一、胚胎干细胞体外分化心肌细胞的研究（论文文献综述）
熊挺淋,应梦慧,张丽莎,张晓刚,杨燕[1]（2022）在《诱导多能干细胞分化的心肌细胞电生理特点》文中进行了进一步梳理背景:诱导多能干细胞定向分化后移植治疗解决了免疫排斥及伦理问题,其向心肌细胞的定向分化为心肌细胞再生研究提供了可能。目的:观察诱导多能干细胞分化的心肌细胞电生理功能。方法:体外培养诱导多能干细胞,采用直接悬浮培养法及分化培养基诱导形成拟胚体,观察细胞生长情况,记录心肌细胞的形成时间、数目和收缩率;使用Axon Axopatch 200B单探头超低噪声膜片钳放大器及MED64多电极阵列系统检测心肌细胞的电生理特点,以及观察分化心肌细胞对异丙肾上腺素的反应性;免疫荧光检测分化心肌细胞中心肌肌钙蛋白T的表达。结果与结论:（1）诱导多能干细胞生长特点与胚胎干细胞相似,形似鸟巢,呈集落样生长;（2）在分化培养基培养下,悬浮培养5 d后诱导多能干细胞聚集而形成大小不一的拟胚体,在拟胚体贴壁生长期间,最高将近10%的菌落出现跳动的心肌细胞,第20天和第25天时的搏动率明显高于其他时间点,差异有显着性意义（P <0.05）;（3）诱导多能干细胞分化的心肌细胞观察到了心室、心房和窦房结样细胞的动作电位;（4）异丙肾上腺素可以提高诱导多能干细胞分化的心肌细胞自发搏动频率;（5）细胞免疫荧光提示诱导多能干细胞分化的心肌细胞中肌钙蛋白T呈阳性表达;（6）结果表明,诱导多能干细胞分化的心肌细胞具有窦房结样、心房样和心室样的动作电位,且具有肾上腺素信号传导。
张晖[2]（2021）在《LncRNA NRON通过shp2调控Wnt/β-catenin信号通路参与心肌分化》文中认为第一部分LncRNA NRON在小鼠和TOF胚胎心脏中的表达及细胞分布背景:既往研究表明,lncRNA NRON与心肌病、心力衰竭及肿瘤发生等相关,在细胞质中可以作为scaffold与其他蛋白质组成复合体参与蛋白质的失活、转运,或作为“sponge”隔离mi RNA,参与与调节蛋白质的功能。这些研究所关注都是的lncRNA NRON与发育完成后的心脏疾病的关系,到目前为止没有文献报道lncRNA NRON与发育中的心脏或先天性心脏病的关系。法洛四联症（TOF）是复杂先天性心脏病中表型最多且最常见的类型,可以作为和心脏发育相关的研究对象。目的:阐明lncRNA NRON与发育中的心脏及TOF的相关性,并明确其在心肌细胞中的分布。方法:（1）收集C57BL/6J小鼠胚胎期（E9.5,E10.5,E11.5,E13.5天,E14.5）,生后7天（P7）及成年（Adult）的心脏,提取RNA后RT-PCR扩增lncRNA NRON,进行DNA凝胶电泳,构建lncRNA NRON时间表达谱。（2）利用RT-qPCR技术检测lncRNA NRON在C57BL/6J小鼠不同时期的表达量差异,从而明确与小鼠心脏发育时间的关联性。（3）收集人类平均胎龄在20周的正常胚胎心脏和TOF胎儿心脏各8例,取右心室组织提取RNA后RT-qPCR检测lncRNA NRON的表达量,观察两组间是否存在差异以明确lncRNA NRON与TOF的相关性。（4）利用RNAFish及亚细胞分离技术对lncRNA NRON进行心肌细胞亚定位。结果:（1）lncRNA NRON在小鼠胚胎发育的E10.5天开始表达,此后的胚胎期至成年均稳定表达。（2）lncRNA NRON的表达量并不均一,从E10.5至P7,呈现上升趋势,此后至成年时又逐渐下降。（3）与对照组相比,TOF组胚胎心脏中lncRNA NRON呈现明显低表达,差别有统计学意义（P<0.0001）。（4）在hESCs诱导分化的心肌细胞（h ESC-CM,HCM）及AC16人心肌细胞中,80%的NRON定位在细胞核中。结论:（1）lncRNA NRON的表达时间与小鼠心脏发育关键时间窗具有部分重合性,可能参与小鼠心脏的发育。（2）lncRNA NRON低表达和TOF的发生具有相关性。（3）lncRNA NRON主要分布在心肌细胞胞核中,为研究其在胞核中的作用奠定基础。第二部分敲除LncRNA NRON抑制hESCs向正常心肌细胞分化背景:先天性心脏病的发生与心肌分化异常密不可分。既往研究表明,多个和心肌分化相关的核心转录因子（NKX2.5、TBX5、GATA4）及信号通路（Wnt信号通路、TGF-β信号通路）的异常均和TOF的发生相关,提示心肌分化异常在TOF的发生中可能占据主导地位,任何导致心肌分化异常的因素均可能成为TOF的发生原因之一。第一部分研究发现,lncRNA NRON同心脏发育及TOF发生具有相关性,但同心肌分化的关系尚未明确。目的:利用人胚胎干细胞（hESCs）可以向心肌分化的特性研究敲除lncRNA NRON对心肌分化的影响。方法:（1）利用epi CRISPR技术构建hESCs细胞lncRNA NRON敲除株（NRON-KO hESCs）及空载对照细胞株（empty-vector hESCs）,内部引物（238bp）及外部引物（292bp）PCR产物凝胶电泳挑选纯合敲除和杂合敲除株,外部引物PCR产物测序验证敲除成功。（2）对构建好的两组细胞株进行体外诱导分化,电子显微镜观察分化过程中形态差异,细胞免疫荧光观察心肌细胞标志物差异。（3）RT-qPCR检测不同分化时期标志基因的表达差异。结果:（1）从50个单克隆细胞群落中成功挑选出2个纯合敲除细胞株和45个杂合敲除细胞株,外部引物PCR产物测序结果与敲除后连接片段序列一致,证明敲除成功。（2）empty-vector hESCs组细胞在诱导分化第8天开始看到第一簇跳动的心肌细胞,到第12天几乎90%以上的细胞可以看到跳动。而NRON-KO hESCs组细胞在分化期间及结束后始终未发现可以搏动的心肌细胞。细胞免疫荧光证实仅有少数细胞可见c Tn T标记,且荧光量明显低于对照组。（3）RT-qPCR结果显示,早期中胚层标志基因T和MIXL1的表达显着受到抑制（P<0.001）;心脏发育核心转录因子基因NKX2.5、MEF2C和GATA4转录水平在第4天、第6天和第8天时均显着低于对照组（P<0.001）,由此产生的结果是诱导分化的细胞相关的心肌标志物（ANP,BNP,α-MHC,β-MHC,TNNT2及TNNT3）的表达几乎消失（P<0.0001）。结论:敲除lncRNA NRON可以阻碍hESCs向功能性心肌细胞分化,表明lncRNA NRON对hESCs向心肌细胞分化必不可少。第三部分LncRNA NRON促进shp2在细胞核聚集激活Wnt/β-catenin信号通路参与心肌分化背景:shp2蛋白在细胞核中可去磷酸化Parafibromin,促进其与β-catenin形成复合体,从而激活经典Wnt信号通路。我们采用的体外分化方案是通过使用小分子物质调控Wnt/β信号通路即可完成hESCs向心肌分化,且心肌细胞分化效率高达98%。前两部分研究结果提示,lncRNA NRON主要定位在心肌细胞胞核中,敲除lncRNA NRON后hESCs不能分化成功能性心肌细胞。根据分化方案推测敲除lncRNA NRON可能对Wnt/β-catenin信号通路产生了干扰而导致hESCs无法向心肌细胞分化。目的:验证lncRNA NRON对Wnt/β-catenin信号通路的调控及可能参与的蛋白质,进一步研究NRON参与心肌细胞发育调控及其潜在的机制。方法:（1）RT-qPCR检测诱导分化4天时敲除组与对照组中Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因的转录水平,包括cyclin D1,Myc及Axin2。（2）构建NRON过表达质粒载体（pc DNA-NRON）,利用双荧光素酶报告基因检测lncRNA NRON对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用。同时将构建好的NRON-KO hESCs和empty-vector hESCs细胞株分别提取RNA送测序。（3）提取AC16人心肌细胞胞核蛋白,利用RNA Pulldown及质谱分析技术（MS）寻找细胞核内与lncRNA NRON互作的蛋白质,Western blot（WB）验证结果。（4）WB检测对照组与敲除组中与NRON互作的蛋白质表达的差异。（5）利用双荧光素酶报告基因检测与NRON互作蛋白质的抑制剂对lncRNA NRON激活的Wnt/β-catenin信号通路的作用。（6）在AC16人心肌细胞中过表达lncRNA NRON,通过激光共聚焦观察对NRON互作蛋白细胞定位的影响。结果:（1）与empty-vector hESCs相比,Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因cyclin D1,Myc以及Axin2在NRON-KO hESCs组均表现为明显的下调,差别有统计学意义（P<0.001）,而β-catenin的表达未受影响（P>0.05）。（2）与仅转染β-catenin的细胞相比,同时转染pc DNA-NRON和β-catenin的HEK293T细胞的TOPflash活性提高了2倍,差别有统计学意义（P<0.01）。这一现象在仅转染pc DNA-NRON的细胞中也可以见到。（3）对敲除组和空载组细胞进行RNA-seq及KEEG富集分析,发现在NRON-KO hESCs细胞株中表达下调的基因在Wnt信号通路富集。（4）RNA Pulldown-MS发现shp2蛋白与NRON特异性结合,这一结果得到了WB的支持。（5）双荧光素酶报告实验显示由NRON过表达增加的TOPflash活性,在加入shp2的强效抑制剂TNO155后,TOPflash活性急剧下降了10倍以上,且差别有统计学意义（P<0.001）。（6）WB分析显示,shp2蛋白表达量在empty-vector h ESC组与NRON-KO h ESC组之间无差异,提示shp2可能不是NRON的靶基因（target gene）,而是一个伙伴基因（partner gene）。（7）激光共聚焦结果显示在同样密度的AC16心肌细胞中转染pc DNA-NRON,shp2主要聚集在细胞核内,而在转染空载的AC16细胞中,shp2主要聚集在细胞质内。结论:（1）lncRNA NRON可以激活经典的Wnt信号通路。（2）lncRNA NRON在细胞核内与shp2相互作用,通过促进shp2核聚集激活Wnt/β-catenin信号通路参与调控心肌分化。
蔡泽坡[3]（2021）在《c-Jun在人胚胎干细胞多能性维持与退出中的研究》文中进行了进一步梳理多能干细胞具有自我更新和向三胚层细胞分化的潜能,是细胞命运调控机理研究的理想细胞模型,在再生治疗方面具有广阔应用前景。然而,在实际应用到临床上时仍存在很多问题,主要原因包括对多能干细胞在命运决定过程中的机理研究还不够透彻,多能性维持与退出调控机制仍未清楚。本实验室前期研究结果表明c-Jun通过调控Ss18形成相变等途径显着影响小鼠胚胎干细胞多能性维持与退出,同时作为核心多能性基因Oct4的“平行镜面因子”拮抗多能性获得,并提出了体细胞与多能干细胞的界面假说。然而,c-Jun在人胚胎干细胞命运决定过程中所起的作用还知之甚少,与小鼠体系存在哪些异同点仍不清楚。本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建c-Jun敲除的人胚胎干细胞系,结合形态特征、检测多能性基因表达与畸胎瘤形成等实验判断,发现c-Jun敲除对人胚胎干细胞多能性维持和三胚层分化早期阶段没有显着影响。为了进一步确定c-Jun在人胚胎干细胞多能性退出及其向三胚层后期终末谱系功能细胞分化过程中的功能调控作用,本研究分别通过人胚胎干细胞定向分化至心肌细胞、肝脏细胞、肾脏细胞、神经细胞、体节前体细胞、定型内胚层细胞,发现c-Jun敲除显着抑制人胚胎干细胞向心肌细胞分化,但促进向肝脏细胞分化,这与已报道的c-Jun敲除小鼠抑制肝细胞分化、对心肌细胞分化无影响的表型不同。另外,c-Jun敲除对人胚胎干细胞向定型内胚层细胞、体节前体细胞、肾脏细胞以及神经细胞分化没有显着影响,这与已报道的c-Jun敲除小鼠对这些细胞发育分化没有影响的表型一致。本研究对c-Jun在人胚胎干细胞多能性维持与退出中所起的作用进行了初步研究,为进一步探索多能干细胞命运决定以及比较研究c-Jun在不同物种的谱系功能细胞命运调控中的作用机制奠定理论基础,对未来多能干细胞更加安全有效应用于临床研究与疾病治疗具有重要的理论指导意义。
肖倩茹[4]（2020）在《基于人头发丝支架的体外三维心肌组织的构建及其收缩性能的研究》文中研究指明目前,心血管疾病仍然是威胁人类健康的头号杀手。心血管疾病的传统药物开发和研究主要依赖于动物模型,但由于种间差异,动物模型并不能很好地模拟人体心脏的真实环境,因此,即便这些药物顺利地通过了动物实验,也有较大可能在临床上表现出很强的毒副作用,最终不得不被撤回。因此,针对心血管疾病的药物开发仍然面临着巨大的挑战。近年来,科研人员们致力于利用人源细胞构建体外心脏模型的研究。体外心脏模型可以更真实地模拟人体心脏的生理和功能环境,有效提高临床前药物评估的安全性和可靠性。本论文主要研究了人源心肌细胞的来源,并利用人头发丝作为支架材料构建体外心肌组织,研究了体外心肌组织的收缩性能。由于成人心肌细胞是终末分化细胞,缺乏增殖和再生的能力,因此,体外人源心肌细胞的获取主要依赖于干细胞分化。人多能干细胞,包括人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞,具有很强的增殖能力以及在特定条件下向不同细胞系分化的潜能。本文主要通过小分子诱导法和商用试剂盒法两种方法来诱导人诱导多能干细胞向心肌细胞方向分化。小分子诱导法首先通过糖原合成激酶3抑制剂CHIR99021分子来激活Wnt信号通路,然后再利用IWR-1分子来抑制Wnt信号通路,从而诱导人诱导多能干细胞分化为心肌细胞。而商用试剂盒法则是通过在不同的培养时间点添加不同的试剂,来获得心肌细胞。通过比较两种方法我们可以发现,小分子诱导法成本较低,可以获得单层收缩的心肌细胞,而商用试剂盒法虽然成本较高,但其心肌分化效率也更高。两种分化方法在我们后续的体外心肌组织构建和研究实验中均有涉及。在确定心肌细胞的来源以后,我们采用了人头发丝作为支架材料来构建体外心肌组织。首先,我们构建了以短直头发丝作为悬挂模板的体外心肌组织（心肌条）并对其进行了长期培养。结果表明,头发丝作为悬挂模板有助于悬挂心肌条的形成,心肌条可以很好地在头发丝之间收缩,并且该支架可以支持心肌条的长期培养（最长培养时间达118天）。随后,我们又将人头发丝制备成弹簧结构,并将头发丝弹簧与短直头发丝一起组合作为支架,来构建心肌组织,并研究了头发丝弹簧与短直头发丝的不同组合方式对心肌组织的收缩性能的影响。结果表明,头发丝弹簧的引入可以使得体外工程化心肌组织的收缩更具有立体感,并且明显提升工程化心肌组织的收缩性能。最后,为了更定量地了解体外心肌组织的收缩力,我们制备了一系列不同直径和不同长度的头发丝弹簧,并测量了弹簧的弹性系数,我们发现头发丝弹簧的弹性系数可以低至0.019 N/m,与原子力显微镜用于测量细胞的探针的弹性系数相当,足以测量心肌组织的收缩力。于是,我们用头发丝弹簧和两根短直头发丝组建了一个测量心肌组织收缩力的装置。该装置可以在体外心肌组织的培养过程中,实时地通过视频观察,测算出心肌组织的收缩力。
范洁[5]（2020）在《多梳家族蛋白PHC1在人胚胎干细胞定向分化为心肌细胞中的作用》文中指出由于胚胎干细胞的多能性使其在再生和移植医学,建立疾病模型,药物筛选和人类发育生物学领域得到持续的关注和发展。与体细胞类型不同,多能干细胞仅在胚胎发生的最初几天短暂存在,并且没有能够在体内长时间维持多能性的环境,因此实验室中的hPSCs都是依靠细胞培养条件,各种通路信号刺激和合适的培养方法及模式维持hPSCs多能性并促进其分化过程。心脏的形成是一个复杂的过程,包含了细胞的快速特化和分化以及相关基因按照时间、空间规律顺序的激活和表达。这种基因严格按照时间、空间规律有序的激活并表达很大程度上由表观遗传修饰调控所决定的。多梳家族蛋白（Polycomb group proteins,PcG）是维持基因稳定表现及决定细胞命运的重要表观遗传分子,在细胞标识和维持适当分化过程中起关键作用,PHC1是PcG蛋白中重要组成部分。本论文尝试建立胚胎干细胞向心肌细胞体外分化体系并通过免疫荧光鉴定心肌细胞特有蛋白表达,通过实时定量PCR鉴定分化过程中中胚层、心生中胚层、心肌前体细胞、成熟心肌细胞基因标记物。然后构建shRNA进行胚胎干细胞PHC1敲降,在确定敲降不会影响细胞多能性维持的情况下在心肌分化未开始前和心肌分化中后期进行PHC1敲降,接着构建带标签的PHC1过表达质粒经过电转至胚胎干细胞,经潮霉素筛选后开始心肌细胞分化以确定PHC1在hESCs定向分化为心肌细胞过程中的作用。实验发现通过免疫荧光和实时定量PCR鉴定,确认诱导干细胞分化为心肌细胞的体系已建立;shRNA特异性敲降干细胞中PHC1对胚胎干细胞增殖和存活影响并不大,NANOG和OCT4、SOX2在转录水平仍旧有较高表达;过表达PHC1没有影响核心转录因子NANOG和OCT4、SOX2的表达;PHC1通过MESP1调控心肌分化前期阶段即中胚层形成时期来影响心脏发育。对进一步认识心肌分化与PcG之间的关系打下基础,也为临床通过胚胎干细胞治疗心脏疾病提供思路。
廖英男[6]（2020）在《人类多能干细胞向心肌谱系定向分化机制研究》文中认为研究背景与目的:人多能干细胞向心肌分化为体外研究人类心脏发育提供了独特的机会,为心脏再生提供了潜在的细胞来源。然而,与研究心脏成熟和心肌细胞亚型特异性诱导的大量研究相比,多能干细胞早期心肌谱系命运决定的分子事件机制研究仍然欠缺。另一方面,能够催化染色质结构发生改变的酶——染色质重塑复合物,通常组装成多亚基的复合体来发挥功能,对于真核生物的基因转录、细胞周期发展、DNA复制和损伤修复具有至关重要的意义。尽管染色质重塑复合物对于心脏正常发育很重要,但染色质重塑复合物在心肌分化过程中如何行使其功能的机理仍知之甚少。研究报道,作为SWI/SNF染色质重塑复合物四大家族之一的INO80复合物可参与许多生物学过程,包括DNA修复、转录和复制中起着重要的调控作用。INO80复合物可以结合在胚胎干细胞主要转录因子基因的启动子区域,保持染色质区域的开放,已经发现INO80复合物突变与心血管疾病有关,但尚未探索INO80复合物在体外心肌分化过程中的作用。本研究旨在利用单细胞测序技术从单细胞水平探究早期心肌细胞命运决定过程以及探究染色体重塑复合物INO80调控心肌命运决定过程中的作用机制。研究方法:采用单细胞测序对分化过程中六个关键时间点（T0、T2、T5、T9、T14、T60）细胞进行单细胞测序;进一步通过免疫荧光技术验证T5四类细胞亚群代表蛋白的表达;构建shRNA敲低ETS1、INO80表达,通过定量RT-PCR检测心肌特异性基因表达变化;RNA-seq分析敲低INO80后差异基因的表达;采用ChIP-seq,Mnase-seq进行机制研究。研究结果:为揭示在分化过程中从多能干细胞状态下控制心肌谱系命运决定的关键分子事件和调控因子,我们首先对心肌分化过程中不同阶段细胞进行了单细胞RNA-Seq测序,获得了人类胚胎干细胞心肌分化过程6个阶段的6879个单细胞的高质量数据,并鉴定了具有明显分子特征的多个细胞亚群,包含有多能干细胞亚群、早期中内胚层细胞亚群、晚期中内胚层细胞亚群、心肌祖细胞亚群、内胚层样细胞亚群、心肌细胞亚群等。通过构建心肌分化的发育轨迹图谱和假定的配体-受体相互作用分析,我们发现T5的内胚层细胞存在调节心肌祖细胞的潜在的旁分泌途径,这可能为第5天的心肌谱系命运决定提供一个细胞微环境。此外,单细胞RNA测序数据的计算分析揭示了 ETS1（ETS原癌基因1）的激活是由心肌祖细胞和内胚层细胞间的相互联系引起的一个重要的下游分子信号事件。与单细胞分析的结果一致,针对ETS1染色质免疫沉淀的高通量测序（ChIP-Seq）显示ETS1在第9天和第14天的心脏结构基因中的基因组的占位,而构建shRNA敲低ETS1则显着影响心肌分化过程。Western blot检测发现在心肌分化过程中染色质重塑复合物INO80在心脏祖细胞阶段表达显着上调,并调节了心肌谱系命运决定的关键调控基因的转录。通过对心肌分化的每个关键阶段进行INO80的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）,确定了INO80的5种全基因组结合模式,其中群集4显示出从多能干细胞阶段到心肌细胞阶段结合逐渐增加,该群集基因显着富集在心肌发育通路上。蛋白质组学分析揭示了心肌分化过程中INO80亚基的独特组合组装。我们的数据进一步确定了 BRG1,SWI/SNF染色质重塑核心亚基,与目标基因的转录调控所需的INO80发生物理相互作用并在功能上相互合作。与表观遗传动力学的联合分析阐明了 INO80和H3K4me3在心肌分化中的相互作用。最后,构建shRNA敲低INO80会导致终末分化心肌细胞的生长迟缓。研究结论:本研究不仅揭示了体外心肌分化过程中不同细胞类型的分子特征,确定了 ETS1是由细胞间相互联系引起的心肌谱系命运决定过程中的关键因素,并且发现了INO80对于诱导心脏祖细胞过程中关键的心脏特异性基因的转录激活至关重要,同时建立了不同的依赖ATP染色质重塑复合物在人类胚胎干细胞心肌分化中的相关性,从而为了解人类胚胎早期心脏发育以及再生医学中心脏分化的定向操控提供了重要实验依据和理论基础。
李文静[7]（2019）在《NLRP3基因修饰猪的制备及RYR2突变的hiPSC建立并初步向心肌分化的研究》文中认为(1)利用TALENs/CRISPR技术制备NLRP3基因修饰猪背景:转基因抗病猪、高品质猪等拥有巨大的经济前景和社会效益。因为猪的胚胎干细胞系尚未建立,所以常用的方法是将体细胞基因修饰与体细胞核移植技术相结合产生克隆猪。但是由于体细胞的扩增代数有限,且体细胞打靶效率较低,定点基因修饰猪的推广受到限制。ZFN、TALENs和CRISPR技术的相继诞生使得基因定点敲除变得更为高效。人类NLRP3（NACHT,LRR and PYD domains-containing protein 3）基因第260位氨基酸发生错意突变（R260W）会导致NLRP3炎症小体的激活而产生自身炎症性疾病。小鼠、猪在人类NLRP3 R260W基因致病突变位点的是保守的,小鼠对应氨基酸突变位点为R258W,猪对应氨基酸突变位点为R259W。在小鼠R258W突变的模型中,NLRP3炎症小体的活化并未表现出严重的炎症反应,而是导致其抗病力增强。提示我们通过在猪上模拟NLRP3基因的相同突变可能制备出抗病能力增强的克隆猪。此外,我们拟同时制备NLRP3基因敲除猪模型,通过对比NLRP3基因敲除猪和定点突变猪的各项生理指标差异,共同作为NLRP3炎性体相关疾病机理的大型动物模型。方法:我们分别利用TALENs、CRISPR基因修饰技术,在猪成纤维细胞上分别筛选出基因编辑活性较高的TALENs组合以及gRNA位点,然后分别将TALENs、CRISPR基因修饰技术与同源重组技术相结合,用于制备NLRP3基因修饰的猪成纤维细胞系。然后再结合体细胞核移植技术（SCNT）,将重组胚胎体外培养后移植到受体母猪中,用于制备NLRP3敲除/定点修饰的转基因猪。结果:我们构建出针对猪NLRP3基因的TALENs打靶载体,以及用作同源重组模板的单链DNA（ssDNA）,并筛选出活性最高的TALENs组合;同时构建了针对猪NLRP3基因的CRISPR基因编辑系统打靶载体,以及相应的ssDNA。我们利用CRISPR/Cas9基因修饰技术,获得了 10株NLRP3敲除的猪成纤维细胞系。我们利用CRISPR/Cpf1基因修饰技术结合同源重组技术,获得了 3株NLRP3定点突变的猪成纤维细胞系。我们将获得的NLRP3敲除/定点突变的猪成纤维细胞作为供体细胞,通过体细胞核移植技术和胚胎移植技术,成功获得了 28头NLRP3R259W纯合突变的克隆猪,1头NLRP3基因双拷贝敲除13bp的克隆猪。结论:我们模拟人自然发生的NLRP3基因突变,结合TALENs/CRISPR基因定点敲除技术、同源重组技术以及体细胞核移植技术,成功制备了 NLRP3基因修饰的克隆猪,以供进一步的研究。（2）RYR2突变的iPSCs建立和初步分化背景:诱导多能干细胞的出现为疾病模型的建立提供了新的思路。由于可以从患者自身的很多易得的细胞来源（例如尿液、皮肤成纤维细胞）诱导,且具有与胚胎干细胞相似的多能性,因此hiPSCs可用于建立个性化疾病模型,且不存在伦理问题,大大拓展了精准医学的范围。儿茶酚胺多形性室性心动过速Ⅰ型（CPVT1）是一种由兰尼碱受体2型基因（RYR2）单基因突变导致的遗传性心脏病。RYR2基因突变导致了心脏功能的紊乱,以应激诱发的室性心律失常为特征,每年会导致大量年轻人猝死。因此,建立RYR2单基因突变导致的遗传性心脏病iPSCs并将其分化成心肌细胞,对于研究疾病机理,进行药物筛选等方面具有重要意义。方法:本研究利用慢病毒系统将Yamanaka四因子（Oct4、Sox2、Klf4和Nanog）整合到儿茶酚胺多形性室性心动过速I型（CPVT1）患者的皮肤成纤维细胞中,将其诱导成为iPSCs,并通过形态,表面抗原,基因表达,多能细胞特异性基因的表观遗传状态等方面验证其多能性。然后,再将iPSCs在体外定向分化成心肌细胞,并鉴定心肌细胞的特异性标志物的表达情况,从而初步建立RYR2单基因突变导致的遗传性心脏病模型。结果:我们鉴定了一名儿茶酚胺多形性室性心动过速I型（CPVT1）患者的基因型特征,从该患者皮肤成纤维细胞诱导出了 2株hiPSCs。通过对获得的hiPSCs干细胞标记物染色,可见其表现出很强的碱性磷酸酶活性,且表达Oct4和Nanog以及胚胎干细胞细胞特异性表面抗原,包括阶段特异性胚胎抗原-3（SSEA3）,阶段特异性胚胎抗原-4（SSEA4）,肿瘤相关抗原TRA-1-60,TRA-1-81。通过对hiPSCs的Oct4基因启动子区域进行了去甲基化程度分析,确认2株hiPSCs,即iPS-2和iPS-4的Oct4基因启动子区域均被很大程度地去甲基化。通过实时荧光定量PCR的方法,发现hiPSCs中多能性基因的表达量显着高于成纤维细胞（P<0.01）。通过采用RT-PCR方法,发现hiPSCs分化得到的拟胚体（EB）的三个胚层标志基因的表达量是hiPSCs的5～50倍,证明hiPSCs具有在体外分化成三个胚层的潜能。通过将hiPSCs接种非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷（NOD-SCID）小鼠获得的畸胎瘤切片进行HE染色,证明hiPSCs具有在体内分化成三个胚层的潜力。我们还通过联重复技术（STR）检测确定了 iPS细胞为单一细胞来源,不存在交叉污染现象。以上证明我们诱导得到的hiPSCs具有很高的多能性。然后我们对RYR2 iPSCs进行了定向诱导分化,分化11天后可以观察到细胞有自发的跳动簇。我们采用RT-PCR检测发现跳动的细胞中心肌发育相关的早期基因的表达量为hiPSCs的20～40倍。结论:我们成功诱导了儿茶酚胺多形性室性心动过速I型（CPVT1）患者特异性iPS细胞系2株,并证明其具有很强的多能性。我们初步将iPS细胞向心肌细胞定向分化,可以观察到心肌细胞有节律收缩现象,并高表达心肌特异性标志物。但由于本研究处于初步探索阶段,心肌分化方案尚需完善,功能性验证实验尚未涉及,有待进行进一步研究。
方星[8]（2019）在《MIR148A家族在人多能干细胞心肌分化过程中的功能及其机制研究》文中提出人胚胎干细胞（Human embryonic stem cells,hESCs）可在体外分化为心肌细胞,在心脏发育和疾病研究、细胞治疗、药物筛选和毒性分析等方面具有巨大的应用潜力。目前的心肌细胞诱导方法仍存在效率低、稳定性差和异质性高等问题,限制了干细胞衍生心肌细胞的临床研究和转化。MicroRNAs（miRNAs）是一类长约22个碱基的非编码RNAs,能够特异性结合靶mRNA,并直接降解mRNA或者抑制蛋白质翻译,在心脏发育和心肌分化过程中发挥重要作用。本研究发现MIR148A家族成员MIR148A、MIR148B和MIR152的表达水平在hESCs向心肌细胞分化进程中显着升高。为探索MIR148A家族在心肌分化中的功能,本研究利用 CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9）基因组编辑技术分别建立了 MIR148A家族三个成员的单敲除hESCs系和全敲除hESCs系（MIR148A-TKO）。研究显示,三个MIR148A家族成员单敲除并不影响hESCs的心肌分化效率,且单敲除hESCs系中的MIR148A家族成员间具有剂量补偿作用。MIR148A-TKO细胞具有与野生型hESCs相似的自我更新和三胚层分化能力。与野生型hESCs相比,MIR148A-TKO细胞的心肌细胞分化效率显着降低;而过表达MIR152显着提高MIR148A-TKO细胞和野生型hESCs的心肌分化效率。本研究利用实时定量PCR方法进一步证实,MIR148A家族成员全敲除并不影响原条形成相关基因（T、MIXL1）的表达水平,但显着抑制侧板中胚层标志分子（MESP1、FOXF1）及随后心肌前体细胞标志分子（ISL1、NKX2.5）的表达。通过对心肌分化第4天（侧板中胚层时期）样本进行高通量转录组分析（RNA-Seq）,本研究筛选到1837个在MIR148A-TKO和hESCs衍生细胞中差异表达的基因。功能聚类分析表明,在MIR148A-TKO分化细胞中上调的基因主要为轴旁中胚层及体节发育相关基因,而下调的基因主要为侧板中胚层和心肌发育相关基因。信号通路聚类分析显示,NOTCH信号通路相关基因在MIR148A-TKO衍生细胞中显着富集。TargetScan预测和荧光素酶活性分析进一步证实NOTCH信号通路的配体DLL1是MIR148A家族的直接靶基因。shRNA介导的DLL1干涉可显着抑制MIR148A-TKO衍生细胞中NOTCH信号下游基因的表达,提高MIR148A-TKO细胞的心肌分化效率。结论:MIR148A家族成员在hESCs心肌分化过程中表达水平显着上调,MIR148A家族成员全部敲除不影响hESCs本身的自我更新和分化能力,但显着降低心肌细胞分化效率。在心肌分化过程中,MIR148A家族成员可通过抑制DLL1-NOTCH信号通路来维持hESCs向侧板中胚层和心肌前体细胞分化进程;MIR148A家族成员全敲除将解除其对DLL1-NOTCH信号通路的抑制作用,进而促进多能干细胞向轴旁中胚层及体节细胞分化,抑制侧板中胚层及心肌细胞的分化。本研究阐明了 MIR148A家族在多能干细胞向心肌细胞分化过程中的功能和调控机制,为研究心肌细胞分化和发育机理,建立和优化心肌细胞分化方法提供了新依据。
苗淑梅[9]（2019）在《视黄酸调控人胚胎干细胞向心肌细胞分化和成熟的功能研究》文中提出心血管疾病严重威胁着人类健康,其死亡率已跃居疾病死亡原因的首位。因此,亟需找到有效的治疗方式。胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）具有无限增殖、多向分化潜能等特征,因此在再生医学领域具有巨大的潜力。利用胚胎干细胞诱导的心肌细胞,可应用于疾病模型诊断、药物筛选和心肌修复,作为潜在的高效细胞治疗手段,其具有非常广阔的应用前景。然而,利用人胚胎干细胞诱导产生的心肌细胞（Human embryonic stem cell derived cardiomyocytes,hESC-CMs）,还存在心肌分化效率低、亚型不均一以及心肌细胞成熟度低等问题。视黄酸（Retinoic acid,RA）信号通路在心脏发育过程中具有多重作用。前期数据结果表明,与视黄酸合成相关的基因Stra6在老鼠发育的中胚层特异性表达。在此基础上,我们首先采用人的心肌细胞定向分化系统,研究显示STRA6在中胚层和跳动后均高表达,表明其在中胚层和心肌成熟过程中可能发挥重要作用。因此,本课题系统的研究了视黄酸在心肌分化和成熟过程中的作用,为干细胞的临床转化应用提供了新的方法。我们通过在心肌分化过程中的不同时间段进行RA处理,系统地研究了RA通路在心肌分化和成熟过程中的作用。利用实时荧光定量PCR发现,视黄酸在第2-4天处理能显着的促进侧板中胚层的分化,进而促进下游谱系心肌细胞的特异性基因TNNT2,NKX2.5和MYH6的表达。流式细胞术结果表明,视黄酸处理后的心肌细胞比例显着提高;同时,心房肌标志分子MYL7和SLN明显增加,表明RA主要促进心房肌细胞的分化。为了研究RA对心肌细胞成熟的作用,我们通过代谢筛选的方法对定向分化的心肌细胞,进行了纯化,然后在不同时间段添加视黄酸。结果表明,与心肌细胞结构性成熟有关的基因表达显着上调。我们通过免疫荧光、膜片钳和能量代谢的实验方法分别从结构、电生理和代谢这三个方面揭示视黄酸处理能诱导心肌成熟。实验结果表明,视黄酸在心肌跳动后的第15-20天处理显着的增加细胞面积、肌小节的长度、多核率和线粒体拷贝数。在电生理水平上,膜片钳结果表明视黄酸处理后的心肌细胞的APD50、APD90明显提高。更重要地,视黄酸处理后的心肌细胞的糖酵解能力下降,线粒体氧化磷酸化水平增加,同时能更加有效的利用脂肪酸和丙酮酸作为能量来源。上述研究结果表明,在心肌分化的早期时间窗（第2-4天）进行视黄酸处理,能够促进侧板中胚层的分化,进而提高心肌细胞的分化效率;在心肌跳动之后的第15-20天进行视黄酸处理,能有效的促进心肌细胞的结构、电生理和代谢成熟。视黄酸在心肌分化过程中的作用为心肌细胞的分化效率和心肌质量的提高提供了新的思路。
秦念慈[10]（2019）在《人胚胎干细胞衍生心肌细胞对不同心肌损伤模型的治疗效果研究》文中研究说明缺血性心肌病是由心肌缺血缺氧引起的一类心脏疾病,主要表现为心肌细胞死亡、心肌纤维化和心脏功能受损,并最终导致心力衰竭。因其死亡人数逐年上升,缺血性心肌病已成为人类健康的主要杀手之一,有效预防和治疗这类疾病已迫在眉睫。多能干细胞因具有自我更新能力和多向分化潜能,在缺血性心肌病治疗中展现出广阔的应用前景。但干细胞治疗缺血性心肌病的适应症、疗效和作用机制仍有待深入研究。本课题主要研究人胚胎干细胞衍生心肌细胞治疗小鼠永久缺血（Permanent ischemia,PI）和缺血再灌注（Ischemic reperfusion,IR）心肌损伤的疗效。本研究首先利用基因编辑技术构建了可进行活体示踪的人胚胎干细胞细胞系（ESC-Rep）,该细胞系可通过CAG启动子驱动表达copGFP、HSVtk和Fluc三个报告基因。体外研究显示,ESC-Rep仍具有干细胞的自我更新能力和多向分化潜能,并可在体外高效分化为跳动的心肌细胞（ESC-Rep-CMs）。ESC-Rep-CMs依然表达起初引入的三个报告基因,且荧光素酶活性信号强度与细胞数量成线性正相关,可用于移植细胞的体内示踪。本研究随后比较了移植ESC-Rep-CMs在PI和IR小鼠受损心肌组织中的驻留和修复作用。小动物活体成像和组织切片免疫荧光技术均可在受体心脏中检测到ESC-Rep-CMs的驻留,且移植细胞驻留率在PI和IR模型追踪中无明显差别。心脏超声结果显示,在PI小鼠心肌损伤模型中,心肌细胞治疗后的心脏收缩功能指标,包括射血分数（Ejection fraction,EF）和缩短分数（Fractional shortening,FS）,均显着升高,心脏舒张功能指标,包括舒张早期血流峰值速度（E）与心脏舒张晚期血流峰值速度（A）的比值（E/A）,以及二尖瓣环舒张早期峰值速度（E’）与二尖瓣环舒张晚期峰值速度（A’）的比值（E’/A’）,均明显上调;但心肌细胞移植对IR心肌损伤治疗效果不明显。Masson染色结果显示,心肌细胞移植可显着减小PI组小鼠心梗面积,对IR组小鼠心梗面积则无明显影响。为探究引起两种模型治疗效果差异的原因,我们检测了小鼠血清中的炎症因子表达和心脏组织中髓过氧化物酶（MPO）活性,发现心肌细胞移植可显着抑制PI组小鼠中促炎因子（TNF-α和IL-6）的表达,并促进抑炎因子（IL-10）的表达;而炎症相关因子的表达水平在对照和心肌细胞移植后的IR小鼠中无明显差异。我们进一步利用体外心肌纤维化模型证实,促炎因子TNF-α显着促进TGF-β诱导的纤维化,而抑炎因子IL-10对纤维化程度有明显的抑制作用。因此,本课题研究结果表明人胎干细胞衍生心肌细胞能够改善永久缺血小鼠心脏收缩和舒张功能,对缺血再灌注小鼠受损心脏的治疗效果不明显;人胚胎干细胞衍生心肌细胞通过降低心脏缺血后的炎症反应程度来延缓纤维化进程,从而改善心脏功能。
二、胚胎干细胞体外分化心肌细胞的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、胚胎干细胞体外分化心肌细胞的研究（论文提纲范文）
（1）诱导多能干细胞分化的心肌细胞电生理特点（论文提纲范文）
| 0引言Introduction |
| 1 材料和方法Materials and methods |
| 1.1 设计 |
| 1.2 时间及地点 |
| 1.3 材料 |
| 1.3.1 实验所用细胞 |
| 1.3.2 实验试剂和仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 诱导多能干细胞培养 |
| 1.4.2 拟胚体的制备 |
| 1.4.3 诱导拟胚体向心肌细胞分化 |
| 1.4.4 电生理检测 |
| 1.4.5 免疫荧光染色 |
| 1.5 主要观察指标 |
| 1.6 统计学分析 |
| 2 结果Results |
| 2.1 诱导多能干细胞和拟胚体的形态 |
| 2.2 诱导多能干细胞分化的心肌细胞形态及收缩率 |
| 2.3 诱导多能干细胞分化的心肌细胞电生理学特征 |
| 2.4 异丙肾上腺素对诱导多能干细胞分化的心肌细胞电活动的影响 |
| 2.5 免疫荧光染色结果 |
| 3 讨论Discussion |
（2）LncRNA NRON通过shp2调控Wnt/β-catenin信号通路参与心肌分化（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 LncRNA NRON在小鼠和TOF胚胎心脏中的表达及细胞分布 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 敲除LncRNA NRON抑制hESC向正常心肌细胞分化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 LncRNA NRON促进shp2在细胞核聚集激活Wnt/β-catenin信号通路 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 唐氏综合征相关先天性心脏病发生分子机制研究进展 |
| References |
| 致谢 |
| 攻读学位期间完成的学术论文和研究成果 |
（3）c-Jun在人胚胎干细胞多能性维持与退出中的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 多能干细胞 |
| 1.2 c-Jun与细胞命运调控 |
| 1.3 CRISPR/Cas9 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 试剂耗材 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 确定敲除策略,设计sgRNA |
| 2.2.2 构建质粒PX330-sgRNA-PURO |
| 2.2.3 sgRNA切割活性鉴定 |
| 2.2.4 将sgRNA质粒转入h ESCs中 |
| 2.2.5 PCR鉴定基因型 |
| 2.2.6 测序 |
| 2.2.7 荧光定量PCR |
| 2.2.8 蛋白质印迹法 |
| 2.2.9 RNA-seq文库构建与分析 |
| 2.2.10 人胚胎干细胞向肝细胞分化 |
| 2.2.11 人胚胎干细胞向体节前体细胞分化 |
| 2.2.12 人胚胎干细胞向肾脏细胞分化 |
| 2.2.13 人胚胎干细胞向心肌细胞分化 |
| 2.2.14 人胚胎干细胞向神经细胞分化 |
| 2.2.15 畸胎瘤检测 |
| 2.2.16 HE染色 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 用于敲除c-Jun的 sgRNA质粒的构建 |
| 3.2 sgRNA切割效率验证 |
| 3.3 c-Jun敲除人胚胎干细胞的构建及其对多能性维持的影响 |
| 3.3.1 .c-Jun敲除人胚胎干细胞的构建 |
| 3.3.2 .畸胎瘤检测c-Jun敲除人胚胎干细胞向三胚层早期分化 |
| 3.3.3 .RNA-seq检测比较分析c-Jun敲除人胚胎干细胞转录组变化 |
| 3.4 c-Jun敲除对人胚胎干细胞向不同胚层谱系终末分化的影响 |
| 3.4.1 c-Jun敲除显着促进人胚胎干细胞向肝细胞分化 |
| 3.4.2 c-Jun敲除显着抑制人胚胎干细胞向心肌细胞分化 |
| 3.4.3 c-Jun敲除对人胚胎干细胞向体节前体细胞分化没有显着影响 |
| 3.4.4 c-Jun敲除对人胚胎干细胞向肾脏细胞分化没有显着影响 |
| 3.4.5 c-Jun敲除对人胚胎干细胞向神经细胞分化没有显着影响 |
| 讨论与总结 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 综述 人多能干细胞诱导分化为骨骼肌相关细胞的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历及攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（4）基于人头发丝支架的体外三维心肌组织的构建及其收缩性能的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 心血管疾病的研究现状 |
| 1.1.1 心血管疾病的发病原因及危害 |
| 1.1.2 心血管疾病的治疗及面临的挑战 |
| 1.2 干细胞 |
| 1.2.1 干细胞概述 |
| 1.2.2 胚胎干细胞 |
| 1.2.3 成体干细胞 |
| 1.2.4 诱导多能干细胞 |
| 1.3 心脏组织工程 |
| 1.3.1 体外心肌细胞的来源 |
| 1.3.2 生物材料支架在心脏组织工程方面的应用 |
| 1.3.3 力的测量在心脏组织工程方面的应用 |
| 1.4 本论文的主要研究工作 |
| 参考文献 |
| 第二章 体外诱导人诱导多能干细胞向心肌细胞方向分化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂与仪器 |
| 2.2.2 人诱导多能干细胞的培养及表征 |
| 2.2.3 小分子诱导人诱导多能干细胞向心肌细胞方向分化 |
| 2.2.4 心肌分化试剂盒诱导人诱导多能干细胞向心肌细胞方向分化 |
| 2.2.5 心肌细胞的表征 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 人诱导多能干细胞的形态特征 |
| 2.3.2 小分子诱导分化所得的心肌细胞的形态及收缩性能 |
| 2.3.3 心肌分化试剂盒诱导分化所得的心肌细胞的形态及收缩性能 |
| 2.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于人头发丝的三维平台用于体外工程化心肌组织的长期培养 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂与仪器 |
| 3.2.2 人头发丝的形态表征 |
| 3.2.3 心肌细胞的形态表征 |
| 3.2.4 基于人头发丝的三维细胞培养平台的搭建 |
| 3.2.5 基于人头发丝平台的体外工程化心肌组织的构建及长期培养 |
| 3.2.6 体外工程化心肌组织的表征 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 人头发丝的微观形态 |
| 3.3.2 心肌细胞的形态 |
| 3.3.3 体外工程化心肌组织的形态随时间的变化 |
| 3.3.4 体外工程化心肌组织的收缩性能随时间的变化 |
| 3.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 基于人头发丝弹簧的三维平台用于体外心肌组织的培养 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂与仪器 |
| 4.2.2 人头发丝弹簧的制备 |
| 4.2.3 两种基于人头发丝弹簧的三维平台的搭建 |
| 4.2.4 基于人头发丝弹簧的体外心肌组织的构建与培养 |
| 4.2.5 基于人头发丝弹簧的体外工程化心肌组织的收缩性能的表征 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 基于人头发丝弹簧的支架的制备 |
| 4.3.2 基于人头发丝弹簧的体外工程化心肌组织的构建 |
| 4.3.3 基于人头发丝弹簧的体外工程化心肌组织的收缩性能 |
| 4.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 人头发丝弹簧用于体外心肌组织收缩力测量的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 试剂与仪器 |
| 5.2.2 不同直径和不同长度的人头发丝弹簧的制备 |
| 5.2.3 人头发丝弹簧的弹性系数的测量 |
| 5.2.4 人头发丝弹簧的循环拉伸试验 |
| 5.2.5 人头发丝弹簧的结构变化表征 |
| 5.2.6 基于人头发丝弹簧的心肌细胞收缩力的测量装置的搭建 |
| 5.2.7 体外工程化心肌组织的培养及其收缩力的测量 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 不同直径和不同长度的人头发丝弹簧的制备 |
| 5.3.2 不同直径和不同长度的人头发丝弹簧的弹性系数测量结果 |
| 5.3.3 人头发丝弹簧的结构变化 |
| 5.3.4 人头发丝弹簧的1000 次循环拉伸试验结果 |
| 5.3.5 人头发丝弹簧用于体外工程化心肌组织的收缩力测量的结果 |
| 5.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 论文总结 |
| 6.2 论文的创新点 |
| 6.3 论文的后续工作及展望 |
| 攻读博士学位期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（5）多梳家族蛋白PHC1在人胚胎干细胞定向分化为心肌细胞中的作用（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 诱导胚胎干细胞定向分化的进展 |
| 1.1.1 胚胎干细胞体外培养体系的方法研究 |
| 1.1.2 胚胎干细胞体外培养模式的研究 |
| 1.1.3 胚胎干细胞体外自我更新与分化中的通路研究 |
| 1.2 多梳蛋白家族和PHC1蛋白研究进展 |
| 1.2.1 多梳家族蛋白结构特征 |
| 1.2.2 多梳家族蛋白功能研究 |
| 1.2.3 多梳家族蛋白与细胞命运之间的关系 |
| 1.2.4 多梳家族蛋白与心脏疾病之间的关系 |
| 1.3 本论文研究目的及意义 |
| 第二章 人胚胎干细胞定向分化为有心肌功能的细胞 |
| 2.1 实验试剂和仪器 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞复苏 |
| 2.2.2 Matrigel铺板 |
| 2.2.3 胚胎干细胞传代与培养 |
| 2.2.4 胚胎干细胞冻存 |
| 2.2.5 胚胎干细胞定向分化为心肌细胞 |
| 2.2.6 免疫荧光鉴定心肌细胞 |
| 2.2.7 提取细胞RNA |
| 2.2.8 逆转录合成CDNA |
| 2.2.9 实时荧光定量PCR |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 胚胎干细胞分化过程示意图及分化情况 |
| 2.3.2 免疫荧光鉴定分化细胞 |
| 2.3.3 分化各阶段蛋白标记物表达情况 |
| 2.3.4 分化过程中PcG家族基因表达 |
| 2.4 实验讨论 |
| 第三章 shRNA敲降PHC1 对胚胎干细胞的影响 |
| 3.1 实验试剂和仪器 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 配置试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 酶切载体 |
| 3.2.2 构建PHC1寡核苷酸序列 |
| 3.2.3 双链DNA合成 |
| 3.2.4 T4连接酶连接质粒与DNA双链 |
| 3.2.5 制作感受态细菌 |
| 3.2.6 质粒导入感受态细菌 |
| 3.2.7 质粒去内毒素小提中量提取 |
| 3.2.8 慢病毒包装,收集 |
| 3.2.9 病毒感染hESCs |
| 3.2.10 Western Blot检测PHC1 敲降效果 |
| 3.2.11 Annexin-FITC/PI双染法测细胞凋亡 |
| 3.2.12 PI染色法检测细胞周期 |
| 3.2.13 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 PHC1 介入慢病毒载体的shRNA序列鉴定 |
| 3.3.2 shRNA敲降PHC1 效率检测 |
| 3.3.3 shRNA敲降PHC1对hESCs周期和凋亡的影响 |
| 3.3.4 shRNA敲降PHC1对hESCs多能性的影响 |
| 3.4 实验讨论 |
| 第四章 敲降PHC1对hESCs诱导为心肌细胞的影响 |
| 4.1 实验试剂和仪器 |
| 4.1.1 实验试剂 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 分化前病毒感染hESCs |
| 4.2.2 第七天病毒感染分化中的hESCs |
| 4.2.3 提取RNA,逆转录CDNA,荧光定量PCR,WB |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 定向分化前敲降PHC1后分化情况 |
| 4.3.2 定向分化第七天敲降PHC1后分化情况 |
| 4.4 实验讨论 |
| 第五章 过表达PHC1对hESCs诱导为心肌细胞的影响 |
| 5.1 实验试剂和仪器 |
| 5.1.1 实验试剂 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 PB-CAG供体质粒的构建 |
| 5.2.2 扩增PHC1目的基因片段 |
| 5.2.3 胶回收Phc1-flag载体 |
| 5.2.4 回收目的条带凝胶 |
| 5.2.5 同源重组连接PB-CAG载体和目标PHC1-FLAG片段 |
| 5.2.6 转化感受态细胞 |
| 5.2.7 去内毒素提取质粒 |
| 5.2.8 293T细胞验证质粒效率 |
| 5.2.9 Lonza电转PB-CAG-PHC1-FLAG和 PB辅助质粒 |
| 5.2.10 支原体检测 |
| 5.2.11 细胞计数 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 酶切PB-CAG质粒 |
| 5.3.2 同源重组后PCR验证连接片段 |
| 5.3.3 构建质粒图谱 |
| 5.3.4 293T验证质粒效果 |
| 5.3.5 过表达PHC1对细胞多能性的影响 |
| 5.3.6 过表达PHC1对MESP1 的影响 |
| 5.3.7 过表达PHC1对心肌前体细胞发育的影响 |
| 5.3.8 PCR检测支原体感染 |
| 5.4 实验讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读学位期间发表的论文与科研成果清单 |
| 致谢 |
（6）人类多能干细胞向心肌谱系定向分化机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 前言 |
| 一、体外多能干细胞向心肌谱系定向分化的单细胞测序研究 |
| 二、染色质重塑复合物INO80在心肌谱系命运决定中的作用及其机制研究 |
| 第二章 实验材料及实验方法 |
| 1. 实验试剂及耗材 |
| 2. 主要设备 |
| 3. 主要溶液配制配方 |
| 4. hESC的体外培养 |
| 4.1 H1干细胞的传代 |
| 4.2 H1干细胞的冻存 |
| 4.3 H1干细胞的分化 |
| 5. 单细胞测序文库的制备 |
| 5.1 消化单细胞悬液 |
| 5.2 单细胞测序 |
| 6. scRNA-Seq数据生物信息学分析 |
| 6.1 预处理 |
| 6.2 scRNA-Seq数据聚类和轨迹重建 |
| 6.3 基因本体分析,KEGG富集和GSEA分析 |
| 6.4 定量表征细胞间相互作用 |
| 6.5 基因调控网络分析 |
| 7. shRNA 构建 |
| 7.1 pLKO.1-TRC克隆载体 |
| 7.2 设计shRNA寡核苷酸 |
| 7.3 将寡核苷酸与pLKO.1载体相容 |
| 7.4 克隆寡核苷酸进入pLKO.1载体 |
| 7.5 酶切pLKO.1-TRC克隆载体 |
| 7.6 连接与转化 |
| 7.7 筛选克隆 |
| 8. 染色质免疫共沉淀高通量测序(ChIP-seq) |
| 8.1 固定交联 |
| 8.2 封闭磁珠&结合抗体 |
| 8.3 细胞超声 |
| 8.4 染色体免疫沉淀 |
| 8.5 洗脱和逆转交联 |
| 8.6 消化蛋白和RNA |
| 8.7 DNA建库 |
| 8.8 测序分析 |
| 9. 免疫组化 |
| 9.1 脱蜡、水化 |
| 9.2 抗原修复 |
| 9.3 抗原阻断 |
| 9.4 孵育一抗 |
| 9.5 孵育二抗 |
| 9.6 显色 |
| 10. 免疫荧光 |
| 10.1 固定和封闭 |
| 10.2 抗体孵育 |
| 11. 流式细胞术 |
| 11.1 收集细胞 |
| 11.2 固定细胞 |
| 11.3 透膜 |
| 11.4 染色 |
| 12. 293T细胞的培养、传代和冻存 |
| 12.1 293T细胞的复苏 |
| 12.2 293T细胞的传代 |
| 12.3 293T细胞的冻存 |
| 13. 慢病毒包装 |
| 14. 细胞转染 |
| 15. 质粒DNA的提取 |
| 16. RNA提取 |
| 17. 反转录及荧光定量PCR |
| 17.1 逆转录聚合酶链反应 |
| 17.2 荧光定量PCR |
| 18. 细菌转化 |
| 19. Western Blot蛋白质免疫印迹 |
| 19.1 蛋白样本制备 |
| 19.2 蛋白质定量 |
| 19.3 蛋白质电泳 |
| 19.4 转膜 |
| 19.5 封闭及抗体孵育 |
| 20. 免疫沉淀和质谱联用(IP-MS) |
| 20.1 细胞裂解 |
| 20.2 细胞超声 |
| 20.3 磁珠孵育抗体 |
| 20.4 磁珠孵育裂解物 |
| 20.5 收集磁珠和洗脱 |
| 20.6 溶解 |
| 21. 免疫共沉淀(co-IP) |
| 21.1 细胞裂解 |
| 21.2 细胞超声 |
| 21.3 磁珠孵育抗体 |
| 21.4 磁珠孵育裂解物 |
| 21.5 收集磁珠和洗脱 |
| 21.6 溶解 |
| 21.7 蛋白质电泳 |
| 21.8 转膜 |
| 21.9 封闭及抗体孵育 |
| 22. RNA测序建库 |
| 22.1 捕获 mRNA |
| 22.2 mRNA洗脱、破碎和启动 |
| 22.3 第一链合成 |
| 22.4 二链合成与A-加尾 |
| 22.5 Adapter连接 |
| 22.6 连接后第一次清洗 |
| 22.7 连接后第二次清理 |
| 22.8 文库扩增 |
| 22.9 扩增产物清洗 |
| 23. 统计分析 |
| 第三章 实验结果及结论 |
| 一、体外多能干细胞向心肌定向分化的单细胞测序 |
| 1. 心肌分化的单细胞测序分析 |
| 2. 重建人胚胎干细胞心肌分化发育轨迹图 |
| 3. 内胚层细胞与心肌祖细胞之间的信号转导可能调节心肌谱系命运决定 |
| 4. ETS1作为调节心脏谱系命运决定过程中细胞-细胞相互作用的重要下游因子 |
| 5. ETS1与心肌分化高度相关 |
| 6. ETS1直接调控心脏基因促进心脏分化 |
| 7. 讨论 |
| 二、染色质重塑复合物INO80在心肌谱系命运决定中的作用及其机制研究 |
| 1. INO80在心肌分化过程中的心肌祖细胞阶段被诱导表达 |
| 2. INO80表达的缺失导致异常的心肌分化 |
| 3. INO80的动态占位与分化过程中的心肌发育高度相关 |
| 4. INO80与靶基因的转录激活密切相关 |
| 5. 染色质重塑复合物INO80在心肌分化过程中具有独特的亚基组成 |
| 6. INO80与SWI/SNF染色质重塑家族的核心亚基BRG1直接相互作用,以调节其靶基因表达 |
| 7. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 综述 |
| 第一部分 人多能干细胞向心肌细胞方向分化发展与现状 |
| 1. 前言 |
| 2. 新生心肌细胞的运用 |
| 3. 心脏形成 |
| 4. 人类多能干细胞向心肌方向分化方法进展 |
| 5. 人类多能干细胞来源的心肌细胞的发展现状 |
| 6. 展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 染色体重塑复合物INO80的生物学功能 |
| 1. 前言 |
| 2. 染色体重塑复合物INO80的亚基组成 |
| 3. 染色体重塑复合物INO80的基本生物学功能 |
| 4. 染色体重塑复合物INO80在心血管疾病中的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）NLRP3基因修饰猪的制备及RYR2突变的hiPSC建立并初步向心肌分化的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 基因修饰猪的研究进展 |
| 1.1 基因修饰动物的发展 |
| 1.2 基因修饰猪具有巨大的应用潜力和需求 |
| 1.2.1 基因修饰猪在遗传育种中的应用 |
| 1.2.2 基因修饰猪可以作为生物反应器合成药物 |
| 1.2.3 基因修饰猪在人类疾病动物模型中的应用 |
| 1.2.4 基因修饰猪可作为异种器官移植的首选供体 |
| 1.3 基因打靶技术的飞速发展突破了传统的基因修饰猪面临的难题 |
| 1.3.1 基因修饰猪的制造方式 |
| 1.3.2 基因修饰方式 |
| 第二章 NLRP3炎症小体的研究进展 |
| 2.1 模式识别受体 |
| 2.2 炎症小体 |
| 2.3 NLRP3炎症小体 |
| 2.4 人类自然发生的NLRP3突变导致的疾病 |
| 2.5 模拟人类自然发生的NLRP3突变,转基因小鼠抗病力增强 |
| 第三章 诱导多能干细胞技术的研究进展 |
| 3.1 细胞多能性的探索 |
| 3.1.1 通过核移植重编程 |
| 3.1.2 通过与胚胎干细胞融合来实现重编程 |
| 3.1.3 用确定的转录因子进行重编程 |
| 3.2 iPSCs技术具有巨大的应用潜力 |
| 第四章 iPS细胞技术在构建心血管疾病模型的研究 |
| 4.1 基于hiPSC的人类心血管疾病模型的建立 |
| 4.1.1 心脏离子通道突变 |
| 4.1.2 心肌病 |
| 4.1.3 结构缺陷 |
| 4.1.4 代谢紊乱 |
| 4.2 疾病药物筛选 |
| 4.3 心脏再生医学 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第五章 利用CRISPR技术制备NLRP3基因修饰猪的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果与分析 |
| 5.3.1 猪胎儿成纤维细胞的准备 |
| 5.3.2 确定猪成纤维细胞的NLRP3基因序列 |
| 5.3.3 利用TALEN技术针对NLRP3基因进行基因修饰 |
| 5.3.4 利用CRISPR系统针对NLRP3基因进行基因修饰 |
| 5.3.5 通过体细胞核移植产生NLRP3敲除猪和R259W纯合突变猪 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 RYR2单基因突变心脏患者的ips建立和初步分化 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 实验方法 |
| 6.3 实验结果与分析 |
| 6.3.1 RYR2突变的ips建立 |
| 6.3.2 PS细胞的多能性检测 |
| 6.3.3 将iPS细胞向心肌细胞定向分化 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 结论 |
| 参考文献 |
（8）MIR148A家族在人多能干细胞心肌分化过程中的功能及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 多能干细胞及其在心血管疾病中的应用进展 |
| 1.1.1 多能干细胞概述 |
| 1.1.2 多能干细胞在心血管疾病中的应用研究 |
| 1.2 多能干细胞分化心肌细胞的研究进展 |
| 1.2.1 心脏发育与体外诱导心肌细胞分化的研究 |
| 1.2.2 多能干细胞分化心肌细胞方法的建立和优化 |
| 1.3 MicroRNAs在心脏发育和心肌细胞分化中的功能研究 |
| 1.4 MIR148A家族的生物学特征及功能 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验用细胞 |
| 2.1.2 主要实验仪器和设备 |
| 2.1.3 主要实验试剂耗材 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 MIR148A家族成员敲除CRISPR/Cas9质粒构建 |
| 2.2.2 MIR148A、MIR148A和MIR152过表达病毒的制备 |
| 2.2.3 人胚胎干细胞培养 |
| 2.2.4 MIR148A家族敲除系建立与鉴定 |
| 2.2.5 hESCs体外分化 |
| 2.2.6 流式细胞仪检测hESC-CMs诱导效率 |
| 2.2.7 免疫荧光法对心肌细胞染色分析 |
| 2.2.8 Trizol裂解法提取总RNA |
| 2.2.9 RT-qPCR检测mRNA和miRNA表达 |
| 2.2.10 Western blot检测蛋白表达 |
| 2.2.11 AP染色 |
| 2.2.12 EdU染色法测干细胞增殖能力 |
| 2.2.13 MIR148A-TKO分化样本RNA-Seq及分析 |
| 2.2.14 MIR148A家族靶基因预测 |
| 2.2.15 靶基因DLL1双荧光素酶活性测试 |
| 2.2.16 靶基因DLL1干涉载体构建 |
| 2.2.17 靶基因DLL1功能测试 |
| 2.2.18 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 MIR148A家族成员在心肌细胞分化过程中的表达分析 |
| 3.1.1 MIR148A家族成员在人源心肌细胞中高表达 |
| 3.1.2 MIR148A家族成员在hESCs分化心肌细胞中的表达上调 |
| 3.2 MIR148A家族敲除hESCs细胞系的建立 |
| 3.2.1 MIR148A家族敲除载体的构建 |
| 3.2.2 MIR148A家族敲除系的成功建立 |
| 3.2.3 MIR148A家族敲除系的基因型鉴定 |
| 3.2.4 MIR148A家族敲除系的mRNA水平表达验证 |
| 3.3 MIR148A家族在hESCs心肌分化中的功能研究 |
| 3.3.1 单敲除MIR148A家族成员不影响心肌细胞分化效率 |
| 3.3.2 全敲除MIR148A家族维持hESCs正常自我更新和多能性 |
| 3.3.3 全敲除MIR148A家族的hESCs系心肌分化效率降低 |
| 3.3.4 全敲除MIR148A家族hESCs系中过表达MIR152恢复心肌分化 |
| 3.3.5 WT系中过表达MIR152促进心肌分化效率 |
| 3.4 MIR148A家族影响心肌分化的机制分析 |
| 3.4.1 全敲除MIR148A家族影响中胚层亚型命运决定 |
| 3.4.2 MIR148A家族靶向调节DLL1介导的NOTCH信号通路 |
| 3.4.3 MIR148A家族靶基因DLL1抑制心肌分化效率 |
| 4 讨论 |
| 4.1 单敲除和全敲除MIR148A家族成员在心肌分化中的剂量补偿分析 |
| 4.2 MIR148A家族经由DLL1-NOTCH通路调节hESCs心肌分化 |
| 4.3 MIR148A家族和其它miRNAs协同调控心肌生成 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间主要科研成果 |
| 致谢 |
（9）视黄酸调控人胚胎干细胞向心肌细胞分化和成熟的功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 干细胞治疗心脏疾病的研究进展 |
| 1.1.1 心血管疾病的现状 |
| 1.1.2 心血管疾病的细胞治疗研究进展 |
| 1.2 人多能干细胞分化心肌细胞的研究现状 |
| 1.2.1 人多能干细胞分化为心肌细胞的现状 |
| 1.2.2 人多能干细胞分化为心肌成熟的研究进展 |
| 1.3 RA通路在心脏发育和体外心肌定向分化中的研究进展 |
| 1.3.1 RA通路的概述 |
| 1.3.2 RA通路在心脏发育中的研究 |
| 1.3.3 RA通路在体外诱导心肌分化中的研究进展 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 细胞 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要抗体 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 人胚胎干细胞的培养、传代与分化 |
| 2.2.2 免疫荧光 |
| 2.2.3 流式分析 |
| 2.2.4 RNA提取 |
| 2.2.5 反转录 |
| 2.2.6 实时荧光定量PCR |
| 2.2.7 细胞计数 |
| 2.2.8 基因组提取实验 |
| 2.2.9 线粒体拷贝数定量PCR |
| 2.2.10 膜片钳 |
| 2.2.11 线粒体染色 |
| 2.2.12 线粒体流式分析 |
| 2.2.13 糖酵解代谢检测 |
| 2.2.14 线粒体氧化磷酸化代谢检测 |
| 2.2.15 葡萄糖氧化磷酸化代谢检测 |
| 2.2.16 丙酮酸氧化磷酸化代谢检测 |
| 2.2.17 谷氨酰胺氧化磷酸化代谢检测 |
| 2.2.18 脂肪酸氧化磷酸化代谢检测 |
| 2.2.19 统计学分析 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 RA合成相关基因在胚层分化和心肌定向分化中的表达 |
| 3.1.1 RA合成相关基因在不同胚层中的表达模式 |
| 3.1.2 RA合成的关键基因STRA6在人心肌定向分化中的表达 |
| 3.2 RA促进侧板中胚层的分化和下游谱系心肌的分化 |
| 3.2.1 RA在体外心肌定向分化中促进侧板中胚层分化的时间优化 |
| 3.2.2 RA促进下游谱系心肌细胞的分化 |
| 3.2.3 RA拮抗剂抑制下游谱系心肌细胞的分化 |
| 3.2.4 RA对心肌分化亚型的影响 |
| 3.3 RA促进心肌成熟 |
| 3.3.1 RA在体外心肌定向分化中促进心肌成熟的时间优化 |
| 3.3.2 RA促进心肌结构成熟 |
| 3.3.3 RA促进心肌电生理成熟 |
| 3.3.4 RA促进心肌代谢成熟 |
| 4 讨论 |
| 4.1 RA在不同时间段对心肌分化效率的影响 |
| 4.2 RA对心肌亚型命运调控 |
| 4.3 RA对心肌成熟的调控 |
| 4.4 建立心房/心室肌细胞方法的探讨 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 主要缩略词表 |
| 致谢 |
（10）人胚胎干细胞衍生心肌细胞对不同心肌损伤模型的治疗效果研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1.引言 |
| 1.1 缺血性心肌病概述 |
| 1.1.1 缺血性心肌病的发生与病理进程 |
| 1.1.2 缺血性心肌病研究现状 |
| 1.2 缺血性心肌病动物模型研究进展 |
| 1.2.1 永久缺血模型 |
| 1.2.2 缺血再灌注模型 |
| 1.2.3 永久缺血与缺血再灌注模型比较 |
| 1.3 干细胞治疗缺血性心肌病研究进展 |
| 1.3.1 多能干细胞在缺血性心肌病研究中的应用 |
| 1.3.2 干细胞治疗缺血性心肌病作用机制研究 |
| 1.4 研究目的和策略 |
| 2.实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 实验主要试剂 |
| 2.1.3 实验主要试剂配方 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.1.5 实验主要仪器 |
| 2.1.6 实验主要抗体 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 人胚胎干细胞培养及传代 |
| 2.2.2 拟胚体(EB)分化 |
| 2.2.3 干细胞向心肌细胞定向分化 |
| 2.2.4 心肌细胞纯化 |
| 2.2.5 荧光素酶(Luciferase)活性检测 |
| 2.2.6 免疫荧光 |
| 2.2.7 RNA提取 |
| 2.2.8 RNA反转录及实时荧光定量PCR |
| 2.2.9 小鼠PI和IR模型的建立 |
| 2.2.10 小鼠心电图测定 |
| 2.2.11 小鼠超声心动图与超声成像 |
| 2.2.12 小动物活体示踪 |
| 2.2.13 小鼠心脏冰冻切片 |
| 2.2.14 切片免疫荧光 |
| 2.2.15 Masson染色 |
| 2.2.16 酶联免疫检测(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) |
| 2.2.17 髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性检测 |
| 2.2.18 蛋白质印记(Western Blot) |
| 2.2.19 支原体检测 |
| 2.2.20 细胞计数 |
| 2.2.21 畸胎瘤形成 |
| 2.2.22 苏木精-伊红(H&E)染色 |
| 2.2.23 体外纤维化诱导 |
| 2.2.24 统计学分析 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 携带报告基因的胚胎干细胞系(ESC-Rep)的鉴定 |
| 3.1.1 ESC-Rep细胞系报告基因的表达 |
| 3.1.2 ESC-Rep细胞系多能性的鉴定 |
| 3.2 ESC-Rep衍生心肌细胞的获得与功能特征分析 |
| 3.2.1 ESC-Rep衍生心肌细胞的获得 |
| 3.2.2 ESC-Rep衍生心肌细胞的特征鉴定 |
| 3.2.3 ESC-Rep衍生心肌细胞的报告基因表达分析 |
| 3.3 心肌细胞治疗小鼠不同心肌损伤模型的效果比较 |
| 3.3.1 小鼠PI和IR模型建立 |
| 3.3.2 心肌细胞在PI和IR小鼠心脏中驻留 |
| 3.3.3 小鼠PI和IR心肌细胞治疗后心脏收缩功能比较 |
| 3.3.4 小鼠PI和IR心肌细胞治疗后心脏舒张功能分析 |
| 3.3.5 小鼠PI和IR心肌细胞治疗后心脏纤维化程度检测 |
| 3.4 心肌细胞调节小鼠心梗后炎症反应参与心脏修复 |
| 3.4.1 小鼠PI和IR模型血清中促炎分子的表达 |
| 3.4.2 小鼠PI和IR模型组织中促炎分子表达 |
| 3.4.3 小鼠PI和IR模型组织中抑炎分子的表达 |
| 3.4.4 小鼠成纤维细胞体外诱导纤维化 |
| 3.4.5 TNF-α促进体外成纤维细胞纤维化 |
| 3.4.6 IL-10抑制体外成纤维细胞纤维化 |
| 4.讨论 |
| 4.1 小鼠PI和IR模型的心肌细胞治疗效果比较 |
| 4.2 小鼠PI和IR模型的心肌细胞驻留率分析 |
| 4.3 炎症调节对心脏损伤修复的影响 |
| 4.4 多能干细胞来源的心肌细胞治疗缺血性心肌病应用前景 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 主要缩略词表 |
| 致谢 |
四、胚胎干细胞体外分化心肌细胞的研究（论文参考文献）
- [1]诱导多能干细胞分化的心肌细胞电生理特点[J]. 熊挺淋,应梦慧,张丽莎,张晓刚,杨燕. 中国组织工程研究, 2022(07)
- [2]LncRNA NRON通过shp2调控Wnt/β-catenin信号通路参与心肌分化[D]. 张晖. 重庆医科大学, 2021(01)
- [3]c-Jun在人胚胎干细胞多能性维持与退出中的研究[D]. 蔡泽坡. 广州医科大学, 2021(02)
- [4]基于人头发丝支架的体外三维心肌组织的构建及其收缩性能的研究[D]. 肖倩茹. 东南大学, 2020(02)
- [5]多梳家族蛋白PHC1在人胚胎干细胞定向分化为心肌细胞中的作用[D]. 范洁. 湖南科技大学, 2020(06)
- [6]人类多能干细胞向心肌谱系定向分化机制研究[D]. 廖英男. 北京协和医学院, 2020
- [7]NLRP3基因修饰猪的制备及RYR2突变的hiPSC建立并初步向心肌分化的研究[D]. 李文静. 浙江大学, 2019(01)
- [8]MIR148A家族在人多能干细胞心肌分化过程中的功能及其机制研究[D]. 方星. 苏州大学, 2019(06)
- [9]视黄酸调控人胚胎干细胞向心肌细胞分化和成熟的功能研究[D]. 苗淑梅. 苏州大学, 2019(06)
- [10]人胚胎干细胞衍生心肌细胞对不同心肌损伤模型的治疗效果研究[D]. 秦念慈. 苏州大学, 2019(07)