一、重组人白细胞介素-6治疗小鼠膀胱癌机制的实验研究（论文文献综述）
李传刚,舒晓宏,李墨林,刘用楫,武文森[1]（2003）在《重组人白细胞介素-6治疗小鼠膀胱癌机制的实验研究》文中指出目的 :探讨重组人白细胞介素 - 6 （rhIL 6 ）对BTT739荷瘤小鼠的抗肿瘤作用机制。方法 :BTT739肿瘤细胞接种T739小鼠 ,随机分组 :1)对照组 :腹腔注射生理盐水 0 2mL ,每日 1次 ;2 )rhIL 6组 :每日腹腔注射 1次rhIL 6 ,剂量为 4× 10 6IU/kg小鼠体重 ;应用电镜、流式细胞分析技术检测细胞凋亡 ;用流式细胞仪检测肿瘤细胞膜Fas与FasL受体及Bcl 2蛋白的表达。结果 :rhIL 6组小鼠肿瘤组织电镜下可见特征性凋亡细胞的出现 ,流式细胞仪检测出在G1期前出现凋亡峰较对照组明显增加 ,P <0 0 5 ;Fas与FasL的表达较对照组明显增加 ,rhIL 6组升至 12 5 7%和 2 0 1% ,而对照组仅为 4 6 6 %和 14 1% ,经检验P <0 0 5 ;Bcl 2蛋白的表达较对照组无明显变化 ,经检验P >0 0 5。结论 :rhIL 6可以诱导小鼠膀胱癌细胞凋亡 ,死亡受体Fas及FasL的表达增加 ,可能是rhIL 6诱导肿瘤细胞凋亡的重要信息传导途径
武文森,胡宏慧[2]（2000）在《重组人白细胞介素-6抑制BTT739小鼠膀胱癌生长和转移的实验研究》文中进行了进一步梳理目的 探讨重组人白细胞介素 6对小鼠膀胱癌BTT739生长和转移的抑制作用。方法将BTT739肿瘤细胞接种于T739近交系小鼠皮下 （ 2 6× 10 5/小鼠 ） ,2 4只小鼠随机分成 3组 ,第 3天始分别给予对照组溶剂 （ 0 9NS） 0 3mL ,治疗组重组人白细胞介素 6（ 4× 10 6IU kg） ,日 2次 ,腹腔注射 ,共 2 0天 ,阳性对照组MMC （ 1mg kg）日 1次 ,腹腔注射计 14天。第 2 5天测对照组和治疗组的皮下瘤重及肺转移率 ,分别进行t检验和 χ2 检验。结果 两组皮下瘤重分别为 11 4± 1 9g和 7 4± 0 8g ,重组人白细胞介素 6有明显抑制BTT739肿瘤生长作用 ,抑瘤率 35 1% （P<0 0 5） ,而对肺转移灶数目及转移灶大小的抑制率分别为 61 3%和 2 6 2 % （P值均 <0 0 5） ,有显着性差异。结论 重组人白细胞介素 6可明显抑制BTT739小鼠膀胱癌生长和转移。
冷怀明[3]（2002）在《《第三军医大学学报》2002年第24卷主题词索引》文中研究说明
纪璇[4]（2021）在《朱良春痛风汤治疗间歇期痛风的临床疗效观察并基于网络药理学的潜在机制探讨》文中提出目的:观察朱良春痛风汤治疗间歇期痛风的疗效;并基于网络药理学方法初步探讨朱良春痛风汤治疗痛风的作用机制。方法:1.本研究共纳入60名痛风间歇期患者,采用非双盲法、分层随机分组试验。将患者分为三组:西药组、中药组及中西药组,每组各20例。西药组给予非布司他口服治疗,中药组给予朱良春痛风汤口服治疗,中西药组给予朱良春痛风汤联合非布司他口服治疗,治疗4周后和8周后均给予检测尿酸水平,并比较治疗前后的临床疗效、症状积分以及尿酸水平的下降情况,同时观察各组治疗药物的不良反应。2.运用TCMSP数据库筛选朱良春痛风汤的活性成分和对应靶点,借助Genecard、TTD、OMIM及Drug Bank数据库收集痛风的作用靶点并通过微生信软件筛选出药物-疾病共同作用靶点。随后通过STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用网络,通过Cytoscape 3.6.0软件,构建PPI网络,并进行拓扑参数分析筛选出重要靶点。然后应用Metascape数据库对筛选出的共同靶点进行GO生物功能注释和KEGG通路富集分析。结果:1.三组药物治疗间歇期痛风均可降低症状积分,总有效率达都在75%以上;且均可降低血尿酸水平。在降低血尿酸水平方面,朱良春痛风汤单用不如非布司他;而朱良春痛风汤联合非布司他可起到协同作用。在不良反应方面,西药组中有15%的肝功能异常发生率,中西药组中有10%的肝功能异常发生率,中药组则无明显不良反应的发生。2.预测出朱良春痛风汤治疗痛风的有效化合物有189个和共同作用靶点有76个,经过筛选后获得TNF、IL1β、IL6、IL4、CXCL8、STAT3、JUN、CCL2、RELA、IL10、IL2、IFNG、ICAM1、MAPK14、IL1A等核心靶点,这些靶点可能为朱良春痛风汤的作用靶点。经GO生物功能注释得到31个GO生物过程,48个GO分子功能和88个细胞组分,这提示朱良春痛风汤是通过多种途径作用于不同的靶点。KEGG通路富集分析显示AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路、NF-κB信号通路等为显着性较高的通路,可能为这些通路可能是朱良春痛风汤的作用途径。结论:1.朱良春痛风汤可以改善间歇期痛风患者临床症状、降低血尿酸水平,无明显不良反应;在单用朱良春痛风汤时降尿酸水平不如非布司他;而联合非布司他治疗痛风时,可以协同提高痛风患者的临床疗效。2.朱良春痛风汤可能通过控制炎症因子、调节免疫、影响细胞分化、影响脂质代谢等生物过程改善痛风的临床症状,降低血尿酸水平。
张红欣[5]（2021）在《半乳糖凝集素-3抑制剂联合PD-L1抗体治疗非小细胞肺癌的疗效及其免疫调控机制的实验研究》文中进行了进一步梳理近年来免疫检查点抑制剂程序性死亡受体-1（Programmed cell death protein-1,PD-1）和其配体（PD-L1）的抗体在肺癌治疗中发挥了十分重要的作用,可有效抑制肿瘤的增长,延长了患者的生存期。但是在临床使用过程中,单纯应用PD-1抗体或者PD-L1抗体,未获得满意的临床疗效。原因之一为肺癌细胞表面表达PD-L1,其与机体内PD-1结合导致肿瘤免疫逃逸。半乳糖凝集素-3（Galectin-3,Gal-3）是一种半乳糖苷结合糖蛋白,在细胞内外都存在广泛的表达。研究发现Gal-3能调节免疫细胞的功能,参与细胞和体液免疫过程,而且在肺癌细胞中高表达,与肺癌的发生发展密切相关。JAK-STAT分子信号通路是肿瘤细胞内最为重要的分子信号通路之一,参与癌细胞的生长和迁移,STAT3是JAK-STAT信号通路中的关键成员,异常激活STAT3能够诱导肿瘤细胞PD-L1表达水平的升高,从而诱导免疫抑制。既往研究发现肿瘤微环境普遍存在乏氧现象,乏氧是诱导肿瘤细胞增殖或者侵袭力增强的一个原因。因此本研究探讨了缺氧环境下是否诱导肺癌细胞表达分泌Gal-3,Gal-3能否通过调节肿瘤细胞内的JAK-STAT分子通路而影响其PD-L1的表达,进而参与免疫抑制过程。继而我们研究了抑制Gal-3能否降低肺癌细胞表面PD-L1的表达,从而解除免疫抑制。此外我们也探讨了Gal-3抑制剂是否能够直接作用T细胞的激活过程、改善T细胞功能。最后我们分析了Gal-3抑制剂能否在体内抑制小鼠肺癌移植瘤的生长,是否能够增强PD-L1抗体对小鼠肺癌移植瘤的作用。本研究的主要内容分为以下三个部分:第一部分半乳糖凝集素-3在非小细胞肺癌中的表达及其通过STAT3途径对PD-L1调控作用研究目的:测定非小细胞肺癌细胞中Gal-3的表达水平,探讨在非小细胞肺癌中Gal-3及Gal-3抑制剂对JAK-STAT3分子信号通路的影响,以及对PD-L1表达水平的影响。方法:体外培养人源肺腺癌A549细胞系,将其置于缺氧环境,采用实时定量PCR检测细胞内Gal-3 m RNA水平,用酶联免疫吸附实验检测人源肺腺癌A549细胞Gal-3分泌量。采用不同浓度的Gal-3抑制剂处理体外培养的人源肺腺癌A549细胞72小时,进行MTT染色、酶标仪检测OD值法测定细胞活力,计算确定Gal-3抑制剂的IC50值,用于后续试验。采用Gal-3或者Gal-3抑制剂和人源肺腺癌A549细胞共培养,采用免疫蛋白印迹方法检测细胞内STAT3分子信号通路的活性,以及PD-L1表达情况。此外采用STAT3的沉默RNA（Si RNA）转染进入人源肺腺癌A549细胞内,抑制STAT3表达,采用免疫蛋白印迹验证抑制效果。并检测阻断STAT3通路活性后,Gal-3是否通过STAT3信号途径调节PD-L1表达。结果:1.缺氧诱导人肺腺癌A549细胞Gal-3的表达和分泌。缺氧组人肺腺癌A549细胞内Gal-3的m RNA水平明显高于空白对照组,缺氧组细胞内Gal-3的m RNA水平是空白对照组的3.3倍左右（P<0.05）。此外,采用免疫酶联吸附实验方法检测细胞培养基中Gal-3水平,对照组肿瘤细胞培养基中Gal-3水平为（320.67±12.34）pg/ml,而缺氧组细胞培养基中Gal-3水平为（1866.67±32.25）pg/ml,缺氧组肿瘤细胞培养基中Gal-3水平明显升高（P<0.05）。2.检测Gal-3抑制剂对人源肺腺癌A549细胞的IC50。结果显示Gal-3抑制剂对人源肺腺癌A549细胞IC50是1.04μM。3.Gal-3通过STAT3通路调控PD-L1表达。首先根据之前其他的研究结果,确定体外Gal-3处理人源肺腺癌A549细胞的浓度为0.5μg/ml。然后肺癌细胞接受安慰剂、Gal-3、Gal-3抑制剂、STAT3的si RNA处理后,分析细胞STAT3表达及活性和PD-L1表达水平。免疫蛋白印记结果显示;Gal-3组肿瘤细胞STAT3表达水平较对照组虽然没有区别,但Gal-3组人源肺腺癌A549细胞的STAT3磷酸化水平为对照组的189.33%（P<0.01）,PD-L1表达水平为对照组的188.36%（P<0.01）。同样,Gal-3抑制剂组肿瘤细胞STAT3表达水平较对照组虽然没有区别,但Gal-3抑制剂组肿瘤细胞STAT3磷酸化水平为对照组的48.72%（P<0.05）,PD-L1表达水平为对照组的56.37%（P<0.01）。转染si RNA的人源肺腺癌A549细胞内的STAT3表达,仅为对照组的23%抑制剂处理后与si RNA组的PD-L1表达水平没有明显差别（P>0.05）,但均明显低于对照组（P>0.05）。小结:缺氧环境下人源肺腺癌A549细胞Gal-3的表达和分泌水平明显升高。Gal-3能够激活肺癌细胞的STAT3信号途径,从而促进肺癌细胞表达PD-L1。抑制Gal-3表达后肺癌细胞内STAT3活性降低,其表面PD-L1的表达也降低。通过转染si RNA抑制肺癌细胞STAT3基因后,Gal-3失去调节肺癌细胞PD-L1表达的能力。第二部分半乳糖凝集素-3抑制剂对免疫细胞的激活和功能调控研究目的:Gal-3抑制剂对人外周血单核细胞功能的调节及机制。方法:首先采集正常人外周血标本,提取外周血中单核细胞。体外培养人源肺腺癌A549细胞,通过冻融法制作肿瘤细胞抗原。用肿瘤细胞抗原、脂多糖、细胞因子（重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素4、重组人白细胞介素2）刺激人外周血单核细胞,然后采用流式细胞学检测CD8阳性T细胞增殖能力,酶联免疫吸附实验检测细胞炎症因子的分泌（肿瘤坏死因子α,干扰素γ）。此外用肿瘤抗原、Gal-3抑制剂、细胞因子和PD-L1抗体刺激人外周血单核细胞,再将其与人源肺腺癌A549细胞以一定比例共同培养,采用4小时51Cr释放法方法观察人外周血单核细胞的细胞毒性变化,以评估人外周血单核细胞对人源肺腺癌A549细胞的杀伤效果。结果:1.Gal-3抑制剂能够提高外周血单核细胞中的T细胞增殖。流式细胞法检测结果显示,Gal-3抑制剂组的CD8+细胞毒性T细胞数量明显高于对照组（77.09%VS 10.51%,P<0.05）。2.Gal-3抑制剂能够提高人外周单核细胞分泌炎症因子Gal-3抑制剂组的IFN-γ和TNF-α的水平分别为（1233.00±23.20）pg/ml和（1679.84±40.20）pg/ml,而对照组IFN-γ和TNF-α的水平分别为（782.33±21.20）pg/ml和（1257.47±42.23）pg/ml,Gal-3抑制剂组的IFN-γ和TNF-α的水平均明显高于对照组（IFN-γ两组比较P<0.01,TNF-α两组比较P<0.01）。3.Gal-3抑制剂能够提高人外周单核细胞及PD-L1对人源肺腺癌A549细胞的杀伤效能。结果显示Gal-3抑制剂组人外周单核细胞对人源肺腺癌A549细胞的杀伤效能明显高于安慰剂对照组（P<0.05）。同样我们的研究结果也证实,PD-L1抗体组较安慰剂组也能明显提高人外周单核细胞对人源肺腺癌A549细胞的杀伤效能（P<0.01）。Gal-3抑制剂和PD-L1抗体联合组人外周单核细胞对人源肺腺癌A549细胞的杀伤效能明显高于Gal-1抑制剂组和PD-L1组（P<0.01）。小结:Gal-3抑制剂能够提高人外周血单核细胞细胞的活性和功能,以及对肺癌细胞的杀伤能力。而且Gal-3抑制剂能够提高PD-L1抗体介导的人外周血单核细胞对人源肺腺癌A549细胞的体外杀伤能力。第三部分半乳糖凝集素-3抑制剂联合PD-L1抗体体内抗肿瘤作用的研究目的:检测Gal-3抑制剂对裸鼠人源肺腺癌5549移植瘤的抑制作用,以及Gal-3抑制剂与PD-L1抗体联合应用对裸鼠人源肺腺癌A549移植瘤的抑制效果。方法:采用BALB/C小鼠,用皮下注射方式将人源肺腺癌A549细胞种植于小鼠皮下,待瘤体形成后,经尾静脉向小鼠体内注射人外周血单核细胞,再随机分组,包括:Gal-3抑制剂组、PD-L1抗体组、Gal-3抑制剂联合PD-L1抗体、安慰剂组。然后监测小鼠肿瘤生长速度。以安慰剂治疗组为对照,计算各个治疗组中,Gal-3抑制剂或者PD-L1抗体单独治疗对肿瘤生长的抑制率,以及Gal-3抑制剂与PD-L1抗体联合治疗对小鼠皮下移植瘤的抑制率,然后通过公式计算联合治疗指数,分析联合治疗产生的效应。此外收集小鼠肿瘤组织,称量肿瘤重量。最后采用免疫组织化学染色方法,检测小鼠肿瘤组织中CD3和颗粒酶B表达阳性情况,以评估T淋巴细胞的浸润和功能情况。并用ELISA法分析肿瘤组织的IFN-γ及IL-2的表达水平。结果:与安慰剂相比,Gal-3抑制剂和PD-L1抗体在单独应用时,均能抑制肿瘤的增殖,Gal-3对肿瘤生长的抑制率为23.94%;PD-L1抗体对肿瘤生长的抑制率为62.02%。而且当Gal-3抑制剂和PD-L1抗体联合应用时,对肿瘤生长的抑制率达到78.17%,能够产生协同效应,其联合治疗的效应指数为0.21,抑制肿瘤的能力明显优于上述两种药物单独应用。免疫组织化学染色也发现,联合治疗组小鼠的肿瘤组织内CD3阳性的T淋巴细胞数量明显高于Gal-3抑制剂或者PD-L1抗体单独治疗组。而且联合治疗组肿瘤颗粒酶B阳性的淋巴细胞内的表达也明显高于Gal-3抑制剂或者PD-L1抗体的单独治疗组。ELISA检测发现肿瘤组织中检测Gal-3抑制剂联合PD-L1抗体治疗组肿瘤组织中IFN-γ和IL-2的分泌量明显高于单独应用Gal-3抑制剂或者PD-L1抗体组（P<0.05）。小结:Gal-3抑制剂能够抑制人源肺腺癌A549肿瘤的生长,而且Gal-3抑制剂能够提高肿瘤细胞内T淋巴细胞数量及功能,在与PD-L1抗体联合应用后,能够明显提高肿瘤浸润的淋巴细胞的功能,产生抑制肿瘤的协同效应。结论:肺癌细胞能够表达和分泌Gal-3,缺氧环境可促进Gal-3的表达和分泌;Gal-3可通过STAT3信号通路调控肺癌细胞PD-L1的表达,但尚不能完全抑制PD-L1的表达,表明Gal-3可能其它信号通路调节PD-L1的表达;Gal-3能够调节免疫细胞的数量和功能,并可增加肿瘤组织中T细胞浸润数量;Gal-3抑制剂和PD-L1抗体有协同抗肿瘤作用;Gal-3抑制剂可以抑制肿瘤的生长,其可能成为新的治疗靶点。
武红飞[6]（2021）在《PHF6调控NSD2介导的H3K36me2修饰的分子机制》文中认为调控基因表达的表观遗传机制主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA,其中组蛋白修饰在染色质调控过程中起着至关重要的作用。组蛋白H3赖氨酸36二甲基化（H3K36me2）作为转录活性的标志,与基因转录水平呈正相关。目前为止,已发现七个组蛋白甲基转移酶可以催化H3K36二甲基化,包括NSD1、NSD2、NSD3、ASH1L、SETD3、SETMAR和SMYD2。致癌基因核受体结合SET结构域蛋白2（NSD2）在多发性骨髓瘤中被首次发现,在乳腺癌、肺癌、膀胱癌、结肠癌和前列腺癌等实体肿瘤中均高表达。NSD2参与很多细胞过程,包括DNA损伤修复、DNA复制、上皮-间质转化和调控细胞周期等。NSD2作为组蛋白甲基转移酶家族成员,主要催化H3K36me2,然而NSD2以何种机制调控H3K36me2在染色质上的分布还研究很少。为了探究NSD2调控H3K36me2的具体机制,我们通过免疫沉淀实验和质谱分析,得到一系列与NSD2结合的蛋白,通过蛋白结构域分析,选取PHF6为候选蛋白。通过体内免疫共沉淀实验,我们发现PHF6蛋白确实能够与NSD2结合,并且其C端结构域的缺失导致这种结合的降低。为了进一步验证PHF6与NSD2的结合作用,我们通过体外Pull-down实验,发现PHF6蛋白的C端主要负责与NSD2蛋白直接结合,NSD2蛋白的第四个PHD4区域主要负责与PHF6蛋白直接结合。在小鼠胚胎干细胞中敲除PHF6基因能够导致NSD2蛋白水平的降低,同时,细胞中H3K36me2水平也明显降低,而H3K27me3水平明显升高。通过碱性磷酸酶染色以及MTS细胞增殖实验,我们发现敲除PHF6基因不影响小鼠胚胎干细胞的多能干性和生长速率。综上所述,PHF6的C端通过与NSD2的第四个PHD4区域结合,调控NSD2介导的H3K36me2。此研究为细胞体内H3K36me2的调控提供了新的的分子机制,也为将来调控细胞内H3K36me2水平提供了更多的可能靶点。
尹良伟[7]（2021）在《黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究》文中研究表明自20世纪70年代末,全球乳腺癌（Breast Cancer）发病率一直呈上升趋势,在我国乳腺癌已经成为女性发病首位的恶性肿瘤,而且呈现年轻化趋势;年轻女性乳腺癌的发病,往往侵袭性更高,病理分级及预后更差。手术、化疗、放疗和内分泌治疗是乳腺癌传统的四大治疗手段,生物治疗为进入本世纪以来乳腺癌的第五大治疗手段,免疫治疗从属于生物治疗的范畴。然而,乳腺癌免疫治疗的发展一直较为缓慢。因此,如何合理选择人群和合理的治疗模式,让更多的乳腺癌患者从免疫治疗中获益,是未来该领域的重点发展方向。树突状细胞（Dendritic Cells,DC）作为抗原提呈功能细胞的主要效应细胞之一,将固有免疫和适应性免疫紧密连接在一起,尤其是在特异性免疫反应中发挥独特的免疫学效应。根据不同阶段DC生物学特性的不同,有些学者设想利用改善DC功能的手段来增强其抗肿瘤效应。黏蛋白1（Mucins1,MUC1）是I型跨膜糖蛋白,正常情况下可表达于多种组织、器官的上皮细胞近管腔或腺腔面,亦可见于腺癌上皮细胞的表面,而且呈高表达态势。相关研究显示,MUC1表达程度越高,往往预示着肿瘤侵袭性越强,预后越差,而且更容易出现局部浸润、淋巴结转移和血行转移。结合近年来MUC1在肿瘤生物治疗中的新发现以及基因修饰技术的成熟和推广,我们以MUC1作为出发点,以基因修饰DC作为主要技术路线,分以下3部分系统探讨MUC1基因转染后的DC对乳腺癌的免疫作用,旨在探索乳腺癌新的肿瘤免疫治疗途径与方法。一、黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备目的:验证MUC1在人乳腺癌中高表达,并构建和包装MUC1重组慢病毒,感染DC,制备过表达MUC1的DC疫苗。材料和方法:（1）应用免疫组织化学技术检测90例乳腺癌组织和30例癌旁正常组织以及三种细胞（神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y与两种乳腺癌细胞系MCF7、MDA-MB-231）中MUC1蛋白的表达,q PCR检测26例新鲜乳腺癌组织和癌旁正常组织以及三种细胞MUC1 m RNA水平,验证MUC1在乳腺癌组织及细胞系中的表达;（2）应用GV657载体,经目的基因扩增、PCR产物与载体交换、测序、质粒提取及纯化、病毒包装,获取重组MUC1慢病毒;（3）通过密度梯度离心法,体外分离获得人外周血单个核细胞;采用无血清培养基,经人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rh GM-CSF）、重组人白介素-4（rh IL-4）和肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor,TNF）-α诱导产生成熟DC;流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平;（4）MUC1慢病毒感染DC,分为MUC1基因感染DC组（MUC1-DC组）、空载体感染DC组（GFP-DC组）以及对照组（DC组）;（5）RT-PCR检测感染后DC的MUC1 m RNA水平;（6）Western blotting检测感染后DC的MUC1蛋白表达。结果:（1）90例乳腺癌组织中,MUC1表达明显高于癌旁正常组织,92.2%（83/90）乳腺癌组织中显示MUC1高表达,30例癌旁组织中5例为高表达（16.7%）,其余25例者（83.3%）为阴性或细胞质内弱表达。在26例乳腺癌组织中有92.3%（24/26）的MUC1 m RNA水平明显高于配对的癌旁对照组织（P<0.01）,仅2例乳腺癌中MUC1 m RNA表达水平与癌旁组织相当;与神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y比较,两种乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231的MUC1 m RNA水平和蛋白表达均显着增高（均为P<0.01）;（2）MUC1重组质粒测序结果与目的基因一致,经包装获得病毒滴度为1×109TU/m L的重组MUC1慢病毒;（3）相差显微镜观察体外培养的外周血来源DC形态变化过程,培养至5～7d大部分细胞脱壁悬浮,体积明显增大且大小不等,形态不规则,表面可见很多粗细不一、参差不齐、形态各异的毛刺状突起,呈现典型的树突状细胞形态;培养7d的DC流式检测结果显示,CD1a、CD80、CD83及CD86分子表达率分别为（21.6±2.4）%、（22.7±1.6）%、（24.9±2.1）%及（95.4±4.3）%,表明获得成熟DC;（4）采用MUC1重组慢病毒感染DC后,于24 h时可见特异性GFP表达,24h、48 h、72 h的转染效率分别为（11.7±1.0）%、（12.9±0.9）%和（36.8±1.6）%;（5）与空载体组和对照组相比,MUC1-DC组RT-PCR检测到346 bp扩增带;（6）同时Western blotting检测MUC1-DC组可见明显的MUC1蛋白条带。结论:（1）验证了MUC1在人乳腺癌组织以及两种人乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231中呈高表达;（2）成功构建MUC1重组质粒,并包装获得携带MUC1基因重组慢病毒;（3）以MUC1重组慢病毒感染DC,成功获得过表达MUC1的DC,即MUC1-DC疫苗。二、MUC1-DC免疫功能的体外研究目的:探究前一部分实验获得的MUC1-DC疫苗在体外诱导CTL的免疫作用及对人乳腺癌细胞MCF7的杀伤活性。材料和方法:（1）诱导培养特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）,免疫荧光技术检测不同转染时间后MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-α情况;（2）ELISA法检测比较MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL和DC-CTL IL-12、TNF-α含量;（3）以人乳腺癌细胞MCF7为靶细胞,以MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL、DC-CTL为效应细胞,采用LDH释放法检测CTL的杀伤活性,CTL特异性杀伤率（%）=（试验孔值-效应细胞对照值）/（最大杀伤对照值-最小杀伤对照值）×100%。结果:（1）经免疫荧光检测,转染的MCU1-DC培养2d后诱导CTL开始表达IL-12和TNF-α,但荧光强度较弱;与MCU1-DC培养3d相比,培养4d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的量均明显升高,荧光强度增强,差异均具有统计学意义（P<0.05,P<0.05）;MCU1-DC培养5d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α荧光强度最强;MCU1-DC培养6d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的荧光强度逐渐下降;（2）ELISA结果显示:GFP-DC诱导CTL分泌细胞因子IL-12、TNF-α能力较低,分别为（101.83±5.79）ng/m L、（119.26±11.52）ng/m L,与DC组比较差异无统计学意义（P>0.05）;而MUC1-DC诱导CTL分泌这两种因子的能力明显增强,分别为（202.52±17.10）ng/m L和（349.07±79.42）ng/m L,与DC组和GFP-DC组比较,差异均有明显统计学意义（均为P<0.01）;（3）LDH释放法检测结果显示,三组杀伤活性均随效靶比的升高而增强;相同效靶比时,与DC-CTL组或GFP-DC-CTL组比较,MUC1-DC-CTL组对靶细胞MCF7具有更明显的杀伤活性,差异具有明显统计学意义（均为P<0.01）。结论:（1）MUC1基因转染的DC诱导CTL即MUC1-DC-CTL在5 d时分泌IL-12和TNF-α的能力最强,用于本研究后续实验;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC诱导CTL具有更强的产生IL-12、TNF-ɑ细胞因子的免疫活性;（3）MUC1-DC-CTL对人乳腺癌MCF-7细胞比单纯DC-CTL具有更明显的杀伤活性,而且随着效靶比的升高,CTL的杀伤活性逐渐增强。三、光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用目的:通过活体监测MCF7荷瘤裸鼠的成瘤生长情况,评价MUC1基因转染的DC疫苗对乳腺癌免疫作用的效果及其可能的机制。材料和方法:（1）GFP慢病毒转染MCF7细胞（GFP-MCF7）;（2）BALB/c裸鼠皮下种植GFP-MCF7 1×107个/只,成瘤后随机分为3组,各组裸鼠首先尾静脉注射体外活化的CIK细胞1×108个/只,治疗组于皮下注射MUC1-DC（MUC1-DC组）或DC细胞（DC组）1×107个/只,体积0.2 ml/只,对照组（Ct组）注射等体积生理盐水,每天治疗1次,连续5d;（3）采用小动物活体光学成像系统在开始治疗前及开始治疗后第35d进行成像观察移植瘤荧光成像,分析荧光强度和荧光面积;（4）免疫组化法检测三组裸鼠移植瘤组织中Caspase3的表达情况;（5）TUNELl法检测三组裸鼠移植瘤组织中的细胞凋亡率。结果:（1）裸鼠于GFP-MCF7荷瘤后7d,成瘤率100%。开始治疗前和开始治疗后35d活体光学分子成像结果显示,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号强度无明显差异（F=0.4341,P>0.05）;开始治疗后第35d,MUC1-DC组的荧光信号强度明显低于Ct组（F=7.864,P<0.05）;DC与Ct、MUC1-DC与DC组间均无显着性差异（均为P>0.05）,但MUC1-DC比DC组荧光信号更低。从荧光信号面积上进行统计分析,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号分布面积无显着差异（F=1.084,P>0.05）;开始治疗后第35d,Ct组荧光信号呈多处散在分布,MUC1-DC组和DC组的荧光信号面积均明显低于Ct组（均为P<0.01）,但MUC1-DC组与DC组的荧光信号面积无显着性差异（P>0.05）;（2）Ct组Caspase3表达最少,DC组次之,MUC1-DC组呈高表达Caspase3,三组间比较,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;（3）TUNEL结果显示,三组细胞凋亡率分别为:Ct组（4.11±2.61%）、DC组（9.63±2.27）%、MUC1-DC组（25.30±8.24）%,三组间比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论:（1）GFP荧光标记的人乳腺癌细胞在裸鼠内可以持续表达荧光信号,可以通过光学分子成像系统检测光密度值观察肿瘤的部位及生长情况,是一种活体内实时动态观察肿瘤的生长和转移、评价抑瘤作用的有效方法;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC免疫治疗人乳腺癌荷瘤小鼠能够更有效地抑制肿瘤生长和扩散;（3）MUC1-DC发挥了更好的促进肿瘤细胞凋亡的作用。
许卓[8]（2020）在《当归多糖联合黄芪多糖对骨髓抑制小鼠骨髓造血干细胞RAS-MAPK信号系统影响的实验研究》文中指出目的:从细胞增殖率,造血因子,细胞信号通路分子,核转录因子等方面探讨当归多糖联合黄芪多糖对骨髓抑制小鼠骨髓造血干细胞的影响,为临床治疗提供依据和参考。材料与方法:（1）购置清洁级C57BL/6小鼠60只作为对象,随机取C57BL/6小鼠10只,设为空白对照组;剩余50只C57BL/6小鼠建立小鼠动物模型,建模完毕后观察小鼠饮食、排泄、精神状态与体重变化情况。分别在建模前、建模后第4d小鼠眶静脉取血1ml,加入冷凝管中,采用全自动细胞分析仪完成小鼠外周血红细胞、白细胞计数及血红蛋白测定,进一步确定小鼠建模成功。动物分组。建模成功后随机分为模型对照组、促红细胞生成素组（EPO组）、当归多糖组、黄芪多糖组及联合用药组清洁级C57BL/6小鼠60只,随机取C57BL/6小鼠10只,设为空白对照组;剩余50只C57BL/6小鼠建立小鼠动物模型,建模成功后随机分为模型对照组、EPO组、当归多糖组、黄芪多糖组及联合用药组,每组小鼠10只;空白对照组腹腔常规注射等剂量生理盐水;其余各组均腹腔注射环磷酰胺380mg/（kg·d）,连续完成3d干预。第4d各组小鼠均以断颈方式处死,取股骨、胫骨,并将其放置在浓度为75.0%乙醇中连续完成15min浸泡,将小鼠转移到超净工作台上,在在无菌条件下完成取股骨、胫骨的分离、提取;去皮毛、肌肉及两端软骨,充分暴露红色骨髓腔。采用1m L无菌6号注射器,吸取PBS液1m L,并拧弯无菌针头套管,并插入骨髓腔中,冲洗后获得骨髓,放置在平皿中进行反复冲洗;冲出大部分细胞,利用300目滤网进行过滤,制备单细胞悬液,并向细胞悬液中加入淋巴细胞分离液（等量）,10min离心,速度2500rpm,分离完毕后去除上清,并加入红细胞裂解液1m L,3min静置后加入PBS溶液9m L,10min离心,速度2500rpm,去除上清,加入浓度为10.0%IMDM完成2次洗涤,利用10.0%IMDM完成沉淀的重悬,利用计数板调整细胞密度为1×106/m L,并完成细胞的分离、培养,加入96/24孔板中。细胞实验分为六组即空白组,模型对照组、EPO组、当归多糖组、黄芪多糖组及联合用药组,并配置药物,当归多糖、黄芪多糖及药物联合配置。取购置的当归多糖、黄芪多糖,放置在RPMI-1640培养液中,通过预实验配置研究所需的浓度,即:当归多糖200mg/m L、黄芪多糖200mg/m L、联合用药（当归多糖200mg/m L混合黄芪多糖200mg/m L）中,保证实际药物比例为:黄芪:当归=5:1。将上述药物过滤、除菌后放置在4℃冰箱中,备用。其中EPO组、当归多糖、黄芪多糖组及联合用药组均加入等剂量药物干预,并将细胞放置在5%CO2、37℃培养箱中培养;采用MMT法测定各组细胞增殖率;采用酶联免疫吸附试验测定各组白细胞介素-2（IL-2）、血小板生成素（TPO）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）及γ-干扰素（INF-r）水平;（2）当归多糖联合黄芪多糖对信号分子RAS、ERK1、ERK2、p38影响。取各组处理后的细胞,采用实时荧光PCR法测定各组细胞中信号分子RASm RNA、ERK1m RNA、ERK2m RNA、p38 m RNA表达水平,分析RAS-MAPK信号通路与造血干细胞增殖,分化关系;进一步确定当归多糖、黄芪多糖及其配伍对RAS-MAPK信号转导通路及造血干细胞增殖分化影响。（3）当归多糖联合黄芪多糖对核转录因子c-jun、c-fos、JNK影响。取各组处理后的细胞,采用实时荧光PCR法测定各组细胞中核转录因子c-junm RNA、c-fosm RNA、JNK m RNA水平,分析细胞周期、核转录因子与细胞增殖的关系,确定当归多糖、黄芪多糖及其配伍对核转录因子、细胞周期和造血干细胞增殖的影响。本研究中所有数据均采用SPSS20.0软件处理。结果:1.当归多糖、黄芪多糖及两药联合对骨髓抑制小鼠造血干细胞增殖和造血因子影响1.1当归多糖、黄芪多糖及两药联合对骨髓抑制小鼠造血干细胞增殖影响1.1.1造模前后骨髓抑制小鼠体重、外周血细胞及生化指标变化空白对照组未参与建模体重及外周血血细胞、生化指标变化不明显;其余各组较造模前红细胞、白细胞、血红蛋白均明显下降（P<0.05）,体重明显下降（P<0.05）。1.1.2当归多糖、黄芪多糖及两药联合对骨髓抑制小鼠造血干细胞细胞增殖率影响六组细胞随着时间延长细胞均呈增长趋势。正常组细胞由于未参与建模细胞速率较快;1.1.2.1MTT实验24h结果:当归多糖组、黄芪多糖组细胞增殖率比较无统计意义（P>0.05）,两组皆高于EPO组（P<0.05）;联合用药组细胞增殖率均高于当归多糖组、黄芪多糖组、EPO组（P<0.05）。1.1.2.2MTT实验48h结果:当归多糖组、黄芪多糖组细胞增殖率比较无统计意义（P>0.05）,两组皆高于EPO组（P<0.05）;联合用药组细胞增殖率均高于当归多糖组、黄芪多糖组、EPO组（P<0.05）。1.1.2.3MTT实验72h结果:当归多糖组、黄芪多糖组细胞增殖率比较无统计意义（P>0.05）,两组皆高于EPO组（P<0.05）;联合用药组细胞增殖率均高于当归多糖组、黄芪多糖组、EPO组（P<0.05）。1.2当归多糖、黄芪多糖及两药联合对骨髓抑制小鼠造造血因子影响1.2.1对造血因子TPO影响同正常组比较,模型组TPO水平明显下降（P<0.05）,当归多糖组、黄芪多糖组TPO比较无统计意义（P>0.05）,两组皆高于EPO组（P<0.05）;联合用药组TPO均高于当归多糖组、黄芪多糖组、EPO组（P<0.05）。1.2.2对造血因子IL-2影响同正常组比较,模型组IL-2水平明显下降（P<0.05）,当归多糖组、黄芪多糖组IL-2比较无统计意义（P>0.05）,两组皆高于EPO组（P<0.05）;联合用药组IL-2均高于当归多糖组、黄芪多糖组、EPO组（P<0.05）。1.2.3对造血因子GM-CS影响同正常组比较,模型组GM-CS水平明显下降（P<0.05）,当归多糖组、黄芪多糖组GM-CS比较无统计意义（P>0.05）,两组皆高于EPO组（P<0.05）;联合用药组GM-CS均高于当归多糖组、黄芪多糖组、EPO组（P<0.05）。1.2.4对细胞因子INF-r影响同正常组比较,模型组INF-r水平明显下降;同模型组比较其余用药各组INF-r上升;当归多糖组、黄芪多糖组INF-r比较无统计意义（P>0.05）,两组皆低于EPO组（P<0.05）;联合用药组INF-r均低于当归多糖组、黄芪多糖组、EPO组（P<0.05）。2当归多糖、黄芪多糖及两药联合对骨髓抑制小鼠造血干细胞MAPK信号分子影响2.1对信号分子RASm RNA影响同正常组比较,模型组RAS水平明显下降（P<0.05）,当归多糖组、黄芪多糖组RAS比较无统计意义（P>0.05）,两组皆高于EPO组（P<0.05）;联合用药组RAS均高于当归多糖组、黄芪多糖组、EPO组（P<0.05）。2.2对信号分子ERK1/2m RNA影响同正常组比较,模型组ERK1/2水平明显下降（P<0.05）,当归多糖组、黄芪多糖组ERK1/2比较无统计意义（P>0.05）,两组皆高于EPO组（P<0.05）;联合用药组ERK1/2均高于当归多糖组、黄芪多糖组、EPO组（P<0.05）。2.3对信号分子p38m RNA影响同正常组比较,模型组p38水平明显下降（P<0.05）,当归多糖组、黄芪多糖组p38比较无统计意义（P>0.05）,两组皆高于EPO组（P<0.05）;联合用药组p38均高于当归多糖组、黄芪多糖组、EPO组（P<0.05）。3.当归多糖、黄芪多糖及两药联合对骨髓抑制小鼠造血干细胞核转录因子影响3.1对核转录因子JNKm RNA影响同正常组比较,模型组JNK水平明显下降（P<0.05）,当归多糖组、黄芪多糖组JNK比较无统计意义（P>0.05）,两组皆高于EPO组（P<0.05）;联合用药组JNK均高于当归多糖组、黄芪多糖组、EPO组（P<0.05）。3.2对核转录因子c-junm RNA影响同正常组比较,模型组c-jun水平明显下降（P<0.05）,当归多糖组、黄芪多糖组c-jun比较无统计意义（P>0.05）,两组皆高于EPO组（P<0.05）;联合用药组c-jun均高于当归多糖组、黄芪多糖组、EPO组（P<0.05）。3.3对核转录因子c-fosm RNA影响同正常组比较,模型组c-fos水平明显下降（P<0.05）,当归多糖组、黄芪多糖组c-fos比较无统计意义（P>0.05）,两组皆高于EPO组（P<0.05）;联合用药组c-fos均高于当归多糖组、黄芪多糖组、EPO组（P<0.05）。结论:1.当归多糖联合黄芪多糖能促进大鼠细胞增殖,能发挥两种药物协同作用,有助于促进IL-2、TPO、GM-CSF水平及下调INF-r水平。2.当归多糖联合黄芪多糖能促进信号分子RAS、ERK1、ERK2、p38m RNA表达,上调核转录因子c-jun、c-fos、JNKm RNA水平,可能通过调控RAS-MAPK信号系统影响细胞增殖、分化。
莫灿龙[9]（2020）在《毛兰素对角质细胞增殖和凋亡的影响及树状介孔硅透皮给药系统的研究》文中研究说明银屑病作为一种慢性的,反复发作的,难以根治的皮肤疾病,它的病理特征主要表现为角质细胞的过度增殖以及异常的分化。毛兰素作为一种提取自鼓槌石斛的联卞类小分子量天然化合物,在肿瘤方面显示了强大的增殖抑制和抗血管生成的功能。然而,关于毛兰素在对于银屑病致病当中具有重要地位的角质细胞的相关作用,目前仍然没有相关的报道。于此同时,越来越多的纳米药物载体应用于皮肤局部给药方面,大大增加了药物在皮肤疾病上的治疗效果和减少了药物进入到系统循环而引起的不必要毒性。而无机材料中的介孔硅纳米载体,由于其具有比表面积大,易于修饰,高度的生物相容性和良好的生物降解性等特点,在近几年尤其是皮肤递送方面,出现了不少的报道。因此,本文一方面探讨毛兰素对人永生化角质细胞HaCaT细胞的增殖功能和凋亡方面的作用,以及探讨其潜在的药理机制,另一方面为了增强毛兰素的抑制细胞增殖能力,以及解决毛兰素水溶性差,难以到达皮肤组织发挥作用的缺点,我们构建了树状介孔硅透皮递送纳米载体。本文使用MTT试验评价毛兰素对HaCaT细胞的细胞活力影响,利用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞凋亡分析法分析毛兰素对HaCaT细胞的凋亡影响,使用DCFH-DA荧光探针检测了HaCaT细胞的细胞内活性氧ROS的水平变化,使用western blot法测定毛兰素对HaCaT细胞的凋亡相关蛋白cleaved PARP与cleaved caspase-3的生成水平影响,以及检测了JNK/c-Jun信号通路和AKT/m TOR信号通路的蛋白表达水平变化。我们通过一步双相方法合成两种具有相似粒径但不同孔径的中心放射性中空通道的树状介孔硅,并对其理化性质进行表征,包括平均粒径、zeta电位、高分辨率透射电子显微镜TEM下的外观形貌、氮气吸附脱附曲线等。我们利用旋转蒸发方法将毛兰素载入到树状介孔硅里,并对其进行上述表征,通过傅里叶变换红外光谱FTIR和固定X射线衍射光谱XRD,以探讨毛兰素与树状介孔硅的结合方式,通过热重分析TGA和超高效液相色谱UPLC测量毛兰素的含量,利用透析袋法测定树状介孔硅载毛兰素的体外释放行为,并利用垂直式Franz扩散池法测定载药树状介孔硅卡波姆胶的透过猪皮的性能。我们通过合成FITC荧光标记的树状介孔硅,利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪分析其细胞摄取的行为,并探讨其可能的细胞摄取途径。然后通过MTT法、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞凋亡分析法、JC-1染色法和fluo-4 AM染色法比较负载毛兰素的树状介孔硅和单纯的毛兰素对HaCaT细胞的存活率、细胞凋亡率、线粒体膜电位和细胞内钙离子浓度的影响。并通过western blot法继续比较两者对线粒体介导的凋亡信号通路（Bcl-2、Bax、cytochrome c,cleaved caspase-3和cleaved PARP）和内质网应激信号通路（PERK、ATF6、IRE1α和CHOP）的影响。最终我们发现,毛兰素对HaCaT细胞的增殖能力具有抑制作用,并且能够促进HaCaT细胞的凋亡,增加凋亡相关蛋白cleaved PARP和cleaved caspase-3的生成,上调HaCaT细胞内的活性氧ROS水平,可能通过活性氧ROS介导的JNK/c-Jun信号通路和AKT/m TOR信号通路来发挥抑制增殖和促进凋亡的作用。合成出来的两种树状介孔硅的平均粒径均在160nm左右,孔径分别为3.5nm和4.6nm,载药率大约都在50%左右,并且通过表征分析得知毛兰素不仅分布在树状介孔硅的孔道里面,也有部分处于树状介孔硅的表面。和纯毛兰素组相比,树状介孔硅组能够很好地增加毛兰素的皮肤滞留量,并且树状介孔硅组能够降低毛兰素的皮肤透过量。体外药物释放实验表明毛兰素从树状介孔硅里释放出来主要分为两个阶段,爆发释放和缓慢释放阶段,最终药物累积释放量均达到70%以上。在细胞摄取行为方面,大孔径树状介孔硅的细胞摄取量比小孔径树状介孔硅的细胞摄取量大概高出3倍左右。小孔径树状介孔硅能够分别通过网格蛋白介导的细胞内吞途径,细胞膜陷穴蛋白介导的细胞内吞途径和Na+/H+离子交换受体介导的大胞饮三条途径进入到HaCaT细胞里,而大孔径树状介孔硅则通过网格蛋白介导的细胞内吞途径进入到HaCaT细胞里。和毛兰素组比较,载药树状介孔硅能够增强毛兰素的抗增殖和促凋亡作用,并且大孔径的效果相对明显。毛兰素能够影响HaCaT细胞里线粒体膜电位变化和胞内钙离子浓度,可能通过调控线粒体信号通路和内质网应激信号通路来发挥促进HaCaT细胞的凋亡作用,并且树状介孔硅作为药物载体,能够增强此过程。
宋世斌[10]（2020）在《藏獒犬IFN-γ,IFN-α和IL-18基因克隆、表达及产物活性鉴定》文中进行了进一步梳理干扰素（Interferon,IFN）是机体细胞受到病毒等生物诱导剂刺激而产生的一类分泌型糖蛋白类细胞因子,而白细胞介素18（Interleukin-18,IL-18）是一种具有促炎作用的细胞因子,由机体活化的单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等产生,能诱导IFN-γ等细胞因子的分泌,具有促进T细胞增殖、增强Th1型细胞、NK细胞及CTL细胞的细胞毒效应,与临床自身免疫性疾病及心血管系统疾病等多种疾病的发生发展呈现相关性,IFN和IL-18都具有抗病毒、抗寄生虫和细菌感染、抗肿瘤、免疫调节等多种生物学功能。因此,本实验开展藏獒犬IFN-γ、IFN-α和IL-18的相关研究,采用分子克隆和基因工程等技术获得了3个基因,体外制备了藏獒犬3个基因的重组蛋白,验证了其生物学活性,并开展了临床相关实验,丰富了犬细胞因子的知识,对犬疾病的检测和防控以及保障人类健康有着重要的意义,在犬疾病的防控上有着广阔的应用前景。第一,从藏獒犬血液中分离淋巴细胞,利用脂多糖（LPS）与植物血凝素（PHA）联合刺激淋巴细胞后提取RNA,经RT-PCR扩增IFN-γ、IFN-α和IL-18基因全长片段,将扩增到的基因分别克隆到pGEM-T-easy载体,经酶切、测序鉴定,结果表明:所克隆的IFN-γ基因与GenBank上登载的犬核苷酸序列同源性达99.6%,开放阅读框为501 bp,编码166个氨基酸（AA）,N端23个AA为信号肽,成熟蛋白编码143个AA,分子量为17.2 kD;克隆的IFN-α基因与GenBank上登载的犬核苷酸序列同源性达96.0%,其开放阅读框为564 bp,N端23个AA为信号肽,成熟蛋白编码164个AA,推测的分子量为19.0 kD;克隆的IL-18基因与GenBank上登载的犬核苷酸序列同源性达100%,其开放阅读框为582 bp,编码193个AA,N端36个AA为信号肽,成熟蛋白编码157个AA,推测的分子量为18.1 kD。第二,根据克隆的藏獒犬IFN-γ、IFN-α和IL-18基因阅读框序列,设计3个基因去掉信号肽的表达引物,克隆去信号肽后的目的片段,构建原核表达质粒pET-30a-IFN-γ、pET-30a-IFN-α和pET-30a-IL-18,转化大肠杆菌后诱导表达。经优化诱导条件后,3个重组菌都能够在温度为37℃,浓度为0.5 mM IPTG的诱导条件下成功的表达,3个重组菌在诱导后主要以包涵体形式表达,其中pET-30a-IFN-γ重组蛋白在上清中也有一定量的表达;经SDS-PAGE分析,pET-30a-IFN-γ、pET-30a-IFN-α和pET-30a-IL-18表达的蛋白分别约为23 kD、25kD和24 kD,表达的蛋白大约占菌体蛋白30%35%。第三,用镍琼脂糖凝胶纯化层析柱纯化pET-30a-IFN-γ、pET-30a-IFN-α和pET-30a-IL-18重组蛋白,纯度达到90%以上,通过梯度透析复性法复性蛋白。利用抑制病毒噬斑法测定重组藏獒犬IFN-γ和IFN-α的生物学活性,二者都具有抗病毒的活性,而且IFN-α抑制VSV的作用强于IFN-γ,二者的抗病毒活性在一定的浓度范围内有作用,在高于或低于这个浓度范围时发挥的效果一般;利用MTS法检测重组藏獒犬IL-18重组蛋白的生物学活性,纯化的重组IL-18具有诱导淋巴细胞增殖的能力,说明表达的蛋白具有生物学活性。第四,通过对总数为128只犬病毒性传染病病例（包括犬细小病毒病、犬冠状病毒病及犬瘟热3类宠物常见病）的IFN治疗组和对照治疗组的比较分析结果显示:IFN治疗组中3类疾病总计67只,治愈45只,平均治愈率67.2%,对照治疗组中3类疾病总计61只,治愈34只,平均治愈率55.7%,使用本实验获得的IFN-α重组蛋白治疗宠物犬病毒性传染病,能显着提高治愈率,有较好的临床治疗病毒性疾病的效果。本研究克隆了藏獒犬IFN-γ、IFN-α和IL-18基因,并应用分子生物学软件对序列进行生物信息学分析;首次成功的表达了3个基因,纯化、复性了重组蛋白,发现IFN-γ、IFN-α和IL-18基因具有较高的生物学活性,可以开发利用;通过藏獒犬IFN-α重组蛋白的临床病毒性犬病的治疗,验证了藏獒犬IFN的抗病毒活性。藏獒犬是中国特有的大型犬种,本研究为犬基因工程生物制品的进一步开发和相关疾病的检测及防治奠定了理论基础。
二、重组人白细胞介素-6治疗小鼠膀胱癌机制的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、重组人白细胞介素-6治疗小鼠膀胱癌机制的实验研究（论文提纲范文）
（2）重组人白细胞介素-6抑制BTT739小鼠膀胱癌生长和转移的实验研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 动物模型 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 药物 |
| 1.4 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 rhIL-6对BTT739荷瘤小鼠体重影响及毒性作用 |
| 2.2 rhIL-6对BTT739的抑瘤作用 |
| 2.3 rhIL-6对BTT739小鼠肺转移抑制作用 |
| 3 讨论 |
（4）朱良春痛风汤治疗间歇期痛风的临床疗效观察并基于网络药理学的潜在机制探讨（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 现代医学对痛风的认识 |
| 1.2 祖国医学对痛风的认识与研究 |
| 1.3 课题的研究思路 |
| 2 朱良春痛风汤治疗间歇期痛风的临床疗效分析 |
| 2.1 研究方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 小结 |
| 3 朱良春痛风汤的潜在作用机制探讨 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 小结 |
| 4 讨论 |
| 4.1 国医大师朱良春对本病的认识:浊瘀痹理论及痛风汤 |
| 4.2 朱良春痛风汤的临床疗效及不良反应分析 |
| 4.3 朱良春痛风汤中各中药的药理作用 |
| 4.4 朱良春痛风汤的网络药理学机制探讨 |
| 5 结论 |
| 6 结语:问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 学位综述 中药治疗痛风作用机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）半乳糖凝集素-3抑制剂联合PD-L1抗体治疗非小细胞肺癌的疗效及其免疫调控机制的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 半乳糖凝集素-3 在非小细胞肺癌中的表达及其通过STAT3 途径对PD-L1 调控作用研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 半乳糖凝集素 3 抑制剂对免疫细胞的激活和功能调控研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 半乳糖凝集素-3 抑制剂联合PD-L1 抗体体内抗肿瘤作用的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 PD-1 /PD-L1 抗体联合其它抗肿瘤药物治疗癌症研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）PHF6调控NSD2介导的H3K36me2修饰的分子机制（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 引言 |
| 1.1 表观遗传学概述 |
| 1.2 组蛋白修饰 |
| 1.3 核受体结合SET结构域蛋白家族 |
| 1.4 PHF6的结构和功能 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 成功鉴定出YFP和NSD2-YFP蛋白 |
| 3.2 与NSD2结合的蛋白可能参与细胞内蛋白的合成过程 |
| 3.3 构建PHF6 WT、PHF6Δ151-365和PHF6Δ1-149重组质粒 |
| 3.4 PHF6的C端结构域主要负责与NSD2结合 |
| 3.5 获得PHF6 WT、PHF6Δ151-365和PHF6Δ1-149 GST融合蛋白 |
| 3.6 获得结合PHF6 WT、PHF6Δ151-365和PHF6Δ1-149 GST融合蛋白的谷胱甘肽-琼脂糖树脂 |
| 3.7 PHF6的C端结构域主要负责与NSD2直接结合 |
| 3.8 获得NSD2 WT和NSD2Δ1239-1365、NSD2Δ1-879、NSD2Δ1-1062重组质粒 |
| 3.9 NSD2的第四个PHD4结构域主要负责与PHF6直接结合 |
| 3.10 两条sgRNA在基因组序列上成功打靶 |
| 3.11 挑取单克隆鉴定敲除PHF6基因 |
| 3.12 敲除PHF6基因可能影响NSD2蛋白的稳定性 |
| 3.13 敲除PHF6基因不影响小鼠胚胎干细胞的多能干性和增殖速率 |
| 4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 答辩决议书 |
（7）黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备 |
| 材料和方法 |
| 1.标本来源 |
| 2.材料及试剂 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1. MUC1在人乳腺癌组织中表达情况 |
| 2.MUC1在乳腺癌MCF7和MDA-MB-231细胞中的表达 |
| 3.过表达MUC1慢病毒质粒的构建结果 |
| 4.分离培养DC的形态学特征及表型分子表达 |
| 5.转染效率测定 |
| 6.MUC1-DC中MUC1 mRNA和蛋白的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MUC1-DC免疫功能的体外研究 |
| 材料和方法 |
| 1.试剂与仪器 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.MCU1-DC诱导CTL条件的优化 |
| 2.MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-ɑ的含量 |
| 3.MUC1-DC对CTL杀伤活性的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用 |
| 材料和方法 |
| 1.动物来源 |
| 2.试剂与仪器 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.慢病毒转染条件优化 |
| 2.光学分子成像活体检测MUC1-DC对裸鼠乳腺癌移植瘤的抑制作用 |
| 3. MUC1-DC对裸鼠移植瘤体积和重量的影响 |
| 4.MUC1-DC对裸鼠移植瘤Caspase3表达的影响 |
| 5.TUNEL法检测裸鼠移植瘤中的细胞凋亡率 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 基因修饰的树突状细胞在抗肿瘤免疫中的应用 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 博士在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（8）当归多糖联合黄芪多糖对骨髓抑制小鼠骨髓造血干细胞RAS-MAPK信号系统影响的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 当归多糖、黄芪多糖及两药联合对骨髓抑制小鼠造血干细胞增殖和造血因子影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论一 |
| 小结 |
| 论文二 当归多糖、黄芪多糖及两药配合对骨髓抑制小鼠骨髓干细胞RAS-MAPK信号系统影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论二 |
| 小结 |
| 附图 |
| 论文三 当归多糖、黄芪多糖及两药联合对骨髓抑制小鼠造血干细胞核转录因子影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论三 |
| 小结 |
| 附图 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述一 黄芪的药理作用与临床应用研究综述 |
| 参考文献 |
| 综述二 当归的药理作用与临床应用研究综述 |
| 参考文献 |
| 综述三 中医疗法治疗骨髓抑制的进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（9）毛兰素对角质细胞增殖和凋亡的影响及树状介孔硅透皮给药系统的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 银屑病 |
| 1.1.1 发病机制 |
| 1.1.2 角质细胞扮演的角色 |
| 1.1.3 治疗策略 |
| 1.2 毛兰素 |
| 1.2.1 来源 |
| 1.2.2 药理作用 |
| 1.3 细胞凋亡的分子机制 |
| 1.3.1 死亡受体介导的细胞凋亡途径 |
| 1.3.2 线粒体介导的细胞凋亡途径 |
| 1.3.3 内质网应激(ER srtress,ERS)介导的细胞凋亡途径 |
| 1.4 纳米透皮给药系统 |
| 1.5 本课题的研究意义及主要内容 |
| 1.5.1 本课题的研究意义 |
| 1.5.2 本课题的研究内容 |
| 第二章 毛兰素对角质细胞的增殖、凋亡及其机制的初步研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 细胞增殖实验 |
| 2.3.3 细胞凋亡实验 |
| 2.3.4 细胞内活性氧ROS含量检测 |
| 2.3.5 Western blot实验 |
| 2.3.6 统计分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 毛兰素抑制HaCaT细胞的增殖 |
| 2.4.2 毛兰素诱导HaCaT细胞的凋亡 |
| 2.4.3 毛兰素诱导HaCaT细胞的活性氧ROS生成 |
| 2.4.4 毛兰素通过活性氧ROS抑制HaCaT细胞的增殖和促进其凋亡 |
| 2.4.5 毛兰素影响JNK/c-Jun和 AKT/mTOR信号通路 |
| 2.4.6 毛兰素可能通过活性氧ROS调控JNK/c-Jun和 AKT/m TOR信号通路 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 树状介孔硅透皮给药系统的构建与评价 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 树状介孔硅纳米粒的合成 |
| 3.3.2 载药 |
| 3.3.3 药物定量 |
| 3.3.4 表征 |
| 3.3.5 体外透皮试验 |
| 3.3.6 统计分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 装载毛兰素的树状介孔硅的表征 |
| 3.4.2 体外透皮试验 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 树状介孔硅纳米给药载体对角质细胞的影响及其机制的研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 树状介孔硅纳米粒的合成 |
| 4.3.2 载药 |
| 4.3.3 药物定量 |
| 4.3.4 表征 |
| 4.3.5 体外药物释放 |
| 4.3.6 细胞培养 |
| 4.3.7 细胞摄取实验 |
| 4.3.8 细胞增殖实验 |
| 4.3.9 细胞凋亡实验 |
| 4.3.10 线粒体膜电位检测 |
| 4.3.11 胞内钙离子浓度检测 |
| 4.3.12 Western blot实验 |
| 4.3.13 统计分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 体外药物释放和细胞摄取 |
| 4.4.2 载药树状介孔硅抑制HaCaT细胞的增殖和促进其凋亡 |
| 4.4.3 载药树状介孔硅可能通过线粒体信号通路促进HaCaT细胞的凋亡 |
| 4.4.4 载药树状介孔硅可能通过调控内质网应激来促进HaCaT细胞的凋亡 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附表 |
（10）藏獒犬IFN-γ,IFN-α和IL-18基因克隆、表达及产物活性鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 缩略语表 |
| 第一章 犬干扰素研究进展 |
| 1 IFN概述 |
| 1.1 IFN分类 |
| 1.2 犬IFN理化特性及基因组成 |
| 1.3 IFN的空间结构及受体研究 |
| 1.4 IFN生物学活性及作用机制 |
| 2 犬IFN基因工程研究 |
| 2.1 犬Ⅰ型IFN基因工程研究 |
| 2.2 犬Ⅱ型IFN基因工程研究 |
| 2.3 犬Ⅲ型IFN基因工程研究 |
| 2.4 犬长效IFN研究 |
| 3 犬IFN临床应用 |
| 3.1 治疗犬病毒性传染病 |
| 3.2 治疗犬皮肤性疾病 |
| 3.3 治疗眼科及其他疾病 |
| 4 犬IFN应用展望 |
| 第二章 白细胞介素18研究进展 |
| 1 IL-18概述 |
| 1.1 IL-18的发现、结构、特性 |
| 1.2 IL-18受体及信号传导途径 |
| 1.3 IL-18结合蛋白 |
| 2 IL-18生物学作用 |
| 2.1 IL-18抗肿瘤作用 |
| 2.2 IL-18抗感染作用 |
| 2.3 IL-18免疫调节作用 |
| 3 IL-18与临床疾病的关系 |
| 3.1 IL-18与自身免疫性疾病 |
| 3.2 IL-18与心血管系统疾病的关系 |
| 3.3 IL-18与神经系统疾病的关系 |
| 3.4 IL-18与肿瘤疾病的关系 |
| 3.5 IL-18与糖尿病等其他疾病的关系 |
| 4 IL-18应用展望 |
| 5 本研究的目的及意义 |
| 第三章 藏獒犬IFN-γ和 IFN-α基因克隆与序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 淋巴细胞的体外刺激活化 |
| 2.2 RT-PCR扩增藏獒犬IFN-γcDNA |
| 2.3 重组质粒的酶切及PCR鉴定 |
| 2.4 藏獒犬IFN-γ序列测定及分析 |
| 2.5 藏獒犬IFN-α序列测定及分析 |
| 3 讨论 |
| 第四章 藏獒犬IFN-γ和 IFN-α基因的表达、纯化及活性鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 藏獒犬pET-30a-IFN-γ和 pET-30a-IFN-α重组表达质粒的鉴定 |
| 2.2 藏獒犬pET-30a-IFN-γ和 pET-30a-IFN-α重组蛋白Western bloting分析 |
| 2.3 藏獒犬pET-30a-IFN-γ和 pET-30a-IFN-α重组蛋白纯化分析 |
| 2.4 藏獒犬IFN-γ抗病毒活性检测 |
| 2.5 藏獒犬IFN-α抗病毒活性检测 |
| 2.6 藏獒犬IFN-α抗病毒临床应用 |
| 3 讨论 |
| 第五章 藏獒犬IL-18基因克隆、表达及生物学活性鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 藏獒犬IL-18基因的克隆 |
| 2.2 藏獒犬IL-18基因序列测定及分析 |
| 2.3 藏獒犬IL-18基因比较分析及进化分析 |
| 2.4 pET-30a-IL-18 重组质粒的鉴定 |
| 2.5 pET-30a-IL-18 重组蛋白表达及Western bloting分析 |
| 2.6 pET-30a-IL-18 重组蛋白纯化结果 |
| 2.7 藏獒犬IL-18基因生物学活性鉴定 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 导师简介1 |
| 导师简介2 |
四、重组人白细胞介素-6治疗小鼠膀胱癌机制的实验研究（论文参考文献）
- [1]重组人白细胞介素-6治疗小鼠膀胱癌机制的实验研究[J]. 李传刚,舒晓宏,李墨林,刘用楫,武文森. 肿瘤防治杂志, 2003(12)
- [2]重组人白细胞介素-6抑制BTT739小鼠膀胱癌生长和转移的实验研究[J]. 武文森,胡宏慧. 肿瘤防治研究, 2000(06)
- [3]《第三军医大学学报》2002年第24卷主题词索引[J]. 冷怀明. 第三军医大学学报, 2002(12)
- [4]朱良春痛风汤治疗间歇期痛风的临床疗效观察并基于网络药理学的潜在机制探讨[D]. 纪璇. 汕头大学, 2021(02)
- [5]半乳糖凝集素-3抑制剂联合PD-L1抗体治疗非小细胞肺癌的疗效及其免疫调控机制的实验研究[D]. 张红欣. 河北医科大学, 2021(02)
- [6]PHF6调控NSD2介导的H3K36me2修饰的分子机制[D]. 武红飞. 浙江大学, 2021(02)
- [7]黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究[D]. 尹良伟. 大连医科大学, 2021(01)
- [8]当归多糖联合黄芪多糖对骨髓抑制小鼠骨髓造血干细胞RAS-MAPK信号系统影响的实验研究[D]. 许卓. 辽宁中医药大学, 2020(02)
- [9]毛兰素对角质细胞增殖和凋亡的影响及树状介孔硅透皮给药系统的研究[D]. 莫灿龙. 华南理工大学, 2020(01)
- [10]藏獒犬IFN-γ,IFN-α和IL-18基因克隆、表达及产物活性鉴定[D]. 宋世斌. 甘肃农业大学, 2020(01)