一、β-1,3-葡聚糖酶在植物抗真菌病基因工程中的研究进展（论文文献综述）
周杰[1]（2017）在《粘细菌Corallococcus sp.EGB中新型葡聚糖水解酶CoMA和LamC的鉴定及功能分析》文中研究表明粘细菌（Myxobacteria）是一类具有复杂多细胞社会性行为的革兰氏阴性菌,是研究生物发育的最简单的模式生物,也是一种重要的药源微生物类群。该类微生物的基因组复杂性高,基因组最大可达14.78 Mb,基因组信息分析显示水解酶类基因占到其基因组的～2.7%。糖苷水解酶在淀粉工业、食品加工及农业生产等多个行业都具有重要的应用价值。因此,挖掘粘细菌中的新糖苷水解酶对于扩展对该家族酶的认识及为工农业生产提供新的酶资源方面具有重要的意义。Corallococcus sp.EGB是本实验室分离保存的一株具有良好抗真菌能力的粘细菌,其发酵的胞外上清液具有丰富的糖苷水解酶活性。本研究以EGB菌株为材料,挖掘其基因组中具有应用研究价值的糖苷水解酶,并在分子水平、酶学性质及催化机理等方面对其进行了详细的研究。利用基因组生物信息学分析、蛋白纯化、功能验证等手段从EGB菌株中鉴定了多个葡聚糖水解酶及其基因。其中有一个新型的淀粉酶基因coMA,该基因全长1665 bp,G+C%高达69.19%,编码554个氨基酸,分子量为59.95 kDa。CoMA的N端前26个氨基酸为典型的信号肽序列。BlastP序列比对、进化树分析结果显示淀粉酶CoMA可归类于糖苷水解酶GH13家族中一个新的亚家族GH1343。本文构建了coMA的全长表达菌株E.coli BL21（DE3）-（pET29a（+）-coMA）,实现了 重组酶 CoMA 在E.coli BL21（DE3）中可溶性表达。经镍柱亲和层析纯化,在以可溶性淀粉为底物时比酶活力高达980 U/mg。CoMA对直链淀粉、支链淀粉、糖原、γ-环糊精、麦芽寡糖（≥G3）以及普鲁兰多糖均具有不同程度的水解作用。水解产物分析结果显示,以淀粉或麦芽三糖为底物时,水解产物中麦芽糖含量高达90%且不含葡萄糖;以γ-环糊精为底物时,同样产生高纯度的麦芽糖;CoMA还能作用于普鲁兰多糖,产生唯一的水解产物—潘糖（panose）。以上酶学性质表明,该酶表现出高效的水解效率及独特的催化机制,使得淀粉水解产物中麦芽糖含量高达90%且不含葡萄糖,这与已报道淀粉酶的理化性质完全不同。为了进一步阐明CoMA独特的水解特性,首先对CoMA水解淀粉过程的蓝值和旋光度进行测量,结果表明CoMA属于内切型的α-淀粉酶,有别于β-淀粉酶、外切型的产麦芽糖α-淀粉酶。随后,对CoMA水解可溶性淀粉和麦芽三糖（20 mM G3）过程中的产物进行HPLC监测。结果表明,CoMA不仅具有水解α-1,4-键的活性,还具有转糖基活性（transglycosylation activity）以及缩合活性（condensation activity）,我们推测这种多分子催化的协同作用是CoMA产高纯度麦芽糖的原因。为进一步阐明其多分子催化机制,对CoMA水解低浓度（2 mM）和高浓度（200 mM）麦芽三糖过程中的产物同样进行了监测。当CoMA水解低浓度的麦芽三糖时,整个水解过程只产生麦芽糖。表明在CoMA的转糖基活性中,转葡萄糖基活性（glucosyl-transfer activity）要高于转麦芽糖基活性（maltosyl-transfer activity）,即CoMA偏好从麦芽三糖的非还原端进行切割,同时释放麦芽糖单元并将剩下的葡萄糖单元转移给一个新的麦芽三糖形成麦芽四糖,麦芽四糖进一步被水解成2分子的麦芽糖（2G3→G2+G4→3G2）,因此整个催化过程只产生麦芽糖且无葡萄糖和其他麦芽寡糖的形成。随后的定点突变及EDC化学修饰实验表明其多分子催化活性都源于同一催化活性中心（D243-E286-D359）。基于麦芽糖淀粉酶CoMA具有利用麦芽寡糖和淀粉生产高纯度麦芽糖的特性,因此CoMA具有被应用于工业上制备高纯度麦芽糖的潜力,起着去除其他麦芽寡糖提高麦芽糖含量的作用。然而,由于CoMA在大肠杆菌中表达量较低,仅有3.3 mg/升发酵液。本文尝试了利用真核表达系统对其进行异源表达,构建表达菌株Pichia pastoris GS115（pEαA-coMA）,经甲醇诱导发酵后,表达量提高到54 mg/升培养液。重组酶性质稳定,在以淀粉为底物时,依然产生高纯度的麦芽糖。在联合本实验室一个具有良好液化能力的a-淀粉酶AmyM处理10%的淀粉时,麦芽糖的得率提高了 5倍。进而,通过基因工程手段将AmyM和CoMA这两个蛋白通过不同的连接肽进行连接,构建了三组融合蛋白。其中使用柔性连接肽（flexible linker）连接的融合蛋白（M-S2-Z）性质最优,其在酵母分泌表达量最高,达到140 mg/升发酵液。且在处理淀粉制备麦芽糖中,其麦芽糖得率最高为6%。通过基因组分析,从EGB菌株中还克隆到一个新型的β-1,3-葡聚糖酶基因lamC。该基因全长1317 bp,G+C%高达为69.8%,编码438个氨基酸,分子量为47 kDa。该酶含有一个fascin-like结构域和一个GH16催化结构域。Fascin-like结构域具有典型的β-trefoil三维结构,该结构域常出现于动物细胞的Actin结合蛋白中。Fascin-like结构域在细菌的糖苷水解酶中属于首次发现,fascin-like结构域在整个糖苷水解酶家族中的功能未知。构建了表达菌株E.coli Origami B（DE3）-（pET32a（+）-lamC）,在Trx标签的作用下实现了重组酶rLamC在E.coli Origami B（DE3）中的可溶性表达。rLamC具有特殊的广底物谱活性,对β-（1,3）-葡聚糖型底物（昆布多糖、茯苓多糖、酵母葡聚糖和可得然胶）、β-（1,4）-葡聚糖型底物（羧甲基纤维素钠）、β-（1,4）-木聚糖型底物（木聚糖）和β-（1,6）-葡聚糖型底物（石耳素）都具有不同程度的水解活性。同时,rLamC对β-（1,3）/（1,6）-葡聚糖表现出外切酶活性,对β-（1,4）-木聚糖/葡聚糖则表现为内切酶活性。活性中心的定点突变（E304A和E309A）实验发现,LamC的广底物谱活性都源于同一催化活性中心。本文也首次研究了 LamC的fascin-like结构域的潜在功能。采用截短表达、酶表观动力学以及酶-多糖底物pull-down实验,证明了 LamC的fascin-like结构域是一种具有结合β-（1,3）-葡聚糖能力的新型碳水化合物结合结构域;然而fascin-like结构域不具有结合F-actin的能力。同时构建了 LamC的酵母表达菌株P.pastoris GS115（pEFαA-lamC）,经96 h发酵诱导后表达量达到160 mg/L。通过硫酸铵沉淀、镍柱亲和层析将LamC从发酵液中纯化2.8倍,回收率达到48%。LamC的最适底物为昆布多糖,其相应的Km和Vmax值分别为1.4 mg/mL和12.6 μmol.min-1.mg-1。最适反应温度为45℃,最适反应pH为7.0。Mn2+、DTT对LamC酶活有促进作用,Cu2+、Co2+、EDTA对酶活具有强烈的抑制作用。同时,LamC还具有水解稻瘟病菌孢子及菌丝细胞壁的能力。综上所述,从粘细菌Corallococcus sp.EGB中鉴定了两个新型的葡聚糖水解酶及其基因。其中一个为麦芽糖淀粉酶CoMA,该酶具有水解淀粉和麦芽寡糖产生高纯度的麦芽糖且产物中不含葡萄糖的显着特点;另一个是具有广底物谱活性的β-1,3-葡聚糖酶LamC,并首次证明了 LamC的fascin-like结构域是一个具有结合β-1,3-葡聚糖能力的新型碳水化合物结合域（CBM）。
刘玲玲,车树理,禹娟红,李润红,原霁红[2]（2012）在《维管特异启动子BSP驱动的基因Chi、Glu双价载体构建》文中研究表明几丁质和β-1,3-葡聚糖是绝大多数真菌细胞壁的主要成份,可分别被几丁质酶（Chitinase,Chi）和β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase,Glu）降解,而且它们具有协同抗真菌的作用,几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶存在于大多数植物细胞中。在正常情况下,植物体内的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶只有低水平的组成型表达,但在病原菌侵染、诱导物刺激及各种伤害下可诱导产生大量的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶。而真菌病害是危害植物的主要病害之一,这些病害主要通过韧皮部运输而进一步扩展到其他部位。如果利用维管特异表达启动子调节目的基因在韧皮部高效特异地表达,就可以更为有效地发挥目的基因的作用。为此,克隆了维管特异BSP启动子和Chi、Glu基因,并构建了以BSP驱动的Chi和Glu基因的双价表达载体pBIBCG。重组质粒pBIBCG经过PCR分析鉴定,结果表明,以维管特异启动子BSP驱动的含有双价抗真菌基因的植物重组表达载体已构建成功,为植物抗真菌基因工程育种奠定了基础,对提高植物的整体抗病性具有重要的作用。
石玉[3]（2011）在《抗真菌病基因转化苹果和番茄的研究》文中认为抗真菌病害的改良是苹果和番茄育种的目标之一,利用基因工程技术将外源抗真菌病基因导入苹果和番茄中,一旦证实其对病原真菌具有抗性,可作为抗病育种的材料或者抗病品种加以应用。本研究以‘嘎拉’苹果无菌组培苗和‘中蔬四号’番茄无菌组培苗为材料,利用根癌农杆菌介导法,进行了抗病基因PGIP及几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶二价基因的遗传转化。主要研究结果如下:构建了富士苹果多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的植物表达载体pWR306-PGIP,导入根癌农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化苹果和番茄,获得了5个PCR鉴定为阳性的苹果抗性芽;8株PCR鉴定为阳性的番茄植株;利用根癌农杆菌介导法将几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶二价基因转入苹果和番茄中,经过PCR鉴定后初步确定4个苹果抗性芽为阳性植株;9株番茄抗性植株为阳性植株。对转基因植株中的目标酶活进行测定,首先进行了酶活测定条件的优化,试验结果表明:几丁质酶反应的最适温度和最适pH值分别为40℃和5.0;最适的反应时间和显色时间分别为60 min和15 min;β-1,3-葡聚糖酶反应的最适温度为50℃;最适pH值为4.5和8.5两个;最适的反应时间和显色时间分别为30 min和20 min。然后测定了目的基因编码的酶活性,试验结果表明转基因植株几丁质酶活性和β-1,3-葡聚糖酶活性比对照植株酶活性均有提高,提高的幅度在7.27%127.27%和37.63%279.64%之间。对转几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶二价基因阳性番茄植株进行离体抑菌试验,转基因植株几丁质酶粗酶液对苹果斑点病和葡萄炭疽病抑菌率比对照分别提高50%和49.8%,转基因植株β-1,3-葡聚糖酶粗酶液对苹果斑点病和葡萄炭疽病抑菌率比对照分别提高50%和33.3%,转基因植株几丁质酶粗酶液和β-1,3-葡聚糖酶粗酶液的混合液对苹果斑点病和葡萄炭疽病的抑菌率比对照均提高66.6%。对转PGIP基因PCR鉴定为阳性的番茄植株进行病原菌PG酶活抑制试验,转基因植株PGIP粗蛋白液对日本曲霉PG酶的抑制率比对照提高45%。
王广慧[4]（2010）在《含几丁质酶基因的双价防卫基因在植物抗逆基因工程中的应用》文中指出几丁质酶是一类以几丁质为底物的水解酶,是目前为止研究得最为深入的一类病程相关蛋白（PRP/PRs）,在植物抗逆基因工程中有广泛应用。研究表明,将几丁质酶基因与同它起协同作用的其它PRs基因一起转入植物,会获得比转单一几丁质酶基因更为理想的抗逆效果。综述了近年来含几丁质酶的双价防卫基因在植物抗逆基因工程中的应用研究进展。
陈秀玲,李景富,王傲雪[5]（2008）在《β-1,3-葡聚糖酶及其在蔬菜抗真菌病害基因工程中的应用》文中研究表明β-1,3-葡聚糖酶是重要的细胞壁水解酶,可以降解真菌的细胞壁,对植物真菌病害的防治起重要作用。对β-1,3-葡聚糖酶基因进行分离和克隆,并将其转入植物,可成为植物抗真菌病害防治的有效途径之一。文章对β-1,3-葡聚糖酶的分布、分类、结构特点、作用机理及其在蔬菜真菌病害的防治中的应用进行了阐述。
李华[6]（2008）在《嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilium）热稳定性β-1，3-葡聚糖酶的纯化特性及cDNA克隆》文中研究表明β-1,3-葡聚糖酶属于水解β-葡聚糖的葡聚糖酶系,在自然界中存在广泛。β-1,3-葡聚糖酶参与生物的生长发育、新陈代谢等生理过程,是植物抗真菌病的重要物质之一。低分子量β-1,3-葡聚糖对异体宿主防御系统具有较强的诱导和活化作用,是一种免疫系统的活化剂。β-1,3-葡聚糖酶可应用于啤酒和葡萄酒酿造工程中酒的澄清、作为饲料添加剂、酵母原生质体制备、多糖的改性增溶、植物有害真菌防治与真菌细胞壁结构分析、医疗保健等方面。来源于嗜热真菌的各种酶,因为他们的热稳定性,引起了研究者们的高度关注。目前,虽然有部分研究报告报道了一些来源于真菌的β-1,3-葡聚糖酶,但是还未见有关嗜热真菌的热稳定性β-1,3-葡聚糖[酶的报道。嗜热毛壳菌（C. thermophilum）是一种广泛分布的嗜热真菌,是真核生物中生长上限温度很高的一种真菌。本研究分离纯化了嗜热毛壳菌的一种胞外β-1,3-葡聚糖酶,并研究了他的部分生理生化特性,并且对嗜热毛壳菌的β-1,3-葡聚糖酶cDNA进行了克隆。嗜热毛壳菌（C. thermophilum）在以麦麸为碳源的培养基中诱导产生的胞外β-1,3-葡聚糖酶粗酶液经80%饱和（NH4）2SO4沉淀、Phenyl-Sepharose疏水层析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析和凝胶层析等步骤获得了凝胶电泳蛋白带单一的β-1,3-葡聚糖酶。所得样品的比活力为45.4 U·mg-1,纯化倍数17.2倍,活力回收率为26.24。SDS-PAGE测得所分离纯化酶蛋白的分子量约为76.3kDa。分离得嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶的最适反应温度和pH分别为60℃和6.0。在pH6.0条件下,该酶在50℃以下稳定,60℃保温60min后,仍保留90%的酶活性,70℃的半衰期为20min。在酶与底物反应的条件下,加入不同的12种金属离子,使其终浓度为0.05mol/L,以不加金属离子的酶活为100%,测定其相对酶活。不同金属离子对酶活力的影响测定结果表明,Ca2+、Na+、对酶有激活作用;而一些重金属离子如Co2+、Zn2+、Mg2+、Al3+、Fe2+、Cu2+、Ag+对酶有显着的抑制作用;K+、Mn2+、Ba2+对酶活的影响不大。利用液相色谱分析β-1,3-葡聚糖酶水解海带多糖产物表明分离纯化得到的β-1,3-葡聚糖酶是外切型β-1,3-葡聚糖酶。采用Edman降解法测定嗜热毛壳菌（C. thermophilum）β-1,3-葡聚糖酶N端8个氨基酸的序列为HWLGDIPH。与Genbank中其他真菌β-1,3-葡聚糖酶的氨基酸序列同源性不高,氨基酸序列中只有WL和D与个别真菌β-1,3-葡聚糖酶氨基酸序列有一定的同源性。在麦麸诱导培养基上接种嗜热毛壳菌（C. thermophilum）,诱导产β-1,3-葡聚糖酶,接种4天后在培养基表面刮取菌丝,提取mRNA经反转录后获得cDNA。根据测得的纯化的C. thermophilum热稳定β-1,3-葡聚糖酶的N-端氨基酸序列和其他微生物β-1,3-葡聚糖酶同源保守序列设计简并引物,通过RT-PCR的方法,克隆了该嗜热毛壳菌（C. thermophilum）的两个编码β-1,3-葡聚糖酶的cDNA片段glu-N和glu-I,Genbank的登陆号分别为EU744253和EU746500。β-1,3-葡聚糖酶基因glu-I的cDNA序列为1267bp,包含一个1263bp的开放阅读框ORF,编码421个氨基酸的蛋白质,β-1,3-葡聚糖酶基因glu-N的cDNA序列为1273bp,包含一个1269bp的开放阅读框ORF,编码423个氨基酸的蛋白质。两段序列编码区推测出的氨基酸序列与真菌β-1,3-葡聚糖酶氨基酸序列同源性比较,β-1,3-葡聚糖酶基因glu-N编码氨基酸序列与Ampelomyces quisqualis, Coniothyrium minitansβ-1,3-葡聚糖酶氨基酸的同源性为52%,β-1,3-葡聚糖酶基因glu-I编码氨基酸序列与Aspergillus fumigatus, Hypocrea lixii, Cochliobolus carbonumβ-1,3-葡聚糖酶氨基酸的同源性为47%;且β-1,3-葡聚糖酶基因glu-N和glu-I编码氨基酸序列包含β-1,3-葡聚糖酶的保守序列QQFT-RN、IQTETPY-QP,该区域可能与β-1,3-葡聚糖酶的催化活性相关。本研究克隆得到嗜热毛壳菌（C. thermophilum）的两个β-1,3-葡聚糖酶的新基因。
白婧[7]（2008）在《农杆菌介导β-1，3-葡聚糖酶（BG2）基因转化南瓜的研究》文中认为南瓜营养丰富、用途广泛,具有较高的食用价值和经济价值。黑龙江省籽用南瓜栽培面积年达到300万亩,是国内外重要的籽用南瓜产区。南瓜籽也是黑龙江省农产品出口创汇产品之一。南瓜真菌病害的危害极大降低了南瓜的产量和品质。南瓜疫病造成死秧烂瓜,个别多雨年份病害大流行可造成局部地区绝产。南瓜白粉病造成植株早衰而降低产量和影响籽粒饱满度。常规抗病育种方法在南瓜的品种改良、选育等方面发挥了重要作用,但存在选育年限长、耗资大、效率低及抗性种质资源匮乏等问题。近年来以导入目的基因创造新种质的基因工程手段的应用,为南瓜抗真菌病育种的选育开辟了一条新途径。本试验以金辉一号南瓜为试材,建立了南瓜高频再生体系,通过农杆菌介导将抗真菌病基因β-1,3-葡聚糖酶（BG2）基因导入金辉一号南瓜中,并探讨了影响其再生体系和遗传转化效率的主要因素,确定了金辉一号南瓜最佳再生和遗传转化条件,为培育南瓜抗真菌病新品种奠定了基础。研究的主要内容和结果如下:（1）建立了金辉一号南瓜再生体系:最佳无菌苗萌发培养基为0.8%琼脂,接种方式为平放;最佳外植体来源为“两片子叶呈直立状态,颜色为绿色”的无菌苗;最佳外植体为1/2子叶节;最佳不定芽分化培养基为MS+1.0mg/L 6-BA,芽伸长培养基为MS+0.1mg/L 6-BA+0.1mg/L GA3;最佳生根培养基为MS+0.1mg/L NAA。（2）确定了抗生素筛选浓度:载体上含有NPTⅡ选择标记基因,使转化植株带有卡那霉素抗性,本试验进行两次筛选,确定芽分化阶段卡那霉素筛选浓度为100mg/L。（3）确定了预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间、AS添加浓度五个因素对遗传转化的影响:最佳组合为:预培养36h+OD600（0.30.5）侵染10min+共培养2d（培养基中添加100 mg/LAS）（4）对得到的抗性植株进行PCR检测和Southern杂交检测,获得5株阳性植株。
娄树宝[8]（2008）在《β-1，3-葡聚糖酶活性与大豆抗疫霉根腐病的关系》文中进行了进一步梳理β-1,3-葡聚糖酶是一种重要的PR蛋白,能够降解β-1,3-葡聚糖（大多数病原真菌细胞壁的主要成分之一）,从而使细胞内含物外溢,导致病原菌死亡。β-1,3-葡聚糖酶可由多种生物因子和非生物因子诱导产生,能催化β-1,3-葡聚糖和β-1,3-1,6-葡聚糖的水解,水解产物寡糖是植物防御反应的重要激发子。β-1,3-葡聚糖酶不但能够抑制真菌菌丝的生长,而且还可以释放真菌细胞壁的诱导物,从而间接促进寄主体内植保素的积累,增加抗病能力。同时β-1,3-葡聚糖在植物细胞壁含量极少,因此该酶在植物抗病工程中具有极高的生防价值。本研究对β-1,3-葡聚糖酶与大豆抗疫霉根腐病的关系、酶学性质以及抑菌活性进行了系统的研究,其结果如下:1.接种大豆真叶和复叶后各大豆品种的β-1,3-葡聚糖酶活性均明显升高。接种大豆真叶后抗病品种48 h出现酶活性高峰,酶活性增加105%;中感品种和感病品种72 h出现酶活性高峰,酶活性增加量分别为67%和65%。接种大豆复叶后酶的含量和活性的变化与真叶反应一致。β-1,3-葡聚糖酶的活性与大豆品种的抗病性呈正相关,抗病品种较感病品种酶活性峰值出现早,酶活性增加量高,且高活性维持的时间长。2.对β-1,3-葡聚糖酶的基本性质进行了测定,结果表明酶的最适反应温度为55℃,最适反应pH为5.0,在55℃以下,pH 4.5～6.5范围内酶较稳定;Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Hg2+、Ba2+对β-1,3-葡聚糖酶活力有抑制作用,Ca2+、K+、Al3+对酶活力有激活作用;对β-1,3-葡聚糖酶的动力学分析结果表明,酶的米氏常数Km为0.736 mg /mL,最大反应速度Vm为0.261 mg /（mL·min）。3.离体抑菌试验表明,β-1,3-葡聚糖酶粗酶液对大豆疫霉菌的菌丝生长和孢子萌发有明显的抑制作用。
张丽丽,师校欣,杜国强,王惠英[9]（2006）在《植物抗病机制及果树抗病育种研究进展》文中指出果树病害对果品生产危害严重,长期以来科技工作者们致力于植物抗病机制研究并利用育种方法进行品种改良,以提高果树抗病能力。本文综述了近年来国内外学者在植物物理结构特征与抗病性的关系以及化学抗菌物质与抗病性的关系等方面研究,回顾了果树在抗病育种方面所取得的研究成果,论述了转基因技术在果树抗病育种中的应用,以期为今后果树抗病育种研究提供参考。
陈凌娜[10]（2006）在《微束激光介导抗真菌基因转化棉花的研究及抗蚜基因的克隆》文中研究说明棉花是我国主要的经济作物,在国民经济中具有重要地位。黄萎病是对棉花生产危害最大的世界性病害之一,严重影响了棉花的产量及棉纤维的品质。常规育种方法因抗源缺乏很难培育出抗黄萎病的棉花新品种。本研究用基因工程手段,将激光微束穿刺技术与种质系统转化法结合,成功地将几丁质酶基因和β-1, 3-葡聚糖酶基因导入棉花中,并最终得到了几丁质酶基因整合的转基因植株。转化试验是利用Nd:YAG三倍频的微束激光,激光波长为0.35μm,输出能量10 mJ,在12.5倍物镜聚焦于欲照射的细胞,光斑直径为4.02μm。进行激光微束穿刺导入几丁质酶基因和β-1, 3-葡聚糖酶基因的双价植物表达载体。分别以棉花感受态萌动种胚和授粉后40-50天的幼胚为受体,将材料预培养48 h后再进行预高渗处理2 h,外源质粒浓度为0.1 mg/ml,转化后进行卡那霉素梯度筛选,将移栽成活的棉花进行总DNA的PCR扩增,有一株同时扩增到了几丁质酶基因和β-1, 3-葡聚糖酶基因的特异片段,另外有四株分别得到了β-1, 3-葡聚糖酶基因和几丁质酶基因的特异片段。对卡那霉素有抗性植株的T1代进行盆栽检测,30株中表现卡那霉素抗性的植株有10株,其中8株在几丁质酶基因的检测中表现出阳性,但相同植株在β-1, 3-葡聚糖酶基因的检测时无目的条带出现。本研究还克隆了植物凝集素基因,以解决棉花蚜虫的危害问题,蚜虫属同翅目昆虫,通过吸取植物韧皮部的汁液造成直接危害,又通过传播植物病害对植物造成间接危害,植物凝集素是一类具有特异糖结合活性的蛋白,在植物基因工程中具有较大的应用潜力。反枝苋（Amaranthus retroflexus L.）生于农田、路边,适应性极强,对高等动物无毒害。苋菜凝集素基因（ARA）全长2453 bp,含有一个1538 bp的内含子和两个分别为212 bp和703 bp的外显子,通过重叠序列设计的引物与聚合酶链反应（PCR）技术,获得了该基因的915 bp编码区克隆片段,避免了通过mRNA反转录合成cDNA而带来的一系列问题,序列分析表明反枝苋凝集素基因与文献报道来自千穗谷苋菜的AHA基因序列有98.8%的同源性。同时设计特异引物,采用PCR扩增的方法,从质粒pBIBGC中克隆到维管束特异表达BSP基因启动子的功能片段,其序列大小为840 bp,其中富含A/T的区域和富含A/T的重复序列,通过序列比对分析与已报道的序列同源性达98.2%。将ARA基因插入到微生物表达载体pET 28a的T7启动子和终止子之间,通过IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳鉴定,得到了36.0 kDa的特异蛋白条带,证明ARA基因的表达产物的分子量与理论推算的相符。构建了具有BSP-ARA-NOS终止子表达单元的植物表达载体pBIBA,采用直接导入法将其导入到农杆菌LBA4404中,得到了含目的质粒的工程菌株。用农杆菌介导法,对烟草叶片进行了遗传转化,并对转基因植株的抗蚜性进行研究。
二、β-1,3-葡聚糖酶在植物抗真菌病基因工程中的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、β-1,3-葡聚糖酶在植物抗真菌病基因工程中的研究进展（论文提纲范文）
（1）粘细菌Corallococcus sp.EGB中新型葡聚糖水解酶CoMA和LamC的鉴定及功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号与缩略语说明 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 粘细菌简介 |
| 1.1 粘细菌的基本特征 |
| 1.2 粘细菌的分布及分类 |
| 1.3 粘细菌对大分子化合物的利用 |
| 2 麦芽糖淀粉酶的研究进展 |
| 2.1 麦芽糖淀粉酶的分类与基本性质 |
| 2.2 不同微生物来源的麦芽糖淀粉酶 |
| 2.3 麦芽糖淀粉酶催化机制的研究进展 |
| 2.4 麦芽糖淀粉酶的应用 |
| 3 β-葡聚糖酶的研究进展 |
| 3.1 β-葡聚糖简介 |
| 3.2 β-葡聚糖酶的分类 |
| 3.3 β-1,3-葡聚糖酶研究进展 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 Corallococcus sp. EGB来源的麦芽糖淀粉酶基因的克隆及其催化特性的研究 |
| 第一节 Corallococcus sp. EGB麦芽糖淀粉酶基因的克隆及酶学性质研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株、质粒和引物 |
| 1.2 培养基与试剂 |
| 1.3 供试菌株的培养 |
| 1.4 淀粉酶的酶活力测定 |
| 1.5 蛋白含量的测定 |
| 1.6 菌体总DNA提取 |
| 1.7 大肠杆菌普通感受态细胞的制备 |
| 1.8 转化感受细胞 |
| 1.9 质粒的提取 |
| 1.10 麦芽糖淀粉酶基因coMA的重组表达菌株的构建 |
| 1.11 重组麦芽糖淀粉酶CoMA的诱导表达与纯化 |
| 1.12 重组酶CoMA的酶学特性 |
| 1.13 序列分析软件、在线分析网址 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 麦芽糖淀粉酶基因的克隆 |
| 2.2 CoMA蛋白序列分析 |
| 2.3 麦芽糖淀粉酶CoMA的蛋白结构模拟 |
| 2.4 重组麦芽糖淀粉酶CoMA的表达纯化及酶谱分析 |
| 2.5 重组酶CoMA的酶学特性研究 |
| 3 讨论 |
| 第二节 麦芽糖淀粉酶CoMA催化特性的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 培养基与试剂 |
| 1.2 阿卡波糖对重组酶CoMA活性的抑制作用 |
| 1.3 重组酶CoMA对淀粉的水解方式 |
| 1.4 重组酶CoMA对可溶性淀粉的水解特性研究 |
| 1.5 重组酶CoMA对麦芽三糖的水解特性研究 |
| 1.6 重组酶CoMA的化学修饰及定点突变 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 阿卡波糖对重组酶CoMA活性的抑制作用 |
| 2.2 重组酶CoMA对淀粉的水解方式 |
| 2.3 重组酶CoMA对可溶性淀粉的水解特性研究 |
| 2.4 重组酶CoMA对麦芽三糖的水解特性研究 |
| 2.5 重组酶CoMA的多分子催化途径 |
| 2.6 重组酶CoMA的化学修饰及定点突变 |
| 2.7 CoMA在整个GH13家族中的系统进化分析 |
| 3 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 麦芽糖淀粉酶CoMA的高效表达及制备高纯度麦芽糖的研究 |
| 第一节 麦芽糖淀粉酶CoMA在毕赤酵母中的表达及联合液化型淀粉酶AmyM制备高纯度麦芽糖的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株、质粒和引物 |
| 1.2 培养基与试剂 |
| 1.3 表达菌株P.pastoris GS115(pEFαA-coMA/coMA_(27))的构建 |
| 1.4 表达菌株的诱导表达 |
| 1.5 酵母表达菌株胞外重组酶的纯化 |
| 1.6 CoMA联合液化型淀粉酶AmyM制备高纯度麦芽糖的研究 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 目的基因的PCR |
| 2.2 表达载体的构建和线性化 |
| 2.3 酵母阳性转化子的鉴定 |
| 2.4 重组酶CoMA_(27)的纯化及酶谱分析 |
| 2.5 CoMA联合液化型淀粉酶AmyM制备高纯度麦芽糖 |
| 3 讨论 |
| 第二节 液化型淀粉酶AmyM和麦芽糖淀粉酶CoMA融合蛋白的构建及其酶学性质的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 培养基与试剂 |
| 1.2 重叠延伸PCR构建融合蛋白 |
| 1.3 融合蛋白表达菌株的构建 |
| 1.4 融合蛋白表达菌株的诱导表达及纯化 |
| 1.5 淀粉酶的酶活性测定和蛋白含量的测定 |
| 1.6 不同连接肽连接的融合蛋白酶学性质的比较 |
| 1.7 同添加量的融合蛋白M-S2-C对麦芽糖得率的影响 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重叠延伸PCR构建融合蛋白 |
| 2.2 不同连接肽对融合蛋白表达的影响 |
| 2.3 温度、pH对不同连接肽连接的融合蛋白的影响 |
| 2.4 不同连接肽对麦芽糖得率的影响 |
| 2.5 融合蛋白M-S2-C不同添加量对麦芽糖得率的影响 |
| 3 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 Corallococcus sp. EGB来源的β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆及其功能分析 |
| 第一节 Corallococcus sp. EGBβ-1,3-葡聚糖酶基因的克隆及其结构域功能的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株、质粒和引物 |
| 1.2 培养基、试剂和仪器 |
| 1.3 酶活力测定和蛋白含量的测定 |
| 1.4 β-1,3-葡聚糖酶LamC全长基因的PCR扩增 |
| 1.5 β-1,3-葡聚糖酶基因序列分析 |
| 1.6 β-1,3-葡聚糖酶及其截短产物表达菌株的构建 |
| 1.7 β-1,3-葡聚糖酶及其截短产物重组酶的诱导表达与纯化 |
| 1.8 β-1,3-葡聚糖酶催化和非催化结构域的功能研究 |
| 1.9 β-1,3-葡聚糖酶活性中心定点突变 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆 |
| 2.2 β-1,3-葡聚糖酶LamC蛋白序列分析 |
| 2.3 β-1,3-葡聚糖酶及其截短产物的表达纯化 |
| 2.4 β-1,3-葡聚糖酶催化和非催化结构域的功能研究 |
| 3 讨论 |
| 第二节 β-1,3-葡聚糖酶LamC在毕赤酵母中的表达及其酶学特性的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株、质粒和引物 |
| 1.2 培养基与试剂 |
| 1.3 β-1,3-葡聚糖酶LamC在毕赤酵母中的重组表达 |
| 1.4 重组酶LamC_(27)酶学性质的研究 |
| 1.5 重组酶LamC_(27)对稻瘟病菌生防作用的初步研究 |
| 2 结论与分析 |
| 2.1 重组酶LamC_(27)的表达与纯化 |
| 2.2 重组酶LamC_(27)的酶学性质研究 |
| 2.3 重组酶LamC_(27)对稻瘟病菌生防作用的初步研究 |
| 3 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 主要创新点 |
| 研究展望 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的论文目录 |
| 致谢 |
（2）维管特异启动子BSP驱动的基因Chi、Glu双价载体构建（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 植物材料、菌株及质粒 |
| 1.1.2 主要仪器及酶和试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 杨树基因组总DNA的提取及维管特异启动子BSP的克隆 |
| 1.2.2 几丁质酶基因 (Chi) 和β-1, 3-葡聚糖酶基因 (Glu) 的克隆 |
| 1.3 载体构建 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 维管特异启动子BSP的克隆 |
| 2.2 基因克隆 |
| 2.2.1 基因Chi的克隆 |
| 2.2.2 基因Glu的克隆 |
| 2.3 载体的构建及其检测 |
| 2.3.1 BSP启动子驱动的Chi基因植物表达载体构建及检测 |
| 2.3.2 BSP启动子驱动的Glu基因植物表达载体构建及检测 |
| 2.3.3 植物Chi和Glu双价表达载体pBIBCG的构建及检测 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（3）抗真菌病基因转化苹果和番茄的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 1.1 PGIP、CHI 和GLU 的研究进展 |
| 1.1.1 PGIP 的研究 |
| 1.1.2 CHI 基因在植物抗真菌性病害基因工程中的应用 |
| 1.1.3 GLU 基因在植物抗真菌性病害基因工程中的应用 |
| 1.1.4 CHI 和GLU 在植物抗真菌性病害基因工程中的协同作用 |
| 1.2 苹果转基因改良的研究进展 |
| 1.2.1 苹果转基因改良取得的研究成果 |
| 1.2.2 农杆菌介导的苹果遗传转化的研究 |
| 1.2.3 苹果遗传转化中存在的问题及展望 |
| 1.3 番茄遗传转化的研究进展 |
| 1.3.1 番茄离体培养研究进展 |
| 1.3.2 农杆菌介导的番茄遗传转化的研究 |
| 1.3.3 番茄遗传转化中存在的问题 |
| 1.3.4 番茄遗传转化研究的前景与展望 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二部分 试验研究 |
| 2.1 试验材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 PGIP 基因植物表达载体的构建 |
| 2.2.2 苹果叶片卡那霉素抗性筛选浓度的确定 |
| 2.2.3 转基因苹果抗性芽和番茄抗性植株的获得和PCR 鉴定 |
| 2.2.4 转CHI 和GLU 双价基因番茄植株CHI 酶活性测定条件优化 |
| 2.2.5 转CHI 和GLU 双价基因的番茄植株CHI 酶活性检测 |
| 2.2.6 转CHI 和GLU 双价基因番茄植株GLU 酶活性测定条件优化 |
| 2.2.7 转CHI 和GLU 双价基因的番茄植株GLU 酶活性检测 |
| 2.2.8 转基因番茄的抗病性鉴定 |
| 第三部分 讨论 |
| 3.1 转基因植株抗生素抗性筛选假阳性的原因 |
| 3.2 苹果PGIP 基因的抑菌作用 |
| 3.3 不同转基因株系抗病性差异的原因 |
| 3.4 CHI 和GLU 抗病协同作用 |
| 3.5 CHI 和GLU 酶活性测定条件的优化 |
| 第四部分 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）含几丁质酶基因的双价防卫基因在植物抗逆基因工程中的应用（论文提纲范文）
| 1 转几丁质酶基因和β-1, 3-葡聚糖酶基因的双价基因研究 |
| 2 转几丁质酶基因和其它抗病蛋白基因的双价基因研究 |
| 3 讨论 |
（5）β-1,3-葡聚糖酶及其在蔬菜抗真菌病害基因工程中的应用（论文提纲范文）
| 1 β-1, 3-葡聚糖酶的研究 |
| 1.1 β-1, 3-葡聚糖酶的分类与分布 |
| 1.2 β-1, 3-葡聚糖酶的结构特点及同源性研究 |
| 1.3 β-1, 3-葡聚糖酶的抗病机理 |
| 1.4 β-1, 3-葡聚糖酶的可诱导性 |
| 2 β-1, 3-葡聚糖酶在抗蔬菜真菌病害中的应用 |
| 2.1 β-1, 3-葡聚糖酶基因的分离纯化和克隆 |
| 2.2 β-1, 3-葡聚糖酶基因的表达调控 |
| 2.3 β-1, 3-葡聚糖酶与其他防卫基因的协同表达 |
| 2.4 β-1, 3-葡聚糖酶在园艺作物抗真菌病害中的应用 |
| 3 展望 |
（6）嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilium）热稳定性β-1，3-葡聚糖酶的纯化特性及cDNA克隆（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 β-1,3-葡聚糖酶概述 |
| 1.2 β-1,3-葡聚糖酶的来源 |
| 1.3 β-1,3-葡聚糖酶的生理功能 |
| 1.4 β-1,3-葡聚糖酶的生物学以及分子生物学研究 |
| 1.4.1 植物β-1,3-葡聚糖酶 |
| 1.4.2 微生物β-1,3-葡聚糖酶 |
| 1.4.3 无脊椎动物β-1,3-葡聚糖酶 |
| 1.5 β-1,3-葡聚糖酶的应用 |
| 1.5.1 在饲料工业中的应用 |
| 1.5.2 在啤酒酿造业中的应用 |
| 1.5.3 食品添加剂 |
| 1.5.4 在医学中的应用 |
| 1.5.5 制备酵母β-1,3-葡聚糖 |
| 1.5.6 抗真菌 |
| 1.6 展望 |
| 2 选题的目的意义、研究内容、技术路线 |
| 2.1 选题的目的意义 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.3 技术路线 |
| 第二章 嗜热毛壳菌热稳定性Β-1,3-葡聚糖酶的纯化及特性 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试菌株 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 主要仪器和试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶酶活力测定 |
| 2.2.2 培养时间对嗜热毛壳菌产β-1,3-葡聚糖酶的影响 |
| 2.2.3 嗜热毛壳菌产β-1,3-葡聚糖酶的培养 |
| 2.2.4 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化 |
| 2.2.5 SDS-PAGE 对纯化得嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶的纯度鉴定及测定其纯化分子量 |
| 2.2.6 高效液相色谱法测定嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶酶解产物 |
| 2.2.7 蛋白质含量测定 |
| 2.2.8 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶酶学特性的研究 |
| 2.2.9 纯化得嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶蛋白N-端氨基酸序列测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 不同培养时间对嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶活性的影响 |
| 3.2 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化 |
| 3.2.1 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶粗酶液Phenyl-Sepharose 疏水柱层析 |
| 3.2.2 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶粗酶液DEAE-Sepharose 阴离子交换柱层析 |
| 3.2.3 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶粗酶液Sephacryl S-100 凝胶柱层析 |
| 3.2.4 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶纯化过程总表 |
| 3.2.5 各层析处理后嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶蛋白纯度的鉴定 |
| 3.2.6 纯化得嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶蛋白分子量的鉴定 |
| 3.3 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶的特性研究 |
| 3.3.1 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶最适反应温度 |
| 3.3.2 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶最适反应pH |
| 3.3.3 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶的热稳定性 |
| 3.3.4 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶的pH 稳定性 |
| 3.3.5 不同金属离子对嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶活性的影响 |
| 3.3.6 高效液相色谱法测定嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶的降解作用方式 |
| 3.4 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶酶蛋白N-端氨基酸序列测定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶的特性 |
| 4.2 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶的纯化方法 |
| 4.3 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶降解作用的方式 |
| 4.4 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶的稳定性 |
| 4.5 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶活性与金属离子的关系 |
| 4.6 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶活性与其疏水性的关系 |
| 4.7 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶的应用潜力和存在的问题 |
| 4.7.1 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶在生物防治方面的应用前景 |
| 4.7.2 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶工业化大规模生产、利用需解决的问题 |
| 第三章 嗜热毛壳菌热稳定性Β-1,3-葡聚糖酶基因的CDNA 克隆及其序列分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 供试菌株 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 酶和生化试剂 |
| 2.1.4 仪器 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.1.6 溶液配制 |
| 2.1.7 PCR 引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 产β-1,3-葡聚糖酶菌丝的诱导培养 |
| 2.2.2 总 RNA 的提取（Trizol 法） |
| 2.2.3 紫外检测 RNA 产率和纯度 |
| 2.2.4 反转录cDNA 第一链的合成 |
| 2.2.5 目的基因cDNA 的分离 |
| 2.2.6 序列的生物信息学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 嗜热毛壳菌总RNA 的提取 |
| 3.2 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶cDNA 的克隆 |
| 3.3 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因glu-I和glu-N的核苷酸序列及其编码氨基酸的序列 |
| 3.3.1 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因glu-I的核苷酸序列及推测的相应氨基酸序列 |
| 3.3.2 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因glu-N的核苷酸序列及推测的相应氨基酸序列 |
| 3.4 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因glu-I 和glu-N编码氨基酸序列的同源性比较 |
| 3.5 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因glu-I 编码氨基酸密码子偏爱性分析 |
| 3.6 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因glu-I 编码氨基酸的序列分析 |
| 3.6.1 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因glu-I 编码氨基酸的组成 |
| 3.6.2 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因glu-I 编码氨基酸的结构预测 |
| 3.7 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因glu-N 编码氨基酸密码子偏爱性分析 |
| 3.8 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因glu-N 编码的氨基酸序列分析 |
| 3.8.1 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因glu-N 编码氨基酸组成 |
| 3.8.2 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因glu-N 编码氨基酸的结构预测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因及其编码氨基酸分析 |
| 4.2 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶cDNA 的克隆 |
| 4.3 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因的研究 |
| 第四章 主要研究结论及后续研究建议 |
| 1 本研究获得的主要结论 |
| 2 对后续研究工作的建议 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| ACKNOWLEDGEMENT |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（7）农杆菌介导β-1，3-葡聚糖酶（BG2）基因转化南瓜的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 本研究的目的和意义 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.2.1 植物抗真菌基因工程研究进展 |
| 1.2.2 β-1,3-葡聚糖酶基因研究进展 |
| 1.2.3 南瓜属作物再生体系研究进展与应用 |
| 1.2.4 农杆菌介导瓜类作物遗传转化研究进展 |
| 1.3 本研究的主要内容 |
| 2. 试验材料与方法 |
| 2.1 南瓜再生体系的优化 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 南瓜遗传转化体系的建立 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.3 转基因植株的分子生物学检测 |
| 2.3.1 试验材料 |
| 2.3.2 试验方法 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 南瓜植株再生体系的建立 |
| 3.1.1 不同处理方式对南瓜无菌苗萌发的影响 |
| 3.1.2 不同培养基对无菌苗萌发的影响 |
| 3.1.3 胚接种方式对无菌苗萌发的影响 |
| 3.1.4 不定芽的诱导 |
| 3.1.5 不定芽的伸长 |
| 3.1.6 生根培养基的筛选 |
| 3.1.7 再生植株的驯化移栽 |
| 3.2 南瓜遗传转化体系的建立 |
| 3.2.1 卡那霉素选择压的确定 |
| 3.2.2 遗传转化的主要影响因素分析 |
| 3.3 转基因植株的分子生物学检测 |
| 3.3.1 转基因植株的PCR 检测结果 |
| 3.3.2 转基因植株的Southern 杂交检测结果 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 南瓜再生体系的影响因素 |
| 4.1.1 外植体选择 |
| 4.1.2 激素种类与浓度的选择 |
| 4.2 遗传转化的影响因素 |
| 4.2.1 抗生素的选择与使用 |
| 4.2.2 农杆菌菌液浓度与侵染时间 |
| 4.2.3 预培养与共培养 |
| 4.2.4 乙酰丁香酮的加入方式 |
| 4.3 转基因植株的检测 |
| 4.4 本试验的创新点 |
| 4.5 今后研究方向与展望 |
| 5. 结论 |
| 5.1 无菌苗的获得 |
| 5.2 南瓜高频再生体系的优化 |
| 5.3 南瓜遗传转化体系的建立 |
| 5.4 转基因植株的分子生物学鉴定 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文 |
（8）β-1，3-葡聚糖酶活性与大豆抗疫霉根腐病的关系（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 研究的目的、意义和主要内容 |
| 1.2 大豆疫霉根腐病 |
| 1.2.1 大豆疫霉根腐病的分布与危害 |
| 1.2.2 病害症状 |
| 1.2.3 大豆疫霉根腐病病原菌的分类学地位 |
| 1.2.4 大豆疫霉菌的形态学特征和生物学特性 |
| 1.2.5 大豆疫霉菌生活史、病害循环和流行规律 |
| 1.2.6 生理小种分化 |
| 1.2.7 抗病机制研究 |
| 1.3 Β-1,3-葡聚糖酶的研究进展 |
| 1.3.1 β-1,3-葡聚糖酶的分类 |
| 1.3.2 β-1,3-葡聚糖酶的分布 |
| 1.3.3 β-1,3-葡聚糖酶的结构特点 |
| 1.3.4 β-1,3-葡聚糖酶在植物抗病性中的作用 |
| 1.3.5 β-1,3-葡聚糖酶在体外的抑菌作用 |
| 1.3.6 β-1,3-葡聚糖酶的诱导及其活性与植物的抗病性 |
| 1.3.7 β-1,3-葡聚糖酶与抗病基因工程 |
| 1.3.8 β-1,3-葡聚糖酶基因的表达调控 |
| 1.3.9 几丁质酶与β-1,3-葡聚糖酶的协同性 |
| 第二章 Β-1,3-葡聚糖酶与抗病性的关系 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试大豆 |
| 2.1.2 供试菌种 |
| 2.1.3 主要试剂及仪器 |
| 2.1.4 播种大豆 |
| 2.1.5 培养基制备 |
| 2.1.6 游动孢子悬浮液的制备 |
| 2.1.7 大豆真叶和复叶中β-1,3-葡聚糖酶活性与抗疫霉根腐病的关系 |
| 2.1.8 离体叶片中β-1,3-葡聚糖酶活性与抗疫霉根腐病的关系 |
| 2.1.9 大豆疫霉菌接种大豆真叶对复叶β-1,3-葡聚糖酶活性的影响 |
| 2.1.10 β-1,3-葡聚糖酶的提取 |
| 2.1.11 葡萄糖标准曲线的制作 |
| 2.1.12 β-1,3-葡聚糖酶的活性测定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 葡萄糖标准曲线 |
| 2.2.2 大豆真叶和复叶中β-1,3-葡聚糖酶活性与抗病性的关系 |
| 2.2.3 离体叶片中β-1,3-葡聚糖酶活性与抗病性的关系 |
| 2.2.4 接种大豆真叶与未接种复叶β-1,3-葡聚糖酶活性与抗病性的关系 |
| 2.3 结论与讨论 |
| 第三章 Β-1,3-葡聚糖酶的酶学性质 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试大豆 |
| 3.1.2 供试菌种、接种方法、取样、粗酶液的提取 |
| 3.1.3 主要试剂及仪器 |
| 3.1.4 反应时间对β-1,3-葡聚糖酶活力的影响 |
| 3.1.5 β-1,3-葡聚糖酶的最适温度测定 |
| 3.1.6 β-1,3-葡聚糖酶的热稳定性 |
| 3.1.7 β-1,3-葡聚糖酶的最适pH 值测定 |
| 3.1.8 β-1,3-葡聚糖酶的酸碱稳定性 |
| 3.1.9 金属离子对酶活力的影响 |
| 3.1.10 β-1,3-葡聚糖酶动力学常数的测定 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 反应时间对β-1,3-葡聚糖酶活力的影响 |
| 3.2.2 β-1,3-葡聚糖酶的最适反应温度 |
| 3.2.3 β-1,3-葡聚糖酶的热稳定性 |
| 3.2.4 β-1,3-葡聚糖酶的最适反应pH |
| 3.2.5 β-1,3-葡聚糖酶的酸碱稳定性 |
| 3.2.6 金属离子对酶活力的影响 |
| 3.2.7 β-1,3-葡聚糖酶的动力学常数的测定即Michaelis-Menten 动力学分析 |
| 3.3 结论 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 温度对酶促反应的影响 |
| 3.4.2 pH 对酶促反应的影响 |
| 3.4.3 金属离子对酶促反应的影响 |
| 3.4.4 Michaelis-Menten 动力学分析 |
| 第四章 Β-1,3-葡聚糖酶的抑菌活性 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 接种方法、取样、粗酶液的提取 |
| 4.1.3 β-1,3-葡聚糖酶对菌丝生长的抑制作用 |
| 4.1.4 β-1,3-葡聚糖酶对孢子萌发的抑制作用 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 β-1,3-葡聚糖酶对菌丝生长的抑制作用 |
| 4.2.2 β-1,3-葡聚糖酶对孢子萌发的抑制作用 |
| 4.3 结论 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）植物抗病机制及果树抗病育种研究进展（论文提纲范文）
| 1 植物抗病机制的研究 |
| 1.1 物理结构特征与抗病性的关系 |
| 1.2 化学抗菌物质与抗病性的关系 |
| 1.3 几丁质酶和β_1, 3_葡聚糖酶在植物抗病中的作用 |
| 2 果树抗病育种研究进展 |
| 2.1 实生选种 |
| 2.2 芽变选种 |
| 2.3 杂交育种 |
| 2.4 诱变育种 |
| 2.5 生物技术育种 |
（10）微束激光介导抗真菌基因转化棉花的研究及抗蚜基因的克隆（论文提纲范文）
| 引言 |
| 第一章 综述 |
| 1.1 用激光微束穿刺将外源抗真菌基因导入的研究 |
| 1.1.1 激光微束穿刺在植物外源基因转化上的应用 |
| 1.1.2 激光微束穿刺法导入外源基因的基本原理 |
| 1.1.3 激光微束转化体系的特点 |
| 1.1.4 激光微束转化技术研究 |
| 1.1.5 激光微束转化的技术评价 |
| 1.2 棉花抗黄萎病育种研究现状及对策 |
| 1.2.1 黄萎病的发生与危害 |
| 1.2.2 黄萎病病原菌研究 |
| 1.2.3 棉花抗黄萎病育种研究 |
| 1.3 几丁质酶和Β-1，3-葡聚糖酶基因及其应用 |
| 1.3.1 几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶基因的特性和分类 |
| 1.3.2 几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶的抗性机理 |
| 1.3.3 几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶基因在植物基因工程中的应用 |
| 1.4 抗蚜基因的克隆 |
| 1.4.1 植物凝集素的分类 |
| 1.4.2 植物外源凝集素的生物学功能 |
| 1.4.3 植物外源凝集素的植物保护作用 |
| 1.4.4 植物外源凝集素的抗蚜性 |
| 1.5 技术路线 |
| 第二章 用激光微束穿刺法将抗真菌基因导入棉花的研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 棉花激光微束及基因枪转化条件的优化和转化体系的建立 |
| 2.2.2 棉花抗真菌病基因的转化 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 种质系统转化法在棉花转基因育种中的利用 |
| 2.3.2 特异启动子的应用 |
| 2.3.3 用激光微束穿刺将外源基因导入棉花中的优越性 |
| 第三章 抗蚜基因的克隆与韧皮部特异启动子驱动的植物表达载体的构建及其对烟草的转化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 反枝苋凝集素基因（ARA）、维管束特异性启动子（BSP）的克隆鉴定和序列分析 |
| 3.2.2 ARA 基因原核表达载体的构建及其表达 |
| 3.2.3 具有BSP-ARA-NOS 表达单元的基因植物表达载体的构建 |
| 3.2.4 农杆菌介导的含ARA 基因植物表达载体对烟草的转化 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 反枝苋凝集素基因在植物基因工程中的应用 |
| 3.3.2 PCR 重叠延伸（SOE）技术在ARA 基因克隆中的应用 |
| 3.3.3 维管束特异启动子的应用 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、β-1,3-葡聚糖酶在植物抗真菌病基因工程中的研究进展（论文参考文献）
- [1]粘细菌Corallococcus sp.EGB中新型葡聚糖水解酶CoMA和LamC的鉴定及功能分析[D]. 周杰. 南京农业大学, 2017(07)
- [2]维管特异启动子BSP驱动的基因Chi、Glu双价载体构建[J]. 刘玲玲,车树理,禹娟红,李润红,原霁红. 华北农学报, 2012(05)
- [3]抗真菌病基因转化苹果和番茄的研究[D]. 石玉. 西北农林科技大学, 2011(04)
- [4]含几丁质酶基因的双价防卫基因在植物抗逆基因工程中的应用[J]. 王广慧. 生物技术通报, 2010(10)
- [5]β-1,3-葡聚糖酶及其在蔬菜抗真菌病害基因工程中的应用[J]. 陈秀玲,李景富,王傲雪. 东北农业大学学报, 2008(12)
- [6]嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilium）热稳定性β-1，3-葡聚糖酶的纯化特性及cDNA克隆[D]. 李华. 山东农业大学, 2008(03)
- [7]农杆菌介导β-1，3-葡聚糖酶（BG2）基因转化南瓜的研究[D]. 白婧. 东北农业大学, 2008(03)
- [8]β-1，3-葡聚糖酶活性与大豆抗疫霉根腐病的关系[D]. 娄树宝. 黑龙江八一农垦大学, 2008(09)
- [9]植物抗病机制及果树抗病育种研究进展[J]. 张丽丽,师校欣,杜国强,王惠英. 华北农学报, 2006(S2)
- [10]微束激光介导抗真菌基因转化棉花的研究及抗蚜基因的克隆[D]. 陈凌娜. 新疆农业大学, 2006(02)