧化菌Thioclava分类鉴定及其硫氧化机制研究》文中研究指明随着我国经济社会快速发展,以硫化物/硫化氢为代表的硫污染日益严重。近些年,生物处理硫污染方法由于具有绿色、高效和经济等优点得到了广泛关注。但是,其应用目前存在两个突出问题:硫氧化菌株资源匮乏和硫氧化代谢机制认识不足。这不但无法满足不同类型硫污染处理需求,而且限制了有目的的条件优化和硫氧化菌的遗传改良。因此,获得更多高效的硫氧化菌并认识其硫氧化特性和代谢机制显得尤为重要。我们课题组前期研究表明:在海洋环境中广泛分布的硫膨大杆菌（Thioclava）具有较好的硫氧化能力,但是,其分类鉴定和硫氧化机制仍不清晰。因此,本文在Thioclava属细菌分类鉴定及其硫氧化途径等方面开展了研究,这将为后续硫氧化菌株资源的挖掘和工程应用提供理论基础。本文通过串联5个看家基因（顺序:gyrB、rpoD、dnaK、trpB和recA）建立了适用于Thioclava分类研究的多位点序列分析（multilocus sequence analysis,MLSA）方法。16S rRNA基因划分23株Thioclava菌为6个类群,但是其无法区分类群内菌株。相反,MLSA划分这些菌株为7个类群,其中3个为新类群,而且其能够精确区分类群内菌株。代表菌株基因组序列的数值DNA-DNA杂交（digital DNA-DNA hybridization,dDDH）和平均核苷酸相似性（average nucleotide identity,ANI）分析确认了MLSA结果,并发现9个种,其中5个为潜在新种。dDDH-MLSA和dDDH-ANI相关性分析表明:97.3%的MLSA相似度和96.07%的ANI都对应70%的dDDH种分类阈值,因此二者也可以作为种描述阈值。另外,rpoD基因可以作为Thioclava菌株快速分类的分子标记。本文利用多相分类学方法对3个潜在新种进行鉴定。3个新种代表的3个模式菌株革兰氏染色呈阴性,细胞呈短杆状,好氧,酶活特征相似,主要脂肪酸是Summed Feature 8,主要磷脂成分是磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和糖脂,呼吸醌是Q10,DNA G+C含量范围为63.864.1 mol%。3个模式菌株在菌落形态、细胞大小、鞭毛、酶活特征、脂肪酸含量等方面存在显着差异。16S rRNA基因分析、MLSA、dDDH和ANI等基因型特征也支持3个新种的建立。3个新种分别命名为Thioclava sediminum（沉积物硫膨大杆菌）、Thioclava nitratireducens（硝酸盐还原硫膨大杆菌）和Thioclava marina（海洋硫膨大杆菌）,其对应模式菌株分别为MCCC1A10143T、MCCC 1A07302T和MCCC 1A03502T。本文选择T.nitratireducens MCCC 1A07302T作为代表进行硫氧化机制研究。在获得其基因组完成图情况下,通过BLAST、序列特征分析和系统发育分析,初步确定了其硫氧化相关基因,使用实时定量PCR和转录组测序方法对关键的硫氧化基因进行了验证,在此基础上构建了该菌株完整的硫氧化模型:Sqr负责氧化硫化物,SqrR负调控sqr基因转录;Pdo2（AQS46486.1）负责氧化单质硫生成亚硫酸盐,Rho负责催化甘肽过硫化物和亚硫酸盐反应生成硫代硫酸盐;碱性和中性条件下Sox多酶复合体负责氧化硫代硫酸盐为硫酸盐,酸性条件下Tsd负责氧化硫代硫酸盐为连四硫酸盐;Sox复合体或者新基因/酶负责亚硫酸盐氧化。硫氧化特性研究表明:菌株MCCC 1A07302T是一株高效的硫氧化菌,其BMG0315715代表蛋白负责硫代硫酸盐和亚硫酸盐转运。菌株MCCC 1A07302T存在多种碳、氮和硫代谢途径以及完整电子传递途径。另外,菌株MCCC 1A07302T硫氧化作用与同化硫酸盐还原、反硝化作用和电子传递关系密切。综上,本文对海洋Thioclava属菌株进行了系统地研究,完善了其分类体系,确定了其硫氧化特性和代谢途径,探索了其硫氧化过程和其它代谢途径的关联。因此,本文将为后续硫氧化调控机制的探索和硫氧化菌资源的开发利用提供理论依据。
吴伟平[6]（2018）在《基于转录元件的巴斯德毕赤酵母高效启动子构建》文中研究说明随着基因工程技术的发展,蛋白表达已经成为工业生产的主要方式。甲醇型酵母巴斯德毕赤酵母（以下简称毕赤酵母）表达系统具有高表达、高分泌、高密度生长和具有翻译后修饰能力等优点,在科研和工业生产中应用十分广泛。毕赤酵母表达异源蛋白最常用的启动子是醇氧化酶基因aox1基因的启动子（简写为Paox1）,该启动子在甲醇为唯一碳源条件下能够快速高效启动目的基因转录。但是毕赤酵母蛋白表达系统也存在一定的问题:一方面aaox1启动子的转录起始能力还有待进一步加强,以实现更高水平的蛋白表达;另一方面,甲醇有毒,易燃易爆,无法应用于食品和医药等领域蛋白的生产,需要添加无毒的葡萄糖和甘油等非诱导碳源。因此,aox1启动子的活性改造十分重要。此外,近几年随着合成生物学的兴起,利用合成元件在毕赤酵母中构建高效的表达系统也成为研究热点之一,这在重新编程细胞机制中发挥关键作用,使之能更好的改善人类在健康、食品、药品和能源问题的生活。本论文主要从以下三方面展开工作:一是分别构建aox1启动子的正转录调控因子Mxr1和Mit1的过表达菌株,检测过表达菌株在非诱导碳源、诱导碳源以及混合碳源下aox1启动子的转录起始能力;二是对aox1启动子序列进行改造,以egfp为报告基因,检测诱导和非诱导碳源下相关启动子元件的变化以及与正转录调控因子过表达的组合对aox1启动子活性的影响;三是在毕赤酵母中构建了一个基于人工转录因子和合成启动子的表达系统,并在酿酒酵母中进行优化设计。主要研究结果总结如下:一、分别构建过表达转录因子Mxr1和Mit1的重组菌株OEMxr1和OEMit1,发现重组菌株能够显着提升诱导碳源下aox1启动子的转录活性,并且在非诱导碳源下能部分解除aox1启动子的碳代谢阻遏。在毕赤酵母GS115中分别以组成型强启动子GAP启动子驱动Mxr1和Mit1的过表达,通过2-DG敏感性分析、氧化酶酶活和转录水平分析等手段检测过表达菌株中aox1启动子的转录能力。研究结果表明,Mxr1和Mit1的过表达均能够明显增强诱导碳源甲醇下的aox1启动子转录活性,并且能够部分解除非诱导碳源葡萄糖或甘油及其与甲醇的混合碳源下aox1启动子的碳源阻遏。二、通过突变阻遏因子Nrg1结合位点和添加正转录调控因子Mxr1和Mit1的结合基序对aox1启动子序列进行改造,改造后的aox1启动子在甲酵下的转录活性明显增强,并且与Mxr1和Mit1过表达组合后效果更佳。我们首先系统地分析了 aox1启动子上相关的顺式作用元件,对aox1启动子上的负调控因子Nrg1结合位点进行突变失活（命名为mutPaox1）,对Mxr1结合位点以及假定Mit1结合位点增加拷贝数强化（命名为MBS-Paox1）,以egfp为报告基因检测改造后aox1启动子的转录活性。结果表明,在毕赤酵母GS115中,在甲醇诱导条件下,MBS-Paox1转录活性较野生型有明显提高。当MBS-Paox1导入Mxr1过表达菌株中时,其在甲醇诱导条件下的转录活性进一步显着增强,报告基因表达水平是野生型启动子的3倍;与Mxr1过表达菌株不同,当MBS-Paox1导入Mit1过表达菌株则可以实现其在甘油、甘油-甲醇混合碳源下的相对高水平转录活性,相当于野生型启动子的5-8倍。为了检测改造后表达系统的实用性和有效性,我们在Mxr1或Mit1过表达菌株中使用MBS-Paox1驱动表达一个埃默森篮状菌来源的α-半乳糖苷酶,结果显示其表达水平与在野生型中相比有明显提升。三、在毕赤酵母中构建了一个基于人工转录因子和合成启动子的表达系统,并在酿酒酵母中进一步优化设计。我们以pPICZaA为出发质粒,同时表达人工锌指（zinc finger,ZF）转录因子表达盒PGAP-ZF-TT和合成启动子表达盒ZF BD-miniPaox1-yegfp-TT,转入毕赤酵母GS115。荧光分析结果表明,在人工转录因子的激活作用下,合成启动子的启动转录能力比基础转录水平高3-4倍。我们将人工转录因子和合成启动子的表达系统的组件——人工锌指转录因子ZF和合成启动子-报告基因表达盒——在酿酒酵母中进一步优化设计,并初步构建了一个人工锌指结构ZF与阻遏蛋白LacI双调控的转录调控系统。
张伟,郭钦,阮辉,何国庆[7]（2012）在《基于α-半乳糖苷酶基因为筛选标记的酿酒酵母诱导型表达载体的构建及应用》文中进行了进一步梳理以α-半乳糖苷酶基因为筛选标记,构建GAL1诱导型启动子介导的酿酒酵母表达载体YGM-α-gal质粒,将枯草芽孢杆菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆到此载体中,构建质粒YGMPA-α-gal,转化宿主酵母后,实现β-1,3-1,4-葡聚糖酶在酿酒酵母中的分泌表达.结果表明:在2%半乳糖诱导下,摇瓶发酵24h后分泌表达的β-葡聚糖酶活性达到411.9U烂mL-1,而在培养60h后,发酵液中α-半乳糖苷酶活性可达64.2U烂mL-1.说明α-半乳糖苷酶基因可用作酿酒酵母表达载体转化的有效筛选标记,为食品级酿酒酵母表达系统的构建提供了新选择.
周晶辉[8]（2011）在《一株产α-半乳粮苷酶细菌的筛选、鉴定及酶基因克隆分析》文中研究表明α-半乳糖苷酶（α-galactosidase,α-D-galactoside galactohydrolase; EC 3.2.1.22）通常被称为蜜二糖酶,能特异性的水解底物中α-连接的末端非还原性D-半乳糖。该酶在饲料工业、医疗工业、制糖工业中应用广泛。尤其当α-半乳糖苷酶作为制剂添加到以豆粕为主要原料的饲料中可以有效降解其所含的半乳糖苷类抗营养因子,减少动物肠胃疾病的发生。目前普通α-半乳糖苷酶制剂难以满足市场需求,因此有必要研发新型α-半乳糖苷酶。多种生物都能产α-半乳糖苷酶。由于细菌来源的α-半乳糖苷酶结构相对简单,更利于通过基因工程改良酶的特性,因此本研究开展了细菌源α-半乳糖苷酶的研究。通过土壤分离,从湘西富含豆粕下脚料的土壤中筛选获得了一株产α-半乳糖苷酶的细菌,并进行了显微形态观察、革兰氏染色及16S rDNA分子生物学鉴定分析。分离菌株在显微镜下呈球状,表现为革兰氏阳性着色,其16S rDNA序列与NCBI上已登录的乳球菌属（Lactoccus）细菌序列具有98%同源性,可以将其判定为乳球菌属细菌。采用对硝基酚方法对菌株酶活进行了测定。结果表明分离菌株产分泌型a-半乳糖苷酶,发酵粗酶液活性为6.21U/mL。该酶作用最适宜温度为45℃,最适宜pH值为5.5。细菌酶的表达活性受到D-棉籽糖的诱导而受到葡萄糖的抑制,当D-棉籽糖的浓度为30μmol/mL时诱导效果最佳,当葡萄糖浓度为30μmol/mL时酶合成有明显的抑制作用,表现出了糖代谢酶类基因表达的典型调控模式。分离该细菌基因组DNA后,利用多切点酶Sau3A I部分酶解制备随机DNA片段,以pUC19为载体进行随机克隆并转化大肠杆菌后,针对a-半乳糖苷酶活性进行选择,成功克隆了该乳球菌编码α-半乳糖苷酶的基因（命名为agaH）生物信息学分析表明克隆片段全长为3039 bp,其中包含1230 bp的开放阅读框,编码一个409氨基酸的多肽。用Blastn程序分析表明,核苷酸水平与GenBank上己登录的序列没有高同源性序列。但其编码的氨基酸序列在10-220之间具有与糖苷水解酶2超家族（Glycosyl hydrolases 2 super family）共同保守域。说明克隆的基因是一新型α-半乳糖苷酶基因。
李荷,游娟,顾取良,杨红[9]（2010）在《热稳定α-半乳糖苷酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及酶学性质研究》文中进行了进一步梳理克隆前期筛得分枝犁头霉Absidia ramosa WL511的热稳定α-半乳糖苷酶cDNA基因aga（GenBank No.DQ234280）,将aga基因插入表达载体pPICZαA并电转化整合到毕赤酵母P.pastoris GS115的染色体上。30℃、甲醇流加量0.5%（V/V）时,酵母发酵上清液中酶活达32U/ml。纯化后酶的比活力为137U/mg,SDS-PAGE显示单一条带,凝胶过滤和SDS-PAGE估算其分子量分别为348kDa和87kDa,该酶为四聚体结构,糖基化导致重组蛋白的分子量比原酶大6kDa。该酶等电点为5.2,最适反应温度73℃,最适pH6.8,60℃以下及pH5.5～9.0范围内活性稳定。75℃时保温2小时保留54%的酶活,85℃时酶活完全消失。以对硝基苯酚-α-D-半乳糖苷为底物,该酶Km值为0.42mmol/Lol/L;Vmax为413U/mg;kcat为64531/min。
王慧[10]（2010）在《来源于嗜酸真菌Bispora sp. MEY-1的α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶的研究》文中认为α-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.22）和β-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.23）是自然界中广泛存在的两类糖苷水解酶,能从一系列化合物中释放以α-或β-键连接的D-半乳糖。利用α-半乳糖苷酶可以对半乳甘露聚糖进行酶法改性,使改性后的产品具有更多优良的性能,从而使其能够广泛的应用于食品,医药和造纸等行业。β-半乳糖苷酶则可以将乳制品中的乳糖水解为葡萄糖和半乳糖,利用微生物产的β-半乳糖苷酶生产口服剂,可以有效地缓解因不能吸收乳糖而引起的“乳糖不耐症”。本研究从嗜酸真菌Bispora sp. MEY-1中克隆到三个α-半乳糖苷酶基因和一个β-半乳糖苷酶基因,使其在毕赤酵母中进行表达并进行相关酶学性质的研究。三个α-半乳糖苷酶AgalA、AgalB和AgalC都属于27家族糖苷水解酶。AgalA和AgalC与Lachancea thermotolerans （耐热克鲁维酵母）来源的α-半乳糖苷酶相似性最高均为52%,而AgalA与AgalC两者间的氨基酸一致性仅为57.6%; AgalB则与Penicillium simplicissimum （青霉）来源的α-半乳糖苷酶有最高一致性为36%, AgalB与AgalA和AgalC的氨基酸一致性分别为24.9%和27.2%。三个重组α-半乳糖苷酶的最适pH分别为5.5、3.5和7.0,最适温度分别为55°C、55°C和45°C。AgalA、AgalB和AgalC对不同底物表现出不同的特异性: AgalA只对合成底物pNPG有降解能力,对蜜二糖、棉子糖和水苏糖等半乳寡糖均不表现其活性;而AgalB则不仅能催化pNPG、蜜二糖、水苏糖和棉子糖等小分子半乳寡糖,而且对瓜尔豆胶和角豆胶等半乳甘露聚糖也有较高的水解能力; AgalC对不同底物的特异性与AgalB类似。AgalA、AgalB和AgalC的比活分别为31.2 U/mg、581 U/mg和128.8 U/mg。AgalB与同来源的β-甘露聚糖酶Man5A协同降解瓜尔豆胶的实验结果表明: AgalB不仅能单独对瓜尔豆胶侧链的半乳糖残基进行降解,而且能与Man5A一起协同降解瓜尔豆胶。延长AgalB对侧链的作用时间,能显着地促进Man5A对主链的降解。而且随着作用温度的提高,反应速率加快,产物中的还原糖含量也随之增加。AgalA与AgalC则均不能与Man5A发生协同作用。β-半乳糖苷酶BgalA属于糖苷水解酶35家族,其最适pH为1.5,最适温度为60°C。BgalA在整个pH范围内均能保持稳定。有很好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的能力。大多数金属离子对其酶活性没有显着地影响。重组酶的比活为99.5 U/mg。BgalA对ONPG和乳糖两种底物的Km值分别5.22 mM和0.31 mM, Vmax值分别为120.8μmol/（min·mg）和137.3μmol/（min·mg）。与商业化的Aspergillus oryzae来源的β-半乳糖苷酶相比, BgalA在整个模拟人工胃液条件下均能稳定的存在,且重组BgalA对牛奶中的乳糖的水解率可达85.8%,而作为对照的A. oryzae来源的β-半乳糖苷酶在动态模拟人工胃液条件下对乳糖的水解率只能达到3.5%。综合以上实验结果:α-半乳糖苷酶AgalB和β-半乳糖苷酶BgalA不仅耐酸,而且对胃蛋白酶和胰蛋白酶都有很好的抗性,具有很好的工业应用前景。本研究为其将来的工业应用打下了良好的基础。
二、酵母α-半乳糖苷酶组成型表达基因的重组构建及转化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、酵母α-半乳糖苷酶组成型表达基因的重组构建及转化（论文提纲范文）
（1）嗜热烟曲霉HBHF5魔芋葡甘聚糖降解酶系解析及协同机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 绪论 |
| 1.1 甘露聚糖种类与结构 |
| 1.1.1 线性甘露聚糖 |
| 1.1.2 半乳甘露聚糖 |
| 1.1.3 葡甘露聚糖 |
| 1.1.4 半乳葡甘露聚糖 |
| 1.2 魔芋葡甘聚糖的应用 |
| 1.2.1 乳制品 |
| 1.2.2 面制食品 |
| 1.2.3 低脂肉制品 |
| 1.2.4 低热量食品 |
| 1.2.5 寡糖产品 |
| 1.2.6 食品保鲜 |
| 1.3 甘露聚糖降解酶 |
| 1.3.1 甘露聚糖酶 |
| 1.3.2 β-甘露糖苷酶 |
| 1.3.3 β-葡萄糖苷酶 |
| 1.3.4 α-半乳糖苷酶 |
| 1.3.5 乙酰甘露聚糖脂酶 |
| 1.4 甘露聚糖的协同降解进展 |
| 1.4.1 甘露聚糖酶之间的同质协同作用 |
| 1.4.2 甘露聚糖酶与甘露糖苷酶之间的同质协同作用 |
| 1.4.3 甘露聚糖酶与半乳糖苷酶之间的协同 |
| 1.4.4 甘露聚糖酶与半乳糖苷酶和甘露糖苷酶的协同 |
| 1.5 嗜热真菌与嗜热酶研究进展 |
| 1.5.1 嗜热真菌 |
| 1.5.2 嗜热酶 |
| 1.6 烟曲霉研究进展 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 1.8 要研究内容 |
| 1.8.1 酿酒大曲中嗜热真菌的筛选及降解魔芋葡甘聚糖能力评估 |
| 1.8.2 嗜热真菌魔芋葡甘露聚糖降解酶系组份研究 |
| 1.8.3 嗜热真菌魔芋葡甘露聚糖降解酶性质分析和协同研究 |
| 2 大曲中产嗜热甘露聚糖酶真菌的筛选及评估 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 大曲 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 引物、菌株与质粒 |
| 2.1.4 试剂与仪器 |
| 2.1.5 溶液 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 样品采集和处理 |
| 2.2.2 嗜热真菌的分离 |
| 2.2.3 菌株的保存 |
| 2.2.4 菌株的鉴定 |
| 2.2.5 菌株所产甘露聚糖酶的酶学特性评估 |
| 2.2.6 菌株酶解魔芋产物的分析 |
| 2.2.7 菌株HBHF5的生长曲线的测定 |
| 2.2.8 菌株HBHF5的糖苷水解酶表达谱分析 |
| 2.2.9 数据分析及处理 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 嗜热真菌的筛选 |
| 2.3.2 菌株的鉴定 |
| 2.3.3 甘露聚糖酶性能的评估 |
| 2.3.4 菌株HBHF5糖苷水解酶的性能评估 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 烟曲霉HBHF5在魔芋诱导下的组学分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株与培养基 |
| 3.1.2 主要试剂与设备 |
| 3.1.3 样品收集 |
| 3.1.4 转录组测序分析 |
| 3.1.5 非标记定量蛋白质组学(Label-free)分析 |
| 3.1.6 蛋白质组与转录组数据的联合分析 |
| 3.2 转录组测序及数据分析 |
| 3.2.1 转录组数据质量评价及比对分析 |
| 3.2.2 基因表达差异分析 |
| 3.2.3 差异表达基因的功能富集分析 |
| 3.2.4 差异表达的基因的CAZy分析 |
| 3.3 蛋白质组数据分析 |
| 3.3.1 样品蛋白浓度的测定 |
| 3.3.2 肽段特征与蛋白鉴定结果 |
| 3.3.3 分泌蛋白差异表达结果 |
| 3.3.4 差异蛋白的表达分析 |
| 3.4 差异表达基因和蛋白的关联分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 4 差异基因的克隆表达和酶学性质表征及协同作用分析 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 菌株、质粒和基因 |
| 4.1.2 引物合成和核酸序列分析 |
| 4.1.3 试剂和培养基 |
| 4.1.4 常用溶液 |
| 4.1.5 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 菌株总RNA的提取 |
| 4.2.2 c DNA基因的克隆 |
| 4.2.3 基因表达载体的构建 |
| 4.2.4 目的基因在毕赤酵母中的表达 |
| 4.2.5 酶蛋白分子生物信息学分析 |
| 4.2.6 重组酶的酶学性质分析 |
| 4.2.7 关键酶协同降解魔芋葡甘聚糖的测定 |
| 4.2.8 数据分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 重组酶AfMan5A的性质分析 |
| 4.3.2 重组酶AfMan5B的表达及性质分析 |
| 4.3.3 果胶裂解酶AfPly C的性质分析 |
| 4.3.4 重组酶AfPly A的表达及性质分析 |
| 4.3.5 重组酶AfChi的表达及性质分析 |
| 4.3.6 重组酶AfEn的表达及性质分析 |
| 4.3.7 重组酶Afhp的表达及性质分析 |
| 4.3.8 重组酶AfCDH的表达及性质分析 |
| 4.3.9 重组酶AfCel5A的表达及性质分析 |
| 4.3.10 重组酶AfCel5B的表达及性质分析 |
| 4.3.11 重组酶AfPGL的表达及性质分析 |
| 4.3.12 重组酶AfTan的表达及性质分析 |
| 4.3.13 重组酶AfSwol的表达及性质分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 总结与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（2）嗜热真菌埃默森篮状菌糖苷水解酶的功能解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 木质纤维素 |
| 1.2 糖苷水解酶 |
| 1.2.1 糖苷水解酶的家族分类 |
| 1.2.2 纤维素降解酶 |
| 1.2.3 木聚糖降解酶 |
| 1.2.4 阿拉伯聚糖降解酶 |
| 1.2.5 α-半乳糖苷酶和α-N-乙酰半乳糖苷酶 |
| 1.3 耐热酶与嗜热微生物 |
| 1.3.1 耐热酶 |
| 1.3.2 嗜热真菌的研究历史 |
| 1.4 埃默森篮状菌 |
| 1.4.1 埃默森篮状菌的发现 |
| 1.4.2 埃默森篮状菌的研究进展 |
| 1.5 论文立题依据及主要内容 |
| 第二章 埃默森篮状菌胞外糖苷水解酶的分析鉴定 |
| 2.1 材料方法 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 培养基及培养条件 |
| 2.1.3 主要试剂及仪器 |
| 2.1.4 实验方法与步骤 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 埃默森篮状菌在不同培养基上生长情况分析 |
| 2.2.2 埃默森篮状菌在不同碳源上的胞外产酶分析 |
| 2.2.3 埃默森篮状菌糖苷水解酶的质谱鉴定分析 |
| 2.3 本章小结 |
| 第三章 耐热α-半乳糖苷酶的酶学性质表征 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.1.1 菌株和质粒 |
| 3.1.2 引物 |
| 3.1.3 菌株及质粒保藏 |
| 3.1.4 培养基及培养条件 |
| 3.1.5 主要试剂和仪器 |
| 3.1.6 主要溶剂及缓冲液 |
| 3.1.7 α-半乳糖苷酶基因的克隆 |
| 3.1.8 α-半乳糖苷酶在毕赤酵母中的异源表达 |
| 3.1.9 异源表达酶的分离纯化 |
| 3.1.10 α-半乳糖苷酶的酶学性质表征 |
| 3.1.11 生物信息学分析 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 埃默森篮状菌α-半乳糖苷酶的生物信息学分析 |
| 3.2.2 埃默森篮状菌的半乳糖苷酶基因的克隆与异源表达 |
| 3.2.3 ReGal2的酶学性质研究 |
| 3.2.4 ReGal2降解豆粕中抗营养成分能力的分析 |
| 3.2.5 α-N-乙酰半乳糖苷酶ReGal4的酶学性质研究 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 阿拉伯聚糖降解酶Abn93和Abf2的酶学性质研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 菌株和质粒 |
| 4.1.2 引物 |
| 4.1.3 培养基及培养条件 |
| 4.1.4 主要试剂及仪器 |
| 4.1.5 埃默森篮状菌胞外阿拉伯聚糖降解酶的分离纯化及鉴定 |
| 4.1.6 阿拉伯聚糖降解酶的异源表达 |
| 4.1.7 纯化阿拉伯聚糖降解酶的酶学性质表征 |
| 4.1.8 外切阿拉伯聚糖酶水解模式的研究 |
| 4.1.9 SDS-PAGE分析 |
| 4.1.10 生物信息学分析 |
| 4.2 结果和讨论 |
| 4.2.1 埃默森篮状菌的阿拉伯聚糖降解酶基因的克隆和异源表达 |
| 4.2.2 Abf2的酶学性质研究 |
| 4.2.3 埃默森篮状菌胞外阿拉伯聚糖酶的分离纯化及鉴定 |
| 4.2.4 abn93的克隆和异源表达 |
| 4.2.5 Abn93的酶学性质研究 |
| 4.2.6 Abf2和Abn93协同水解阿拉伯聚糖 |
| 本章小结 |
| 第五章 耐热木聚糖酶Xyn10A的酶学性质表征 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 菌株和质粒 |
| 5.1.2 引物 |
| 5.1.3 培养基及培养条件 |
| 5.1.4 主要试剂及仪器 |
| 5.1.5 木聚糖降解酶的异源表达及纯化 |
| 5.1.6 纯化木聚糖降解酶的酶学性质表征 |
| 5.1.7 生物信息分析 |
| 5.2 结果与讨论 |
| 5.2.1 木聚糖降解酶基因的生物信息学分析 |
| 5.2.2 木聚糖降解酶基因的克隆和异源表达 |
| 5.2.3 Xyn10A的纯化及酶学性质表征 |
| 5.3 本章小结 |
| 全文总结和展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表和待发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）3种碱性α-半乳糖苷酶在黄瓜果实水苏糖分解中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 植物韧皮部卸载研究进展 |
| 1.1.1 植物韧皮部卸载途径 |
| 1.1.1.1 植物共质体卸载途径 |
| 1.1.1.2 植物质外体卸载途径 |
| 1.1.1.3 植物共质体与质外体协同卸载途径 |
| 1.1.2 植物韧皮部卸载途径研究方法 |
| 1.1.2.1 电镜观察法 |
| 1.1.2.2 荧光染料示踪法 |
| 1.1.2.3 绿色荧光蛋白示踪法 |
| 1.2 化学诱导表达系统 |
| 1.2.1 化学诱导表达系统的原理及特征 |
| 1.2.2 化学诱导表达系统类型 |
| 1.2.2.1 四环素类诱导表达系统 |
| 1.2.2.2 类固醇类诱导表达系统 |
| 1.2.2.3 地塞米松诱导和四环素抑制系统 |
| 1.2.2.4 乙醇诱导表达系统(alc系统) |
| 1.2.2.5 铜离子诱导表达系统 |
| 1.3 XVE化学诱导激活系统的应用 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 第2章 黄瓜CsAGA3化学诱导RNAi载体的构建及转化后验证 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 试验材料 |
| 2.1.1.2 培养基 |
| 2.1.1.3 试验仪器 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 RNAi载体构建思路 |
| 2.1.2.2 黄瓜总RNA的提取及完整性检验 |
| 2.1.2.3 RNAi干扰片段选择与引物设计 |
| 2.1.2.4 RT-PCR法获得CsAGA3正向片段和反向片段 |
| 2.1.2.5 正向片段的回收,酶切,连接和转化 |
| 2.1.2.6 重组质粒的提取,验证和测序 |
| 2.1.2.7 反向目的片段的回收,酶切,连接和转化 |
| 2.1.2.8 反向片段重组质粒的提取,验证和测序 |
| 2.1.2.9 RNAi片段连入pX6载体 |
| 2.1.2.10 将RNAi载体转入农杆菌 |
| 2.1.2.11 CsAGA3 RNAi载体的黄瓜遗传转化 |
| 2.1.2.12 转化鉴定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 黄瓜总RNA完整性 |
| 2.2.2 CsAGA3正向片段扩增结果 |
| 2.2.3 CsAGA3正向片段连接结果 |
| 2.2.4 CsAGA3反向片段扩增结果 |
| 2.2.5 CsAGA3反向片段连接结果 |
| 2.2.6 CsAGA3 RNAi片段测序检测 |
| 2.2.7 CsAGA3 RNAi转基因黄瓜材料的获取 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 17-β-雌二醇诱导黄瓜不同部位RNAi方法的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 CsAGA2引物设计 |
| 3.1.2.2 黄瓜基因组DNA的提取 |
| 3.1.2.3 黄瓜叶片、叶柄和果柄RNA的提取及完整性检验 |
| 3.1.2.4 反转录和qPCR方法 |
| 3.1.2.5 农杆菌介导的黄瓜遗传转化 |
| 3.1.2.6 转化鉴定 |
| 3.1.2.7 17-β-雌二醇的配置 |
| 3.1.2.8 17-p-雌二醇的使用 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 喷施法处理下黄瓜叶片中CsAGA2基因表达水平的测定 |
| 3.2.2 包裹法处理下黄瓜叶柄中CsAGA2基因表达水平的测定 |
| 3.2.3 包裹法处理下黄瓜果柄中CsAGA2基因表达水平的测定 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 3种CsAGA在黄瓜果实水苏糖分解中的作用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 RNAi黄瓜果实果柄处CsAGAs表达特异性研究 |
| 4.2.2 17-β-雌二醇包裹处理后果把中糖含量研究 |
| 4.2.3 17-β-雌二醇包裹果柄处理下黄瓜果实果长和果径调查 |
| 4.2.4 17-β-雌二醇包裹果柄处理下黄瓜果实干鲜重调查 |
| 4.3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（4）胡萝卜软腐果胶杆菌苎麻脱胶增效的关键酶及应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 苎麻韧皮及结构成分 |
| 1.2 苎麻韧皮脱胶研究进展 |
| 1.3 苎麻生物脱胶关键酶研究进展 |
| 1.4 苎麻脱胶菌株研究进展 |
| 1.5 本文研究意义及主要内容 |
| 2 P.carotovorum HG-49 苎麻脱胶增效的关键酶高效表达、酶特性及其应用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.3 本章小结 |
| 3 P.carotovorum HG-49 内源关键酶的筛选及其与HG-49 联合脱胶性能评价 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.3 本章小结 |
| 4 P.carotovorum HG-49 内源葡甘聚糖酶Cel5M的酶特性分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.3 本章小结 |
| 5 葡甘聚糖酶Cel5M的同源表达工程菌构建及应用 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果与讨论 |
| 5.3 本章小结 |
| 6 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 主要创新点 |
| 6.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读博士学位期间完成论文和专利情况 |
（5）海洋硫氧化菌Thioclava分类鉴定及其硫氧化机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题来源及研究背景 |
| 1.1.1 课题来源 |
| 1.1.2 研究背景 |
| 1.2 Thioclava研究进展 |
| 1.2.1 Thioclava分类研究 |
| 1.2.2 Thioclava环境分布研究 |
| 1.2.3 Thioclava功能研究 |
| 1.3 细菌分类方法研究进展 |
| 1.3.1 16 S rRNA基因研究 |
| 1.3.2 单个看家基因研究 |
| 1.3.3 多位点序列分析研究 |
| 1.3.4 dDDH和 ANI研究 |
| 1.4 细菌多相分类学研究进展 |
| 1.4.1 经典分类学研究 |
| 1.4.2 细菌多相分类学研究 |
| 1.4.3 基因组分类研究 |
| 1.5 细菌硫氧化研究进展 |
| 1.5.1 硫元素生物地球化学循环研究 |
| 1.5.2 硫氧化细菌种类研究 |
| 1.5.3 细菌硫氧化途径研究 |
| 1.5.4 硫氧化细菌应用研究 |
| 1.6 本文研究目的和意义 |
| 1.7 本文研究内容 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株来源 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.1.4 溶液 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.1.6 分析软件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Thioclava培养和保藏 |
| 2.2.2 MLSA方法建立 |
| 2.2.3 分类和系统发育分析 |
| 2.2.4 基因组序列测序和分析 |
| 2.2.5 Thioclava多相分类学鉴定 |
| 2.2.6 菌株MCCC 1A07302~T硫氧化特性鉴定 |
| 2.2.7 菌株MCCC 1A07302~T硫氧化途径推测 |
| 2.2.8 菌株MCCC 1A07302~T碳氮硫代谢途径和电子传递链推测 |
| 2.2.9 菌株MCCC 1A07302~T硫氧化途径相关基因RT-PCR验证 |
| 2.2.10 菌株MCCC 1A07302~T转录组测序和分析 |
| 第3章 Thioclava属细菌分类鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 Thioclava菌株分类 |
| 3.2.1 16S rRNA基因分析 |
| 3.2.2 单个看家基因分析 |
| 3.2.3 Thioclava菌株MLSA分析 |
| 3.2.4 代表菌株dDDH和 ANI分析 |
| 3.3 Thioclava三个新种鉴定 |
| 3.3.1 形态学特征鉴定 |
| 3.3.2 生理特征鉴定 |
| 3.3.3 生化特征鉴定 |
| 3.3.4 基因型特征鉴定 |
| 3.3.5 菌株保藏 |
| 3.3.6 新种描述 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 T.nitratireducens MCCC1A07302~T基因组和硫氧化特性及途径分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 菌株MCCC 1A07302~T基因组特征分析 |
| 4.2.1 基本特征分析 |
| 4.2.2 COG功能归类分析 |
| 4.2.3 重复序列和基因岛分析 |
| 4.2.4 前噬菌体分析和CRISPR预测 |
| 4.3 菌株MCCC 1A07302~T硫氧化特性鉴定 |
| 4.3.1 标准曲线建立 |
| 4.3.2 硫氧化特性确定 |
| 4.4 菌株MCCC 1A07302~T硫氧化途径分析 |
| 4.4.1 硫化物氧化分析 |
| 4.4.2 单质硫氧化分析 |
| 4.4.3 硫代硫酸盐氧化分析 |
| 4.4.4 亚硫酸盐氧化分析 |
| 4.5 菌株MCCC 1A07302~T其它途径分析 |
| 4.5.1 同化硫酸盐还原途径分析 |
| 4.5.2 硫转运基因分析 |
| 4.5.3 DMSP降解相关基因分析 |
| 4.5.4 碳代谢相关基因分析 |
| 4.5.5 氮代谢相关基因分析 |
| 4.5.6 电子传递链分析 |
| 4.5.7 碳氮硫共代谢网络分析 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 T.nitratireducens MCCC1A07302~T硫氧化基因确认和硫氧化途径构建 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 菌株MCCC 1A07302~T硫氧化相关基因RT-PCR验证 |
| 5.2.1 引物特异性和扩增效率检测 |
| 5.2.2 RNA提取 |
| 5.2.3 硫氧化相关基因RT-PCR分析 |
| 5.3 菌株MCCC 1A07302~T硫氧化和其它代谢途径转录分析 |
| 5.3.1 硫氧化相关基因转录分析 |
| 5.3.2 硫转运相关基因转录分析 |
| 5.3.3 硫氧化途径建立 |
| 5.3.4 同化硫酸盐还原相关基因转录分析 |
| 5.3.5 反硝化途径相关基因转录分析 |
| 5.3.6 电子传递链相关基因转录分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的论文及其它成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）基于转录元件的巴斯德毕赤酵母高效启动子构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 毕赤酵母生理特性 |
| 1.1.1 甲醇代谢途径与特点 |
| 1.1.2 蛋白分泌途径 |
| 1.1.3 翻译后修饰 |
| 1.2 甲醇代谢相关基因及调控特点 |
| 1.2.1 aox1和aox2 |
| 1.2.2 das |
| 1.2.3 fld1 |
| 1.3 aox1启动子相关转录因子与顺式作用元件及其调控机制 |
| 1.3.1 aox1启动子相关转录调控因子 |
| 1.3.2 aox1启动子顺式作用元件 |
| 1.4 合成启动子研究进展 |
| 1.4.1 真核生物合成启动设计与研究进展 |
| 1.4.2 酵母中合成启动子研究进展 |
| 1.5 锌指人工转录因子及研究进展 |
| 1.5.1 真核生物锌指人工转录因子及研究进展 |
| 1.5.2 酵母中人工转录因子研究进展 |
| 1.6 论文立题依据及研究内容 |
| 第二章 转录因子Mxr1和Mit1过表达对aox1启动子活性的影响 |
| 2.1 材料方法 |
| 2.1.1 菌种和质粒 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 试剂仪器 |
| 2.1.4 培养基及培养条件 |
| 2.1.5 常规分子生物学方法 |
| 2.1.6 实验具体操作方法 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 毕赤酵母转录调控因子Mxr1与Mit1序列与结构分析 |
| 2.2.2 毕赤酵母过表达菌株OEMit1与OEMxr1的构建及验证 |
| 2.2.3 过表达菌株OEMxr1表型检测 |
| 2.2.4 Mxr1突变体过表达对aox1启动子转录活性的影响 |
| 2.2.5 过表达菌株OEMit1表型检测 |
| 本章小结 |
| 第三章 毕赤酵母aox1启动子元件改造及其对启动子活性的影响 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.1.1 菌种和质粒 |
| 3.1.2 引物 |
| 3.1.3 试剂仪器 |
| 3.1.4 培养基及培养条件 |
| 3.1.5 具体实验操作 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 Nrg1结合位点突变对aox1启动子功能的影响 |
| 3.2.2 5'端增加正转录调控元件拷贝数对aox1启动子转录活性的影响 |
| 3.2.3 aox1改造启动子分泌表达α-半乳糖苷酶 |
| 本章小结 |
| 第四章 毕赤酵母中基于人工转录因子和合成启动子的表达系统构建 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 菌株及质粒 |
| 4.1.2 引物 |
| 4.1.3 试剂及仪器 |
| 4.1.4 培养条件 |
| 4.1.5 具体实验操作 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 毕赤酵母人工转录因子和合成启动子的表达系统构建及表型检测 |
| 4.2.2 酿酒中人工转录因子设计优化与表型检测 |
| 4.2.3 酿酒酵母中合成启动子优化设计与表型检测 |
| 本章小结 |
| 全文总结与展望 |
| 附录论文涉及的合成基因信息 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（7）基于α-半乳糖苷酶基因为筛选标记的酿酒酵母诱导型表达载体的构建及应用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株与载体 |
| 1.2 培养基及培养条件 |
| 1.3 引物设计及载体构建 |
| 1.4 以α-半乳糖苷酶基因为标记筛选转化子 |
| 1.5 β-1, 3-1, 4-葡聚糖酶活性鉴定 |
| 1.6 摇瓶发酵及酶活性测定 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 表达质粒的构建 |
| 2.2 α-半乳糖苷酶对阳性转化子的筛选 |
| 2.3 β-葡聚糖酶阳性转化子平板鉴定 |
| 2.4 摇瓶发酵酶活性测定 |
| 3 结 论 |
（8）一株产α-半乳粮苷酶细菌的筛选、鉴定及酶基因克隆分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 α-半乳糖苷酶研究进展 |
| 1.1 α-半乳糖苷酶催化特性概述 |
| 1.2 α-半乳糖苷酶来源于分类 |
| 1.3 α-半乳糖苷酶分子特性概述 |
| 2 α-半乳糖苷酶的应用 |
| 2.1 α-半乳糖苷酶与饲料工业 |
| 2.2 α-半乳糖苷酶与医疗工业 |
| 2.3 α-半乳糖苷酶与制糖工业 |
| 3 研究的目的及意义 |
| 4 本研究技术路线图 |
| 第二章 产α-半乳糖苷酶细菌的筛选与鉴定 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 菌株及质粒 |
| 1.3 试剂及试剂盒 |
| 1.4 培养基 |
| 2 方法 |
| 2.1 菌株的筛选 |
| 2.2 菌株鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 产α-半乳糖苷酶菌株的筛选与显微观察 |
| 3.2 菌株基于16S rDNA的分子鉴定 |
| 4 关于细菌分类方法的讨论 |
| 第三章 产α-半乳糖苷酶细菌的酶学特性分析 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 培养基 |
| 2 方法 |
| 2.1 酶活的测定 |
| 2.2 不同温度和pH对α-半乳糖苷酶活性的影响 |
| 2.3 细菌酶基因的表达调控分析 |
| 2.4不同浓度棉籽糖诱导下酶基因表达的SDS一PAGE检测分析 |
| 2.5不同浓度的葡萄糖、棉籽糖对菌株产a一半乳糖普酶的影响 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 对硝基酚标准曲线的绘制 |
| 3.2 温度和pH对酶活性的影响 |
| 3.3 不同浓度棉籽糖诱导下酶与底物作用显色反应分析 |
| 3.4 不同浓度的棉籽糖诱导对菌株产酶基因表达的SDS-PAGE检测 |
| 3.5 不同浓度的棉籽糖、葡萄糖对菌株分泌α-半乳糖苷酶影响 |
| 4 讨论 |
| 第四章 乳球菌α-半乳糖苷酶基因的克隆与分析 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 菌株及质粒 |
| 1.2 工具酶与试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 乳球菌基因组DNA的大量提取 |
| 2.2 目的片段的制备 |
| 2.3 pUC19载体的制备 |
| 2.4 目的片段与载体最佳连接比例的确定 |
| 2.5 连接产物的转化 |
| 2.6 阳性克隆的筛选 |
| 2.7 阳性克隆的鉴定 |
| 2.8 α-半乳糖苷酶基因的生物信息学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 细菌基因组DNA不完全酶切条件的确定 |
| 3.2 载体的制备 |
| 3.3 阳性克隆的筛选与鉴定 |
| 3.4 阳性克隆生物信息学分析 |
| 4 讨论 |
| 第五章 总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）热稳定α-半乳糖苷酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及酶学性质研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材 料 |
| 1.2 α-半乳糖苷酶基因aga的重组表达 |
| 1.2.1 重组表达载体的构建 |
| 1.2.2 毕赤酵母的电击转化及筛选 |
| 1.3 α-半乳糖苷酶酶学性质研究 |
| 1.3.1 酶活力测定 |
| 1.3.2 蛋白含量和表观分子量测定 |
| 1.3.3 等电点测定 |
| 1.3.4 最适pH和pH稳定性的测定 |
| 1.3.5 最适反应温度和热稳定性的测定 |
| 1.3.6 底物特异性和动力学常数的测定 |
| 1.3.7 各种化学物质对酶活力的影响 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 分泌型重组表达载体pPICZαA-aga的构建和鉴定 |
| 2.2 重组载体pPICZαA-aga在毕赤酵母的转化和筛选 |
| 2.3 重组蛋白的甲醇诱导表达和分离纯化 |
| 2.4 重组蛋白的酶学性质分析 |
| 2.4.1 分子量和等电点 |
| 2.4.2 最适反应温度和热稳定性 |
| 2.4.3 最适pH和pH稳定性 |
| 2.4.4 动力学常数 |
| 2.4.5 各种化学物质对酶活的影响 |
| 3 讨 论 |
（10）来源于嗜酸真菌Bispora sp. MEY-1的α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 α-半乳糖苷酶的研究进展 |
| 1.1.1 α-半乳糖苷酶的来源 |
| 1.1.2 α-半乳糖苷酶的诱导 |
| 1.1.3 α-半乳糖苷酶的性质 |
| 1.1.4 α-半乳糖苷酶的分子特性 |
| 1.1.5 α-半乳糖苷酶的底物特异性 |
| 1.1.6 α-半乳糖苷酶的应用 |
| 1.2 β-半乳糖苷酶的研究进展 |
| 1.2.1 β-半乳糖苷酶概述 |
| 1.2.2 β-半乳糖苷酶的性质 |
| 1.2.3 β-半乳糖苷酶的基因克隆与表达 |
| 1.2.4 β-半乳糖苷酶的结构 |
| 1.2.5 β-半乳糖苷酶的应用 |
| 1.3 毕赤酵母表达系统 |
| 本研究的目的和意义 |
| 第二章 来源于嗜酸真菌Bispora sp. MEY-1 的三个α-半乳糖苷酶基因的克隆、表达及性质研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 引物合成 |
| 2.1.3 试剂盒、工具酶和生化试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 培养基及主要溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 α-半乳糖苷酶基因AgalB 和AgalC 的克隆 |
| 2.2.2 三个α-半乳糖苷酶基因AgalA, AgalB, AgalC 在毕赤酵母中的表达 |
| 2.2.3 三个重组α-半乳糖苷酶的纯化及脱糖基化处理 |
| 2.2.4 三个重组α-半乳糖苷酶的酶学性质测定 |
| 2.2.5 嗜酸真菌 Bispora sp. MEY-1 来源的 AgalB 和 Man5A 协同作用实验 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 α-半乳糖苷酶基因AgalB 和AgalC 的克隆 |
| 2.3.2 α-半乳糖苷酶基因AgalA, AgalB, AgalC 在毕赤酵母中的表达 |
| 2.3.3 α-半乳糖苷酶AgalA, AgalB, AgalC 的纯化 |
| 2.3.4 α-半乳糖苷酶AgalA, AgalB, AgalC 的酶学性质分析 |
| 2.3.5 嗜酸真菌 Bispora sp. MEY-1 来源的 AgalB 和 Man5A 共作用降解实验 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 来源于嗜酸真菌Bispora sp. MEY-1 的β-半乳糖苷酶基因的表达及性质研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株和质粒 |
| 3.1.2 引物合成 |
| 3.1.3 试剂盒、工具酶和生化试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 培养基及有关溶液的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 真核表达载体pPIC9-BgalA 的构建 |
| 3.2.2 β-半乳糖苷酶基因BgalA 在毕赤酵母中的表达 |
| 3.2.3 β-半乳糖苷酶BgalA 的纯化 |
| 3.2.4 β-半乳糖苷酶BgalA 的酶学性质测定 |
| 3.2.5 嗜酸真菌Bispora sp. MEY-1 来源的BgalA 在模拟人工胃液条件下水解牛奶实验 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 真核表达载体pPIC9-BgalA 的构建 |
| 3.3.2 β-半乳糖苷酶基因BgalA 在毕赤酵母中的表达 |
| 3.3.3 β-半乳糖苷酶BgalA 的纯化 |
| 3.3.4 β-半乳糖苷酶BgalA 的酶学性质测定 |
| 3.3.5 嗜酸真菌Bispora sp. MEY-1 来源的BgalA 与商业乳糖酶在模拟人工胃液条件下水解牛奶实验 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、酵母α-半乳糖苷酶组成型表达基因的重组构建及转化（论文参考文献）
- [1]嗜热烟曲霉HBHF5魔芋葡甘聚糖降解酶系解析及协同机制研究[D]. 谷新晰. 东北农业大学, 2021
- [2]嗜热真菌埃默森篮状菌糖苷水解酶的功能解析[D]. 安建鲁. 山东大学, 2021(11)
- [3]3种碱性α-半乳糖苷酶在黄瓜果实水苏糖分解中的作用[D]. 张金吉. 扬州大学, 2021
- [4]胡萝卜软腐果胶杆菌苎麻脱胶增效的关键酶及应用研究[D]. 王亚伟. 华中科技大学, 2019(01)
- [5]海洋硫氧化菌Thioclava分类鉴定及其硫氧化机制研究[D]. 刘阳. 哈尔滨工业大学, 2018(01)
- [6]基于转录元件的巴斯德毕赤酵母高效启动子构建[D]. 吴伟平. 山东大学, 2018(02)
- [7]基于α-半乳糖苷酶基因为筛选标记的酿酒酵母诱导型表达载体的构建及应用[J]. 张伟,郭钦,阮辉,何国庆. 浙江大学学报(农业与生命科学版), 2012(01)
- [8]一株产α-半乳粮苷酶细菌的筛选、鉴定及酶基因克隆分析[D]. 周晶辉. 湖南农业大学, 2011(04)
- [9]热稳定α-半乳糖苷酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及酶学性质研究[J]. 李荷,游娟,顾取良,杨红. 中国生物工程杂志, 2010(07)
- [10]来源于嗜酸真菌Bispora sp. MEY-1的α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶的研究[D]. 王慧. 中国农业科学院, 2010(01)