一、H7亚型禽流感病毒血凝素基因的真核表达载体的构建及鉴定（论文文献综述）
赵江艳[1]（2021）在《H7N9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的生物学特性与保护效力评价》文中认为H7N9亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）于2013年首次在中国东部长三角地区出现,至今共导致五波人感染事件。其中,第五波流行造成的感染人数最多,并且出现了高致病性变异病毒,对养殖业也造成了巨大损失。根据联合国粮农组织（Food and Agriculture Organization,FAO）的数据显示,目前已有1568例实验室确诊的人感染H7N9亚型AIV的病例,616例死亡,死亡率高达40%,对公共卫生构成了重大威胁。H7N9亚型AIV已被证明具有引起流感大流行的潜力,因此研制高效的抗病毒制剂对于防控H7N9亚型禽流感的大流行具有重要意义。此外,由于疫苗的免疫压力以及流感病毒频繁的基因重配,H7N9亚型AIV在基因水平与抗原性上已发生了显着变异,且病毒已经很好地适应了鸭子这一流感病毒的“天然储库”,为病毒继续变异提供了条件。因此,研究病毒的抗原表位特征对于H7N9亚型禽流感疫苗与抗病毒制剂的研制及优化具有重要的参考意义。近年来,单克隆抗体（简称单抗）（Monoclonal antibody,mAb）制剂已成为人重大病毒性传染病防治的重要手段,也是进行病毒抗原性研究的有力工具。因此,本研究对H7N9亚型AIV血凝素（Hemagglutinin,HA）特异性单抗的生物学活性及其在小鼠模型中对H7N9病毒感染的保护效力进行评价,鉴定了单抗识别的抗原表位,并选择其中1株广谱反应性单抗建立了重组抗体表达的方法。本研究筛选了 1株对H7N9亚型AIV具有较强中和活性的单抗,在小鼠模型中对H7N9病毒的致死性感染具有较高的保护效力;鉴定了 HA蛋白中3个新的抗原表位,其中识别HA茎部保守表位的单抗对group 1和group 2的不同亚型流感病毒具有很广的交叉反应谱;测定了该广谱反应性抗体的可变区基因序列,建立了亚类转换重组抗体的表达方法,实现了单抗亚类由IgG1至IgG2a的转换,为后续抗体保护效力的优化奠定了基础。研究结果为H7N9亚型AIV的抗病毒治疗提供了候选单抗,为深入理解H7N9 HA蛋白的抗原表位特征提供了新的信息。1.H7N9亚型禽流感病毒HA单克隆抗体的生物学活性鉴定前期研究制备了 4 株针对 H7N9 病毒（A/chicken/Guangdong/GD15/2016,GD15）HA蛋白的单抗（1A1 1D7、1B10 1D1、4B7 4D5、5D3 1B5）,为了系统评估它们的生物学活性,测定了抗体对GD15株的血凝抑制（Hemagglutination inhibition,HI）活性、病毒中和活性（Virus neutralization,VN）以及与HA蛋白的结合特性。结果显示,4株单抗与HA蛋白的反应性均较强,能够有效识别杆状病毒系统表达的重组HA蛋白以及H7N9病毒感染MDCK细胞中表达的HA蛋白。其中,4B7 4D5对H7N9病毒具有较强的HI与VN活性,HI效价为8 log2,VN效价为1:5120。4B7 4D5仅与H7亚型AIV反应,具有较强的亚型特异性。另外3株单抗既没有HI活性,也没有VN活性,但对不同亚型流感病毒具有交叉反应性:1A1 1D7、1B10 1D1与H7、H15亚型反应,而5D3 1B5则与group 1和group 2中不同亚型的流感病毒具有广谱反应性。因此,对H7N9亚型AIV HA蛋白特异性单抗的生物学活性及交叉反应性进行了系统分析,为后续抗体的表位筛选与体内效力评价奠定了基础。2.H7N9亚型禽流感病毒HA单克隆抗体的保护效力评价本研究基于BALB/c小鼠模型,采用被动免疫的方式评估4株单抗针对H7N9病毒感染的保护效力。选用1株经小鼠体内连续传11代的H7N9鼠适应株（JTC4 M11）为攻毒株。首先,进行预防性保护试验评价抗体保护性,结果表明,未免疫小鼠于JTC4 M11感染后短时间内出现体重迅速下降,表现严重的临床症状,于攻毒后14天内全部死亡;1A1 1D7和5D3 1B5的各剂量均不能提供保护,而1B10 1D1（10、20、30 mg/kg）和4B7 4D5（5、10、20、30mg/kg）均能够对H7N9病毒感染提供100%的保护率。虽然1B10 1D1处理的小鼠在H7N9病毒感染后不死亡,但是肺脏与鼻甲骨的病毒分离率较高,肺脏表现明显的炎性损伤;而4B7 4D5处理组的病毒分离率显着低于对照和1B101D1处理组,肺脏病理损伤轻微,具有良好的保护作用。接着评价4B7 4D5对H7N9病毒感染小鼠的治疗保护性效果,结果显示,高剂量的4B7 4D5（30 mg/kg）在感染后12 h可提供对H7N9病毒攻击100%的保护;但是在感染后24h施用抗体,相同剂量的单抗仅能提供40%的保护率。以上结果说明,4B7 4D5在预防性与早期（12 h）治疗性保护试验中能够提供针对H7N9病毒感染的高效保护,具有较好的应用潜力。3.H7N9亚型禽流感病毒HA单克隆抗体的抗原表位鉴定解析HA蛋白的抗原表位特征是了解H7N9亚型AIV抗原变异的关键,也是研制疫苗与抗病毒单抗制剂的重要基础。本研究以3株单抗（1B10 1D1、4B7 4D5、5D3 1B5）作为研究对象,采用基于多肽的ELISA、噬菌体表面展示随机多肽文库筛选以及免疫逃逸筛选的方法鉴定了 HA蛋白中3个新的抗原表位,并用生物信息学方法分析了表位的保守性与空间定位。用免疫逃逸方法鉴定中和单抗4B7 4D5识别的抗原表位,发现筛选的免疫逃逸株与4B7 4D5的HI滴度相较母本病毒（GD15）下降8倍,HA基因含有G151R/E与I335V突变。用定点突变方法向HA蛋白引入G151E与I335V的突变,仅含有G151E突变的重组H7N9病毒与4B7 4D5的HI及VN反应性显着降低,说明4B7 4D5识别表位的关键氨基酸为HA蛋白G151位点。此外,用基于多肽的ELISA与噬菌体表面展示随机多肽文库筛选,鉴定5D3 1B5识别的表位是位于HA茎部的431W-433Y-437L基序,1B10 1D1则识别位于HA头部的220Q-225S-227G基序。将鉴定的抗原表位进行突变均显着降低H7N9病毒与对应单抗的反应性。抗原保守性与定位分析表明,4B7 4D5识别的G151位点位于HA头部抗原位点A（Antigenic site A）中,在H7亚型AIV中高度保守;1B10 1D1识别的表位位于HA头部受体结合位点附近220-loop中,在不同亚型流感病毒之间变异性较大;而5D3 1B5针对的表位位于HA茎部C-螺旋区,在不同亚型病毒之间高度保守。因此,本研究鉴定了 HA蛋白中3个新的抗原表位,其中2个位于头部,1个位于茎部,为认识H7N9亚型AIV HA蛋白的抗原表位特征提供了新的信息。4.5D3 1B5亚类转换嵌合抗体表达的初步研究5D3 1B5对group 1和group 2不同亚型流感病毒具有很广的交叉反应谱,但是该抗体为IgG1亚类,且不具有VN活性,对H7N9病毒感染没有保护效力。研究表明,非中和抗体能够通过可结晶片段（Fragment crystalizable,Fc）依赖的免疫效应提供保护,而抗体与免疫效应细胞表面Fc受体（Fc receptor,FcR）的亲和力是其保护力的重要决定因素。鼠源IgG2a亚类与FcR的亲和力最高,而IgG1亚类与FcR的亲和力最低。因此,本研究拟将5D3 1B5的亚类转换为IgG2a,旨在提升抗体的保护效力。首先,测定了 5D3 1B5重链可变区（Variable region of the heavy chain,VH）与轻链可变区（Variable region of the light chain,VL）的编码基因序列,定位了可变区中互补决定区（Complementarity-determining region,CDR）并分析了其与HA蛋白的分子对接特性。其次,将VH与VL基因克隆至已含有鼠源IgG2a恒定区的表达载体中,构建了嵌合抗体的表达载体。质粒共转染至中国仓鼠卵巢细胞（CHO）,用ELISA、IFA与免疫印迹鉴定了抗体的表达,且抗体亚类由IgG1转变为IgG2a,嵌合抗体与H7N9 HA蛋白的反应性与母本抗体（5D3 1B5）相同。本研究建立了鼠源重组抗体的表达方法,实现了抗体亚类由IgG1向IgG2a的转换,为后续抗体效力的优化提供了技术支持。
孙兰[2]（2020）在《H9N2亚型禽流感病毒HA和NP蛋白单克隆抗体的制备及在抗原变异分析中的初步应用》文中研究说明H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）自首次分离至今,已在全世界各地造成了广泛的传播。在国内,H9N2亚型AIV呈地方性流行且传播范围广,不但给养殖业造成巨大的经济损失,也给公共卫生安全造成潜在的威胁。在免疫压力和抗原漂移作用下,AIV容易发生抗原变异,最终导致免疫失败。因此研发针对H9N2亚型AIV较为理想的单抗对H9亚型AIV监测和诊断有重要的意义。1.H9N2亚型禽流感病毒HA和NP基因的克隆及表达选取 H9N2 AIV 流行株 A/Chicken/Taixing/10/2010（简称 rTX）和疫苗株A/Chicken/Shanghai/F/98（简称F98）作为研究对象,通过PCR分别扩增其HA基因和NP基因,将其克隆到真核表达载体PCAGGS上,成功构建出重组质粒PCAGGS-rTX-HA、PCAGGS-F98-HA 和 PCAGGS-rTX-NP。然后将其转染入 293T 细胞,通过间接免疫荧光试验（Indirect immunofluorescence assay,IFA）和蛋白印迹试验（Western blot,WB）检测确定HA和NP蛋白均在体外正确表达,成功制备出用于制备单克隆抗体的免疫原。此外,通过将PCAGGS-rTX-NP进行双酶切获得的NP片段连接pET-32a上,构建原核重组质粒pET32a-rTX-NP,利用Roestta（DE3）进行优化表达,获得分子量约为73 KD的可溶性rNP,以作为下一步制备针对rTX毒株NP蛋白单克隆抗体的筛选原。2.H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备及在抗原变异分析中的初步应用将重组质粒PCAGGS-rTX-HA和PCAGGS-F98-HA通过肌肉注射结合基因导入仪刺激的方式免疫6-8周龄BALB/c小鼠,三免后腹腔注射灭活病毒进行加强免疫,3天后取其脾细胞制备杂交瘤细胞。通过血凝抑制（Hemagglutination inhibition,HI）试验和IFA对融合孔进行筛选,经过3次亚克隆后最终获得6株单克隆抗体,其中有4株为针对rTX HA蛋白的单抗,分别命名为1B9、1C10、3E2和2D6;有2株为针对F98 HA蛋白的单抗,分别命名为1B2和1F10。抗体亚类鉴定结果显示,1B9、1C10和3E2的亚类均为IgM,2D6的亚类为IgG2a,1B2和1F10的亚类为IgG1;6株单抗腹水HI效价较高,均在210-215之间;IFA检测结果显示,单抗1B2和1F10对毒株F98产生特异性荧光,其余的单抗对毒株rTX产生特异性荧光;Western-blot试验结果显示,单抗1B2和1F10对毒株F98有特异性反应,其余的单抗都对毒株rTX有特异性反应,条带大小均为75KD;中和试验结果显示,单抗2D6、1B2和1F10都具有中和特性,其中1F10的中和效价最高;单抗特异性和广谱性鉴定结果显示,6株抗HA蛋白单抗只与H9亚型AIV有反应,而与其他亚型AIV和NDV无反应性,表明具有良好的特异性,其中有4株单抗对H9N2 AIV的反应谱较好;6株单抗对2017-2019年实验室分离株HI和IFA检测结果显示,有37.1%（10/27）的H9N2 AIV分离株与4株抗Y280-like代表株HA蛋白的单抗所识别的表位存在抗原差异性,有22.26%（6/27）的H9N2 AIV分离株获得了与抗F98毒株HA蛋白单抗识别表位类似的抗原位点。因此,这些单抗可用于流行株的抗原差异性分析,且近3年的流行株已发生了较大的抗原变异。3.H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体的制备和鉴定将重组质粒PCAGGS-rTX-NP免疫小鼠进行单克隆抗体的制备。细胞融合10 d后,通过酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）和EFA筛选阳性杂交瘤细胞。经过3次亚克隆后最终获得6株单克隆抗体,分别命名为1B4、1E50、2E10、3A9、8F10和3E6。抗体亚类鉴定结果显示,2E10、3A9和1B4的亚类均为IgG2a,1E50的亚类为IgG1,3E6和8F10的亚类为IgM;采用ELISA试验对单抗腹水效价进行检测,效价在1:25600-1:204800之间;IFA试验结果表明6株单抗中只有3E6和8F10与rTX毒株有特异性的荧光反应;特异性试验结果表明单抗3E6、8F10、2E10和1B4这4株单抗不与NDV和IBV发生反应,具有良好的的特异性,单抗3A9和1E50的特异性不佳;广谱性鉴定结果表明单抗3E6、8F10和2E10的广谱性较好,除了不与H5N1亚型发生反应,与H9N2、H5N6和H7亚型的AIV都有很好的反应,而单抗1B4、3A9和1E50广谱性较差,只与部分H9N2亚型AIV和毒株W1-8（H7亚型）反应。综上所述,单抗3E6、8F10和2E10综合特性较好,在AIV流行病学调查等方面有一定的应用价值。
孟薇[3]（2020）在《表面展示禽流感病毒抗原酿酒酵母菌株的构建及其生物学特性研究》文中研究指明禽流感是由禽流感病毒（Avian Influenza Virus,AIV）引起的一种急性呼吸道传染性疾病,对养禽业危害极大。禽类感染AIV后表现为不同程度的呼吸道症状、产蛋率下降,甚至全身性疾病,该病具有较高的发病率和死亡率。目前,疫苗接种是预防和控制禽流感的主要策略。禽流感病毒血清型多、易突变,存在灭活苗免疫后带毒感染等问题。研制可激发黏膜免疫的广泛交叉保护性疫苗,例如在不同血清型间变异较大、提供主要保护性抗原表位的血凝素（Hemagglutinin,HA）头部区设计疫苗,或在不同流感病毒亚型间相对保守、能产生广泛交叉保护的HA茎部区设计疫苗,均是基因工程通用流感疫苗研发的一个有效策略。酿酒酵母表面展示系统是一种固定化表达外源蛋白的真核展示系统,是将外源基因序列与特定的载体基因序列相融合后导入酵母细胞,利用酿酒酵母细胞内蛋白转运、膜表面展示元件使目的蛋白锚定在细胞表面表达的技术。本研究在对H5、H7和H9三个亚型禽流感病毒血凝素HA序列、结构分析的基础上,构建了锚定型表达包含H5、H7和H9三个亚型禽流感病毒HA截短体蛋白的重组酿酒酵母菌株,表征了其生物学特性,并通过商品蛋鸡口服该菌株初步评价了重组酿酒酵母菌株作为候选疫苗的免疫效力。主要研究方法及结果如下:H5、H7、H9三个亚型的禽流感病毒HA蛋白的免疫原性分析及表达域的筛选:通过对三个亚型AIV的HA序列进行保守性分析,B细胞表位预测以及HA结构模拟,从中获得了高度保守并含有B细胞优势表位的区域,分别选取了H5亚型（Genbank号:AAY56367.1）HA蛋白的头部的97-240位之间强抗原区域和H9亚型（Genbank号:AAR98872.1）HA蛋白26-116位之间的强抗原区域,H7亚型（Genbank号:AGQ80952.1）的HA蛋白的部分头部加茎部区域（28-238位点之间）,该区域包含了目前已知中和抗体的结合位点;选择了编码这些区域的截短序列,用于构建重组酿酒酵母表达载体;重组酿酒酵母菌株的构建及筛选:应用改造后的酿酒酵母菌株作为表达载体,通过醋酸锂转化的方式和同源重组的原理将含有目的基因的转录单位导入酿酒酵母宿主菌的基因组上,用亮氨酸缺失培养基培养,并用基因组验证的方式筛选并纯化出了重组酿酒酵母菌株。对筛选出的重组酿酒酵母菌株的生物学特性进行了研究,Western Blot、免疫荧光和流式细胞术检测结果表明重组酿酒酵母细胞表面成功展示了AIV截短体蛋白。重组酿酒酵母的免疫特性:商品蛋鸡按0.8 m L/羽的量口服以重组酿酒酵母菌株制备的疫苗,在含有母源抗体的前提下,重组酿酒酵母菌株免疫后血清中H5、H7、H9三个亚型AIV的HI抗体效价与商业化油佐剂疫苗水平相当,均可提供免疫保护能力。综上所述,本实验获得了表达包含三个亚型AIV膜蛋白HA截短体蛋白的重组酿酒酵母菌株,作为口服疫苗免疫鸡场商品蛋鸡,表现出一定的免疫原性。与传统疫苗相比,该口服疫苗有安全方便,成本低廉,对禽类产生的应激反应较小等优势,能够有效的应对流感大爆发。HA头部区域的选择和茎部区域表位的设计能够为未来开发广谱禽流感疫苗提供理论基础,并为流感病毒的预防和治疗提供参考。
李如梦[4]（2020）在《基于重组杆状病毒昆虫细胞悬浮培养系统的H7N9 VLP新型疫苗的研究》文中指出2013年,H7N9亚型禽流感首次在中国长三角地区出现,迄今已在我国人群中形成了五波流行高峰。截至2020年3月1日,实验室确诊人感染H7N9禽流感病毒共有1568例病例,其中616人死亡,病死率约为40%。另外,根据世界动物卫生组织（World Orgnization For Animal Health,OIE）的报告,截至2018年3月,在中国家禽中已报告11起高致病性H7N9亚型禽流感暴发,导致将近100万只家禽被扑杀。因此,H7N9亚型禽流感是对公共卫生和家禽养殖的重大威胁。接种疫苗是预防流感病毒感染的最有效手段。传统灭活疫苗依赖于鸡胚进行生产,具有诸如疫病暴发期间鸡胚供应不足、产生大量的废物引起环境污染、内源病毒污染等缺点。此外,灭活疫苗只能诱导抗体免疫,而不能诱导细胞免疫。因此,需要利用新的技术研发一种安全高效的H7N9禽流感疫苗,以满足现代化家禽养殖业疫病防控的需求。病毒样颗粒（Virus-like particle,VLP）是由携带病毒抗原的结构蛋白自行组装的非传染性颗粒,可模拟病毒粒子的天然结构,能激活细胞免疫反应和体液免疫反应,诱导的免疫保护更为全面。另外,利用杆状病毒表达系统在昆虫悬浮细胞中能够大规模生产流感VLP疫苗,而且它由于不依赖鸡胚生产,保证了禽流感大流行时疫苗的充足供应,且具有成本低、对环境友好、生产周期短、安全性高等优势。本研究利用杆状病毒-昆虫细胞悬浮培养平台,采用两种策略构建了表达H7N9禽流感病毒的血凝素（Hemagglutinin,HA）、神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）和基质蛋白（Matrix,M1）的VLP候选疫苗株。两种策略产生的候选VLP疫苗的抗原产量较高、免疫原性好、保护效力强,与商品化H7N9灭活疫苗的表现相当,为H7N9禽流感的防控提供了新的选择。1.基于单独表达HA、NA、M1基因的重组杆状病毒组装H7N9 VLP疫苗的研究本研究选取了一株 H7N9 亚型高致病性禽流感病毒A/Chicken/Guangdong/GD1 5/2016（GD15）作为目的基因的供体。分别将 GD15 的 HA、NA、M1基因克隆在pVL1393载体上,通过与线性化的苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒（AcMNPV）基因组DNA共转染产生了三个重组杆状病毒（rBac-HA-GD15、rBac-NA-GD15、rBac-M1-GD15）。利用IFA方法能检测到外源蛋白的表达。将三个重组杆状病毒以MOI为1:1:1的比例共感染Sf9细胞。通过透射电镜可观察到直径80-120 nm、内部无遗传物质且与流感病毒结构相似的颗粒形成,即为H7N9 VLP（命名为VLP-1）。将VLP经超滤管浓缩后再经30-60%蔗糖密度梯度超速离心进行纯化,其血凝（HA）效价达到11 log2。分别收获超滤浓缩的VLP与超速离心纯化的VLP制备疫苗,同时以单独表达HA蛋白的重组杆状病毒rBac-HA-GD15制备的灭活疫苗为对照。疫苗经肌肉注射方式接种4周龄的SPF鸡,免疫后第3周各疫苗都能诱导产生抗体应答,平均血凝抑制（Hemagglutination inhibition,HI）抗体滴度在6 log2以上;与对照组相比,各疫苗免疫鸡的血清中均能检测到中和抗体,纯化VLP-1组平均滴度能达到260;各疫苗组IgY抗体滴度均在2560以上,这些结果显示了 VLP-1疫苗具有较强的免疫原性。其中15 μg免疫剂量比7.5 μg免疫剂量能诱导更高的HI抗体水平。免疫3周后,用GD15毒株以106.0 EID50的剂量通过滴鼻点眼的方式攻毒。未免疫组在攻毒后出现严重的临床症状,且5天内全部死亡。所有疫苗免疫鸡在攻毒后14天内均未出现症状且未发生死亡,说明H7N9 VLP-1疫苗可提供100%的临床保护。攻毒后第3、5、7、9天采集喉头及泄殖腔棉拭子进行病毒分离。结果显示,疫苗免疫后最高仅有30%的鸡能检测到排毒,且排毒量较低,其中纯化VLP-1组仅在攻毒后第3天能检测到排毒。组织病理学实验显示,VLP-1疫苗以15 μg剂量免疫时,H7N9病毒感染造成的肺脏病变明显较轻。以上结果说明,通过单独表达HA、NA和M1蛋白的重组杆状病毒共感染Sf9细胞可成功组装H7N9 VLP,且VLP-1疫苗能够诱导产生较强的抗体反应,能够提供针对H7N9病毒攻击完全的临床保护且显着抑制排毒。2.基于串联表达HA、NA、M1基因的重组杆状病毒组装H7N9 VLP疫苗的研究本研究将H7N9 GD15毒株的HA、NA和M1基因串联并克隆至穿梭载体中（pVL1393-NA-M1-HA）。将重组穿梭质粒与线性化的AcMNPV基因组DNA共转染Sf9细胞进行VLP的组装。利用IFA方法鉴定了 HA、NA与M1蛋白的表达,并用透射电镜观察到直径约为100 nm的流感病毒样颗粒,说明重组杆状病毒拯救成功且能够组装成H7N9VLP（命名为VLP-2）。重组杆状病毒接种Sf9细胞制备VLP,用超滤结合超速离心方法浓缩VLP,浓缩后VLP的HA效价显着提高（6 log2至11 1og2）。用两种构建策略制备的VLP疫苗（VLP-1与VLP-2）与商品化重组禽流感病毒H5+H7三价灭活疫苗进行动物的免疫与攻毒实验。VLP疫苗以15μg剂量肌肉注射4周龄的SPF鸡,第3周平均HI抗体滴度在6 log2以上,商品疫苗和VLP-1疫苗诱导的最高HI抗体均能达到10 log2以上。疫苗免疫血清与2013-2018年H7N9野毒株均具有良好的交叉反应性。各疫苗均能诱导中和抗体反应,但是VLP疫苗诱导的中和抗体比商品疫苗诱导的抗体略低。各疫苗均能诱导很高的IgY抗体水平（2560-5120）,且VLP疫苗与灭活疫苗之间无显着差异。其中,VLP-2与VLP-1都以15 μg剂量免疫时,VLP-1疫苗诱导的抗体水平更高。免疫后第3周用高致病性H7N9禽流感病毒GD15株以106.0 EID50的剂量进行攻毒。临床观察14天内,各疫苗免疫组均未出现明显的临床症状且未发生死亡,说明VLP疫苗与商品疫苗均能提供100%的临床保护。攻毒后第3、5、7、9天采集喉头及泄殖腔棉拭子进行排毒检测,结果显示50%的商品疫苗免疫鸡能检测到排毒,两个VLP疫苗免疫鸡的排毒率分别为30%与40%,与商品化疫苗相比无显着差异。VLP疫苗与商品疫苗免疫鸡的脏器中均未检测到病毒,说明它们均能有效抑制病毒复制。以上结果说明,基于HA、NA、M1基因串联表达策略组装的H7N9 VLP疫苗能够在SPF鸡中诱导较强的抗体免疫应答,且能够提供针对H7N9病毒攻击完全的临床保护并显着抑制排毒及病毒在体内的复制,其免疫原性与保护效力与杆状病毒共感染组装的VLP-1疫苗及商品疫苗相当。
张锐[5]（2020）在《禽流感病毒的流行株序列分析及PA单克隆抗体的制备》文中认为禽流感（Avian Influenza,AI）是由禽流感病毒（Avian Influenza Virus,AIV）引起的一种针对禽类的急性、传染性强的传染病。禽流感不仅严重危害养殖业,还对公共健康产生威胁。1.本研究通过RT-PCR的方法对2018年5月-2020年2月安徽、山东、浙江等地区采集的5192份样品进行AIV的检测。检测结果显示,AIV的总体阳性率为1.25%,采用鸡胚接种分离病毒的方法从核酸阳性样品中获得了 6株H9N2亚型AIV,2株H5N6亚型AIV。序列分析显示:6株H9N2分离株的HA裂解位点为PSRSSRGLF,符合低致病性禽流感病毒的序列特征;HA受体结合位点234位氨基酸为亮氨酸（Leu）,具有与哺乳动物唾液酸受体结合的特征;6株H9N2分离株的HA蛋白均在313位存在潜在糖基化位点。M2蛋白发生S31N突变。2株H5N6分离株的HA裂解位点为LRERRRKRGLF,符合高致病性禽流感病毒的序列特征,这2株H5N6分离株的HA蛋白未发生Q226L及G228S的突变,表明其受体结合特征仍为禽源性。遗传进化分析显示:6株H9N2分离株的HA、NA基因属于Y280-like分支,PB2、M基因属于G1-like分支,PB1、PA、NP、NS基因属于F/98-like分支。2株H5N6分离株的HA基因属于H5亚型AIV的2.3.4.4分支、NA基因属于Eurasian Lineage分支。本研究通过对2018-2020年部分地区AIV的流行株序列分析为AIV的防控提供了参考。2.构建了 H9N2亚型AIV的PA截短蛋白的原核表达载体pET-28a（+）-H9N2-sPA,表达并纯化出重组蛋白His-sPA。将重组蛋白His-sPA免疫BALB/c小鼠,随后进行免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,最后成功筛选出3株能稳定分泌抗PA蛋白的单克隆抗体细胞株1F5、4B9和8G3。抗体特性研究表明,1F5、4B9和8G3的腹水ELISA效价大于105,WB的反应结果显示1F5、4B9和8G3三株单抗均能与H9N2亚型AIV的PA蛋白反应。IFA的反应结果显示8G3能识别病毒感染的细胞,而1F5、4B9与病毒感染的细胞有微弱的反应性。同时单抗亚类鉴定表明1F5单抗重链为IgG2b,4B9与8G3单抗重链为IgG1,三株单抗的轻连均为κ链。1F5、4B9单抗所识别的抗原区域位于PA蛋白的C端505-558aa内,8G3单抗所识别的抗原区域位于PA蛋白的C端607-660aa内。单克隆抗体的通用性鉴定结果表明8G3单抗能够与H1-H13亚型的A型流感病毒的PA蛋白反应。H9N2亚型AIV的PA蛋白单克隆抗体的制备为进一步研究PA蛋白的结构与生物学功能、病毒的复制与转录奠定了基础。
李俊鑫[6]（2019）在《中和H7N9禽流感病毒全人源单克隆抗体的快速筛选及抗病毒机制研究》文中研究指明H7N9禽流感病毒是一种甲型流感病毒,可以通过禽类感染人。人感染H7N9禽流感是一种急性呼吸道传染病,可以迅速发展为重症肺炎和急性呼吸窘迫综合征,死亡率高达40%,至今仍然缺乏有效的药物和疫苗。目前,高致病性H7N9禽流感病毒的出现已经对家禽养殖业、畜牧业以及人类健康构成严重的威胁,亟需卫生部门采取有效的控制措施。全人源单克隆抗体能够中和和清除禽流感病毒,在防治禽流感上具有显着的疗效,因此,快速筛选靶向病毒保守中和表位的人源抗体对控制H7N9禽流感疫情具有重大意义。在本研究中,我们利用单个记忆B细胞PCR技术和微量中和H7N9病毒实验,两周内快速地从康复病人的可转化记忆B细胞（switched memory B cells）中鉴定和克隆全人源单克隆抗体3L11和5J13,并分别研究两种全新的人源抗体的抗病毒机制。3L11抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因分别由罕见的VH1-8*01/D2-15*01/JH5*02和VL2-13*01/JL3*02家族基因组成,而且分别带有8.87%和5.55%的体细胞突变,使3L11抗体能够结合H7N9病毒的血凝素（Hemagglutinin,HA）,亲和力KD为5.32×10-9M。我们构建的稳转CHO细胞能够生产250.12mg/L的3L11,抗体纯度达99%。在体外,3L11能够广谱中和A/Anhui/1/2013（AH1）、A/Shanghai/2/2013（SH2）、A/Shenzhen/Th004/2017（SZ4）、A/Shanghai/1/2013（SH1）等H7N9禽流感病毒,也可以介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC）清除感染病毒的细胞。对3L11的H7N9逃逸病毒株测序发现,病毒的HA蛋白发生了G151R(Gly151→Arg151)和S152P(Ser152→Pro152)的氨基酸替换,这表明3L11的中和表位是在HA头部受体结合位点（receptor binding site,RBS）附近的抗原位点A（RRSGSS）。而且通过序列比对的结果发现,流行的H7N9野生型病毒都没有这两个氨基酸突变。因此,3L11有极大潜力能够中和所有出现过的H7N9流行毒株。更重要的是,无论是预防实验还是治疗实验,3L11都可以完全地保护小鼠免受H7N9病毒的致命攻击。5J13抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因分别由VH3-30*03/D2-2*01/JH6*02和Vκ4-1*01/Jκ4*01组成,并且分别带有15.25%和4.42%的体细胞突变。5J13特异地高亲和力结合H7N9病毒的HA蛋白,KD值为1.95×10-10M。稳转5J13抗体基因的CHO细胞能够生产84.48mg/L的5J13,抗体纯度达99%。在体外,5J13能够抑制病毒的血凝作用和膜融合作用,从而高效地中和了H7N9病毒;在体内,5J13能够预防和治疗致命的H7N9病毒感染小鼠。更重要的是,通过氢氘交换质谱、逃逸病毒株测序和竞争结合实验等结果发现,5J13的表位在HA蛋白头部RBS的对面,是一个之前国内外从未报道过的全新的中和表位,其中一个氨基酸E89K(Glu89→Lys89)的突变能够导致5J13失去结合病毒的活性。我们把这个全新的中和表位命名为抗原位点J。综上所述,本项研究工作证明了记忆B细胞PCR技术快速鉴定、克隆抗流感病毒人源抗体的可行性,对迅速控制严峻的特别是未来新出现的流感疫情具有重大的指导意义。我们获得了两个新的中和H7N9病毒的人源抗体,为预防和治疗H7N9禽流感提供了优质的候选抗体药物。另外,两个人源抗体的抗病毒机制以及全新中和表位的发现,将有力地促进通用型禽流感疫苗及广谱性中和抗体的研究和发展。
孔德鑫[7]（2019）在《H5N1和H7N9亚型禽流感亚单位疫苗的制备及免疫原性研究》文中研究表明H5N1和H7N9亚型高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV）不仅严重影响了家禽养殖业的健康发展,还对人类公共卫生安全带来了严重威胁。目前禽流感病毒的防控主要依赖于全病毒灭活疫苗,大多采用鸡胚工艺进行疫苗生产,在生产过程中存在较大的生物安全威胁,因此亟需开发一种新的安全有效的禽流感候选疫苗。本研究利用昆虫杆状病毒表达系统表达了禽流感病毒的血凝素（hemagglutinin,HA）蛋白,制备了禽流感基因工程亚单位疫苗,并初步评估了其免疫效果。本研究首先将H5N1（D889）和H7N9（E157）毒株的HA基因插入到转递质粒p ACEBac1中,进一步构建重组穿梭载体,转染sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒BV-HA5和BV-HA7。对表达的HA蛋白进行SDS-PAGE、Western Blot和血凝试验鉴定。SDS-PAGE和Western Blot试验结果显示H7N9的HA蛋白大小约为63 k Da,H5N1的HA蛋白大小约为70 k Da;血凝试验结果表明,H7N9 AIV的HA蛋白血凝效价为216,H5N1 AIV的HA蛋白血凝效价为215。通过SPF鸡试验对HA蛋白的免疫原性进行评估,H7N9和H5N1动物试验各分三组,即高剂量组、低剂量组和PBS对照组,其中高剂量组HA蛋白的血凝效价为214,低剂量组HA蛋白的血凝效价为210,免疫剂量为0.5 m L/只。首次免疫后三周使用同源毒株攻毒,攻毒剂量为106 EID50/200μL。攻毒后连续观察14天,并记录临床症状表现和死亡情况。试验结果表明:疫苗免疫后三周,H7N9高剂量组平均HI（Hemagglutination inhibition,HI）效价为6.4log2,H7N9低剂量组平均HI效价为6.1log2,两组HI效价差异不显着（P>0.05）;H5N1高剂量组平均HI效价为4.6log2,H5N1低剂量组平均HI效价为3.8log2,两组HI效价差异不显着（P>0.05）。攻毒后,H7N9高剂量组和H7N9低剂量组SPF鸡存活率均为100%,H5N1高剂量组和H5N1低剂量组SPF鸡存活率均89%。排毒方面,H7N9高剂量组在第3天和第5天各检测到1只鸡排毒;H7N9低剂量组在第3天检测到3只鸡排毒;H5N1低剂量组在第3天检测到5只鸡排毒,第5天检测到2只鸡排毒;H5N1高剂量组在第3天检测到7只鸡排毒,第5天检测到4只鸡排毒。本研究利用昆虫杆状病毒表达系统表达了禽流感病毒的HA蛋白,基于HA蛋白制备了禽流感基因工程疫苗,为高致病性禽流感的防控提供了新的思路和技术平台。
赵冰兵[8]（2019）在《禽流感病毒调控鸭TRAF3介导抗病毒天然免疫的分子机制》文中提出禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）能够感染家禽且在家禽中传播,且能够在家禽的呼吸道以及多种组织中复制。水禽可以携带禽流感病毒并且将其传播给其他禽类,但自身通常不表现任何临床症状,也罕有发生死亡。病毒可以由水禽传播给陆禽（尤其是鸡）并导致陆禽表现出较高的发病率和死亡率。禽流感病毒对宿主的致病性是由病毒自身的复制能力和宿主的免疫反应决定的。目前,禽流感病毒逃逸宿主天然免疫的研究主要集中在哺乳动物方面,而在水禽方面的相关研究却很少。本文拟研究禽流感病毒调控鸭TRAF3（TNF receptor associated factor3,TRAF3,肿瘤坏死因子受体相关因子3）介导抗病毒天然免疫的分子机制。为了鉴定鸭TRAF3（DKTRAF3）基因并预测其蛋白结构域,本文采用PCR技术从感染禽流感病毒的DEF细胞中扩增了鸭TRAF3基因。序列分析结果显示,鸭TRAF3基因的CDS全长为1704 bp,编码567个氨基酸,推导的蛋白分子量是64.80 k Da,等电点7.80。氨基酸序列分析表明,鸭TRAF3与鸡TRAF3的同源性为96.5%,与人TRAF3的同源性约为80.5%。结构域的预测结果表明,鸭TRAF3由四部分组成,包括RING结构域（52-87aa）、ZN fingers结构域（120-199aa）、TRAF-N结构域（Coiled-coil）（267-337aa）和TRAF-C（MATH）结构域（419-542aa）。鸭TRAF3的主要结构域与人等哺乳动物的TRAF3类似。为了研究鸭TRAF3的功能,本研究将鸭TRAF3基因转染到DEF或DF1细胞中。荧光素酶报告基因检测结果表明,鸭TRAF3基因能够激活禽IFN-β的启动子。荧光定量PCR结果发现,鸭TRAF3基因能够激活IFN-I的信号通路。CO-IP结果发现,鸭MAVS蛋白与鸭TARF3蛋白的349-567aa区域直接互作（包括MATH功能区）,但是其与鸭TRAF3蛋白的1-348aa区域无直接相互作用。这说明鸭TRAF3蛋白通过其MATH功能区直接与鸭MAVS蛋白相互作用。为了研究禽流感病毒NS1蛋白调控鸭TRAF3介导抗病毒天然免疫的分子机制,首先将鸭TRAF3质粒与H5N1亚型禽流感病毒NS1质粒共转染到DEF或DF1细胞中。荧光素酶报告基因检测结果分析表明,H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白可以明显地抑制鸭TRAF3基因对禽IFN-β启动子的激活。荧光定量PCR结果发现,H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白可以明显地抑制鸭TRAF3基因激活IFN-I的信号通路。CO-IP结果发现,H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白可以与鸭TRAF3蛋白的349-567aa区域直接相互作用（包括MATH功能区）,但是其与鸭TRAF3蛋白的1-348aa区域无直接相互作用。CO-IP结果发现,H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白可以与鸭TRAF3蛋白直接相互作用,从而影响鸭MAVS蛋白和鸭TRAF3蛋白的互作,最终影响TRAF3介导的抗病毒天然免疫信号通路。综上所述,本研究发现鸭TRAF3通过其MATH功能区直接与鸭MAVS相互作用;H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白通过与鸭TRAF3的MATH功能区相互作用,进而抑制IFN-β的表达;H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白通过与鸭TRAF3蛋白直接相互作用,从而影响鸭MAVS蛋白和鸭TRAF3蛋白复合体的形成。因此,H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白通过与鸭TRAF3蛋白相互作用,进而调控鸭TRAF3介导的抗病毒天然免疫反应。
马春喜[9]（2019）在《H7N9禽流感病毒PA-X基因多态性分析与功能研究》文中提出禽流感病毒（Avian Influenza virus,AIV）属于正黏病毒科,是一种有囊膜、基因组分节段的负链RNA病毒,可感染禽类、哺乳动物,甚至包括人类,严重威胁禽类与人类的健康。其基因组有8个片段,其中PA基因编码4种蛋白:PA、PA-N155、PA-N182和PA-X。PA-X蛋白是Jagger等人在2012年发现的,它是PA核糖体移码产生的+1阅读框编码的融合蛋白。PA-X蛋白作为新发现的由PA基因编码的病毒蛋白,被证明通过多种方式影响病毒的生命周期从而影响病毒的生物学特性和致病性。其作用主要包括1:调节流感病毒的毒力、聚合酶活性以及病毒诱导的细胞死亡和细胞因子免疫应答能力;2:具有核酸内切酶活性,可以广泛降解宿主的mRNA;3:发挥抑制宿主蛋白表达的功能（host-shutoff）。而且,在不同亚型以及不同宿主来源的流感病毒中,PA-X的以上功能存在差异。自2013以来,新型H7N9AIV感染人事件频频发生,给公共卫生安全带来了巨大的威胁。已有的研究表明,PA-X在不同亚型及其不同宿主之间发挥的作用不同。然而,其潜在的分子机制还不清楚。本研究首先基于大数据分析,探索各亚型之间PA-X基因多态性的差异,然后分别从多肽、蛋白、病毒水平进行PA-X基因多态性功能的研究。目前,国内外尚无PA-X蛋白对H7N9流感病毒致病性影响的相关研究。因此,后期蛋白水平和病毒水平的研究,我们将以H7N9流感病毒作为母本序列,以期通过体内外实验探索PA-X基因多态性对H7N9流感病毒生物学特性和致病性的影响,从而为解析不同亚型之间PA-X蛋白功能差异的分子机制奠定一定的基础。1.PA-X基因多态性分析及多肽水平研究PA-X基因多态性的功能我们从GISAID数据库分别下载H5N1、H5N6、H7N9、H9N2 PA-X基因的序列,按照禽源与哺乳源动物分类,一共下载了 589株禽源H5N1、75株人源H5N1、651株禽源H5N6、19株人源H5N6、917株禽源H9N2、9株人源H9N2、437株禽源H7N9、813株人源H7N9。通过生物学软件比对对PA-X序列进行分析,发现了一些规律性的位点突变。如在 37A、611、101D、193N、195R、199R、2281 这几个氨基酸位点,H7N9 与 H9N2PA-X序列突变率很高,而H5N1、H5N6 PA-X在这些位点突变率很低尤其是人源H5N1。在27D、58G、1291、208Q、213G、215P这6个氨基酸位点,H5N1的PA-X突变率很高,而H9N2、H7N9的PA-X的突变率很低。在20A、142K、251K这3个氨基酸位点,禽源H5N6突变率很高,而H5N1、H9N2、H7N9在这些点突变率很低。接下来,我们着重分析了从2013-2017年1359株H7N9病毒株分析序列,根据分析结果并结合已有关于PA-X功能区的文献,筛选出7条潜在功能的多肽,分别命名为pPA-X-1、pPA-X-2、pPA-X-3、pPA-X-4、pPA-X-5、pPA-X-6、pPA-X-7。并对合成的多肽进行了一系列功能研究。细胞死亡实验结果表明,多肽对细胞凋亡与坏死均无显着性影响。多肽抑制宿主蛋白表达实验结果证实pPA-X-1、pPA-X-4、pPA-X-7能显着抑制萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的表达,而pPA-X-5能显着抑制萤火虫荧光素酶的表达。多肽对小鼠致病性研究结果显示,与PBS对照组相比,所有多肽滴鼻组的小鼠都表现出了不同程度的体重下降,其中pPA-X-5与母本多肽pPA-X-3相比,在第1天显着抑制了小鼠体重的上升（p<0.05）。2.蛋白水平研究PA-X基因多态性的功能为了验证多肽水平的结果,我们以 1 株 H7N9 亚型 AIV A/Chicken/Guangdong/GD15/2016（简称 GD15 株）为研究对象,构建了表达 H7N9 GD15 株PA-X基因的真核表达载体（pCAGGS-GD15-PA-X-Flag）。依据多肽位点的差异,对pCAGGS-GD15-PA-X-Flag进行相应氨基酸位点的突变,并将重组表达质粒分别命名为:pCAGGS-PAX-2、pCAGGS-PAX-4、pCAGGS-PAX-5、pCAGGS-PAX-6、pCAGGS-PAX-7。从各重组PA-X质粒抑制GFP荧光的结果来看,所有表达的PA-X蛋白都显着地抑制了 GFP的表达（其中pCAGGS-PAX-6、pCAGGS-PAX-7表达质粒由于构建的过程中遇到问题,目前相关实验正在开展）。其中,各PA-X蛋白抑制GFP表达的能力由强到弱依次为:pCAGGS-PAX-2>pCAGGS-PAX-4>pCAGGS-PAX>pCAGGS-PAX-5;而从各重组质粒抑制海肾荧光素酶的表达能力来看,各重组PA-X蛋白都显着地抑制了海肾荧光素酶的表达,然而各个组抑制能力存在差异,其抑制海肾荧光素酶报告基因的能力由高到低依次为:pCAGGS-PAX-2>pCAGGS-PAX-4>pCAGGS-PAX>pCAGGS-PAX-5,与抑制 GFP 水平结果一致。因此,综合多肽水平和蛋白水平的结果,发现pCAGGS-PAX-4所处的功能区显着影响PA-X基因抑制宿主蛋白表达的效果,且是新发现的PA-X host-shutoff功能区。3.病毒水平研究PA-X基因多态性的功能为了进一步验证蛋白水平的结果,我们将蛋白水平对应的PA-X点突变回归到病毒水平,从而验证PA-X基因多态性对病毒生物学特性和致病性的影响。对应修饰位点的不同,将拯救的病毒分别命名为:GD15-PA、GD15-PA-2、GD15-PA-4、GD15-PA-5、GD15-PA-6、GD15-PA-7。对拯救的6株重组病毒进行初步的生物学特性研究,发现与母本病毒GD15-PA相比,GD15-PA-4、GD15-PA-5、GD15-PA-7 在 MDCK 上的 TCID50 显着高于母本病毒;小鼠致病性实验结果表明,与母本病毒相比,GD15-PA-4和GD15-PA-5对小鼠的致病性显着增高,表现为母本病毒的MLD50>6.5 lgEID50,而GD15-PA-4与GD15-PA-5的MLD50都为5.51gEID50;重组病毒在MDCK的复制曲线和在小鼠各组织脏器的复制结果表明,GD15-PA-4与GD15-PA-5的复制能力显着高于母本病毒GD15-PA;此外,聚合酶活性结果也表明,GD15-PA-4与GD15-PA-5的聚合酶活性要显着高于母本病毒;最后,小鼠肺组织细胞因子测定实验结果也表明,GD15-PA-4与GD15-PA-5诱导的细胞因子水平较母本病毒高。综上,我们认为以上结果共同解释了 GD15-PA-4与GD15-PA-5感染小鼠的肺脏损伤比母本病毒更为严重的原因。总的来说,本研究首先基于大数据分析,筛选出了潜在的PA-X蛋白功能区;然后分别从多肽水平、蛋白水平、病毒水平验证了这些潜在的PA-X蛋白功能区对PA-X蛋白功能的影响;最终发现了影响PA-X蛋白host-shutoff功能的新功能区与关键氨基酸位点,并探索了这些功能区对H7N9流感病毒生物学特性和致病性的影响。本研究为揭示不同亚型流感病毒PA-X蛋白功能的差异性以及PA-X蛋白调控各亚型流感病毒致病性差异的分子机制奠定了基础。后续实验我们正在将筛选到的功能区在不同亚型的流感病毒中进行验证,以期最终确定PA-X在不同亚型及不同宿主之间发挥的作用存在差异性的潜在分子机制。
肖倩[10]（2019）在《蛋白芯片方法检测AIV抗体并区分其H5和H7亚型抗体的初步研究》文中指出禽流感病毒（AIV）不仅能感染禽类造成巨大的经济损失,更严重的是,它可以感染人类,特别是H5和H7亚型的AIV,给人类带来巨大危害和损失,引起了公众广泛的关注,所以检测AIV的技术也多种多样。众所周知,单克隆抗体具有很多的优点,是一种有效的检测工具,普遍应用于不同的检测方法中,AIV的单克隆抗体也经常被用于检测和诊断AIV。近年来,蛋白微阵列作为一种新兴的技术正在被开发,它是一种高通量的强大工具。为了减少AIV对人类的健康与财产的威胁,准确检测和判断AIV对及时监测病毒、控制病毒传播和抗AIV疫苗研发都具有重要的指导作用。根据禽流感流行发生的情况,诊断方法需要具有快速、有效、高通量、高特异性和便于操作等特点。本研究基于单克隆抗体和蛋白芯片方法的优点和便利,建立了检测AIV抗体的阻断蛋白芯片的方法,该方法可用于检测不同种属血清中的禽流感抗体,同时区分是否是H5或H7亚型。血清学检测使我们能够确定易感物种或人类是否有感染史,为监测和诊断AIV提供重要线索。1.禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体的制备及鉴定本研究首先灭活纯化H5N6病毒,然后免疫小鼠。利用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,用ELISA对其进行筛选,最后获得2株分泌抗NP抗体的细胞株,命名为3D9和2B10。通过间接ELISA、western blot和间接免疫荧光试验对2株杂交瘤细胞进行鉴定。结果分析显示,间接ELISA检测3D9和2B10的细胞培养上清液抗体效价分别为1:1×103和1:1×104,腹水的抗体效价为1:1×105和1:1×106;3D9和2B10亚类鉴定重链为IgM,轻链为κ链。Western blot分析表明2株杂交瘤细胞上清即能特异的与不同亚型的AIV在56KD处发生反应,也可特异的与原核表达的NP蛋白发生反应。间接免疫荧光结果显示,2株单克隆抗体与不同亚型的AIV感染的MDCK细胞均能产生特异性的免疫荧光。本研究制备了 2株分泌抗NP蛋白的单克隆抗体,它们具有较好的保守性、特异性和广谱性。2.H5N1-HA1、H7N3-HA1和H3N2-NP重组蛋白的表达与纯化扩增H5N1-HA1基因,克隆到原核表达载体pCold Ⅰ和pGEX-4T-1上,两个重组阳性质粒被成功构建,之后转化到E.coli BL21,诱导表达目的蛋白。结果显示H5N1-HA1能在pCold Ⅰ中实现带His标签的融合蛋白的表达,也能在pGEX-4T-1中表达带GST标签的蛋白,两种原核表达系统在IPTG浓度为1mM的条件下37℃或16℃诱导都以不可溶的包涵体的形式进行表达,带更小的His标签的H5N1-HA1蛋白被选择进行大量表达用于下一步的实验。将实验室已有的阳性质粒pCold I-H7N3-HA1和pET-32a-H3N2-NP分别转化到E.coli BL21菌株进行原核表达,在IPTG浓度为1mM的条件下,16℃诱导pCold I-H7N3-HA1 和pET-32a-AIV-H3N2-NP,获得包涵体中的H7N3-HA1和部分在上清中表达的H3N2-NP两种重组蛋白。上述AIV蛋白纯化后获得三种不同的较高纯度蛋白,利用相对应的单克隆抗体进行western blot实验,结果分析发现,三种蛋白都具有较好的特异性,为禽流感病毒抗体阻断蛋白芯片检测方法的建立提供了可用且质量高的抗原。3.AIV抗体及其H5和H7亚型抗体蛋白芯片检测方法的构建及优化本研究研制了一种新型的蛋白芯片诊断方法,用于快速地确定不同种属的动物体内是否存在禽流感抗体,且能同时区分AIV的H5和H7亚型抗体,以达到对禽流感及禽流感的H5和H7亚型进行鉴别诊断以及疫情监测的目的,从而为禽流感诊断提供一种新方法。本方法首先确定了抗原和单克隆抗体的使用条件,为了获得容易观察和计算的高强度的化学发光信号,H5和H7抗原浓度确定为0.2mg/mL,NP抗原浓度确定为0.05mg/mL;H5、H7和NP单克隆抗体的最佳稀释度分别为1:2000、1:2000和1:320000;检测样品的最佳稀释倍数为1:32。然后确定蛋白芯片的阴阳性临界值,鸡、孔雀、鸭血清中H5抗体检测临界值分别为40%、50%、30%,NP抗体检测临界值分别为50%、50%、20%,H7抗体检测临界值分别为40%、50%、40%。其他禽类疾病病毒的阳性血清于蛋白芯片孵育检测其特异性,结果表明,该蛋白芯片能特异的检测AIV抗体。该方法的灵敏度高于传统的HI方法,我们将已知HI滴度的血清在蛋白芯片中孵育,结果表明在蛋白芯片中H5和H7抗体最低检测线均为1个HI滴度,用H5和H7亚型阳性血清测定蛋白芯片NP抗体的最低检测线均为0.5个HI滴度。将蛋白芯片与IDEXX AIV抗体检测试剂盒和HI进行比较,检测了 55份临床鸡血清样品,蛋白芯片H5和NP抗体检测的诊断灵敏性和诊断特异性均为10 0%,H7的诊断灵敏性和诊断特异性分别为10 0%和97.06%。取鸭临床血清20份和孔雀临床血清20份孵育于蛋白芯片,并用HI实验作为对照,孔雀血清的蛋白芯片结果与HI结果完全符合,鸭血清的蛋白芯片的结果与HI符合率为90%。本研究建立的方法具有高通量、准确、特异且敏感等优点,对AIV的血清学诊断和流行病学调查以及疫苗接种效率的监测具有重要价值。更重要的是,该方法为后续同时识别更多的AIV亚型和检测其他病原体打下了基础。
二、H7亚型禽流感病毒血凝素基因的真核表达载体的构建及鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、H7亚型禽流感病毒血凝素基因的真核表达载体的构建及鉴定（论文提纲范文）
（1）H7N9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的生物学特性与保护效力评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 |
| 1. H7N9亚型禽流感病毒的研究进展 |
| 1.1 流行现状 |
| 1.2 HA蛋白的结构及其生物学功能 |
| 1.3 H7N9亚型禽流感的防治现状 |
| 2. H7N9亚型禽流感病毒HA单克隆抗体的研究进展 |
| 2.1 中和性HA单抗的研究进展 |
| 2.2 非中和性HA的单抗研究进展 |
| 2.3 基因工程抗体的研究进展 |
| 3. H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白抗原表位的研究进展 |
| 3.1 单抗技术筛选的H7N9 HA抗原表位 |
| 3.2 免疫血清筛选的抗原表位 |
| 3.3 生信分析预测表位 |
| 3.4 抗原表位筛选方法的研究进展 |
| 4. 研究目的与意义 |
| 第一章 H7N9亚型禽流感病毒HA单克隆抗体的生物学活性鉴定 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 单抗的纯化及其亚类鉴定 |
| 2.2 单抗的血凝抑制活性鉴定 |
| 2.3 单抗的病毒中和活性鉴定 |
| 2.4 单抗的HA蛋白结合活性鉴定 |
| 2.5 单抗与H7N9病毒感染细胞的反应性鉴定 |
| 2.6 单抗的广谱反应性鉴定 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 单抗的生物学特征鉴定 |
| 3.2 单抗的HA结合活性鉴定 |
| 3.3 单抗与病毒感染细胞的反应性鉴定 |
| 3.4 单抗的广谱反应性鉴定 |
| 4 讨论 |
| 第二章 H7N9亚型禽流感病毒HA单克隆抗体的保护效力评价 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞、质粒和毒株 |
| 1.2 鸡胚及实验动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 H7N9病毒JTC4 M11株对小鼠最小攻毒剂量的测定 |
| 2.2 小鼠预防性保护试验 |
| 2.3 小鼠治疗性保护试验 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 JTC4 M11对小鼠的最小攻毒剂量测定 |
| 3.2 小鼠预防性保护试验 |
| 3.3 小鼠治疗性保护试验 |
| 4 讨论 |
| 第三章 H7N9亚型禽流感病毒HA单克隆抗体的表位鉴定 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞、质粒和毒株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要分子生物学软件 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 基于多肽的ELISA筛选单抗识别的抗原表位 |
| 2.2 噬菌体表面展示随机多肽文库筛选单抗识别的抗原表位 |
| 2.3 基于免疫逃逸株筛选的方法鉴定4B7 4D5的抗原表位 |
| 2.4 抗原表位的自然突变率分析 |
| 2.5 抗原表位的保守性及其在HA蛋白中的定位分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 基于多肽的ELISA筛选单抗识别的抗原表位 |
| 3.2 噬菌体表面展示随机多肽文库筛选单抗的抗原表位 |
| 3.3 免疫逃逸株筛选的方法鉴定4B7 4D5识别的抗原表位 |
| 3.4 表位的保守性及其在HA蛋白中的定位 |
| 3.5 H7N9 HA氨基酸位点自然突变率分析 |
| 4 讨论 |
| 第四章 5D3 1B5亚类转换嵌合抗体表达的初步研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 质粒与细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 5D3 1B5抗体可变区基因序列的测定 |
| 2.2 亚类转换嵌合抗体表达质粒的构建 |
| 2.3 亚类转换嵌合抗体的真核表达 |
| 2.4 亚类转换嵌合抗体的浓缩 |
| 2.5 亚类转换嵌合抗体的鉴定 |
| 2.6 抗体可变区的生物信息学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 5D3 1B5抗体可变区基因序列的测定 |
| 3.2 亚类转换嵌合抗体表达质粒的构建 |
| 3.3 亚类转换嵌合抗体的真核表达 |
| 3.4 5D3 1B5抗体可变区的生物信息学分析 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）H9N2亚型禽流感病毒HA和NP蛋白单克隆抗体的制备及在抗原变异分析中的初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述: 禽流感病毒及其单克隆抗体制备的研究进展 |
| 1 禽流感病毒的分子生物学特性 |
| 2 H9N2亚型禽流感的流行情况 |
| 3 禽流感主要检测方法 |
| 4 单克隆抗体技术 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 第一章 H9N2亚型禽流感病毒HA和NP基因的克隆及表达 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备及在抗原变异分析中的初步应用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（3）表面展示禽流感病毒抗原酿酒酵母菌株的构建及其生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 综述 |
| 1.1 禽流感病毒概述 |
| 1.2 禽流感病毒的形态和结构及编码蛋白质 |
| 1.2.1 HA蛋白 |
| 1.2.2 NA蛋白 |
| 1.2.3 NP蛋白 |
| 1.2.4 M1和M2基质蛋白 |
| 1.2.5 NS1和NS2非结构蛋白 |
| 1.2.6 RNA聚合酶(PB1、PB2和PA蛋白) |
| 1.3 禽流感病毒复制及感染过程 |
| 1.4 禽流感疫苗 |
| 1.4.1 灭活疫苗 |
| 1.4.2 减毒活疫苗 |
| 1.4.3 基因工程亚单位疫苗 |
| 1.4.4 DNA疫苗 |
| 1.4.5 基因工程活载体疫苗 |
| 1.4.6 流感通用疫苗研究 |
| 1.5 酵母表面展示技术的研究 |
| 1.5.1 酿酒酵母表面展示 |
| 1.5.2 酿酒酵母表达外源基因作为口服疫苗递送载体的优势 |
| 1.6 本论文的意义和目的 |
| 第2章 A型流感病毒H5N1、H7N9、H9N2 亚型的抗原表位分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验毒株、质粒 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 H5N1 禽流感病毒抗原表位分析 |
| 2.3 H7N9 禽流感病毒抗原表位分析 |
| 2.4 H9N2 禽流感病毒抗原表位分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 重组酿酒酵母菌株的构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验菌株、质粒、仪器、试剂、引物 |
| 3.2.2 实验所用溶液及其配方 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 H5N1、H7N9、H9N2 流感病毒的HA截短序列的扩增 |
| 3.3.2 转录单位的构建 |
| 3.3.3 重组酿酒酵母菌株的构建 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 H5N1、H7N9、H9N2 流感病毒的HA截短序列的扩增 |
| 3.4.2 三个流感病毒重组酿酒酵母菌株构建及筛选 |
| 3.4.3 三个流感病毒转录单位串联在酿酒酵母细胞表面展示 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 三个亚型的流感病毒HA蛋白截短体串联展示在酿酒酵母表面的特性 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料和方法 |
| 4.2.1 抗体 |
| 4.2.2 实验相关溶液的配制 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.2.4 主要仪器 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 蛋白表达Western Blot结果 |
| 4.3.2 蛋白表达免疫荧光结果 |
| 4.3.3 蛋白表达流式细胞结果 |
| 4.3.4 表达了外源基因的酵母生长结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 重组酿酒酵母菌株免疫效力评价 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料和方法 |
| 5.2.1 实验所用动物及商品化疫苗 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1.URR1 序列 |
| 2.URR2 序列 |
| 3.LEU序列 |
| 4.转录启动子GPD序列 |
| 5.转录终止子ADH1 序列 |
| 6.POT-TU转录表达载体图谱 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（4）基于重组杆状病毒昆虫细胞悬浮培养系统的H7N9 VLP新型疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 引言 |
| 1 H7N9流感病毒的流行现状 |
| 1.1 流行现状 |
| 1.2 基本结构 |
| 2 流感疫苗的研究进展 |
| 2.1 流感病毒疫苗的研究现状 |
| 2.2 通用型流感病毒疫苗的研究 |
| 3 病毒样颗粒疫苗的研究进展 |
| 3.1 流感VLP疫苗的制备 |
| 3.2 VLP表达系统 |
| 3.3 流感病毒样颗粒疫苗的研究进展及前景 |
| 参考文献 |
| 第二章 基于单独表达HA、NA、M1基因的重组杆状病毒组装H7N9 VLP疫苗的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞、质粒、菌株和毒株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 鸡胚和实验动物 |
| 1.5 主要分子生物学软件 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 重组穿梭质粒的构建 |
| 2.2 重组杆状病毒的拯救 |
| 2.3 重组杆状病毒的鉴定 |
| 2.4 重组杆状病毒的空斑纯化 |
| 2.5 重组病毒的扩增 |
| 2.6 VLP的收获 |
| 2.7 疫苗的制备 |
| 2.8 攻毒用病毒的准备 |
| 2.9 疫苗免疫实验 |
| 2.10 攻毒保护实验 |
| 2.11 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 重组穿梭质粒的构建 |
| 3.2 重组杆状病毒的鉴定 |
| 3.3 重组杆状病毒滴度的测定 |
| 3.4 VLP形态的透射电镜观察 |
| 3.5 H7N9 VLP的HA滴度测定 |
| 3.6 H7N9 VLP疫苗诱导的抗体应答测定 |
| 3.7 攻毒保护实验 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于串联表达HA、NA、M1基因的重组杆状病毒组装H7N9 VLP疫苗的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 毒株、细胞、质粒和菌株 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 鸡胚和实验动物 |
| 1.4 主要分子生物学软件 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 重组穿梭质粒的构建 |
| 2.2 重组杆状病毒的拯救 |
| 2.3 重组杆状病毒的鉴定 |
| 2.4 重组杆状病毒的空斑纯化 |
| 2.5 重组病毒的扩增 |
| 2.6 VLP的收获 |
| 2.7 VLP疫苗的制备 |
| 2.8 疫苗免疫实验 |
| 2.9 攻毒保护实验 |
| 2.10 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 重组穿梭质粒的构建 |
| 3.2 重组杆状病毒的鉴定 |
| 3.3 VLP形态的透射电镜观察 |
| 3.4 H7N9 VLP的滴度测定 |
| 3.5 H7N9 VLP疫苗诱导的抗体应答测定 |
| 3.6 攻毒保护实验 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（5）禽流感病毒的流行株序列分析及PA单克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 流感病毒的病原学 |
| 2 流感病毒的基因组及蛋白功能 |
| 2.1 血凝素蛋白HA |
| 2.2 神经氨酸酶NA |
| 2.3 基质蛋白M |
| 2.4 聚合酶复合体蛋白 |
| 2.5 核蛋白NP |
| 2.6 非结构蛋白NS |
| 3 H9N2亚型禽流感病毒的流行病学 |
| 4 H5N6亚型禽流感病毒的流行病学 |
| 5 PA单克隆抗体的研究进展 |
| 第二章 禽流感病毒的流行株序列分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂及实验材料 |
| 1.2 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物的合成 |
| 2.2 样品的收集 |
| 2.3 样品的处理 |
| 2.3.1 组织样品的处理 |
| 2.3.2 拭子样品的处理 |
| 2.4 RNA抽提 |
| 2.4.1 Trizol法提取RNA |
| 2.4.2 磁珠法抽提RNA |
| 2.5 RNA的反转录 |
| 2.6 AIV的PCR检测鉴定 |
| 2.7 病毒的鸡胚分离培养 |
| 2.8 病毒分离株的全基因组序列分析 |
| 2.8.1 测序引物的设计 |
| 2.8.2 病毒RNA的抽提 |
| 2.8.3 RT-PCR |
| 2.8.4 AIV的八基因的T-A克隆 |
| 2.8.5 基因序列分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 禽流感病毒的总体检测情况 |
| 3.2 禽流感病毒的分离情况 |
| 3.3 6株H9N2亚型禽流感病毒基因组的T-A克隆测序 |
| 3.4 6株H9N2亚型禽流感病毒的遗传变异分析 |
| 3.4.1 HA基因的序列及遗传进化分析 |
| 3.4.2 NA基因的序列及遗传进化分析 |
| 3.4.3 NP基因的序列及遗传进化分析 |
| 3.4.4 M基因的序列及遗传进化分析 |
| 3.4.5 NS基因的序列及遗传进化分析 |
| 3.4.6 PB1基因的序列及遗传进化分析 |
| 3.4.7 PB2基因的序列及遗传进化分析 |
| 3.4.8 PA基因的序列及遗传进化分析 |
| 3.5 2株H5N6亚型禽流感病毒的HA与NA基因的T-A克隆测序 |
| 3.6 2株H5N6亚型禽流感病毒的HA与NA基因的遗传变异分析 |
| 3.6.1 HA基因的序列及遗传进化分析 |
| 3.6.2 NA基因的序列及遗传进化分析 |
| 4 讨论 |
| 第三章 H9N2亚型禽流感病毒PA蛋白单克隆抗体的制备 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂及实验材料 |
| 1.2 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 pET-28a(+)-H9N2-sPA载体的构建及表达纯化蛋白 |
| 2.1.1 H9N2 sPA基因的扩增 |
| 2.1.2 pET-28a(+)-H9N2-sPA载体的构建 |
| 2.1.3 His-sPA重组蛋白的诱导表达与纯化 |
| 2.1.4 His-sPA重组蛋白的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色鉴定 |
| 2.1.5 His-sPA重组蛋白的WB鉴定 |
| 2.2 BALB/c小鼠的His-sPA重组蛋白的免疫 |
| 2.3 小鼠三免血清的鉴定 |
| 2.3.1 三免血清的ELISA鉴定 |
| 2.3.2 三免血清的WB反应性鉴定 |
| 2.4 饲养细胞的制备 |
| 2.5 细胞融合 |
| 2.6 阳性细胞株的获得 |
| 2.7 单抗腹水的制备 |
| 2.8 单克隆抗体特性的鉴定 |
| 2.8.1 单抗腹水ELISA效价的鉴定 |
| 2.8.2 单抗亚类的鉴定 |
| 2.8.3 单抗与H9N2 PA蛋白的WB反应性鉴定 |
| 2.8.4 单抗与H9N2 PA蛋白的IFA反应性鉴定 |
| 2.8.5 单抗识别抗原表位区域的初步鉴定 |
| 2.8.6 单克隆抗体8G3的通用性鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 sPA基因的扩增 |
| 3.2 pET-28a(+)-H9N2-sPA载体的鉴定 |
| 3.3 His-sPA重组蛋白的表达纯化和鉴定 |
| 3.4 小鼠三免血清的鉴定 |
| 3.4.1 小鼠三免血清的ELISA效价鉴定 |
| 3.4.2 小鼠三免血清的WB反应性鉴定 |
| 3.5 阳性细胞株的获得 |
| 3.6 单克隆抗体特性的鉴定 |
| 3.6.1 单抗亚类和腹水ELISA效价的鉴定 |
| 3.6.2 单抗与H9N2 PA蛋白的WB反应性鉴定 |
| 3.6.3 单抗与H9N2 PA蛋白的IFA反应性鉴定 |
| 3.6.4 单抗识别抗原表位区域的初步鉴定 |
| 3.6.5 单克隆抗体8G3的通用性鉴定 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 常用试剂与配方 |
（6）中和H7N9禽流感病毒全人源单克隆抗体的快速筛选及抗病毒机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 甲型流感病毒 |
| 1.1.1 甲型流感病毒的结构 |
| 1.1.2 血凝素HA |
| 1.1.3 H7N9 禽流感 |
| 1.2 全人源单克隆抗体 |
| 1.2.1 全人源单克隆抗体技术的研究进展 |
| 1.2.2 记忆B细胞PCR技术 |
| 1.3 中和流感病毒的全人源单克隆抗体 |
| 1.3.1 靶向HA杆部的中和抗体 |
| 1.3.2 靶向HA受体结合位点的中和抗体 |
| 1.3.3 靶向HA头部抗原位点A的中和抗体 |
| 1.3.4 没有中和活性的抗流感病毒人源抗体 |
| 1.4 本文选题及研究内容 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 伦理声明 |
| 2.2 耗材与试剂 |
| 2.3 病毒 |
| 2.4 重组蛋白的表达和多肽合成 |
| 2.5 稳定表达CD40 配体的细胞系构建 |
| 2.6 康复病人的血液收集 |
| 2.7 酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) |
| 2.8 记忆B细胞法制备全人源单克隆抗体 |
| 2.8.1 分选CD19+ IgM–IgA–IgD–B 细胞 |
| 2.8.2 记忆B细胞的激活、分化和培养 |
| 2.9 微量中和实验 |
| 2.10 抗体基因的克隆 |
| 2.11 抗体基因的表达和纯化 |
| 2.12 血凝抑制(Hemagglutination inhibition,HAI或 HI)实验 |
| 2.12.1 血凝(Hemagglutination,HA)实验 |
| 2.12.2 血凝抑制实验 |
| 2.13 抗体的特异性和亲和力检测 |
| 2.13.1 抗体的特异性结合检测(间接免疫荧光实验,Indirect immunofluorescent assay,IFA;流式细胞技术,Flow Cytometry) |
| 2.13.2 抗体结合抗原的亲和力检测 |
| 2.14 稳转抗体基因细胞株的构建以及抗体生产 |
| 2.14.1 稳转抗体基因细胞株的构建 |
| 2.14.2 抗体生产 |
| 2.15 中和抗体预防和治疗H7N9 病毒感染小鼠 |
| 2.16 ADCC实验 |
| 2.17 利用质谱(mass spectroscopy,MS)技术分析抗体的表位多肽 |
| 2.18 利用氢氘交换质谱(hydrogen deuterium exchange mass spectrometry,HDX-MS)分析抗体的抗原表位 |
| 2.19 H7N9 病毒逃逸突变株的筛选 |
| 2.20 膜融合抑制实验 |
| 2.21 统计学分析 |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1 记忆B细胞PCR技术筛选中和人源单克隆抗体 |
| 3.1.1 构建稳定表达人CD40L的 NTH-3T3 饲养细胞 |
| 3.1.2 流式分选记忆B细胞 |
| 3.1.3 活化记忆B细胞 |
| 3.1.4 筛选中和H7N9 病毒抗体 |
| 3.1.5 PCR克隆抗体基因 |
| 3.1.6 抗体基因瞬时转染和表达 |
| 3.1.7 抗体基因的稳转株构建和生产 |
| 3.2 抗H7N9 病毒人源单克隆抗体的中和活性 |
| 3.3 抗H7N9 病毒人源单克隆抗体的血凝抑制活性 |
| 3.4 抗H7N9 病毒人源单克隆抗体的特异性结合检测 |
| 3.5 抗H7N9 病毒人源单克隆抗体的亲和力检测 |
| 3.6 人源单克隆抗体预防和治疗H7N9 病毒感染的小鼠 |
| 3.6.1 评估人源抗体预防H7N9 病毒感染小鼠的能力 |
| 3.6.2 评估人源抗体治疗H7N9 病毒感染小鼠的能力 |
| 3.7 人源单克隆抗体的抗原表位鉴定(Epitope mapping) |
| 3.7.1 3L11 抗体的抗原表位鉴定 |
| 3.7.2 5J13 抗体的全新的抗原表位 |
| 3.8 3L11 抗体的保护机制研究 |
| 3.9 5J13 抗体的中和机制研究 |
| 3.9.1 位阻效应的研究 |
| 3.9.2 膜融合抑制作用的研究 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 快速筛选抗禽流感病毒人源抗体及鉴定中和表位 |
| 4.2 记忆B细胞PCR技术是研究流感病毒致病及变异新机制的重要工具 |
| 4.3 人源单克隆抗体3L11 及其保守的表位 |
| 4.4 人源单克隆抗体5J13 及其全新的中和表位 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 全人源单克隆抗体3L11 的研究结果 |
| 5.2 全人源单克隆抗体5J13 的研究结果 |
| 5.3 不足及下一步研究计划 |
| 5.4 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 博士期间发表的论文 |
| 博士期间申请的发明专利 |
（7）H5N1和H7N9亚型禽流感亚单位疫苗的制备及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表或符号表 |
| 1 前言 |
| 1.1 禽流感病毒 |
| 1.1.1 禽流感病毒概述 |
| 1.1.2 H5N1亚型禽流感流行现状 |
| 1.1.3 H7N9亚型禽流感流行现状 |
| 1.2 禽流感疫苗的研究进展 |
| 1.2.1 全病毒灭活疫苗 |
| 1.2.2 DNA疫苗 |
| 1.2.3 重组病毒载体疫苗 |
| 1.2.4 基因工程亚单位疫苗 |
| 1.3 杆状病毒表达系统在禽流感疫苗研究中的应用 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒和细胞 |
| 2.1.2 菌种和质粒 |
| 2.1.3 实验动物及鸡胚 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 抗生素配制 |
| 2.1.6 细菌培养试剂配制 |
| 2.1.7 常用试剂的配制 |
| 2.1.8 主要仪器和设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 禽流感病毒的培养 |
| 2.2.2 禽流感病毒基因组RNA的提取及反转录 |
| 2.2.3 引物的设计与合成 |
| 2.2.4 重组质粒pACE-HA5和pACE-HA7的构建与鉴定 |
| 2.2.5 重组杆状病毒BV-HA5和BV-HA7的获得 |
| 2.2.6 禽流感H5N1和H7N9亚型HA蛋白的表达及鉴定 |
| 2.2.7 免疫原性分析及攻毒保护试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组质粒pACE-HA5和pACE-HA7的鉴定 |
| 3.2 重组穿梭载体Bacmid-HA5和Bacmid-HA7的鉴定 |
| 3.3 重组杆状病毒BV-HA5和BV-HA7的获得 |
| 3.4 间接免疫荧光法鉴定HA蛋白的表达 |
| 3.5 H5N1和H7N9 HA蛋白血凝效价的测定 |
| 3.6 H5N1和H7N9 HA蛋白的Western-Blot鉴定 |
| 3.7 HI抗体检测 |
| 3.8 攻毒保护试验结果 |
| 3.8.1 存活率 |
| 3.8.2 排毒情况 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（8）禽流感病毒调控鸭TRAF3介导抗病毒天然免疫的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 常用英文缩略词 |
| 1 前言 |
| 1.1 禽流感病毒的研究进展 |
| 1.1.1 禽流感病毒的结构与分子基础 |
| 1.1.2 流感病毒引起的宿主先天性免疫应答的研究 |
| 1.2 抗病毒天然免疫研究进展 |
| 1.2.1 家禽识别病毒RNA模式识别受体的研究进展 |
| 1.2.2 家禽Toll样受体的研究进展 |
| 1.2.3 家禽RIG-I样受体的研究进展 |
| 1.2.4 TRAFs蛋白的研究进展 |
| 1.2.5 TRAF3的研究进展 |
| 1.2.6 TRAF3 参与Toll样受体的信号传导途径 |
| 1.2.7 TRAF3 参与RIG-I样受体的信号传导途径 |
| 1.2.8 TRAF3与禽流感病毒蛋白分子相互作用的研究进展 |
| 1.2.9 鸭TRAF3蛋白功能研究 |
| 1.3 研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 载体和质粒 |
| 2.1.2 毒株、抗体与细胞 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 部分试剂配方 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.1.6 分子生物学软件 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鸭胚成纤维细胞(DEF)制备 |
| 2.2.2 病毒感染DEF |
| 2.2.3 RNA抽提 |
| 2.2.4 反转录 |
| 2.2.5 引物设计 |
| 2.2.6 PCR扩增 |
| 2.2.7 PCR产物纯化回收 |
| 2.2.8 回收产物酶切 |
| 2.2.9 酶切产物连接 |
| 2.2.10 构建真核表达质粒 |
| 2.2.11 转染用质粒及细胞的准备 |
| 2.2.12 细胞转染 |
| 2.2.13 细胞裂解 |
| 2.2.14 荧光素酶报告基因检测 |
| 2.2.15 相对荧光定量PCR检测 |
| 2.2.16 免疫印迹检测 |
| 2.2.17 免疫共沉淀检测 |
| 2.2.18 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鸭TRAF3的克隆及功能区的预测 |
| 3.1.1 鸭TRAF3的克隆 |
| 3.1.2 鸭TRAF3的序列分析 |
| 3.1.3 鸭TRAF3的结构预测 |
| 3.1.4 鸭TRAF3及其截短体的克隆 |
| 3.2 鸭TRAF3 介导RLRs信号通路的研究 |
| 3.2.1 鸭TRAF3的蛋白表达 |
| 3.2.2 鸭TRAF3截短体的蛋白表达 |
| 3.2.3 鸭RIG-I的蛋白表达 |
| 3.2.4 鸭TRAF3 对禽IFN-β启动子的激活 |
| 3.2.5 鸭TRAF3对IFN-I信号通路的激活 |
| 3.2.6 鸭TRAF3 及其截短体与鸭MAVS的互作分析 |
| 3.3 禽流感病毒H5N1/NS1 调控鸭TRAF3 介导信号通路的研究 |
| 3.3.1 禽流感病毒H5N1/NS1 对鸭TRAF3 功能的影响 |
| 3.3.2 禽流感病毒H5N1/NS1 与鸭TRAF3 的互作分析 |
| 3.3.3 禽流感病毒H5N1/NS1 影响鸭TRAF3 与鸭MAVS的互作分析 |
| 4 全文讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.2 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（9）H7N9禽流感病毒PA-X基因多态性分析与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 多肽在流感病毒研究中的应用 |
| 1.1 多肽在流感病毒疫苗研究中的应用 |
| 1.2 多肽在抗流感病毒中的作用及其作用机制 |
| 1.3 基于噬菌体展示库技术筛选流感病毒蛋白的多肽抑制剂 |
| 1.4 多肽在流感病毒诊断试剂中的应用 |
| 2 流感病毒PA-X蛋白的研究进展 |
| 2.1 PA-X抑制宿主蛋白表达(host-shutoff)现象的发现和功能区的鉴定 |
| 2.2 PA-X蛋白介导host-shutoff的潜在调控机制 |
| 2.3 PA-X在调控宿主先天和后天免疫反应中的作用 |
| 2.4 PA-X对流感病毒致病性的影响 |
| 2.5 与PA-X蛋白相互作用的宿主因子 |
| 参考文献 |
| 第二章 PA-X基因多态性分析及多肽水平研究PA-X基因多态性的功能 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 PA-X基因序列、质粒、多肽与细胞 |
| 1.2 主要试剂、试剂盒 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 分子生物学软件 |
| 1.5 生物信息学分析软件 |
| 1.6 细胞凋亡与坏死检测 |
| 1.7 双荧光素酶报告系统检测实验 |
| 1.8 小鼠实验 |
| 2 结果 |
| 2.1 PA-X基因多态性分析 |
| 2.2 多肽合成 |
| 2.3 多肽对RAW264.7细胞凋亡与坏死的影响 |
| 2.4 多肽对宿主蛋白表达的影响 |
| 2.5 多肽对小鼠的致病性 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 蛋白水平研究PA-X基因多态性的功能 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 病毒、质粒、引物、菌株与细胞 |
| 1.2 主要试剂、试剂盒 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 分子生物学软件 |
| 1.5 真核表达载体的构建 |
| 1.6 双荧光素酶报告系统检测实验 |
| 1.7 Western Blotting |
| 1.8 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 GD15-PA-X基因的扩增 |
| 2.2 pCAGGS-GD15-PA-X-Flag表达载体的构建 |
| 2.3 Western Blot检测GD15-PA-X蛋白 |
| 2.4 不同pCAGGS-PAX表达载体抑制绿色荧光蛋白表达实验 |
| 2.5 不同pCAGGS-PAX表达载体抑制pRL-TK的表达 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 病毒水平研究PA-X基因多态性的功能 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 病毒、菌株、质粒与细胞 |
| 1.2 主要试剂、试剂盒 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 分子生物学软件 |
| 1.5 病毒拯救 |
| 1.6 拯救病毒的生物学特性分析 |
| 1.7 病毒生长曲线测定 |
| 1.8 病毒聚合酶活性测定 |
| 1.9 小鼠致病性实验 |
| 1.10 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 pHW2000-PA基因点突变修饰与重组病毒的拯救 |
| 2.2 重组病毒部分生物学特性分析 |
| 2.3 三株重组病毒对小鼠致病力的差异 |
| 2.4 三株重组病毒在小鼠体内的复制能力 |
| 2.5 三株重组病毒攻毒小鼠肺脏组织病理切片 |
| 2.6 三株重组病毒对小鼠细胞因子应答的影响 |
| 2.7 三株重组病毒在MDCK细胞上的复制情况 |
| 2.8 重组病毒聚合酶活性 |
| 2.9 流感病毒PA基因第100位氨基酸位点分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（10）蛋白芯片方法检测AIV抗体并区分其H5和H7亚型抗体的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 禽流感病毒的研究进展 |
| 1.1 禽流感病毒概述 |
| 1.2 病原学 |
| 1.3 禽流感病毒的危害及公共卫生意义 |
| 2 禽流感病毒的诊断方法 |
| 2.1 病毒分离鉴定 |
| 2.2 分子生物学诊断技术 |
| 2.3 血清学诊断技术 |
| 3 禽流感病毒单克隆抗体的研究进展 |
| 4 蛋白芯片技术 |
| 4.1 蛋白芯片技术的原理 |
| 4.2 蛋白芯片技术的应用 |
| 4.3 蛋白芯片技术的优点 |
| 5 研究的目的和意义 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 病毒、细胞、鸡胚和实验动物 |
| 1.2 菌株、载体以及主要生物试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 病毒的增殖及纯化 |
| 2.2 动物免疫 |
| 2.3 间接ELISA筛选方法的建立 |
| 2.4 细胞融合 |
| 2.5 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 2.6 杂交瘤细胞株的亚克隆 |
| 2.7 单克隆抗体腹水的制备 |
| 2.8 单克隆抗体的鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 H5N6抗原的制备 |
| 3.2 间接ELISA方法的建立 |
| 3.3 免疫小鼠效价的测定 |
| 3.4 细胞融合 |
| 3.5 杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.6 抗体效价测定 |
| 3.7 单克隆抗体亚型测定 |
| 3.8 单克隆抗体特异性检测 |
| 3.9 Western blot检测 |
| 3.10 IFA检测 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 H5N1-HA1、H7N3-HA1和H3N2-NP重组蛋白的表达与纯化 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 RNA的提取 |
| 2.2 反转录 |
| 2.3 目的基因的扩增 |
| 2.4 感受态细胞的制备 |
| 2.5 原核表达载体的构建 |
| 2.6 重组蛋白在原核系统中的表达 |
| 2.7 抗原的制备 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 目的基因的扩增 |
| 3.2 重组载体的鉴定 |
| 3.3 重组蛋白的诱导表达与筛选 |
| 3.4 重组蛋白的鉴定 |
| 3.5 重组蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳结果 |
| 3.6 重组蛋白纯化后的western blot分析结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 AIV及其H5和H7亚型抗体蛋白芯片检测方法的构建及优化 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 蛋白芯片的原理示意图 |
| 2.2 蛋白芯片的制备 |
| 2.3 禽流感和其他禽病病毒的阳性血清的制备 |
| 2.4 H5、H7和NP阻断MAbs的筛选 |
| 2.5 蛋白芯片检测条件的优化 |
| 2.6 蛋白芯片方法的特异性 |
| 2.7 蛋白芯片方法的敏感性 |
| 2.8 蛋白芯片重复性试验 |
| 2.9 蛋白芯片试剂盒有效性验证 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 禽流感和禽病毒病的阳性血清的制备 |
| 3.2 H5、H7和NP阻断MAbs的筛选 |
| 3.3 蛋白芯片检测条件的优化 |
| 3.4 蛋白芯片方法优化后的具体操作步骤 |
| 3.5 蛋白芯片方法的特异性 |
| 3.6 蛋白芯片方法的敏感性 |
| 3.7 蛋白芯片重复性试验 |
| 3.8 蛋白芯片试剂盒有效性验证 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
四、H7亚型禽流感病毒血凝素基因的真核表达载体的构建及鉴定（论文参考文献）
- [1]H7N9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的生物学特性与保护效力评价[D]. 赵江艳. 扬州大学, 2021
- [2]H9N2亚型禽流感病毒HA和NP蛋白单克隆抗体的制备及在抗原变异分析中的初步应用[D]. 孙兰. 扬州大学, 2020(01)
- [3]表面展示禽流感病毒抗原酿酒酵母菌株的构建及其生物学特性研究[D]. 孟薇. 天津大学, 2020(02)
- [4]基于重组杆状病毒昆虫细胞悬浮培养系统的H7N9 VLP新型疫苗的研究[D]. 李如梦. 扬州大学, 2020(04)
- [5]禽流感病毒的流行株序列分析及PA单克隆抗体的制备[D]. 张锐. 浙江大学, 2020(01)
- [6]中和H7N9禽流感病毒全人源单克隆抗体的快速筛选及抗病毒机制研究[D]. 李俊鑫. 中国科学院大学(中国科学院深圳先进技术研究院), 2019(02)
- [7]H5N1和H7N9亚型禽流感亚单位疫苗的制备及免疫原性研究[D]. 孔德鑫. 华南农业大学, 2019(02)
- [8]禽流感病毒调控鸭TRAF3介导抗病毒天然免疫的分子机制[D]. 赵冰兵. 华南农业大学, 2019
- [9]H7N9禽流感病毒PA-X基因多态性分析与功能研究[D]. 马春喜. 扬州大学, 2019
- [10]蛋白芯片方法检测AIV抗体并区分其H5和H7亚型抗体的初步研究[D]. 肖倩. 南京农业大学, 2019(08)