一、基因工程耐热碱性磷酸酯酶的表达与分离纯化（论文文献综述）
曾君瑞[1]（2020）在《巨大芽孢杆菌来源的β-淀粉酶在枯草芽杆菌中的重组表达及应用研究》文中认为β-淀粉酶（α-1,4-D-glucan maltohydrolase,EC3.2.1.2）,是一种外切型淀粉酶,当作用于直链淀粉时,主要生成β-麦芽糖、葡萄糖以及麦芽三糖,而作用于支链淀粉时,主要生成麦芽糖及极限糊精。β-淀粉酶在啤酒酿造、制糖等生产领域有广泛的应用,商品化的β-淀粉酶主要来源于植物,热稳定性、p H耐受性较好,但工艺复杂,成本较高,且酶质量不稳定、纯度不高,而微生物来源的β-淀粉酶专一性、经济成本低,更易达到规模化生产,因此受到研究学者的青睐。本论文通过β-淀粉酶基因重组克隆表达技术,筛选单启动子、构建双启动子提升调控基因表达的强度,并同义突变高度保守的碳分解代谢物响应元件（catabolite responsive element,CRE）区域,以阻止分解代谢物控制蛋白（catabolite control protein A,Ccp A）形成的复合物与其结合,缓解碳分解代谢物阻遏效应（carbon catabolite repression,CCR）,最后经过培养条件优化,β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中表达水平达到8616.1 U/m L。主要研究内容如下:（1）β-淀粉酶基因重组表达体系的构建:成功扩增Bacillus.megaterium DSM 319来源的β-淀粉酶基因Amy M与来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、解链淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的22个天然启动子连接,成功构建了22株由单一启动子介导β-淀粉酶表达的重组菌株,经过测定发酵上清液中β-淀粉酶酶活,结果显示由P43、Pamy Q、Psig W、Pspov G、Pgsi B、PB.liche-apr、Pnpr B启动子介导表达的β-淀粉酶酶活水平较高,进一步筛选了不同组合的双启动子,测定β-淀粉酶酶活水平,显示双启动子P43-P43组合介导的β-淀粉酶重组菌株,在摇瓶发酵培养条件下酶活最高为2950.8 U/m L。（2）重组β-淀粉酶的纯化及酶学性质研究:对重组菌株p BED01(P43-P43)摇瓶发酵,取发酵上清液进行镍柱亲和层析纯化,结果显示重组酶β-淀粉酶的比酶活为361.04 U/mg,回收率为17.29%,纯化倍数为3.04,SDS-PAGE电泳结果显示蛋白的分子量约为50 k Da,重组β-淀粉酶经酶学性质分析,显示重组β-淀粉酶最适温度为50℃,最适p H值为6.0,在温度为35～45℃以及p H在5.0～6.0范围内β-淀粉酶具有较好的稳定性,金属离子Co2+对重组β-淀粉酶酶活有明显的激活作用,Zn2+、Mg2+、Fe3+、Ba2+随着浓度的变化,β-淀粉酶酶活力一直处于抑制状态,其中Ba2+的抑制效果最为明显。（3）缓解碳分解代谢阻遏效应:β-淀粉酶的基因中存在高保守的分解代谢物响应元件（catabolite responsive element,CRE）,并与反式阻遏蛋白—分解代谢物控制蛋白（catabolite control protein A,Ccp A）结合。定点突变CRE相应元件中的碱基,导致阻遏复合物无法与CRE位点结合,从而缓解碳分解代谢阻遏（Carbon catabolite repression,CCR）的影响。本研究结果显示,经过定点突变CRE位点的保守碱基,β-淀粉酶的酶活表达水平最高为4663.0 U/m L,相较于未突变前提高了58.0%。（4）高表达重组菌株p BE05发酵培养条件优化及应用:优化碳源为2.5%马铃薯淀粉,优化氮源为3%的酵母粉和胰蛋白胨复合氮源（2:1）,培养基初始p H为7.0,同时发酵摇瓶温度为34℃时,经发酵培养27 h时,取样测定上清液中重组β-淀粉酶的酶活水平达到最高8616.1 U/m L,相较未发酵优化前β-淀粉酶酶活提高了84.8%。将发酵产生的重组β-淀粉酶应用于糖化过程,探究重组β-淀粉酶加入量对麦芽糖转化率的影响,经研究发现当重组β-淀粉酶液的加入量为200 U/g时,麦芽糖的转化率达到了最高水平为57.6%,继续添加β-淀粉酶,麦芽糖转化率则不再提高。
孟迪[2]（2020）在《Bacillus amyloliquefaciens YP6在降解有机磷农药中的作用及机理》文中研究表明有机磷农药广泛地应用于家庭和农业中病虫害的防治,但其对非靶标生物的高毒性及潜在的迟发性神经毒性,已经造成了严重的环境污染和生态破坏。论文筛选高效降解毒死蜱的菌株,分析其16S rRNA和gyrB基因序列、研究其生理生化特征和降解特性;通过全基因组测序获得该菌株完整的遗传信息;利用转录组测序技术探讨其降解有机磷农药的机制,并获得降解相关的基因;研究其降解酶的基因特性、降解功能和酶学性质;利用环境模式生物斑马鱼对辛硫磷酶解产物的毒理性进行评估;具有一定的理论意义和潜在的应用价值。论文的主要研究结果如下:（1）比较了实验室保藏的20株具有促生和解磷作用的芽孢杆菌,从中筛选出一株高效降解毒死蜱的菌株YP6,经16S rRNA和gyrB基因序列分析及生理生化实验鉴定,确定菌株YP6属于解淀粉芽孢杆菌,并命名为Bacillus amyloliquefaciens YP6,其保藏号为CCTCC NO:M 2018875。Bacillus amyloliquefaciens YP6是一株广谱型降解菌,对有机磷农药毒死蜱、敌敌畏、敌百虫、三唑磷和辛硫磷具有较高的降解能力,尤其对辛硫磷的降解效率最高;该菌能够以辛硫磷为唯一磷源生长,但不能以其为唯一碳源;该菌能够在含有辛硫磷的LB液体培养基中快速生长并高效降解辛硫磷。利用响应面组合获得了该菌的最优降解条件:培养基初始pH 7.2,培养温度40°C和初始接种量为4.17%（v/v）。在最适条件下,该菌可耐受并降解高达700 mg·L-1的辛硫磷。通过液质联用（HPLC-MS）检测了菌株YP6降解辛硫磷的代谢中间产物并推测出该菌对辛硫磷的降解途径。（2）通过PacBio+Illumina Hiseq高通量测序方法对菌株YP6进行了全基因组测序,GenBank登录号为CP032146。该菌株仅含有一条大小为4009619 bp的染色体、GC含量为45.9%、共4322个基因,其中4210个CDS已注释到各大公共数据库中。对菌株的基因组进行生物信息学分析发现该菌与Bacillus amylollquefaciences MT45的亲缘关系最为接近,而且与NCBI数据库中已完成全基因组测序和组装的35株解淀粉芽孢杆菌全基因组对比,该菌的蛋白编码基因数远多于其它35株菌,但注释到“碳水化合物运输和代谢（G）”、“翻译,核糖体结构及合成（J）”、“转录（K）”、“细胞壁/细胞膜/包膜合成（M）”和“信号转导机制（T）”的基因数目却最少;此外,该菌株中含有一些促生物质（IAA合成前体物质色氨酸、铁载体和植酸酶）、抗菌活性的次级代谢产物（如Surfactin、Fengycin、Bacilysin、Macrolactin和Bacilaene）、编码鞭毛、细菌趋化性所需的全部基因,同时含有一些异型生物质（如氨基苯甲酸酯、阿特拉津、苯甲酸盐、氯烷烃、氯苯等）降解代谢途径中部分所需酶的基因。（3）辛硫磷作用下的转录组测序结果发现,菌株YP6降解辛硫磷的过程中有689个基因表达上调,851个基因表达下调。糖ABC转运蛋白、多药ABC转运蛋白、MFS转运蛋白等可能参与了菌株YP6将污染物运输到细胞内的过程。水解酶、单加氧酶、NADPH-细胞色素P450还原酶、糖基转移酶可能参与了辛硫磷水解、脱硫氧化、脱烷基以及糖基转移的代谢过程。细菌趋化性、双组分传感器、DNA摄取与重组和DNA修复等基因的表达上调有利于菌体抵御污染物造成的氧化胁迫。通过qRT-PCR验证了部分基因在转录水平上的表达情况,且结果与转录组数据一致。（4）基于HPLC-MS检测的菌株YP6对辛硫磷的降解中间产物、全基因组数据以及辛硫磷作用下的转录组数据分析锁定了3个碱性磷酸酯酶基因（D2M30＿2812、D2M30＿0296和D2M30＿1007）和1个NADPH-细胞色素P450还原酶基因（D2M30＿0765）,分别编码AP1、AP2、AP3和P450B-1。通过生物信息学分析获得了AP1、AP2、AP3和P450B-1的一级结构、二级结构和三级结构信息,并成功得到了AP2、AP3和P450B-1的蛋白模型。通过异源表达获得了具有生物活性的重组AP1、AP2、AP3和P450B-1;辛硫磷降解实验发现除AP1外,AP2、AP3和P450B-1对辛硫磷均表现出良好的降解性能。对重组酶的酶学性质研究,获得了AP2、AP3和P450B-1的最适p H（5.5、10.0和5.0）、最适反应温度（30、40和40°C）以及不同浓度、不同金属离子对重组酶活性的影响。以对硝基磷酸苯二钠（pNPP）作为AP2和AP3的底物,7-乙氧基香豆素作为P450B-1的底物Km分别为260.4、12.2和1.6 mmol·L-1;kcat分别为2.3×105、3.3×106和1.7×10-2 s-1;kcat/Km分别为8.8×102、2.7×105和1.1×10-2 L·s-1·mmol-1。（5）AP2、P450B-1以及AP2与P450B-1联合处理均能降解辛硫磷,且降解率分别为61.1、34.8和73.2%;通过HPLC-MS检测三种处理方式后的辛硫磷酶解产物发现AP2主要作用于辛硫磷中的P-O键,而P450B-1主要参与O-C2H5键的脱乙基反应。通过斑马鱼的急性毒性检验,显示这三种酶处理辛硫磷方式均有一定程度的解毒效果,其中AP2和P450B-1联合作用对辛硫磷的降解不仅速度快,而且降解比较完全,降解后产物的毒性与未降解辛硫磷相比明显降低。
段晓霞[3]（2020）在《产碱性磷酸酶乳杆菌的筛选、酶学性质及降解有机磷作用研究》文中进行了进一步梳理我国是一个农业大国,农作物产量的提高以及农作物病虫害防治均离不开农药,但农药的不合理施用在一定程度上引起了许多环境及健康问题。近年来研究发现碱性磷酸酶在有机磷农药降解方面发挥着重要作用。碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,EC 3.1.3.1,简称ALP）是一类非特异性磷酸单酯酶,在碱性条件下具有最佳活性,广泛存在于生命体中,参与体内多种生化反应和过程。本试验从78株乳酸菌中筛选出一株高产ALP的乳杆菌,在确定其种属后,优化了目的菌株中ALP的提取条件并纯化ALP,探究其酶学特性及其降解有机磷农药的作用。主要实验结果如下:1.利用传统培养方法从78株乳酸菌中,筛选出一株高产ALP的乳杆菌,将其命名为菌株Z23,酶活力为2.35±0.12U/mL。经形态学和分子生物学鉴定,菌株Z23为鼠李糖乳杆菌,16Sr RNA基因序列长度为1473 bp,基因登录号为MN582955。2.通过单因素试验和正交试验,优化了 ALP的提取条件,最佳提取条件为:细胞破碎时间15 min,破碎功率450W,料液比（g/mL）1:6,提取液pH值10.0,该条件下酶活力为4.95±0.26 U/mL,比优化前提高了 2.11倍。3.经硫酸铵分级沉淀、透析除盐浓缩、DEAE-52离子交换层析、Sephadex G-200凝胶过滤层析、真空冷冻干燥,得到纯化后的酶制剂。纯化后的ALP比活力为180.27 U/mg,纯化倍数为48.37,酶活回收率为17.05%。经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定其纯度,并测得ALP的分子量为46.7 kD。酶学特性表明,ALP的最适反应温度和pH分别为37℃和9.5,在4℃和pH 9.0-10.0范围内酶活最为稳定;Mg2+和K+为激活剂,对ALP有明显的激活作用;Ba2+和Cu2+在浓度为1-3 mmol/L时,对ALP有激活作用,当浓度高于3 mmol/L之后则表现为抑制作用;Ca2+、Zn2+及EDTA对ALP均表现出强烈的抑制作用。米氏常数（Km值）为3.42 mmol/L,最大反应速率（Vmax值）为 1.24 mmol/（L·min）。4.采用酶抑制法,计算出ALP对有机磷农药的降解率。结果表明ALP均表现出良好的降解效果,降解率均在85%以上,降解能力依次为敌敌畏（95.79±0.006%）>甲基对硫磷（90.69±0.026%）>毒死蜱（88.90±0.022%）>敌百虫（86.07±0.032%）>马拉硫磷（85.31±0.019%）>乐果（83.18±0.028%）,其中对敌敌畏和甲基对硫磷的降解效果最好,均可达90%以上。本实验结果为产ALP菌株的筛选和今后ALP的工业化生产及应用提供了理论基础和数据支持。
苏慧慧[4]（2019）在《基于代谢工程的D-葡萄糖二酸生物合成研究》文中认为D-葡萄糖二酸是一种非常有前景的平台化合物,已被广泛用于食品、医药和化工等领域。相较于化学氧化法,D-葡萄糖二酸的生物合成法因具有高效、经济和环保等特点而逐渐受到国内外学者的关注。然而关于D-葡萄糖二酸生物合成法的相关研究至今相当有限。为此,本课题基于代谢工程对D-葡萄糖二酸生物合成进行研究,为其工业化应用提供理论依据。本论文主要研究内容和结果如下:第一,以D-葡萄糖醛酸为原料,经葡萄糖醛酸脱氢酶（Uronate dehydrogenate,Udh）一步催化合成D-葡萄糖二酸,即“一步法”合成D-葡萄糖二酸。首先,利用基因挖掘手段,从根癌农杆菌菌株（Agrobacterium tumefaciens（At）,AtLBA4404,AtGV3101,AtEHA105）挖掘到三个葡萄糖醛酸脱氢酶。其次,对三个酶的酶学性质分析,结果显示:三个葡萄糖醛酸脱氢酶最适反应温度为30℃,最适反应pH为8.0,催化效率分别为800 s-1mM-1（AtLBA440Udh）,600 s-1mM-1（AtGV3101Udh）,530 s-1mM-1（AtEHA105Udh）。接着采用半理性设计策略对AtLBA4404Udh进行点饱和突变和组合突变,以提高其热稳定性和催化活性。结果表明:AtLBA4404的UdhA39P/H99Y/H234K三重突变体在59℃时的半衰期延长近400倍。其T 5010值从58℃提高到63℃。与野生酶Udh相比,UdhA39P/H99Y/H234K酶活提高近2.5倍。在最优条件下,以D-葡萄糖醛酸为底物,用重组全细胞(E.coli BL21（DE3）/pET-udhA39P/H99Y/H234K-nox)为葡萄糖醛酸脱氢酶的载体,催化D-葡萄糖醛酸合成D-葡萄糖二酸,其产量为98 mmol/L,转化率高达98%。此方法具有产量和产率高等特点,但其原料成本较高,制约了其工业化应用。第二,为了解决上述原料成本高的问题,本课题基于系统代谢工程在大肠杆菌体内构建了一条转化D-葡萄糖为D-葡萄糖二酸的合成途径。主要通过重新定向碳代谢流、阻断副产物途径基因表达、引入NAD+原位再生系统和微调关键酶的活性等策略,构建了最佳工程菌株GA17。其次优化培养基种类和培养条件（温度、pH值、底物浓度和溶氧水平）实现了菌株GA17生产D-葡萄糖二酸的最佳性能。在最优条件下,以D-葡萄糖和甘油为底物,大肠杆菌菌株GA17通过发酵生产D-葡萄糖二酸,其产量为25.5 mmol/L,产率为46%。相较于“一步法”,虽然该方法以可再生生物基原料进行合成目标产物,但其产量、产率有待进一步提高。第三,为进一步实现D-葡萄糖二酸的低成本工业化应用,本课题基于蔗糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖变位酶、肌醇-1-磷酸合成酶、肌醇单磷酸酯酶、肌醇氧化酶、葡萄糖醛酸脱氢酶和NADH氧化酶七种酶构建了一条D-葡萄糖二酸的无细胞生物催化系统,即“一锅法”合成D-葡萄糖二酸。该系统实现了NADH-NAD+的循环利用因而无需额外添加ATP或NAD+。通过对该反应体系的温度、pH、NAD+、缓冲液、酶组成及分批添加肌醇加氧酶等条件进行优化,实现了此无细胞生物催化反应体系的最佳性能。在优化条件下,以蔗糖为原料,利用该无细胞生物催化系统生产D-葡萄糖二酸,其产量为34.8 mmol/L,产率为75%（蔗糖）。此方法相较于前两种方法,具有高效、经济和副产物少等特点,同时也是国内外首次利用无细胞生物催化系统来合成D-葡萄糖二酸,极大地推进了D-葡萄糖二酸的低成本工业化进程。总之,本课题基于代谢工程成功构建了三条D-葡萄糖二酸高效合成途径,不仅为D-葡萄糖二酸的生物合成提供新的方法,更为D-葡萄糖二酸的低成本工业化生产奠定了理论基础,同时也为其它高附加值化学品的生物合成途径提供可借鉴经验。
李倩[5]（2018）在《辛硫磷与Cry1Ca对甜菜夜蛾的协同作用及增效机理研究》文中研究指明甜菜夜蛾Spodoptera exigua Hübner是一种间歇性暴发的多食性害虫,自20世纪80年代中后期以来,在棉田的危害越来越严重,主要依靠化学农药对其进行防治。辛硫磷（phoxim）是一种高效、广谱的有机磷杀虫剂,广泛用于防治咀嚼式口器害虫;Cry1Ca是一种对甜菜夜蛾具有高毒力的微生物源杀虫蛋白,但使用单一药剂易导致甜菜夜蛾产生抗药性。农药复配具有扩大防治谱、协同增效及延缓害虫抗药性等优点。因此,本试验旨在通过研究辛硫磷(LC30)与Cry1Ca(LC30)复配（简称混剂）对甜菜夜蛾的毒力变化,明确混剂对甜菜夜蛾毒力的协同作用,探索混剂协同增效对甜菜夜蛾解毒酶、抗性相关基因及体内共生微生物的影响,为揭示和阐明辛硫磷与Cry1Ca的增效机理及甜菜夜蛾产生抗性的分子机理提供理论依据。主要研究结果如下所示:1、利用表面污染法研究了辛硫磷与Cry1Ca的亚致死剂量对甜菜夜蛾的毒力作用。与空白处理相比,取食混剂的甜菜夜蛾2龄幼虫在3 d、5 d、7 d的死亡率分别为52.73%、93.13%、95.87%,分别比单独取食辛硫磷和Cry1Ca试虫的死亡率提高了22.06%、48.46%、50.87%和52.73%、75.40%、78.14%,故混剂毒力显着高于两个单剂;取食混剂的幼虫历期延长至15.6 d,分别比取食辛硫磷和Cry1Ca的幼虫历期延长了2.1 d和4.7 d。因此,混剂对防治甜菜夜蛾的协同增效作用显着。2、混剂对甜菜夜蛾碱性磷酸酯酶表达水平具有较大的影响。试验通过RACE技术获得甜菜夜蛾可溶性碱性磷酸酯酶基因SesALP1、SesALP2的全长序列,且发现SesALP1、SesALP2均在幼虫中肠组织呈现高表达水平;利用qPCR分析混剂对Se ALP mRNA表达水平的影响,结果表明SesALP1和SesALP2的表达水平在处理32 h后分别表现为上调和下调;在处理0 h32 h,SemALP1的表达水平随取食时间推移呈先升高后降低的趋势,SemALP2SemALP5的表达水平呈先下降后上升的趋势。3、混剂对甜菜夜蛾解毒酶及抗性相关基因具有较大的影响。甜菜夜蛾取食辛硫磷、Cry1Ca及混剂8 h后,试虫CAT活力显着升高,分别是空白处理的37.74倍、1.23倍、43.65倍,混剂处理组CAT活力显着高于单剂处理;在处理24 h后,药剂处理试虫体内AChE活性均显着低于空白处理,但各处理间差异不显着;在处理8 h和24 h后,Cry1Ca处理组CarE活力分别是空白处理的4.97和1.42倍,辛硫磷和混剂对CarE活力的抑制率分别为37.72%、65.35%和45.27%、52.36%,故Cry1Ca对CarE活性具有诱导作用,辛硫磷、混剂对CarE活性均具有抑制作用。通过qPCR进一步对试虫抗性相关基因P450和ABCC在0 h24 h表达水平的变化进行分析,结果表明ABCC3、ABCC4、ABCC12的表达水平先降低后升高,而CYP4L7、CYP4M15、CYP4S9、CYP6AB31、CYP6AE47、CYP6AE97、CYP9A9、CYP9A10、ABCC1、ABCC2、ABCC5、ABCC6表达水平先上升后降低。4、混剂对甜菜夜蛾体内共生微生物的多样性具有较大影响。运用16S rDNA宏基因组测序技术,检测辛硫磷与Cry1Ca的协同增效对甜菜夜蛾体内共微生物多样性的影响。经统计分析得到用于物种分类的OTUs数目为4318,RS1（辛硫磷+Cry1Ca）、RS2（辛硫磷）、RS3（Cry1Ca）、RS4（空白对照）4组处理样品的稀释曲线均逐渐趋于平缓,可基本反映处理试虫体内微生物的群落组成。OTUs聚类结果显示,4组样品微生物群落丰度的大小为RS2>RS3>RS1>RS4;由Beta多样性指数组间差异分析可知,4组样品微生物群落的多样性顺序为RS2>RS3>RS4>RS1,故混剂显着降低了试虫体内微生物的多样性;4种处理在门水平上和纲水平上的绝对优势菌群分别有4种（厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、拟杆菌门）和6种（梭菌纲、芽孢菌纲、α变形菌纲、γ变形菌纲、放线菌纲、拟杆菌纲）。从属水平分析可知,辛硫磷与Cry1Ca复配显着提高了红球菌属的丰度、显着降低了乳酸菌属和不动菌属的丰度。综上所述,辛硫磷与Cry1Ca二者混用对甜菜夜蛾的毒力具有明显的增效作用,并且药剂的协同作用对甜菜夜蛾体内部分保护酶活力、解毒酶活力、抗性基因表达水平以及体内微生物群落结构产生影响,导致其对药剂的敏感性发生改变。本项研究初步明确了辛硫磷与Cry1Ca对甜菜夜蛾的协同作用及增效机理,为甜菜夜蛾的抗药性治理和科学防治提供理论指导。
李政[6]（2016）在《HtrA对乳牙高致龋性变异链球菌GTFs表达及活性的影响》文中研究说明目的:变异链球菌（Streptococcus mutans,S.mutans）的致龋性与菌斑生物膜在牙面附着密切相关,菌斑生物膜的形成又与胞外多糖（extracellular polysaccharides,EPS）关系密切。葡萄糖基转移酶（glucosyl transferases,GTFs）作为S.mutans致龋过程中的关键酶,早已被证明是影响变异链球菌致龋性的重要毒力因子,其催化合成了水溶性及水不溶性葡聚糖,后者不仅是胞外多糖中的重要组成部分,更影响了S.mutans对牙面的黏附过程及菌斑生物膜的形成过程。高温需要A蛋白（high temperature requirement serine proteinase A,HtrA）作为链球菌属广泛表达的一种丝氨酸蛋白,同时具有分子伴侣功能和蛋白水解活性,其在细菌的生长、压力感受、错构蛋白的降解、正常蛋白的处理和成熟等方面起重要的调控作用。HtrA基因也存在于变异链球菌中,但其对葡萄糖基转移酶（GTFs）是否有影响,如何影响尚未明确。故本研究旨在运用分子生物学技术,通过对比乳牙变异链球菌HtrA基因缺陷株和乳牙变异链球菌HtrA高毒力株（以下简称HtrA基因缺陷株、HtrA高毒力株）在体外非应激环境中葡萄糖基转移酶信使核糖核苷酸的量、蛋白质的量及蛋白生物学活性的差异以探究乳牙变异链球菌致龋过程中HtrA基因对关键毒力因子的调控作用,推导其致龋机制,从而判断其在致龋过程中的重要性,为乳牙龋病的防治找到新的靶点。方法:本课题选用的菌株为乳牙高致龋性变异链球菌HtrA基因缺陷株和高毒力株（课题组前期已获得）及变异链球菌标准株（ATCC25175）。复苏各菌株,分别接种至MS培养基,进行形态学鉴定、生化鉴定对比。分别取鉴定后HtrA基因缺陷株、HtrA高毒力株的单一菌落接种于BHI培养基,37℃,厌氧（10%CO2、80%N2、10%H2）培养至指数期第10小时,收集菌液并调整菌液至相同浓度。取同体积两菌液,分别提取总RNA以实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（Quantitative Real-time PCR）方法检测两菌株菌液中gtfb,gtfc,gtfd的含量。取同体积两菌液,分别提取HtrA基因缺陷株和HtrA高毒力株的GTFs,调整蛋白浓度后分别加入等体积相同浓度（0.3%）蔗糖溶液,以蒽酮硫酸法检测其生物学活性。以HtrA缺陷株GTFs提取物为抗原辅以福氏完全和不完全佐剂制备GTFs小鼠（BALB/c）抗体。取同批次等体积菌液,分别提取总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,以GTFs小鼠（BALB/c）抗体为一抗进行蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测GTFB,GTFC,GTFD的含量。结果:经形态学和生化鉴定发现HtrA高毒力株、HtrA基因缺陷株和变异链球菌ATCC25175标准株细菌形态基本一致,均为长短不一、链状排列,革兰染色均为紫色阳性。HtrA基因缺陷株及高毒力株均可发酵甘露醇、山梨醇、密二糖、棉子糖,水解七叶苷,但不水解精氨酸,与变异链球菌ATCC25175标准株生物学性状相符。GTFs在HtrA基因缺陷株中的RNA及蛋白的表达量均高于HtrA高毒力株,差异具有显着性（P<0.05）。HtrA基因缺陷株GTFs生物学活性低于HtrA高毒力株,差异具有显着性（P<0.05）。结论:HtrA基因在乳牙高致龋性变异链球菌GTFs表达的过程中起重要的调控作用,其不仅参与GTFs表达的调控,而且可能在GTFs的转运过程中也起重要调控作用,相关机制有待进一步研究证明。
雷霁[7]（2016）在《多菌灵降解菌的筛选及降解酶的研究》文中进行了进一步梳理多菌灵是目前农业上用以防治粮食、蔬菜、水果及蘑菇等农产品真菌病害的一种主要杀菌剂。但是多菌灵大面积的反复施用,导致多菌灵的污染状况日趋严重。多菌灵在自然环境中的残留期较长,且在自然条件下不易降解。其大量和连续的使用也对环境起到了一定的消极作用。多菌灵生物降解研究对改善多菌灵污染具有重要意义。本研究经过分离筛选得到四株多菌灵降解菌,首先考察了其生长特性及降解特性,分析了其降解产物。其次对其所含多菌灵降解酶进行了克隆与表达,并对纯化酶的酶学特性进行了测定。在此基础上通过巯基封闭及氨基酸突变实验确定了多菌灵降解酶的活性位点和活性基团,阐明了酶降解机制。并进一步对该酶在土壤及蔬菜上的降解应用以及酶的固定化条件进行了考察。其结果对农药降解工程菌株的构建提供了理论基础并为多菌灵降解酶制剂的开发和应用具有重要的指导价值。具体内容包括:1.从多菌灵污染土壤中分离、筛选出4株多菌灵降解菌,经过形态学观察、生理生化指标测定及系统发育地位分析,将四菌株初步鉴定为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida sp.djl-1B、假单胞菌Pseudomonas sp.djl-5、微细菌Microbacterium sp.djl-6F和农杆菌Agrobacterium sp.djl-8B。四菌株的生长特性测定结果显示,四菌株在温度25°C到37°C,p H值为6.0-8.0的条件下均生长良好,最适生长温度均为30°C,最适生长p H均为7.0。djl-6F在各温度和p H值条件下的生长速度均高于其他三菌株,而djl-8B在各温度和p H值条件下生长速度最慢。djl-1B和djl-5B在各温度和p H值条件下生长状态相似。1%-2%Na Cl浓度为四菌株生长最佳盐浓度,当Na Cl浓度高于3%时四菌株的生长均表现出明显的受抑现象,Na Cl浓度过高或过低都对四菌株的生长产生不同程度的影响。菌株对抗生素抗性实验表明四菌株对头孢呋辛钠、头孢他啶、阿莫西林克拉维酸钾、马来酸阿奇霉素、克林霉素磷酸酯、头孢哌酮钠舒巴坦钠、头孢曲松钠、氨苄西林钠、青霉素钠、头孢噻肟钠、乳酸左氧氟沙星、硫酸庆大霉素十二种抗生素各表现出了不同程度的抗性。由于四菌株种属关系的异同所以表现出对环境适应性以及生长特性的差异。2.四菌株的降解特性及降解产物的检测结果可见,四菌株均可以多菌灵为唯一碳源生长并同时对多菌灵产生降解,其中djl-6F对多菌灵的降解率均高于其它三菌株,表现出明显的降解优势,而djl-8B则整体表现出较弱的降解能力。djl-1B、djl-5B和djl-8B的最适降解温度为30°C,djl-6F的最适降解温度为35°C,在各温度条件下降解能力最强,最适温度下,96 h时降解率达99.5%。djl-1B和djl-5B的最适降解p H为7.5,djl-6F和djl-8B的最适降解p H为7.0,当p H小于6.5或p H大于8.0均对四菌株的降解活性表现出一定程度的抑制。菌株djl-1B、djl-5B和djl-6F在多菌灵浓度小于150 mg/L时,降解速率较高,当多菌灵浓度大于200 mg/L时,降解明显受抑,而djl-8B对多菌灵浓度最为敏感,在多菌灵浓度大于100 mg/L时,降解速率明显减慢。四菌株对多菌灵的降解产物中均检测到2-氨基苯并咪唑（2-AB）和2-羟基苯并咪唑（2-HB）,其中菌株djl-5B降解产物还检测到了苯并咪唑（BZ）,四菌株对多菌灵的降解过程中均未见邻苯二酚的检测信号。3.降解酶的定域表达结果可知,djl-1B和djl-5B的多菌灵降解酶主要以诱导型胞内酶为主,djl-6F所含降解酶主要是以非诱导型的胞外酶为主,djl-8B所含降解酶主要是非诱导型胞内酶。使用特征引物对多菌灵降解酶基因mheI进行PCR扩增并测序分析,经比对,菌株djl-6F成功克隆得到792bp的多菌灵降解酶基因。将该基因片段克隆到p ET-28a（+）载体上,成功在E coli.中得到其融合蛋白的表达,通过钴离子亲和层析柱纯化后,得到纯化蛋白MheI-6F。酶动力学参数测定结果表明MheI-6F水解多菌灵的Km值为6.69±2.1μmol/L,kcat值为160.88±3.3 min-1。MheI-6F在10°C到45°C的范围内酶活比较稳定,相对酶活可保持在80%以上,对多菌灵的最适降解温度为45°C。当温度升至70°C时,MheI-6F仅剩40.17%的酶活。MheI-6F在p H 5.0到p H 8.0的范围较稳定,相对酶活在80%以上,稳定性和降解活性均在p H 7.0时达到最高。MheI-6F在偏酸性介质（4.07.0）中比偏碱性介质中（8.010.0）稳定性更强。体系中添加1 mmol/L的金属离子和化学试剂均对MheI-6F的酶活产生了不同程度的影响,金属离子中Fe3+影响最大,添加后的相对酶活为77.66%,而添加K+、Mg2+、Zn2+、Li+、Mn2+和Ca2+后MheI-6F的相对酶活均在80%以上。β-巯基乙醇、吐温-20、EDTA对多菌灵水解酶MheI-6F的酶活有轻微的抑制作用,而SDS则对MheI-6F的酶活抑制作用较强,添加后的相对酶活仅剩余46.21%,叠氮钠和甘油对酶活几乎没有影响。MheI-6F对多菌灵的降解产物中仅检测到了m/z为134[M+H]+的碎片峰,说明MheI-6F是将多菌灵水解为2-氨基苯并咪唑（2-AB）的关键酶。巯基封闭实验结果表明,MheI-6F所含巯基经过封闭以后完全失活。Cys突变结果表明,MheI-6F中16位点和222位点Cys突变后其水解酶活性分别降为45.06%和64.51%,而62位点、140位点和165位点Cys突变后其水解酶活性几乎没有变化。16位点和222位点Cys双突变后,MheI-6F完全失去水解活性。由此可确定,位于16位和222位的半胱氨酸是MheI-6F在水解多菌灵的过程中产生主要贡献的活性氨基酸残基,水解活性基团为巯基。该结果为农药降解工程菌的建立提供了理论基础。4.多菌灵降解酶对三种土壤及蔬菜多菌灵污染的降解实验结果可见外源添加降解酶MheI-6F后农田土壤、果园土壤和大棚土壤中多菌灵的降解半衰期分别从8.15 d、8.93d和7.52 d,骤然缩短为56.80 min、63.58 min和50.22 min。在喷施MheI-6F降解酶后,芹菜、菠菜和油菜中多菌灵的降解半衰期分别从5.06 d、4.41 d和4.26 d骤然缩短为40.76min、36.86 min和31.50 min。充分说明降解酶MheI-6F在对土壤农药残留污染及果蔬采摘后农药残留的降解方面具有一定的应用价值。5.采用海藻酸钠和Ca Cl2对降解酶MheI-6F进行了固定化,对其固定化条件进行了考察,单因素实验结果表明,用3%海藻酸钠、4%Ca Cl2溶液固定化4h的多菌灵固定化酶酶活力最高,正交试验表明这三个因素中固定化时间对酶活影响最大。固定化酶与游离酶的酶活比较显示经固定化后多菌灵降解酶的最适温度增加了5°C,而最适p H向碱性方向偏移了1.0,酶的热稳定性和p H稳定性都比游离酶有明显的提高。这一系列结果对固定化多菌灵降解酶MheI-6F的实地修复应用提供了一定的理论基础。
黎高翔[8]（2015）在《中国酶工程的兴旺与崛起》文中指出酶工程是生物工程的重要组成部分,工业生物催化技术被认为是继医药、农业之后的第三个浪潮。在25年中,中国在酶工程领域研究中取得很大进展,本综述集中介绍在中国酶工程会议上,酶的基因工程、酶的蛋白质工程、生物合成、微生物转化和生物传感器方面的成果和我国酶制剂工业的进展。
李洪波[9]（2014）在《黏玉米谷氨酰胺转氨酶微生物异源表达及其酶学性质研究》文中研究指明谷氨酰胺转氨酶（protein-glutamine: amine γ-glutamyltransferase，简称TGase， EC2.3.2.13）是一种催化酰基转移反应的酶，它能催化谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基（氨基受体）和赖氨酸残基的ε-氨基或其它伯胺基（氨基供体）之间的酰基转移反应。TGase的这种催化作用改变了蛋白质的构象，实现了蛋白质分子内、分子间的交联，从而改善了蛋白质的功能性质。TGase广泛分布于自然界，但植物来源TGase的分离纯化困难、得率较低，限制了研究者对植物来源TGase的研究，将其进行异源表达是解决这一问题的有效途径。本论文分别利用大肠杆菌、毕赤酵母表达系统表达黏玉米来源TGase（TGZ），同时利用重叠区扩增基因拼接法对tgz基因进行密码子优化，从而达到TGZ的高效表达，并将纯化后TGZ与微生物来源TGase（MTG）的功能特性进行了比较研究。为了研究tgz基因中叶绿体转移肽对TGZ可溶性表达和产量的影响，分别将tgz和不含叶绿体转移肽的tgz基因转入大肠杆菌感受态细胞，诱导发现两种表达产物均以包涵体的形式存在，且表达量无明显差异，说明叶绿体转移肽对TGZ的可溶性表达和产量无显着影响。对重组TGZ的表达条件进行优化，结果表明：含有tgz基因的重组ArcticExpress E. coli菌株，于37℃在LB培养基中培养至OD600约为0.4时，加入0.2mmol/L IPTG，于16℃诱导16h后获得TGZ的最大表达。诱导表达后，用8mol/L尿素溶解包涵体，复性后用亲和层析法进行分离纯化，纯化后TGZ活性为0.34U/mg，产量达到1.41mg/L。为了获得TGZ的可溶性表达，将tgz基因在真核表达宿主毕赤酵母中进行诱导表达。首先在不改变TGZ氨基酸序列的基础上，根据毕赤酵母密码子的偏好性，对tgz基因进行密码子优化。由于tgz基因含有15个重复序列，且重复序列个数对TGZ活性无影响，为了正确合成tgz基因，我们只保留一个重复序列，并把tgz分为A、B和C三个亚片段，利用重叠区扩增基因拼接法对优化后tgz基因（tgzo）进行合成。与tgz基因相比，tgzo基因共改变了289个核苷酸，涉及239个氨基酸，G+C含量从53.1%下降至40.3%，与毕赤酵母的G+C含量相符。同时为了便于后续的分离纯化，设计的tgzo基因带有组氨酸标签。将tgz和tgzo基因分别与载体pPIC9K连接，构建重组表达载体pPIC9K-tgz和pPIC9K-tgzo。将两种重组载体单酶切后通过电击转化入毕赤酵母GS115感受态细胞，经表型、G418抗性及菌落PCR法筛选出His+Mut+表型的高拷贝重组菌株G-tgz和G-tgzo。将两种重组菌株分别进行甲醇诱导表达，其中G-tgz通过凝胶过滤层析和离子交换树脂进行分离纯化，纯化后TGZ的比活达到0.32U/mg，产量达到1.44mg/L。G-tgzo则通过亲和层析法进行分离纯化，纯化后TGZo的比活达到0.89U/mg，产量达到4.4mg/L。密码子优化后，TGZo的酶活分别是大肠杆菌表达TGZ的2.6倍，毕赤酵母表达TGZ的2.8倍，产量分别是大肠杆菌和毕赤酵母表达TGZ的3.1倍，所以通过密码子优化设计，成功的提高了TGZ的活性和产量。为了提高重组子G-tgzo的表达量，本实验对诱导培养基、甲醇浓度、诱导时间、装液量、诱导阶段pH、诱导前菌体生物量、油酸及PMT1进行了单因素优化，确定了各因素的最佳值。采用Plackett-Burman设计及响应面分析法确定了最佳的表达条件：重组子G-tgzo用37mL pH6.5的改良BMMY培养基（含有0.006%PMT1和0.07%油酸）重悬至OD600为2时，于28℃诱导96h，每24h时补加100%甲醇，使其终浓度为1.31%，同时补加0.006%PMT1和0.07%油酸。在该条件下TGZo的活性达到1078mU/mL，比优化前提高了1.8倍。利用亲和层析法分离纯化TGZo，产量达到7.6mg/L，是优化前的1.73倍。采用荧光测定法对不同来源TGase的酶学性质进行研究。结果表明，重组酶对酪蛋白的亲和力低于MTG，TGZo的最适反应温度为37℃，低于TGZe和MTG的45℃，但是重组酶的温度稳定范围高于MTG，为460℃。重组酶的最适反应pH为8.0，高于MTG的7.0，且在偏碱性条件下重组酶的稳定性更好。不同金属离子对酶活性有一定的影响，其中低浓度的Ca2+对重组酶的促进作用最强。两种酶对不同底物蛋白的交联作用研究表明，TGZo和MTG对酪蛋白和大豆分离蛋白有显着的交联作用，其中TGZo对大豆分离蛋白的交联作用高于MTG，但是TGZo对乳清蛋白无交联作用。将重组TGZo用于酸奶发酵，发现它能提高酸奶的质构参数、表观黏度，降低酸奶的乳清析出量，但是TGZo的酶学性质导致了其对酸奶品质的改善作用低于MTG。同时研究了TGZo对不同脂肪含量酸奶样品的改善作用，发现脂肪对酶的催化作用影响不大。这些结果为植物来源TGase在食品工业中的应用奠定了基础。
涂洁[10]（2014）在《座壳孢菌酯酶和脂肪酶的纯化及酶学性质的研究》文中进行了进一步梳理座壳孢菌是一类应用广泛的昆虫病原真菌,在其侵染害虫过程中能产生酯酶和脂肪酶等,能加速病原真菌入侵昆虫。本文对座壳孢菌产酯酶及脂肪酶进行了初步研究,其结果如下。1.采用摇瓶培养筛选的方法从23株座壳孢菌筛选出高产酯酶和脂肪酶的菌株分别为座壳孢菌WYTY-03和WYTY-21。2.采用单因素筛选法、正交设计法及响应面优化法,对座壳孢菌产酶培养基成分及培养条件进行了优化。座壳孢菌WYTY-03产酯酶的最优培养基:10.0 g/L 的 L-阿拉伯糖、2.5 g/L 酵母浸粉、0.01 g/L Fe3+、2.28 g/L Mg2+、5.37 g/1（NH4）2SO4、0.112 g/L的VB2和pH6.7;最优培养条件:接种量20%,装液量50/250 mL,菌龄7 d,培养时间2d。在最优的培养基成分及条件下液体摇瓶发酵,其产酯酶活力达到29.52±0.39 U/mL,较基础培养基提高了 5倍左右。以上述最优条件大量培养的发酵液为实验材料,经硫酸铵沉淀、阴离子交换柱层析及葡聚糖凝胶层析技术,获得纯化的酯酶,由SDS-PAGE电泳推断其分子量约为79 KDa。对纯酶液进行性质研究,其结果表明.:酯酶的最适反应温度为40℃,在40℃条件下稳定性最好;最适pH为7.0,在pH6.5-8.0时稳定性较好;除了Al3+之外,几乎所有的金属离子都能促进酯酶的活性;而绝大部分的有机溶剂对酯酶有抑制作用;酯酶的Km值为0.802 mg/mL,Vmax为40.32μmol/min。同理,座壳孢菌WYTY-21产脂肪酶的最优培养基:51.5 g/L乳化橄榄油、2.5 g/L α-乳糖、0.35抑胰蛋白胨、1.45 g/L Na+、0.01 g/L Zn2+、0.1 g/L B4和ppH7.1;最优培养条件:接种量10%,装液量75/250 mL,菌龄1d,培养时间4 d。经优化后,其产脂肪酶酶活力达到39.48±0.52 U/mL,较筛选培养基提高了 7.6倍左右。纯化的脂肪酶分子量约为23 KDa,其性质研究结果表明:脂肪酶的最适反应温度为50℃,在低于50℃时稳定性较好;最适pH为8.0,在pH7.5-8.5时稳定性较好;除了 Na+、K+之外,几乎所有的金属离子对脂肪酶都有一定的促进作用;而甲醛对脂肪酶有明显的抑制作用;脂肪酶的Km值为1.252 mg/mL,Vmax为28.01μmol/min。3.通过扫描电子显微镜观察分析,其结果表明酯酶和脂肪酶对害虫（粉虱）体表有一定的降解作用,这对座壳孢菌应用于生物防治方面具有重要意义。另外,利用发酵罐深层发酵培养高产酶菌株,其发酵过程的pH变化、残糖含量变化及酶活变化也为酯酶及脂肪酶的工业应用提供了一些理论依据。
二、基因工程耐热碱性磷酸酯酶的表达与分离纯化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、基因工程耐热碱性磷酸酯酶的表达与分离纯化（论文提纲范文）
（1）巨大芽孢杆菌来源的β-淀粉酶在枯草芽杆菌中的重组表达及应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 淀粉及淀粉酶 |
| 1.1.1 淀粉的结构及特性 |
| 1.1.2 淀粉酶 |
| 1.2 β-淀粉酶 |
| 1.2.1 β-淀粉酶来源 |
| 1.2.2 β-淀粉酶结构与催化机理 |
| 1.2.3 β-淀粉酶酶活的测定方法 |
| 1.2.4 β-淀粉酶的应用 |
| 1.2.5 微生物来源的β-淀粉酶重组表达研究进展 |
| 1.3 枯草芽孢杆菌基因表达系统概述 |
| 1.3.1 枯草芽孢杆菌表达系统 |
| 1.3.2 枯草芽孢杆菌表达系统的控制元件 |
| 1.4 枯草芽孢杆菌碳分解代谢物阻遏效应 |
| 1.4.1 细菌磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统转运机制 |
| 1.4.2 碳分解代谢物阻遏效应的机制 |
| 1.5 论文研究的主要内容及意义 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章 β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌系统中高效表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌种与质粒 |
| 2.2.2 引物序列 |
| 2.2.3 试剂与试剂盒 |
| 2.2.4 培养基 |
| 2.2.5 主要仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 pBE-Amy M载体的构建 |
| 2.3.2 pBE-Amy M质粒转化大肠杆菌克隆及验证 |
| 2.3.3 单启动子pBE-promoter-Amy M表达载体的构建 |
| 2.3.4 pBE-promoter-Amy M质粒的克隆与验证 |
| 2.3.5 含有单启动子质粒在枯草芽孢杆菌中的转化 |
| 2.3.6 β-淀粉酶的酶活力测定 |
| 2.3.7 单启动子重组菌株酶活水平测定 |
| 2.3.8 双启动子pBE-P43-promoter-Amy M表达载体的构建 |
| 2.3.9 pBE-P43-promoter-Amy M质粒的克隆与验证 |
| 2.3.10 双启动子重组质粒在枯草芽孢杆菌中的转化、验证及发酵 |
| 2.3.11 双启动子重组菌株酶活水平测定 |
| 2.3.12 突变型Amy M-CRE重组质粒的构建 |
| 2.3.13 突变型Amy M-CRE重组质粒在宿主中的转化 |
| 2.3.14 突变型Amy M-CRE重组菌株摇瓶发酵及酶活测定 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 β-淀粉酶基因生物信息分析 |
| 2.4.2 β-淀粉酶基因和pBE载体片段的扩增与验证 |
| 2.4.3 载体pBE-Amy M构建、克隆与验证 |
| 2.4.4 单启动子pBE-promoter-Amy M表达载体的构建与验证 |
| 2.4.5 单启动子质粒转化宿主B.subtilis ATCC6051?10 的验证 |
| 2.4.6 单启动子对β-淀粉酶表达水平的影响 |
| 2.4.7 双启动子pBE-P43-Promoter-Amy M质粒的构建与验证 |
| 2.4.8 双启动子对β-淀粉酶表达水平的影响 |
| 2.4.9 突变型Amy M-CRE重组载体的构建、克隆与转化 |
| 2.4.10 缓解CCR效应对重组菌株β-淀粉酶酶活水平的影响 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 发酵菌株摇瓶培养条件的优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌种 |
| 3.2.2 试剂与培养基 |
| 3.2.3 主要仪器与设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 生长曲线的测定 |
| 3.3.2 发酵培养基成份的优化 |
| 3.3.3 发酵不同条件的优化 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 生长曲线的绘制 |
| 3.4.2 培养基成份的优化 |
| 3.4.3 摇瓶培养条件的优化 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 重组β-淀粉酶纯化、酶学性质及应用效果研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌种与质粒 |
| 4.2.2 试剂 |
| 4.2.3 培养基 |
| 4.2.4 主要仪器与设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 重组β-淀粉酶的纯化和蛋白含量的测定 |
| 4.3.2 重组β-淀粉酶SDS-PAGE蛋白电泳及Western blot分析 |
| 4.3.3 重组β-淀粉酶的酶学性质分析 |
| 4.3.4 重组β-淀粉酶在糖化反应过程中的应用 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 重组β-淀粉酶的亲和层析纯化 |
| 4.4.2 重组β-淀粉酶酶学性质分析 |
| 4.4.3 重组β-淀粉酶在糖化过程的应用效果 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 本论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（2）Bacillus amyloliquefaciens YP6在降解有机磷农药中的作用及机理（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词索引表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 有机磷农药概述 |
| 1.1.1 有机磷农药的结构 |
| 1.1.2 有机磷农药的发展 |
| 1.1.3 有机磷农药的污染 |
| 1.1.4 有机磷农药的危害 |
| 1.2 有机磷农药的生物降解 |
| 1.2.1 生物降解简介 |
| 1.2.2 有机磷农药降解菌 |
| 1.2.3 有机磷农药降解酶 |
| 1.3 微生物基因组研究 |
| 1.3.1 基因组及基因组学简介 |
| 1.3.2 微生物基因组分析 |
| 1.4 微生物转录组研究 |
| 1.4.1 转录组及转录组学简介 |
| 1.4.2 微生物转录组分析 |
| 1.5 斑马鱼及其在毒理学中的应用 |
| 1.5.1 斑马鱼的特点 |
| 1.5.2 斑马鱼在环境污染物中的毒性评价 |
| 1.6 论文的立题依据和研究内容 |
| 1.6.1 立题依据 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 第二章 降解菌株的筛选、鉴定及降解特性 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌种 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 实验试剂 |
| 2.2.4 培养基 |
| 2.2.5 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 不同菌株促生能力的检测 |
| 2.3.2 不同菌株对毒死蜱的降解特性 |
| 2.3.3 菌株YP6的鉴定 |
| 2.3.4 菌株YP6的底物谱分析 |
| 2.3.5 菌株YP6在不同培养基中的生长状况及对辛硫磷的降解特性 |
| 2.3.6 菌株YP6降解辛硫磷条件的优化 |
| 2.3.7 菌株YP6对辛硫磷的耐受性 |
| 2.3.8 菌株YP6降解辛硫磷的代谢产物检测与代谢途径分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 菌株YP6的全基因组测序及分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌种 |
| 3.2.2 实验仪器与试剂 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 菌株B.amyloliquefaciens YP6 基因组DNA提取 |
| 3.3.2 菌株YP6基因组组装与测序 |
| 3.3.3 菌株YP6基因组注释 |
| 3.3.4 比较基因组学分析 |
| 3.3.5 菌株YP6基因组中促生物质和抗菌物质合成基因簇 |
| 3.3.6 菌株YP6基因组注释中降解相关特性分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 菌株YP6降解辛硫磷的机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌种 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 实验试剂 |
| 4.2.4 培养基 |
| 4.2.5 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 RNA-seq测序质量 |
| 4.3.2 RNA-seq |
| 4.3.3 辛硫磷作用下细胞应激响应相关的差异表达基因 |
| 4.3.4 辛硫磷作用下物质运输相关的差异表达基因 |
| 4.3.5 辛硫磷作用下代谢相关的差异表达基因 |
| 4.3.6 辛硫磷作用下参与促生物质和抗菌物质合成相关的差异表达基因 |
| 4.3.7 qRT-PCR验证 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 辛硫磷降解酶基因及其异源表达 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌种 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 实验试剂 |
| 5.2.4 培养基 |
| 5.2.5 实验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 AP1、AP2、AP3和P450B-1 的生物信息学分析 |
| 5.3.2 AP1、AP2、AP3和P450B-1 蛋白同源建模 |
| 5.3.3 异源表达 |
| 5.3.4 辛硫磷降解验证 |
| 5.3.5 酶学性质 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 辛硫磷酶解产物对斑马鱼的急性毒理研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 试验动物 |
| 6.2.2 实验仪器 |
| 6.2.3 盐溶液 |
| 6.2.4 实验方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 辛硫磷酶解产物液质分析 |
| 6.3.2 辛硫磷的最大非致死浓度(MNLC)和LC_(10) |
| 6.3.3 酶处理辛硫磷对斑马鱼的急性毒性的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
| 附录Ⅱ:Bacillus amyloliquefaciens属全基因组信息 |
| 附录Ⅲ:菌株YP6促生物质和抗菌物质基因(簇)结构示意图 |
| 附录Ⅳ:异型生物质降解途径及相关基因 |
（3）产碱性磷酸酶乳杆菌的筛选、酶学性质及降解有机磷作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 酸马奶简介 |
| 1.2 乳酸菌的概述 |
| 1.3 碱性磷酸酶 |
| 1.3.1 碱性磷酸酶的概述 |
| 1.3.2 碱性磷酸酶结构及理化特性 |
| 1.3.3 碱性磷酸酶的检测方法 |
| 1.3.4 碱性磷酸酶的分离纯化 |
| 1.3.5 碱性磷酸酶功能基团修饰 |
| 1.3.6 碱性磷酸酶的应用 |
| 1.4 有机磷农药 |
| 1.4.1 有机磷农药的概述 |
| 1.4.2 有机磷农药的危害 |
| 1.4.3 有机磷农药的生物降解 |
| 1.4.4 有机磷农药降解酶降解机制 |
| 1.4.5 有机磷农药降解酶基因研究 |
| 1.4.6 有机磷农药降解酶的展望 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 样品采集 |
| 2.1.2 培养基及主要试剂 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 产ALP乳杆菌的筛选 |
| 2.2.2 产ALP菌株的鉴定 |
| 2.2.3 不同提取条件对ALP的影响 |
| 2.2.4 酶的分离纯化 |
| 2.2.5 酶学性质的研究 |
| 2.2.6 ALP对有机磷农药的降解作用 |
| 2.2.7 数据处理及分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 产ALP乳杆菌的菌种筛选 |
| 3.1.1 产酶菌株的初筛 |
| 3.1.2 产酶菌株的复筛 |
| 3.1.3 对硝基苯酚标准曲线的绘制 |
| 3.1.4 牛血清蛋白标准曲线的绘制 |
| 3.2 产ALP菌株的菌种鉴定 |
| 3.2.1 菌株形态学及生理生化鉴定 |
| 3.2.2 菌株分子生物学鉴定 |
| 3.2.3 系统发育树及同源性分析 |
| 3.2.4 菌株Z23的生长曲线和产酶曲线 |
| 3.3 ALP提取条件的单因素优化 |
| 3.3.1 破碎时间对ALP的影响 |
| 3.3.2 破碎功率对ALP的影响 |
| 3.3.3 料液比对ALP的影响 |
| 3.3.4 提取液pH对ALP的影响 |
| 3.3.5 正交试验 |
| 3.4 酶的分离纯化 |
| 3.4.1 硫酸铵分级沉淀 |
| 3.4.2 DEAE-52离子交换层析 |
| 3.4.3 Sephadex G-200凝胶过滤层析 |
| 3.4.4 ALP纯化结果 |
| 3.4.5 ALP的纯度鉴定及分子量测定 |
| 3.5 酶学性质的研究 |
| 3.5.1 ALP的最适温度 |
| 3.5.2 ALP的最适pH |
| 3.5.3 ALP的热稳定性 |
| 3.5.4 ALP的pH稳定性 |
| 3.5.5 金属离子和EDTA对ALP的影响 |
| 3.5.6 ALP的动力学常数K_m和V_(max)的测定 |
| 3.6 ALP对有机磷农药的降解作用 |
| 3.6.1 乙酰胆碱酯酶抑制率曲线的建立 |
| 3.6.2 ALP对有机磷农药降解率的测定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 产ALP乳杆菌的筛选 |
| 4.2 产ALP菌株提取条件优化 |
| 4.3 ALP的分离纯化 |
| 4.4 ALP的酶学性质 |
| 4.5 ALP对有机磷农药的降解 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（4）基于代谢工程的D-葡萄糖二酸生物合成研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 D-葡萄糖二酸简介 |
| 1.1.1 D-葡萄糖二酸的理化性质 |
| 1.1.2 D-葡萄糖二酸的用途 |
| 1.1.2.1 D-葡萄糖二酸在医药领域的应用 |
| 1.1.2.2 D-葡萄糖二酸在聚合物单体中的应用 |
| 1.1.2.3 D-葡萄糖二酸在金属螯合剂中的应用 |
| 1.2 国内外对D-葡萄糖二酸合成途径的研究进展 |
| 1.2.1 化学法生产D-葡萄糖二酸 |
| 1.2.2 微生物法合成D-葡萄糖二酸的研究进展 |
| 1.2.2.1 大肠杆菌合成葡萄糖二酸的研究进展 |
| 1.2.2.2 酵母合成D-葡萄糖二酸研究 |
| 1.2.2.3 红茶菌发酵产D-葡萄糖二酸研究 |
| 1.3 代谢工程改造策略 |
| 1.3.1 竞争性副产物相关基因的敲除 |
| 1.3.2 关键酶的表达翻译水平调节 |
| 1.3.3 酶的热稳定性改造 |
| 1.3.3.1 热稳定酶的来源 |
| 1.3.3.2 影响酶热稳定性的因素 |
| 1.3.3.3 酶的热稳定性改造策略 |
| 1.4 无细胞生物催化系统概述 |
| 1.4.1 无细胞生物催化系统研究进展 |
| 1.4.2 无细胞生物催化系统的应用 |
| 1.4.3 无细胞生物催化系统中辅因子和能量再生策略 |
| 1.4.4 无细胞生物催化系统的优势和挑战 |
| 1.5 本课题研究意义及主要研究内容 |
| 1.5.1 本课题的研究意义 |
| 1.5.2 本课题的主要内容 |
| 1.5.2.1 基于“一步法”合成D-葡萄糖二酸的研究 |
| 1.5.2.2 基于代谢工程构建高产D-葡萄糖二酸的大肠杆菌工程菌株的研究 |
| 1.5.2.3 基于无细胞生物催化系统构建D-葡萄糖二酸合成途径的研究 |
| 第二章 “一步法”合成D-葡萄糖二酸的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 培养基 |
| 2.2.3 仪器和设备 |
| 2.2.4 试剂、酶及相关试剂盒 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 大肠杆菌(E.coli DHα)的质粒提取 |
| 2.3.2 基因组提取 |
| 2.3.3 酶切和连接 |
| 2.3.4 DNA片段胶回收 |
| 2.3.5 大肠杆菌感受态的制备与转化 |
| 2.3.6 重组蛋白的诱导表达和纯化 |
| 2.3.7 蛋白浓度测定 |
| 2.3.8 重组葡萄糖醛酸脱氢酶Udh的辅因子依赖性研究和酶活测定 |
| 2.3.9 重组葡萄糖醛酸脱氢酶Udh的最适反应温度及热稳定性研究 |
| 2.3.10 重组葡萄糖醛酸脱氢酶Udh的最适反应pH及 pH稳定性研究 |
| 2.3.11 金属离子和化学试剂对重组葡萄糖醛酸脱氢酶Udh活性的影响 |
| 2.3.12 重组葡萄糖醛酸脱氢酶Udh的酶促反应动力学研究 |
| 2.3.13 重组葡萄糖醛酸脱氢酶LBA4404Udh的三维结构建模 |
| 2.3.14 重组葡萄糖醛酸脱氢酶LBA4404 Udh突变位点的选择 |
| 2.3.15 重组葡萄糖醛酸脱氢酶LBA4404 Udh突变文库的构建 |
| 2.3.16 重组葡萄糖醛酸脱氢酶LBA4404Udh突变文库的筛选 |
| 2.3.17 重组葡萄糖醛酸脱氢酶LBA4404 Udh突变体的分离纯化 |
| 2.3.18 重组葡萄糖醛酸脱氢酶LBA4404 Udh突变体的酶活测定 |
| 2.3.19 重组葡萄糖醛酸脱氢酶LBA4404 Udh突变体的酶学性质研究 |
| 2.3.19.1 重组葡萄糖醛酸脱氢酶LBA4404 Udh突变体的最适反应温度及最适反应pH研究 |
| 2.3.19.2 重组葡萄糖醛酸脱氢酶LBA4404 Udh突变体的酶促反应动力学常数研究 |
| 2.3.20 重组葡萄糖醛酸脱氢酶LBA4404 Udh突变体的热稳定性考察 |
| 2.3.21 重组全细胞催化D-葡萄糖醛酸产D-葡萄糖二酸 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 编码葡萄糖醛酸脱氢酶Udh的载体构建及诱导表达 |
| 2.4.2 葡萄糖醛酸脱氢酶Udh的辅因子依赖性 |
| 2.4.3 葡萄糖醛酸脱氢酶Udh的最适反应温度及热稳定性研究 |
| 2.4.4 葡萄糖醛酸脱氢酶Udh的最适反应pH及 pH稳定性研究 |
| 2.4.5 金属离子和化学试剂对重组葡萄糖醛酸脱氢酶Udh酶活影响 |
| 2.4.6 重组葡萄糖醛酸脱氢酶催化反应动力学参数研究 |
| 2.4.7 重组葡萄糖醛酸脱氢酶(AtLBA4404 Udh)突变位点的选取 |
| 2.4.8 重组葡萄糖醛酸脱氢酶突变文库筛选 |
| 2.4.9 部分突变体酶的最适温度和最适pH测定 |
| 2.4.10 葡萄糖醛酸脱氢酶Udh突变体的催化反应动力学参数 |
| 2.4.11 突变体酶的热稳定性研究 |
| 2.4.12 全细胞催化D-葡萄糖醛酸合成D-葡萄糖二酸的过程曲线 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 代谢工程构建高产D-葡萄糖二酸的大肠杆菌工程菌株的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 培养基 |
| 3.2.3 仪器和设备 |
| 3.2.4 试剂、酶及相关试剂盒 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 大肠杆菌的质粒提取 |
| 3.3.2 基因组提取 |
| 3.3.3 酶切和连接 |
| 3.3.4 DNA片段胶回收 |
| 3.3.5 大肠杆菌感受态的制备与转化 |
| 3.3.6 菌株培养和发酵条件 |
| 3.3.7 产物的发酵和检测方法 |
| 3.3.8 大肠杆菌基因组基因敲除流程 |
| 3.3.9 D-葡萄糖二酸合成途径质粒及敲除副产物途径基因构建 |
| 3.4 大肠杆菌对D-葡萄糖二酸耐受性试验 |
| 3.5 结果与讨论 |
| 3.5.1 大肠杆菌对D-葡萄糖二酸的耐受性 |
| 3.5.2 利用工程菌株从D-葡萄糖合成D-葡萄糖二酸 |
| 3.5.3 考察不同拷贝数质粒对D-葡萄糖二酸产量的影响 |
| 3.5.4 筛选最适的大肠杆菌宿主来提高生产D-葡萄糖二酸性能 |
| 3.5.5 基于CRISPR/pCas系统的菌体中心代谢途径改造 |
| 3.5.6 miox基因的改造 |
| 3.5.6.1 体外考察肌醇-1-磷酸合酶和肌醇氧化酶的最佳比例 |
| 3.5.6.2 miox基因的RBS序列选取和质粒重新构建 |
| 5.6.6.3 miox基因的改造对D-葡萄糖二酸产量的影响 |
| 5.6.6.4 辅因子循环体系的构建 |
| 3.5.7 发酵条件优化 |
| 3.5.7.1 溶解氧水平的优化 |
| 3.5.7.2 培养基的优化 |
| 3.5.7.3 发酵培养基pH的优化 |
| 3.5.7.4 发酵温度优化 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 无细胞生物催化系统合成D-葡萄糖二酸的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株和质粒 |
| 4.2.2 培养基 |
| 4.2.3 仪器和设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 分子生物学操作 |
| 4.3.2 D-葡萄糖二酸无细胞生物催化系统中7 种酶的诱导表达及纯化 |
| 4.3.3 D-葡萄糖二酸无细胞生物催化中的各个酶活测定 |
| 4.3.3.1 蔗糖磷酸合酶酶活测定 |
| 4.3.3.2 磷酸葡萄糖变位酶酶活测定 |
| 4.3.3.3 肌醇-1-磷酸合酶酶活测定 |
| 4.3.3.4 肌醇磷酸酯酶酶活测定 |
| 4.3.3.5 肌醇氧化酶酶活测定 |
| 4.3.3.6 葡萄糖醛酸脱氢酶酶活测定 |
| 4.3.3.7 NADH氧化酶酶活测定 |
| 4.3.4 D-葡萄糖二酸无细胞生物生物催化系统中各个条件优化 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 D-葡萄糖二酸无细胞生物催化系统的可行性分析 |
| 4.4.2 D-葡萄糖二酸无细胞生物生物催化系统中酶的选取及限速步骤分析 |
| 4.4.3 D-葡萄糖二酸无细胞生物催化系统中条件优化 |
| 4.4.4 D-葡萄糖二酸无细胞生物催化体系中酶浓度优化 |
| 4.4.5 D-葡萄糖二酸无细胞生物催化体系中pH调控 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）辛硫磷与Cry1Ca对甜菜夜蛾的协同作用及增效机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 甜菜夜蛾的危害特点与防治概况 |
| 1.1.1 危害特点 |
| 1.1.2 防治概况 |
| 1.2 Cry毒素对甜菜夜蛾的毒效 |
| 1.2.1 Cry毒素的结构与功能 |
| 1.2.2 作用方式 |
| 1.2.3 Cry毒素对甜菜夜蛾的毒力 |
| 1.3 辛硫磷防治甜菜夜蛾的概况 |
| 1.3.1 辛硫磷简介 |
| 1.3.2 甜菜夜蛾对辛硫磷的抗性 |
| 1.4 农药亚致死效应 |
| 1.4.1 亚致死剂量 |
| 1.4.2 农药亚致死剂量对昆虫生长发育的影响 |
| 1.5 昆虫抗性产生机制 |
| 1.5.1 农药对昆虫酶活性的影响 |
| 1.5.2 P450与昆虫抗性的相关性 |
| 1.5.3 ABC转运蛋白与昆虫抗性的相关性 |
| 1.6 昆虫肠道微生物的研究 |
| 1.7 农药复配 |
| 1.7.1 复配的优缺点 |
| 1.7.2 复配的应用 |
| 1.8 研究的内容与目的 |
| 第二章 辛硫磷与Cry1Ca的混剂对甜菜夜蛾的协同增效作用 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 供试昆虫 |
| 2.1.2 供试药剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 室内毒理生测 |
| 2.2.2 辛硫磷对甜菜夜蛾2龄幼虫的毒力测定 |
| 2.2.3 Cry1Ca对甜菜夜蛾2龄幼虫的毒力测定 |
| 2.2.4 混剂对甜菜夜蛾2龄幼虫的毒力测定 |
| 2.2.5 亚致死效应 |
| 2.2.6 毒力增效作用评估 |
| 2.3 数据统计及分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 辛硫磷、Cry1Ca对甜菜夜蛾2龄幼虫的毒力 |
| 2.4.2 混剂对甜菜夜蛾2龄幼虫的毒力 |
| 2.4.3 混剂对甜菜夜蛾的亚致死效应 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 辛硫磷与Cry1Ca的协同增效对甜菜夜蛾碱性磷酸酯酶表达水平的影响 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 供试昆虫 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 SesALP1、SesALP2基因全长的获得及序列分析 |
| 3.2.1 甜菜夜蛾总RNA提取 |
| 3.2.2 RACE模板的合成 |
| 3.2.3 SesALP1、SesALP2序列分析 |
| 3.3 SesALP1与SesALP2的时空表达分析 |
| 3.3.1 甜菜夜蛾各发育阶段和组织样本的收集 |
| 3.3.2 不同龄期和不同组织样本总RNA的提取 |
| 3.3.3 第一条链cDNA合成 |
| 3.3.4 荧光定量PCR |
| 3.4 协同增效对碱性磷酸酯酶基因mRNA表达量的影响 |
| 3.4.1 试虫收集 |
| 3.4.2 总RNA的提取 |
| 3.4.3 cDNA第一条链的合成 |
| 3.4.4 荧光定量PCR |
| 3.5 数据统计及分析 |
| 3.6 结果分析 |
| 3.6.1 SesALP1、SesALP2序列分析 |
| 3.6.2 SesALP1、SesALP2的时空表达分析 |
| 3.6.3 协同增效对甜菜夜蛾ALPmRNA表达水平的影响 |
| 3.7 讨论 |
| 第四章 辛硫磷与Cry1Ca的协同增效对甜菜夜蛾解毒酶及抗性相关基因的影响 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 供试昆虫 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 酶活性测定 |
| 4.2.1 试虫处理 |
| 4.2.2 保护酶活性测定 |
| 4.2.3 解毒酶活性测定 |
| 4.2.4 可溶性蛋白含量测定 |
| 4.3 协同增效对抗性相关基因表达量的影响 |
| 4.3.1 试虫收集 |
| 4.3.2 总RNA的提取 |
| 4.3.3 cDNA第一条链的合成 |
| 4.3.4 荧光定量PCR |
| 4.4 数据统计及分析 |
| 4.5 结果与分析 |
| 4.5.1 协同增效对3种酶活影响 |
| 4.5.2 协同增效对P450mRNA表达水平的影响 |
| 4.5.3 协同增效对ABCC表达水平的影响 |
| 4.6 讨论 |
| 第五章 辛硫磷与Cry1Ca的协同增效对甜菜夜蛾体内共生微生物的影响 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 供试昆虫 |
| 5.1.2 试虫处理 |
| 5.2 16SrDNA高通量测序 |
| 5.2.1 DNA的提取和PCR扩增 |
| 5.2.2 产物的混样和纯化 |
| 5.2.3 文库的构建和上机测序 |
| 5.3 信息分析 |
| 5.3.1 测序数据处理 |
| 5.3.2 OTU聚类和物种注释 |
| 5.3.3 样品复杂度分析(AlphaDiversity) |
| 5.3.4 多样品比较分析(BetaDiversity) |
| 5.4 结果分析 |
| 5.4.1 Illumina测序序列数据统计 |
| 5.4.2 物种多样性曲线 |
| 5.4.3 Beta多样性指数组间差异分析 |
| 5.4.4 不同处理对甜菜夜蛾体内菌群的种类及丰度的影响 |
| 5.4.5 不同处理对甜菜夜蛾体内优势菌群的影响 |
| 5.4.6 药剂处理组Ternaryplot分析 |
| 5.4.7 属水平物种进化树 |
| 5.4.8 LefSe |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）HtrA对乳牙高致龋性变异链球菌GTFs表达及活性的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略词对照表 |
| 致谢 |
| 细菌蛋白分离纯化技术的应用及研究进展(综述) |
| 参考文献 |
| 附件 |
（7）多菌灵降解菌的筛选及降解酶的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 我国农药的生产与使用 |
| 1.2 我国农药污染现状 |
| 1.3 农药残留的危害 |
| 1.3.1 农药污染对微生物的影响 |
| 1.3.2 农药污染对农作物的影响 |
| 1.4 农药的微生物降解 |
| 1.4.1 降解农药的微生物 |
| 1.4.2 微生物降解农药的主要途径 |
| 1.4.3 微生物降解农药的降解酶 |
| 1.4.4 微生物降解农药工程菌的构建 |
| 1.4.5 微生物降解农药的影响因素 |
| 1.5 农药多菌灵研究进展 |
| 1.5.1 农药多菌灵的使用现状 |
| 1.5.2 多菌灵的环境行为 |
| 1.5.3 农药多菌灵的毒性 |
| 1.5.4 农药多菌灵的微生物降解 |
| 1.6 研究目的与内容 |
| 1.6.1 研究目的 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.6.3 技术路线 |
| 1.6.4 创新点 |
| 第二章 多菌灵降解菌的筛选、分离与鉴定 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 主要仪器及试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 多菌灵降解菌株的分离与纯化 |
| 2.3.2 多菌灵降解菌株的分类鉴定 |
| 2.3.3 降解菌生长特性研究 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 多菌灵降解菌的分离与纯化 |
| 2.4.2 降解菌的分类鉴定 |
| 2.4.3 降解菌生长特性研究 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 多菌灵降解菌降解产物及降解特性的测定 |
| 3.1 供试菌株 |
| 3.2 主要仪器及试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 降解菌对多菌灵的降解研究 |
| 3.3.2 降解菌的降解特性研究 |
| 3.3.3 降解菌对多菌灵的降解产物研究 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 四菌株对多菌灵的降解曲线 |
| 3.4.2 温度对菌株降解多菌灵的影响 |
| 3.4.3 pH值对菌株降解多菌灵的影响 |
| 3.4.4 多菌灵初始浓度对四菌株降解多菌灵的影响 |
| 3.4.5 四菌株对多菌灵的降解产物 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 多菌灵降解酶降解机理的研究 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.2 主要仪器及试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 多菌灵降解酶的活性检测 |
| 4.3.2 多菌灵降解粗酶的定域表达测定 |
| 4.3.3 多菌灵降解酶基因的克隆与表达 |
| 4.3.4 酶学特性分析 |
| 4.3.5 巯基封闭实验 |
| 4.3.6 Cys突变实验 |
| 4.4 试验结果 |
| 4.4.1 多菌灵降解酶的活性检测方法 |
| 4.4.2 多菌灵降解酶的定域表达 |
| 4.4.3 目的基因的PCR扩增 |
| 4.4.4 多菌灵降解酶的重组表达 |
| 4.4.5 重组蛋白的可溶性分析 |
| 4.4.6 目标蛋白MheI-6F纯化结果 |
| 4.4.7 酶的动力学参数测定 |
| 4.4.8 酶的降解产物的测定 |
| 4.4.9 酶学特性分析 |
| 4.4.10 巯基封闭实验 |
| 4.4.11 Cys突变实验 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 多菌灵降解酶对土壤及蔬菜污染降解研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 供试土壤 |
| 5.1.2 供试蔬菜 |
| 5.2 主要试剂及仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 多菌灵降解酶对土壤多菌灵的降解测定 |
| 5.3.2 多菌灵降解酶对蔬菜多菌灵的降解测定 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 降解酶MheI-6F对土壤多菌灵的降解测定 |
| 5.4.2 降解酶MheI-6F对蔬菜多菌灵的降解测定 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 多菌灵降解酶的固定化 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 主要试剂及仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 多菌灵降解酶的固定试验 |
| 6.3.2 酶学特性试验 |
| 6.3.3 酶稳定性试验 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.4.1 固定化条件对固定化酶活力的影响 |
| 6.4.2 固定化酶酶学活性分析 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第七章 结论与创新点 |
| 7.1 研究结论 |
| 7.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）中国酶工程的兴旺与崛起（论文提纲范文）
| 1 酶的基因工程与蛋白质工程 |
| 2 酶与微生物细胞的生物合成与催化 |
| 3 生物传感器 |
| 4 我国酶制剂工业发展现状 |
（9）黏玉米谷氨酰胺转氨酶微生物异源表达及其酶学性质研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题背景及研究的目的和意义 |
| 1.2 不同来源TGase |
| 1.2.1 动物来源TGase |
| 1.2.2 微生物来源TGase |
| 1.2.3 植物来源TGase |
| 1.3 TGase的应用 |
| 1.3.1 TGase在食品工业中的应用 |
| 1.3.2 TGase在生物医学中的应用 |
| 1.3.3 TGase在纺织工业中的应用 |
| 1.4 TGase基因工程菌株的研究现状 |
| 1.4.1 大肠杆菌基因工程菌株的构建 |
| 1.4.2 棒杆菌基因工程菌株的构建 |
| 1.4.3 链霉菌基因工程菌株的构建 |
| 1.4.4 其它基因工程菌株的构建 |
| 1.5 大肠杆菌表达系统 |
| 1.5.1 宿主菌株的选择 |
| 1.5.2 载体的选择 |
| 1.5.3 与其它蛋白共表达 |
| 1.5.4 培养条件的控制 |
| 1.6 巴斯德毕赤酵母表达系统 |
| 1.6.1 毕赤酵母表达系统的组成 |
| 1.6.2 影响外源蛋白表达的主要因素 |
| 1.7 课题来源及研究内容 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 主要生化试剂 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.1.6 常用试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 黏玉米谷氨酰胺转氨酶基因的克隆 |
| 2.2.2 重组表达载体pCold-tgz和pCold-ptgz的构建 |
| 2.2.3 tgz在大肠杆菌中的诱导表达及表达产物的Western-Blot鉴定 |
| 2.2.4 重组大肠杆菌的表达条件优化 |
| 2.2.5 重组TGZ的分离纯化 |
| 2.2.6 TGZ活性测定 |
| 2.2.7 tgz基因密码子优化设计及全基因的合成 |
| 2.2.8 重组表达载体pPIC9K-tgz和pPIC9K-tgzo的构建 |
| 2.2.9 毕赤酵母的电击转化及转化子的筛选 |
| 2.2.10 G-tgzo重组子产酶条件的优化研究 |
| 2.2.11 不同来源TGase的性质研究和应用 |
| 2.3 数据处理与统计分析 |
| 第3章 黏玉米TGase基因在大肠杆菌中的高效表达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 tgz基因的克隆 |
| 3.3 重组表达载体pCold-tgz和pCold-ptgz的构建 |
| 3.4 重组大肠杆菌的诱导表达及产物的Western-Blot鉴定 |
| 3.5 重组大肠杆菌的表达条件优化 |
| 3.5.1 宿主菌株的确定 |
| 3.5.2 诱导培养基的确定 |
| 3.5.3 IPTG诱导周期的确定 |
| 3.5.4 IPTG诱导浓度的确定 |
| 3.5.5 诱导前菌体生物量的确定 |
| 3.6 重组TGZ的分离纯化 |
| 3.6.1 包涵体的提取 |
| 3.6.2 包涵体的复性和纯化 |
| 3.7 tgz在大肠杆菌中表达的讨论 |
| 3.7.1 叶绿体转移肽对TGZ表达的影响 |
| 3.7.2 温度对TGZ表达的影响 |
| 3.7.3 tgz在大肠杆菌中的高效表达 |
| 3.8 本章小结 |
| 第4章 黏玉米TGase基因在毕赤酵母中分泌表达的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 tgz基因密码子优化 |
| 4.2.1 tgzo基因的设计 |
| 4.2.2 tgzo基因的合成 |
| 4.3 tgz基因在毕赤酵母中的转化 |
| 4.3.1 重组表达载体pPIC9K-tgz和pPIC9K-tgzo的构建 |
| 4.3.2 毕赤酵母的电击转化及转化子的鉴定 |
| 4.4 酵母重组子的诱导表达 |
| 4.4.1 tgz基因在毕赤酵母中的分泌表达 |
| 4.4.2 TGZ的分离纯化 |
| 4.4.3 tgzo基因在毕赤酵母中的分泌表达及Western-Blot的鉴定 |
| 4.4.4 TGZo的分离纯化 |
| 4.5 tgz在毕赤酵母中分泌表达的讨论 |
| 4.5.1 tgz基因的密码子优化 |
| 4.5.2 SOEing-PCR法在tgzo合成过程中的应用 |
| 4.5.3 tgz和tgzo基因在毕赤酵母中的表达 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 G-tgzo重组子产酶条件的优化研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 G-tgzo重组子摇瓶发酵条件优化 |
| 5.2.1 诱导培养基对TGZo表达的影响 |
| 5.2.2 甲醇浓度对TGZo表达的影响 |
| 5.2.3 甲醇诱导时间对TGZo表达的影响 |
| 5.2.4 装液量对TGZo表达的影响 |
| 5.2.5 诱导阶段pH对TGZo表达的影响 |
| 5.2.6 诱导前菌体生物量对TGZo表达的影响 |
| 5.2.7 油酸浓度对TGZo表达的影响 |
| 5.2.8 PMT1浓度对TGZo表达的影响 |
| 5.3 Plackett-Burman设计 |
| 5.4 最陡爬坡试验 |
| 5.5 中心组合试验 |
| 5.6 G-tgzo重组子产酶条件优化研究的讨论 |
| 5.6.1 单因素条件优化研究 |
| 5.6.2 响应面优化研究 |
| 5.7 本章小结 |
| 第6章 不同来源TGase的性质研究和应用 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 不同来源TGase的酶学性质研究 |
| 6.2.1 酶动力学参数测定 |
| 6.2.2 最适反应温度 |
| 6.2.3 温度稳定范围 |
| 6.2.4 最适反应pH |
| 6.2.5 pH稳定范围 |
| 6.2.6 金属离子对酶活性的影响 |
| 6.3 不同来源TGase对不同底物蛋白交联作用的研究 |
| 6.3.1 不同来源TGase对酪蛋白交联作用的研究 |
| 6.3.2 不同来源TGase对乳清蛋白交联作用的研究 |
| 6.3.3 不同来源TGase对大豆分离蛋白交联作用的研究 |
| 6.4 不同来源TGase在酸奶中的应用研究 |
| 6.4.1 不同来源TGase对酸奶质构的影响 |
| 6.4.2 不同来源TGase对酸奶表观粘度的影响 |
| 6.4.3 不同来源TGase对酸奶乳清析出量的影响 |
| 6.4.4 不同来源TGase对酸奶蛋白质交联作用的影响 |
| 6.5 不同来源TGase在酸奶中应用的讨论 |
| 6.6 本章小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的论文及其它成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）座壳孢菌酯酶和脂肪酶的纯化及酶学性质的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 座壳孢菌的研究现状 |
| 1.1 座壳孢菌的分类地位 |
| 1.2 座壳孢菌的形态特征 |
| 1.3 座壳孢菌的侵染机理 |
| 2 酯酶概述 |
| 2.1 酯酶和脂肪酶的差异 |
| 2.2 微生物酯酶的来源 |
| 2.3 微生物酯酶的研究概况 |
| 2.4 微生物酯酶的应用 |
| 2.4.1 微生物酯酶在食品工业的应用 |
| 2.4.2 微生物酯酶在医药工业的应用 |
| 2.4.3 微生物酯酶在环保及军事中的应用 |
| 2.4.4 微生物酯酶在日用化工品及其他方面中的应用 |
| 3 脂肪酶概述 |
| 3.1 微生物脂肪酶的研究概况 |
| 3.2 脂肪酶的分离纯化 |
| 3.3 微生物脂肪酶的应用 |
| 4 研究内容 |
| 4.1 研究内容及意义 |
| 4.2 创新点 |
| 第二章 高产酯酶和脂肪酶菌株的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 酶的诱导 |
| 1.2.2 酶活力测定 |
| 1.2.3 标准曲线的制定 |
| 1.2.4 计算公式 |
| 1.2.5 高产酶菌株筛选 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 酯酶标准曲线的制定 |
| 2.2 高产酯酶菌株的筛选 |
| 2.3 脂肪酶标准曲线的制定 |
| 2.4 高产脂肪酶菌株的筛选 |
| 3 讨论 |
| 第三章 座壳孢高产酶菌株培养基及培养条件的优化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 酶的诱导 |
| 1.2.2 酶活力测定 |
| 1.2.3 标准曲线的制定 |
| 1.2.4 计算公式 |
| 1.2.5 碳源、氮源等单因素对产酶量的影响 |
| 1.2.6 培养基和培养条件的正交优化 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 酯酶及脂肪酶标准曲线的制定 |
| 2.2 酯酶单因素优化 |
| 2.2.1 碳源对产酯酶的影响 |
| 2.2.2 氮源对产酯酶的影响 |
| 2.2.3 金属离子对产酯酶活性的影响 |
| 2.2.4 维生素对产酯酶活性的影响 |
| 2.2.5 pH对产酯酶的影响 |
| 2.3 脂肪酶单因素优化 |
| 2.3.1 碳源对产脂肪酶的影响 |
| 2.3.2 氮源对产脂肪酶的影响 |
| 2.3.3 金属离子对产脂肪酶活性的影响 |
| 2.3.4 维生素对产脂肪酶活性的影响 |
| 2.3.5 pH对产脂肪酶的影响 |
| 2.4 酯酶培养基和培养条件的优化 |
| 2.4.1 培养基的优化 |
| 2.4.2 培养条件的优化 |
| 2.5 脂肪酶培养基和培养条件的优化 |
| 2.5.1 培养基的优化 |
| 2.5.2 培养条件的优化 |
| 3 讨论 |
| 第四章 座壳孢酯酶及脂肪酶的分离纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要试剂设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 考马斯亮蓝染色法测定蛋白含量 |
| 1.2.2 粗酶液的制备 |
| 1.2.3 硫酸铵盐析 |
| 1.2.4 酶液透析浓缩 |
| 1.2.5 DEAE A-52离子交换层析 |
| 1.2.6 Sephadex G-100凝胶过滤层析 |
| 1.2.7 纯化酯酶及脂肪酶的分子量检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 蛋白含量标准曲线 |
| 2.2 酯酶的分离纯化 |
| 2.3 脂肪酶的分离纯化 |
| 3 讨论 |
| 第五章 座壳孢酯酶及脂肪酶酶学性质初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 温度对酶的影响 |
| 1.2.2 pH对酶的影响 |
| 1.2.3 金属离子对酶的影响 |
| 1.2.4 有机溶剂及表面活性剂对酶活性的影响 |
| 1.2.5 动力学常数的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 酯酶的酶学性质 |
| 2.1.1 温度对酯酶的影响 |
| 2.1.2 pH对酯酶的影响 |
| 2.1.3 金属离子对酯酶的影响 |
| 2.1.4 有机溶剂及表面活性剂对酯酶活性的影响 |
| 2.1.5 酯酶的反应动力学曲线 |
| 2.2 脂肪酶的酶学性质 |
| 2.2.1 温度对脂肪酶的影响 |
| 2.2.2 pH对脂肪酶的影响 |
| 2.2.3 金属离子对脂肪酶的影响 |
| 2.2.4 有机溶剂对脂肪酶活性的影响 |
| 2.2.5 脂肪酶的反应动力学曲线 |
| 3 讨论 |
| 第六章 座壳孢酯酶及脂肪酶生物活性与发酵工艺的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 培养基 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 酶的生物活性分析 |
| 1.2.2 酶的发酵工艺研究 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 酯酶的生物活性分析 |
| 2.2 脂肪酶的生物活性分析 |
| 2.3 酯酶的发酵工艺研究 |
| 2.4 脂肪酶的发酵工艺研究 |
| 3 讨论 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文、授权国家发明专利和获奖 |
| 致谢 |
四、基因工程耐热碱性磷酸酯酶的表达与分离纯化（论文参考文献）
- [1]巨大芽孢杆菌来源的β-淀粉酶在枯草芽杆菌中的重组表达及应用研究[D]. 曾君瑞. 华南理工大学, 2020(06)
- [2]Bacillus amyloliquefaciens YP6在降解有机磷农药中的作用及机理[D]. 孟迪. 江南大学, 2020(01)
- [3]产碱性磷酸酶乳杆菌的筛选、酶学性质及降解有机磷作用研究[D]. 段晓霞. 内蒙古农业大学, 2020(02)
- [4]基于代谢工程的D-葡萄糖二酸生物合成研究[D]. 苏慧慧. 华南理工大学, 2019(06)
- [5]辛硫磷与Cry1Ca对甜菜夜蛾的协同作用及增效机理研究[D]. 李倩. 中国农业科学院, 2018(12)
- [6]HtrA对乳牙高致龋性变异链球菌GTFs表达及活性的影响[D]. 李政. 西南医科大学, 2016(04)
- [7]多菌灵降解菌的筛选及降解酶的研究[D]. 雷霁. 西北农林科技大学, 2016(09)
- [8]中国酶工程的兴旺与崛起[J]. 黎高翔. 生物工程学报, 2015(06)
- [9]黏玉米谷氨酰胺转氨酶微生物异源表达及其酶学性质研究[D]. 李洪波. 哈尔滨工业大学, 2014(03)
- [10]座壳孢菌酯酶和脂肪酶的纯化及酶学性质的研究[D]. 涂洁. 福建农林大学, 2014(05)