一、SCID小鼠在脐血造血干/祖细胞移植研究中的应用(论文文献综述)
文瑞婷[1](2020)在《单细胞水平解析体外扩增对脐带血造血干细胞自我更新和分化的影响》文中提出【目的】本研究拟在体外采用细胞因子联合不同小分子化合物扩增脐带血(cord blood,CB)来源的造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSC),探索体外诱导HSC高效扩增的最佳体系;通过免疫缺陷小鼠连续移植实验评价扩增后细胞的植入能力和长期自我更新能力;基于单细胞测序技术筛选调控HSC自我更新的关键分子,阐明其作用的信号通路,并从单细胞水平解析体外扩增体系对HSC自我更新和分化的影响。【方法】(1)CB来源的CD34+细胞在4种细胞因子(SCF、Flt3-L、TPO、IL-6)存在的条件下与UM171、SR1、和K1小分子单独或联合(USK)在无血清培养基中培养10 d,流式细胞术检测CD34+、CD34+CD38-、CD34+CD38-CD45RA-CD90+细胞的比例以及CD33+、CD41+、CD3-CD56+、CD235a+、CD19+和CD3+细胞的比例;通过集落形成单位(colony forming units,CFU)实验评价扩增后的细胞向各系祖细胞分化的能力。(2)将500、2500及10000个未经培养的CB来源的CD34+细胞(Unculture),或者500、2500及10000个起始细胞经Vehicle、USK体外培养10 d扩增后的细胞分别移植给首次移植NOD-Prkdcscid Il2rgnull(NPG)受鼠,通过流式细胞术检测移植后5、8、12、16周时小鼠外周血和16周时骨髓中h CD45+的比例。(3)取首次移植10000个起始细胞组的NPG小鼠骨髓分为2×106,5×106和1×107三个数量级分别移植给二次移植NPG受鼠,通过流式细胞术检测移植后16周时小鼠骨髓中h CD45+细胞的比例。(4)通过极限稀释分析(limiting dilution analysis,LDA)计算首次移植和二次移植小鼠体内NOD-SCID小鼠再植细胞(severe-combined immunodefcient mouse-repopulating cells,SRC)的数量。(5)采用单细胞RNA测序(single cell RNA sequencing,sc RNA-seq)技术从单细胞水平解析体外扩增体系对HSC分化的影响,筛选调控HSC自我更新的关键分子,阐明其作用的信号通路。【结果】(1)UM171、SR1、K1以及USK培养后CD34+细胞的比例均高于Vehicle培养组(P均<0.001);USK以及UM171培养后CD34+CD38-细胞的比例较Vehicle培养组明显升高(P均<0.001),SR1及K1培养组与Vehicle培养组比较无统计学差异(P均>0.05);USK培养后CD34+CD38-CD45RA-CD90+细胞比例较Vehicle培养组明显升高(P<0.001),其他组与Vehicle培养组比较无统计学差异(P均>0.05)。USK培养后CD34+细胞的比例与Unculture组比较无统计学差异(P均>0.05),CD34+CD38-细胞以及CD34+CD38-CD45RA-CD90+细胞的比例均高于Unculture组(P均<0.05)。(2)USK培养组及SR1培养组CD34+细胞扩增的倍数较Vehicle组显着增多(P均<0.05);UM171培养组CD34+CD38-细胞扩增的倍数较Vehicle组升高(P<0.05);Vehicle、UM171、SR1、K1、USK体外培养后CD34+CD38-CD45RA-CD90+细胞的数量较培养前初始细胞数量分别增加了(61.58±47.51)、(248.56±193.44)、(210.05±201.46)、(133.08±118.93)和(543.33±365.20)倍,USK培养组CD34+CD38-CD45RA-CD90+细胞扩增的倍数较Vehicle组显着增多(P<0.001)。(3)USK及SR1培养组CD3-CD56+细胞比例均较Vehicle组增加(P<0.01);UM171培养组CD33+细胞比例较Vehicle组增加(P<0.01);UM171培养组CD41+细胞比例较Vehicle组降低(P<0.05);各组之间CD235a+、CD19+和CD3+细胞比例均无统计学差异(P均>0.05)。USK、UM171、K1组CFU-G、M、GM、E以及GEMM的数量与Unculture组和Vehicle组比较均无统计学差异(P均>0.05);SR1组CFU-G和GEMM的数量均较Unculture组减少(P<0.05);Vehicle组GEMM的数量也较Unculture组减少(P<0.05)。(4)当移植500个起始细胞时,首次移植后第5周时USK组小鼠外周血中h CD45+细胞比例较Unculture组和Vehicle组均明显增加(P均<0.05),移植后16周时USK组小鼠外周血和骨髓中h CD45+细胞比例与Unculture组比较无统计学差异(P>0.05);当移植2500个起始细胞时,移植后5、8、12、16周时USK和Vehicle组小鼠外周血和骨髓中h CD45+细胞比例均较Unculture组明显降低(P均<0.05)。当移植10000个起始细胞时,移植后8、12、16周时USK组小鼠外周血中h CD45+细胞比例均较Unculture组减少(P均<0.05)。(5)当移植2×106、5×106或1×107个起始骨髓细胞时,二次移植后16周时USK组以及Vehicle组小鼠骨髓中h CD45+细胞的比例与Unculture组比较均未见明显差异(P均>0.05)。(6)首次移植时USK组每个起始细胞中含有SRC的数量(1/279)较Vehicle组(1/1379)增加了约5倍(P<0.05),较Unculture组(1/543)增加了约2倍(P>0.05)。二次移植时各组每个起始细胞中含有SRC的数量无统计学差异(P均>0.05)。(7)sc RNA-seq数据采用UMAP降维可视化后,共分为17个细胞亚群。比较CB来源的CD34+细胞经USK体外培养与Unculture细胞群的变化,结果显示:CD34+细胞经USK体外培养10 d时Cluster 4(HSC)、Cluster 16(My SC)以及Cluster 10(MESC)细胞数量较体外培养前显着减少或消失,Cluster 1(My RP)、Cluster 2(GMP)、Cluster 3(Granulocyte)、Cluster 5(EMP)、Cluster 6(Ma/Ba/Eo)、Cluster7(Monocyte/m DC)、Cluster 8(Platelet)、Cluster 15(Erythroid)的细胞数量增多;比较CD34+细胞经USK培养与Vehicle培养之间细胞群的变化,结果显示:USK体外培养后10 d时Cluster 10、Cluster 0、Cluster 1、Cluster 5、Cluster 6以及Cluster15细胞数量较Vehicle培养组增多,Cluster 3、Cluster 7、Cluster 8、Cluster 13以及Cluster 14(B/p DC)细胞数量较Vehicle组显着减少。(8)sc RNA-seq基因表达分析显示:除研究已报道的HSC特异性标记AVP以及与HSC“干性”相关转录因子KLF2、HES1、MLLT3之外,HOPX和ID1也表达于Cluster 4(HSC)和Cluster 16(My HSC)。(9)比较USK组与Vehicle组差异性表达基因结果显示:USK体外培养上调了NRIP1、PRDX1、SELENOW基因表达并下调了CYP1B基因表达。比较USK组与Unculture组差异性表达基因结果显示:USK体外培养后细胞周期和细胞增殖相关基因(MKI67、TOP2A、HIST1H4C和TUBA1B)、髓系基因(IGLL1和MPO)、线粒体基因(MT-ND1和MT-CO3)表达上调,转录因子JUN、JUND、FOS、FOSB、IRF1、REL和NFKBIA表达下调。(10)比较Cluster 0(Multi RP)、Cluster 1(My RP)、Cluster 2(GMP)、Cluster10(MESC)与Cluster 4(HSC)细胞群之间的差异性基因表达结果显示:富集的上调基因包括PCLAF、TYMS、CENPF、MPO、IGLL1、HIST1H4C、TESC和PGAM1,富集的下调基因包括JUN、JUND、FOS、FOSB、KLF2、IRF1、NFKBIA、HES1、DNAJB1、HSPH1、HSPA1A和PNRC1;GO分析结果显示Cluster 0、Cluster 1、Cluster 2、Cluster 10与Cluster 4比较主要是促进了线粒体氧化磷酸化能量代谢,抑制了细胞分化的负向调节以及细胞的黏附作用;Pathway分析显示:Cluster 0、Cluster1、Cluster 2、Cluster 10与Cluster 4比较正向调节了氧化磷酸化能量代谢通路,负向调节了MAPK信号通路、FOXO通路以及REG/GR通路。(11)采用SCENIC分析sc RNA-seq数据,结果显示:转录因子FOS、FOSB、JUN、JUND、IRF1、REL在Cluster 4(HSC)、Cluster 16(My SC)中调控强度较高;这些关键分子主要作用于HSC“干性”相关基因、核受体基因、FOXO家族、低氧相关基因、HOX家族、NF-κB信号、TGF-β信号、Notch信号、m TOR信号以及MAPK信号相关基因。【结论】(1)4种细胞因子(SCF+Flt3-L+TPO+IL-6)与3种小分子(UM171+SR1+K1)组合能够使表型为CD34+CD38-CD45RA-CD90+的细胞体外扩增约543倍,其扩增效果明显优于4种细胞因子与其他单个小分子组合。(2)小分子化合物USK组合体外扩增的CD34+CD38-CD45RA-CD90+细胞在NPG小鼠体内可以短期植入,但在长期植入方面与Unculture和Vehicle组比较未见优势,提示CD34+CD38-CD45RA-CD90+可能并不能作为具有长期植入能力的HSC标记。(3)CB CD34+细胞经USK以及Vehicle体外培养后HSC、My SC、MESC显着减少或消失,“再生祖细胞”数量增多;但是与Vehicle培养体系比较,USK体外培养使MESC和“再生祖细胞”数量增多,成熟细胞数量减少。表明CB CD34+细胞经USK以及Vehicle体外培养后HSC发生了不同程度的分化,但是USK扩增组比Vehicle扩增组的分化程度低。(4)HOPX和ID1有望作为人功能性HSC的表型标记。(5)FOS、FOSB、JUN、JUND、IRF1、REL是调控HSC自我更新的关键分子;通过促进转录因子FOS、FOSB、JUN、JUND、IRF1、REL的表达和调节HSC的代谢途径、线粒体功能和ROS水平可能有助于维持HSC的自我更新并抑制其分化。
曲琦[2](2016)在《脐血源内皮祖细胞在造血干细胞移植中的作用及机制探究》文中进行了进一步梳理一.脐血源内皮祖细胞(cord blood derived endothelial progenitorcell,CB-EPC)的体外分离、培养及鉴定目的:探讨体外分离及扩大培养CB-EPC的方法,在本实验室建立稳定的CB-EPC培养体系。方法:以密度梯度离心法分离脐血单个核细胞(mononuclear cells,MNCs),将MNCs接种于纤连蛋白(Fibronectin,Fn)包被的培养瓶中,培养基为endothelial growth medium-2(EGM-2),其中添加recombinant human fibroblast growth factor-β(rh FGF-β),recombinant human epidermal growth factor(rh EGF),R3-insulin-like growth factor(IGF)-1,vascular endothelial growth factor(VEGF),ascorbic acid and GA-100)及10%FBS。采用贴壁培养培养72小时(hour,h)后弃未贴壁细胞的培养方式。2-3天半量换液一次并观察贴壁细胞生长状况。待细胞出现EPC形态特征并达到80%以上融合后,可传代培养。以流式细胞术检测所分离培养细胞表面CD34,CD45,CD133,CD31,KDR,及CD14抗原表达情况,鉴定是否为EPC表型。用CCK8法分析实验所选用的Passage(P)1-P5之间EPC的体外增殖能力,以成熟内皮细胞株人脐静脉内皮细胞(human umbilical veins endothelial cells,HUVECs)为对照。以Matrigel胶铺板,HUVEC为对照,分析EPC各代细胞之间体外成管能力及差异。采用Transwell小室,分析观察各代EPC细胞的迁移能力及与HUVEC迁移能力的差异。进一步通过荧光定量PCR(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)方法分析所培养细胞的内皮相关基因表达,确定其内皮系属性。结果:在特殊内皮系培养基的培养条件下,72h后去除未贴壁细胞继续培养,可于体外分离培养后约21-28天时出现典型EPC表现的克隆细胞团;继续培养,细胞团分裂增殖、克隆增大并逐渐融合;细胞生长速度较快,可经胰酶消化传代培养,约4-5天可传代一次,并可稳定传代约10代左右。流式细胞技术分析所分离培养细胞表面抗原的表达,和HUVECs相比,所培养EPC均不表达或极弱表达CD45(EPC vs.HUVEC,2.32%±1.56%vs.0.92%±0.77%,P=0.236)及CD14(EPC vs.HUVEC,3.44%±1.27%vs.1.29%±0.54%,P=0.054);EPC上有干祖细胞标志的CD133阳性表达(26.12%±4.56%),而HUVEC无此抗原表达(0.13%±0.11%)(P=0.001);CD31(EPC vs.HUVEC,98.82%±1.33%vs.97.90%±1.50%,P=0.472)和KDR(EPC vs.HUVEC,34.21%±6.44%vs.30.78%±5.60%,P=0.524),在脐血EPC及HUVEC上均有阳性表达,表达量相当;CD34在脐血EPC及HUVEC上均有表达,但在脐血EPC表面表达阳性率更高(EPC s.HUVEC,45.66%±6.81%vs.26.89%±4.91%,P=0.018)。以CCK8法对脐血EPC体外增殖能力分析,和HUVEC相比,脐血EPCs在体外培养第4天后增殖更为迅速,在P1,P3及P5之间,脐血EPC体外扩增趋势相当,无明显增殖差异,均较HUVEC扩增迅速。脐血EPC可于体外形成管腔样结构,成管能力较HUVEC弱,在40×镜下观察视野内脐血EPC成管数为P1,28.67±4.51个;P3,29.33±4.51个;P5,31.33±4.04个,而HUVEC为71.67±7.64个,各代脐血EPC和HUVEC成管数差异均具有统计学意义(P1 vs.HUVEC,P=0.000;P3 vs.HUVEC,P=0.000;P5 vs.HUVEC,P=0.000),而各代EPC之间成管数无明显差异(P=0.749)。在细胞迁移能力上,于×100视野下,随机计数三个不同视野,脐血EPC细胞数为P1,208.67±13.05个;P3,204.33±16.17个;P5,203.00±16.37个,而HUVEC细胞计数为71.67±3.79,两两比较有统计学意义(P1 vs.HUVEC,P=0.000;P3 vs.HUVEC,P=0.000;P5 vs.HUVEC,P=0.000),而各代之间迁移能力无统计学差异(P=0.925)。选取内皮细胞相关基因CDH5,VWF,VEGF,TIE1,TIE2,及SELE,通过RT-q PCR方法,进一步确认所培养细胞的内皮源性质,以HUVEC为对照,脐血EPC中基因转录水平CDH5增高1.64±0.32倍(P=0.025),VWF增高4.49±0.50倍(P=0.000),VEGF增高1.76±0.12倍(P=0.008),TIE1增高2.08±0.28倍(P=0.021),TIE2增高2.25±0.26倍(P=0.014),SELE增高7.34±0.61倍(P=0.000)。结论:通过体外分离脐血MNCs,以特殊培养基贴壁、黏附蛋白包被培养器皿,培养72h弃未贴壁细胞进一步培养的方法,可于培养的21-28天获得典型EPC形态表现的细胞群。经流式鉴定该细胞群非造血系细胞,并带有部分阳性的祖细胞标记区别于成熟内皮细胞,表达内皮相关基因,符合目前对EPC的表型认知。实验中所用细胞,各代表型特征、基因表达及内皮功能稳定。从脐血中分离培养的细胞具备目前所知关于EPC的大部分特点,在本实验室已建立CB-EPC的分离、有效扩增体系,可进一步应用于后续实验。二.脐血源内皮祖细胞为基质对体外扩增造血干细胞的作用及机制探究目的:探究CB-EPC在脐血造血干/祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cell,HSPC)体外扩增中的作用。分析以CB-EPC为基质细胞,体外扩增脐血HSPC数量的有效性,干祖细胞数量及比例,并分析扩增后的脐血HSPC体内长期造血重建的作用及相应机制。为脐血HSPC体外有效扩增提供新的途径和解决方法,为克服脐血造血干细胞移植(hematiopoietic stem cell transplantation,HSCT)因有核细胞数不足的临床应用限制提供一有效途径。方法:CB-EPC为常规分离、培养。用于HSPC获取的脐血标本,其来源与EPC分离所用脐血标本非同一供体。分离脐血MNCs后,以CD34+磁珠阳性分选法,分选其中的HSPCs并以流式分析CD34+细胞阳性率。脐血HSPC与EPC直接接触共培养或以Transwell小室的间接接触共培养,以不加EPC单纯培养的HSPC为对照,培养7天后计数扩增的细胞总数,结合流式术计数CD34+细胞数,及更原始祖细胞CD34+CD38-细胞数,各系祖细胞CD34+CD33+、CD34+CD19+、CD34+CD61+细胞数。流式细胞术检测扩增后HSPC的细胞周期,分析分裂各期细胞比例。比较扩增前后脐血HSPC的集落形成能力,行HSPC扩增后的功能学分析。建立人-非肥胖糖尿病、重症联合免疫缺陷小鼠(non-obese diabetic/severe combined immunodeficient mice)NOD/SCID鼠异种移植模型,移植分组包括:经MACS后CD34+干细胞组;单纯培养7天后干细胞组;共培养7天后干细胞组及照射组;分析移植后小鼠的生存状况、外周血象的恢复及移植后的人类HSPC嵌合。以RT-q PCR方法分析EPC扩增脐血HSPC的分子机制,并取具有体外扩增HSPC作用的间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)为对照。结果:在培养7天后,直接接触共培养HSPC扩增6.75±0.84倍,单纯HSPC培养扩增3.76±0.60,二者之间存在统计学差异(P=0.003);间接接触共培养体外扩增HSPC 7.56±0.80倍,较单纯HSPC培养扩增倍数存在显着性优势(P=0.001);但直接接触共培养与间接接触共培养在HSPC的扩增倍数上,无明显差异(P=0.239)。直接接触共培养可扩增CD34+细胞5.38±0.61倍,单纯体外扩增培养有3.25±0.59倍CD34+细胞扩增,二者相比较具统计学差异(P=0.003);间接接触共培养同样可有效扩增CD34+细胞,扩增倍数为4.06±0.43倍,较单纯培养具统计学差异(P=0.025),与直接接触共培养之间无统计学差异(P=0.124),表明EPC的体外支持脐血HSPC扩增作用主要来源于细胞因子的分泌,而细胞间的直接生理性接触对HSPC扩增作用有限;在单纯培养条件下,CD34+CD38-细胞群扩增79.12±19.77倍,与EPC的直接接触共培养后,该群细胞扩增倍数可达156.17±21.32倍,明显较单纯培养时扩增倍数增高(P=0.010);在间接接触共培养条件时,该群细胞可获95.43±33.00倍扩增,亦较单纯培养时升高(P=0.026);接种0天时,脐血HSPC中CD34+CD38-的细胞比例为2.13%±0.58%,经单纯共培养7天后该比例达到44.29%±7.30%;经直接接触共培养可将该群细胞比例升高至48.38%±5.07%,与单纯培养下该细胞群比例无明显统计学差异(P=0.392);而间接接触共培养情况下CD34+CD38-群比例为24.58%±3.02%,较单纯培养(P=0.004)及直接接触共培养(P=0.002)条件下细胞比例均低;该部分结果显示,尽管EPC支持脐血HSPC体外扩增主要依靠EPC细胞因子的分泌,但是EPC与HSPC的细胞间直接接触有利于维持更原始造血细胞的比例。在直接接触共培养条件下,CD34+CD33+及CD34+CD61+细胞群较单纯培养或间接接触共培养均有更多倍数的扩增,而淋系CD33+CD19+在三种培养条件下扩增倍数相当。细胞周期结果显示,单纯培养后较培养前HSPC有G0/G1期细胞比例的下降(60.67%±1.68%,P=0.000),S期细胞比例的升高(31.40%±3.50%,P=0.000),而G2/M期细胞比例相当(5.94%±0.17%,P=0.120);经接触共培养7天后的细胞群,也存在G0/G1期比例下降(59.77%±1.94%,P=0.000),S期细胞比例上升(35.17%±2.75%,P=0.000),但有相当的G2/M期细胞比例(5.62%±0.39%,P=0.851),尽管以EPC为基质的体外共培养体系可较单纯培养提供更高倍数的HSPC扩增,却仍保证了足够的细胞处于分裂前期,有助于维持其干细胞特性;以EPC为基质共培养后的HSPC形成的CFU总数不仅比新鲜分离的HSPC多(446.33±6.66 vs.124.67±9.71,P=0.000),且比单纯培养后的HSPC总数多(446.33±6.66 vs.257.33±6.67,P=0.000)。就CFU的种类而言,与EPC共培养后的HSPC形成的各类CFU,在CFU-GM,BFU-E以及CFU-E数量上均较新鲜分离后的HSPC和单纯培养后的HSPC所形成的CFU数量多。人-NOD/SCID小鼠移植实验中,可观察到EPC扩增培养HSPC移植组与未经培养组有相似的白细胞、血红蛋白及血小板的各系血细胞恢复趋势;在移植后5周内,EPC扩增培养HSPC移植组小鼠的血红蛋白及血小板水平较未经培养HSPC组小鼠更高;单纯培养HSPC移植组小鼠多在移植后5周内死亡,未到达观察终点,未经培养HSPC组、EPC扩增培养HSPC移植组到观察终点分别有50%,60%小鼠存活,在生存时间上经统计分析无明显统计学差异(P=0.892)。在移植后8周未经培养HSPC组、EPC扩增培养HSPC移植组小鼠中均有人CD45的成功植入,平均嵌合率分别为16.0%±14.3%,13.3%±11.0%(P=0.750)。分析其机制,RT-q PCR结果显示EPC中的造血相关细胞因子基因IL6(4.24±1.42倍,P=0.017)、ANGPT1(7.75±0.90倍,P=0.000)及CXCL12(8.25±2.03倍,P=0.025)基因的转录水平均较MSC高;信号通路相关分子基因WNT5A转录水平在EPC中有明显升高(11.76±2.11倍,P=0.013);且经过体外共培养后的HSPC中,其WNT5A基因转录水平较培养前明显上调(3.49±0.54倍,P=0.001)。结论:人脐血源EPC可在体外有效扩增HSPC,提高细胞总数及具有原始造血、长期始动能力的细胞数量比例,提高各系祖细胞数量,并可保证一定数量处于静息期的HSPC数量,维持干细胞特性。经EPC为基质细胞扩增后的脐血HSPC具有良好的干细胞功能,可于体内植入及重建造血,在移植早期促进造血恢复。相关机制可能与EPC分泌多种造血相关因子及激活Wnt信号通路有关。脐血源EPC是良好的体外扩增HSPC的基质细胞,可为脐血HSPC体外有效扩增提供新的途径和解决方法。三.脐血源内皮祖细胞联合造血干细胞移植在造血重建和移植物抗宿主病中的作用初探目的:通过联合脐血源EPC及HSC共移植的方式,分析其是否可通过修复移植过程中的内皮损伤,达到促进移植后的造血重建和减轻移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)的作用。方法:建立人-NOD/SCID鼠共移植(EPC+HSC)模型,以单纯移植HSC小鼠为对照,观察移植后的生存状况、造血重建及体内植入,观察移植后小鼠有无GVHD相关症状并记录评分,以病理实验进行GVHD的验证;以CD31免疫组化病理实验分析共移植EPC组小鼠的骨髓微血管恢复情况,并与单纯移植小鼠比较;以慢病毒转染的方式转染绿色荧光蛋白EGFP入EPC,并建立小鼠移植模型,分析移植后EGFP-EPC的归巢及分布,是否直接参与骨髓的微血管恢复。以MSC为对照,流式细胞术分析EPC的表面人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)抗原表达及行混合淋巴细胞实验对EPC免疫原性进行分析。结果:经单纯移植小鼠(n=10)的中位生存时间为51天,长期存活率为60%;经脐血EPC联合HSC共移植组小鼠(n=10)的中位生存时间为54天,长期存活率为70%;EPC联合HSC共移植组较单纯移植组在生存时间上有提高的趋势,但统计学比较无明显差异(P=0.314)。两移植处理组均随着时间延长有血细胞恢复趋势,在观察的各时间点可发现共移植组较单纯移植组在WBC、HBG及PLT上均恢复值高。单纯移植组骨髓中人CD45嵌合比例为(13.27%±6.36%),共移植组骨髓中人CD45比例为(18.21%±10.57%),无统计学差异(P=0.308);在单纯移植组脾脏中的嵌合比为(4.91%±7.56%),共移植组中该比例为(5.14%±2.97%),无统计学差异(P=0.840)。单纯移植组中共有3只小鼠出现GVHD症状,主要表现为体重下降和(或)弓背姿势和(或)活动度下降和(或)耸毛,评分分别为2分、2分、6分;在共移植组中共观察到2只小鼠出现GVHD症状,该组的主要表现是体重下降和(或)轻中度活动度下降,评分分别为2分,1分;存在GVHD表现的小鼠存在不同程度的小肠和骨髓损伤,主要表现为腺体轻中度破坏和或骨髓增生度减低、骨小梁连续性差。EPC共移植组小鼠在观察终点时骨髓中有明显的、连续的CD31阳性染色,骨髓血管窦结构显示完整,提示其微血管恢复良好,而经单纯移植的小鼠骨髓血管内皮细胞有部分恢复但总体骨髓微血管恢复情况较共移植组为差。在将EPC转染EGFP并行移植实验后24h,骨髓中可检测到一定的呈聚集的染色阳性细胞,平均阳性比例占所有有核细胞比约为2.3%;移植后72h及7天,仍可见少量的阳性染色细胞分布于骨髓。实验中所用的EPC的免疫原性均较低,其表面HLA-I类抗原(HLA-ABC)的阳性率为(27.97%±3.60%),MSC的HLA-I类抗原阳性率为(44.46%±7.18%)(P=0.024);EPC表面HLAⅡ类抗原(HLA-DR)的阳性率为(6.37%±2.73%),同样较MSC该类抗原(14.77%±1.96%)表达低(P=0.012);与人淋巴细胞行混合淋巴细胞实验,以CFSE染色后未发现淋巴细胞过度增殖的现象。结论:本部分实验揭示了脐血EPC联合造血干细胞移植具有一定的促进移植后造血重建、减轻GVHD、延长生存时间的趋势,但因受样本量所限,仍需进一步扩大样本量进一步验证。修复骨髓微环境的髓窦内皮细胞损伤,可能是脐血源EPC促进移植后造血重建、减轻GVHD的机制之一。
耿哲[3](2012)在《MLL重排急性白血病的临床和遗传学特点研究及MLL白血病原代细胞异种移植小鼠模型的建立》文中指出第一部分MLL重排急性白血病的临床和遗传学特点研究目的:11q23/MLL急性白血病(11q23/MLL acute leukemia, 11q23/MLL AL)是一种常见的细胞遗传学异常。11q23/MLL AL的易位和重排涉及众多的伙伴基因,应用传统的细胞遗传学分析(conventional cytogenetical assay, CCA)检测所有的MLL重排会比较困难。为了提高11q23/MLLAL染色体畸变的检测,我们联合应用多重巢式RT-PCR分析染色体畸变的方法。最近已发现大量的分子标记是急性白血病中潜在的预后因素。评估这些分子标记的相互关系和相对预后已变得尤为重要。我们在11q23/MLLAL中检测了这些分子突变和免疫分型,这可能会为11q23/MLL AL提供良好的治疗策略。方法:采用多重巢式RT-PCR联合染色体核型分析对2009年至2011年间347例初治AL患者进行检测。对检测出11q23/MLLAL同时检测NPM1, FLT3, CEBPα, c-kit, DNMT3A, IDH1和IDH2分子突变。对11q23/MLLAL患者采取标准的化疗方案治疗后,采用Cox比例风险模型评估OS的独立预后因素。结果:347例AL患者中,通过CCA检测出2例11q23/MLLAL,通过多重巢式RT-PCR则检测出28例11q23/MLLAL。在这28例11q23/MLLAL中有4例(14.28%,4/28)检测出FLT3突变;有1例(3.5%,1/28)检测出DNMT3A突变;有1例(3.5%,1/28)检测出IDH2突变。在这28例11q23/MLL AL中未检测出有NPM1、CEBPα、c-kit和IDH1突变。多变量Cox回归分析未显示出分子突变与11q23/MLL AL的预后相关。结论:常规细胞遗传学和分子遗传学技术相辅相成有助于提高11q23/MLLAL的检出率。11q23/MLL AL患者的细胞遗传学和分子学研究结果为选取治疗方法,尤其是否选取造血干细胞移植提供了最佳治疗策略。第二部分MLL白血病原代细胞异种移植小鼠模型的建立目的本研究旨在利用混合谱系白血病(Mixed Lineage Leukemia, MLL)细胞在NOD/SCID免疫缺陷小鼠中建立人鼠嵌合的异种移植模型。方法选取MLL/AF4重排的白血病患者的单个核细胞悬液通过尾静脉注射的方式接种给NOD/SCID小鼠。每周称量体重,接种14天后经流式细胞术(Flow cytometry, FC)检测小鼠外周血中CD45+细胞的百分比。当小鼠出现精神萎靡、乏力、苍白、竖毛,或体重下降20%时,对其施行安乐死,解剖动物。取小鼠脾脏及肝脏行HE染色,并通过流式细胞术检测外周血、骨髓、脾脏和淋巴结细胞悬液中CD45+细胞的百分比。结果以对照组小鼠的单个核细胞做阴性设门,通过FC监测发现分别于接种35±4后,在病例的小鼠外周血中检测到人CD45+细胞,且其百分比随时间延长而逐渐增高,最终达61.0%±3.5%;大体观上发现小鼠脾脏、肝脏及淋巴结均不同程度增大,镜下可见典型的恶性瘤细胞浸润;流式细胞术显示外周血、骨髓、淋巴结和脾脏中,均发现一群表达人CD45+的细胞。结论本研究成功建立了MLL/AF4原代细胞异种移植的免疫缺陷小鼠模型。
苏约翰[4](2014)在《骨形成蛋白对造血干细胞体外扩增特性和生理功能的影响》文中研究表明造血干细胞体外培养是解决造血干细胞临床移植中数量不足的主要途径,但由于体外培养条件与体内造血微环境存在很大差异,扩增后造血干细胞不仅在数量上无法充分满足临床需求,而且其生理功能也可能受到一定的影响。研究造血微环境中的调控因子对造血干细胞生长发育的影响能够为优化体外培养条件提供重要的依据。骨形成蛋白(BMPs)表达于骨髓造血微环境,在造血调控中发挥重要作用。本文以新鲜分离的脐血CD34+细胞为起始,使用含干细胞生长因子(SCF)、血小板生成素(TPO)和Flt-3配体(FL)的无血清培养基,考察了BMP蛋白亚型和浓度对造血干/祖细胞体外扩增特性的影响,并进一步通过NOD/SCID小鼠移植实验,考察了BMPs对扩增后造血细胞生理功能的影响。结果如下:(1)在本文考察的浓度范围内BMP2对总细胞和造血干/祖细胞的扩增倍数、扩增后造血干/祖细胞的集落形成能力以及培养物中各系血细胞的组成均没有影响;(2)在培养体系中添加25ng/ml BMP4和5ng/ml BMP7,对提高总细胞和造血干/祖细胞的扩增倍数有一定的促进作用;(3)采用NOD/SCID小鼠模型评价了培养体系中添加5ng/ml BMP2或BMP7扩增后细胞的生理功能,发现添加5ng/ml BMP7对培养物的体内植入能力和造血重建功能均有促进作用,而添加5ng/ml BMP2对扩增后细胞的生理功能没有影响。以上研究结果为优化脐血造血干细胞体外培养环境,实现干细胞有效扩增,促进其临床应用提供了依据。
许力[5](2009)在《脐血造血细胞体外扩增的研究进展》文中研究说明
井莹莹[6](2009)在《hLIF转基因饲养层细胞对脐血CD34+造血干/祖细胞增殖和分化的影响》文中进行了进一步梳理目的:分别建立逆转录病毒载体和腺病毒载体介导的转人白血病抑制因子(human leukemia inhibitory factor,hLIF)基因饲养层细胞,体外观察转基因细胞对CD34+造血干/祖细胞增殖和分化的影响,体内研究对辐射损伤SCID小鼠造血功能恢复的效果。方法:将本科室构建和保存的hLIF基因重组逆转录病毒载体经鉴定正确后转染293T人胚肾成纤维细胞,经抗生素Zeocin筛选后获得稳定的转基因饲养层细胞,采用RT-PCR法和ELISA法分别从mRNA水平和蛋白质水平检测hLIF基因在饲养层细胞中的转录和翻译;将本科室保存的重组腺病毒Ad-hLIF感染WI-38人胚肺成纤维细胞建立饲养层细胞,同样采用RT-PCR法和ELISA法检测hLIF基因的表达;采用免疫磁珠法分离脐带血CD34+造血干/祖细胞,流式细胞术检测其纯度;将CD34+造血干/祖细胞分别与上述饲养层细胞共培养,流式细胞术检测各组增殖效果;扩增后的造血细胞经CFDA SE(Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester,)荧光标记后移植入辐射损伤SCID小鼠体内,通过细胞荧光标记法和RT-PCR法检测小鼠骨髓内含Alu基因人源细胞的归巢情况。结果:建立的逆转录病毒载体介导转hLIF基因饲养层细胞经Zeocin筛选后均带有绿色荧光,RT-PCR法和ELISA法鉴定hLIF基因可以在293T细胞中有效表达;50MOI的重组腺病毒Ad-hLIF感染WI-38细胞48h后,可见95%以上的细胞均有绿色荧光,RT-PCR法和ELISA法鉴定转基因细胞中有hLIF基因的表达;免疫磁珠法分离的CD34+造血干/祖细胞经流式细胞术检测其纯度可达95.6±2.58%,与逆转录病毒载体介导的转hLIF基因饲养层细胞共培养7d后,细胞总数最高可扩增12.6±1.32倍,表面粘附分子CXCR4和CD54表达量分别为55.0%、59.3%;而Ad-hLIF转基因饲养层细胞可使CD34+造血干/祖细胞7d内扩增18.45±1.24倍,表面粘附分子CXCR4和CD54表达量分别为57.2%、59.8%,继续培养28d后,细胞总数扩增了356.95±0.87倍,其中CD34+细胞的数量出现了动态变化,在014d能维持较高水平,最高可扩增52.11±1.13倍,以后逐渐降低,共培养28d时,CD34+细胞数量仍比共培养前有较大升高,可扩增13.92±0.85。将扩增后的造血细胞移植辐射损伤SCID小鼠后,可明显提高小鼠存活率,4周内小鼠骨髓中不仅可观察到CFDA SE荧光标记的细胞,而且经RT-PCR法鉴定后,还可检测到表达Alu人源基因的人脐血造血归巢细胞。结论:成功建立了逆转录病毒载体介导的转hLIF基因饲养层细胞和Ad-hLIF转基因饲养层细胞,不仅体外可以有效的扩增CD34+造血干/祖细胞,并延缓其分化,而且扩增的CD34+细胞对辐射损伤SCID小鼠具有一定的造血恢复功能。
袁燕[7](2008)在《体外扩增人脐血造血干祖细胞方法初步研究》文中认为脐血是临床上良好的造血干祖细胞来源之一。然而,单份脐血所能提供的造血干祖细胞数量较少,限制了脐血移植的应用范围。为了满足青少年和成人患者的需要,必须在移植前体外扩增脐血的造血干祖细胞数量。目前常规的体外扩增造血干祖细胞的实验方法是将造血干祖细胞单个悬浮培养,依赖于较高剂量多种细胞因子的联合作用。在这样的培养体系里扩增后的细胞无法长期重建造血。因此,发展新的体外扩增造血干祖细胞的方法是十分必要的。第一部分,藻酸盐三维培养系统体外扩增人脐血造血干祖细胞造血干祖细胞在体内生存于骨髓微环境中,造血细胞之间、造血细胞与基质细胞之间、细胞与细胞外基质之间的相互作用是维持干细胞自我更新能力的因素之一。三维培养体系旨在模拟骨髓微环境而设计。我们的实验设计藻酸盐三维培养体系,包装脐血单个核细胞,培养于培养皿静止系统和Synthecon RWV旋转培养系统中,与常规培养体系(二维系统)相比较。结果显示常规培养体系在低浓度细胞因子培养脐血单个核细胞,细胞总数下降,CD34+细胞明显减少。而三维静止培养体系在低浓度细胞因子培养条件下,细胞总数上升,CD34+细胞明显增加。三维旋转培养体系则可在更低浓度细胞因子作用下得到相类似的结果。在三维培养体系扩增的细胞其粒巨系克隆形成细胞亦明显增多,移植NOD/SCID小鼠可在移植细胞总数少的情况下,在小鼠体内更好植活,重建造血。第二部分,下调细胞周期素依赖激酶抑制因子p18ink4c对脐血造血干祖细胞的作用细胞的增殖分化是受到细胞周期的严格调控的。调控细胞周期的有三大类重要分了,细胞周期素,细胞周期素依赖激酶和细胞周期素依赖激酶抑制因子CKI。p18ink4c属于CKI,它作用于细胞周期G1期早期,抑制cyclinD-CDK4/6复合物的活性,使细胞停留于GO期。p18ink4c-/-小鼠表现为普遍的组织增生和器官肿大,正常小鼠移植p18ink4c-/-小鼠骨髓细胞模型显示出p18ink4c-/-造血干细胞自我更新能力增强。我们的实验以p18ink4c为目标,确定下调p18ink4c(?)的最佳siRNA序列,将该序列克隆到真核细胞siRNA表达载体,并构建包装pl8ink4c-siRNA腺病毒载体。实验分别采用合成siRNA、p18ink4c-siRNA质粒和p18ink4c-siRNA腺病毒载体转染人脐血纯化CD34+细胞。结果发现运用siRNA技术可以下调人脐血CD34+细胞的p18ink4c表达,扩增细胞数,降低CD34+的减少。但是转染效率较低,难以满足临床的需要。这两部分实验,分别通过改变扩增脐血造血干祖细胞的培养环境和下调脐血干祖细胞细胞周期负向调控分子,达到或部分达到了扩增脐血造血干祖细胞的目的。其中三维藻酸盐培养系统对脐血干祖细胞的扩增达到理想结果,国内外迄今无相同报道。而目前对造血干祖细胞转基因技术的转染效率不高,限制了下调p18ink4c分子扩增造血干祖细胞的效率,还有待于今后转染技术的完善和突破。
于文俊,杨文华,史哲新,杨向东,王慧娟[8](2008)在《NOD/SCID小鼠在实验血液学研究中的应用》文中认为NOD/SCID(非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷)小鼠是在SCID(重症联合免疫缺陷)小鼠的基础上与非肥胖性糖尿病小鼠(NOD/Lt)品系回交的免疫缺陷鼠。NOD/SCID小鼠既有先天免疫缺陷,又有T和B淋巴细胞缺乏,各种肿瘤细胞可以植入,且较少发生排斥反应及移植物抗宿主病(GVHD),所以NOD/SCID小鼠逐渐成为血液学实验研究的有用工具。本文从NOD/SCID小鼠的生物学特性及其在建立人类白血病模型、干细胞移植、药物研究及NOD/SCID小鼠应用中存在的不足和改良等方面综合述评。
王海莲[9](2008)在《体外扩增脐血巨核细胞的生物学特性及其体内功能的研究》文中进行了进一步梳理目的:造血干细胞移植目前已经成为治疗多种恶性疾病的有效方法之一,脐血因具有移植物抗宿主病发生率低的优点,成为造血干细胞的主要来源。但是,有两大因素阻碍了脐血造血干细胞的广泛应用。一是脐血中所含的造血干/祖细胞数目少,不能满足移植的需要,尤其是对一些难治性的血液系统疾病,如范可尼贫血、慢性髓系白血病和重型再生障碍性贫血。二是脐血移植同骨髓和外周血移植相比其植入速度慢,尤其是血小板的恢复时间延长,持续的血小板减少不仅会增加患者出血死亡的可能性,而且反复的血小板输注易导致血小板无效输注及病毒感染机会增加等一系列问题,成为困扰临床的一大难题。脐血中含有大量的干/祖细胞,具有扩增、分化的潜能,因此取出部分的脐血进行巨核系祖细胞的体外扩增及适当的诱导成熟,然后与未扩增部分一并输注回受者体内,从而加速体内血小板的恢复是有望解决这一难题的重要途径。近年来大量的研究证实,多种细胞因子如Flt-3配体(FL)、血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、白介素-3(IL-3)等能支持脐血巨核系祖细胞的定向扩增,且效果明显优于骨髓及外周血造血干细胞。但是,扩增后的巨核祖细胞是否具有体内功能,能否向成熟的巨核细胞分化尚未证实,而且关于短期的扩增效果尚未涉及。目前已有少数研究确认体外扩增后的巨核祖细胞可以植入非糖尿病/免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠动物模型,但关于移植后的巨核祖细胞在体内分化及成熟的研究尚未见到。本文以脐血CD34+造血干细胞为研究对象,应用含有TPO、SCF、IL-3、IL-6不同因子组合的无血清培养体系诱导其向巨核系分化和扩增,并对其植入NOD/SCID小鼠模型后的植入水平进行检测。方法:1.脐血CD34+细胞的分离及体外扩增脐血取自健康足月妊娠的胎盘组织,枸橼酸钠抗凝的血袋保存,4-6小时内进行CD34+细胞分离纯化。Percol密度梯度离心法收集单个核细胞(MNC),采用免疫磁珠法,按CD34细胞分选试剂盒说明纯化细胞。将CD34+细胞接种于含Stem SpanTM SFEM无血清培养基的24孔板中,加入四种不同细胞因子。根据细胞因子不同组合分为3组(1)TPO+SCF+IL-3+IL-6组;(2)TPO+SCF+IL-3组;(3)TPO+SCF组。2.体外扩增后脐血巨核细胞生物学特性的研究(1)巨核细胞表面标志的表达收集第3、7、10、14天的细胞,荧光显微镜检测细胞表面标志CD42b、CD41a、CD61和粘附因子标志CD49d、CD49e、CD11a、CD54的表达。(2)巨核细胞凋亡的检测扩增后的细胞用Annexin V/FITC和碘化丙锭(PI)溶液处理后,流式细胞仪进行检测。(3)巨核细胞形成单位(CFU-Mk)检测将细胞接种于含人甲基纤维素培养基的24孔板中,在37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养,进行CFU-GM集落计数,培养前后进行对比。(4)多倍体巨核细胞的检测扩增后的细胞用含有核糖核酸酶(RNase)的碘化丙啶(PI)缓冲液进行处理后,使DNA染色,在流式细胞仪上对CD41+细胞进行多倍体检测。(5)巨核细胞特异性基因的表达按RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis试剂盒说明合成cDNA。用荧光定量PCR鉴定基因β-actin、APAF-1、GATA-1、NF-E2、HPRT、GPIIb、TXS的表达。3.体内功能检测(1)体外扩增的巨核细胞移植入NOD/SCID小鼠16只6-8周的NOD/SICD小鼠无菌条件下饲养,分为4组,经亚致死量放射线(350 cGy)全身照,4-6h内将细胞尾静脉注入照射后的小鼠体内。(1)实验组Ⅰ:TPO+SCF+IL-3+IL-6扩增7-10天的细胞。(1)实验组Ⅱ:TPO+SCF扩增7-10天的细胞。(3)阳性对照组:同等数量的CD34+细胞。(4)阴性对照组:同等体积的生理盐水。(2)小鼠骨髓的检测小鼠处死后无菌条件下取小鼠的股骨与胫骨骨髓细胞,荧光显微镜检测人巨核细胞表面标志CD34、CD41、CD45的表达。(3)小鼠外周血中人血小板的检测小鼠处死后心脏取血,荧光显微镜检测鼠源性和人源性抗体CD41的表达。结果:1.分离获得的CD34+细胞在体外可以有效扩增,三个实验组的原始巨核细胞(CD34+/CD41+)均在第7天达最高值,且添加IL-3和IL-6的细胞因子组合优于未添加组;三个实验组CD4+、CD42b+、CD61+细胞的扩增倍数随培养时间的延长表达量逐渐增高,三组之间有显着性差异。粘附因子CD49d+、CD11a+、CD49e+的表达均在培养第7天达到最高水平,而CD54+的表达量呈下降趋势。2.SCF、TPO组合在扩增第7天并不能显着抑制细胞凋亡,加入IL-3和IL-6后,Annexin V阳性细胞由(8.26±2.49)%降至(3.51±1.24)%。CFU-MK的数量在第10天时最高,且8倍体及8倍体以上的巨核细胞所占的的百分比增加,即成熟产板型巨核细胞增加。荧光定量PCR测定GATA-1、NF-E2、GPIIb的相对表达量在实验Ⅰ组第7天水平最高,GATA-1、GPIIb的相对表达量在实验Ⅱ组第7天达到最高水平而NF-E2在第10天降到最低之后逐渐回升,凋亡转录因子APAF-1的相对表达逐渐增多,实验Ⅲ组GATA-1、NF-E2、GPIIb的相对表达量在第10天达到水平之后下降,TXS、HPRT的测定基本通NF-E2。3.移植入NOD/SCID小鼠体内后,1周后小鼠骨髓均有人脐血细胞植入,CD45的表达量在两实验组小鼠的骨髓中为(5.47±1.76)%、(6.63±0.57)%,CD41+细胞为(1.70±0.17)%、(2.21±0.31)%。小鼠外周血中人血小板在移植后3天就可测到,两实验组分别再第7天和14天达到高水平(为20.46%和24.37%)。结论:1.三种因子组合TPO+SCF+IL-3+IL-6、TPO+SCF+IL-3和TPO+SCF在体外均可使脐血巨核细胞有效扩增,通过对扩增后巨核细胞的生物学特性的鉴定,认为因子组合TPO+SCF+IL-3+IL-6在第7-10天的扩增效率最高。2.将扩增后的脐血巨核细胞植入NOD/SCID小鼠体内,无论因子组合TPO+SCF+IL-3+IL-6或TPO+SCF均可满足移植的需要,并能在小鼠体内产生血小板,因子组合TPO+SCF搭配简单。
林雪梅[10](2007)在《青蒿琥酯对K562细胞系CD34~+细胞的作用及分子机制》文中认为目的慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一组起源于造血干/祖细胞的恶性克隆增殖性疾患,迄今治疗仍主要采用传统的大剂量联合化疗,但此法副作用大,复发率高,而且对正常机体免疫与造血系统有极大的损害。从祖国医学宝库中寻找出既能抑制白血病细胞恶性增殖、诱导凋亡,副作用又相对较小的天然药物已成为治疗白血病的希望和重要途径。青蒿素(Artemisinin)是从传统中药分离提取的含特殊过氧基团的倍半萜类物质,青蒿琥酯(artesunate, AST)为其衍生物之一,作为高效抗疟药已广泛应用于临床。近年研究证明:青蒿素类药物对包括K562细胞系在内的多种肿瘤细胞系有确切的抗肿瘤作用。但现有青蒿素类药物的抗肿瘤研究,还主要存在以下四方面不足:①未涉及到肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSC)层面;②未见对荷瘤动物模型的影响;③毒理学相关研究较少;④机制不清楚。据此,我们观察了青蒿琥酯对源于K562细胞系的CD34+白血病干细胞样细胞和脐血CD34+造血干/祖细胞的影响,对荷瘤动物模型的影响,对bcr-abl、BCL-XL mRNA的影响,以达到评价青蒿素类药物药理作用、毒副作用,研究作用机制,并为后续研究青蒿素类药物的临床应用奠定理论与实验基础。方法1.采用免疫磁珠阳性筛选法从K562细胞中分选CD34+细胞,应用细胞形态学、流式细胞仪、免疫组化、集落培养、RT-PCR等进行鉴定,运用有限稀释法及细胞因子组合进行纯化和扩增培养。2.在成功建立K562细胞系CD34+细胞移植性白血病SCID小鼠模型的基础上,通过比较发病情况及生存时间,移植瘤生长情况,外周血白细胞计数及分类,骨髓细胞形态改变及计数,病理学检查,RT-PCR检测组织bcr-abl表达等考察药物对荷瘤小鼠的影响。3.选用K562细胞系CD34+细胞及脐血CD34+造血干/祖细胞,加入不同浓度的AST。甲基纤维素半固体培养法考察AST对其体外扩增和多向分化能力的影响;应用形态学观察、TUNEL原位检测、流式细胞术Annexin V-FITC加碘化丙啶(PI)双染定量检测细胞凋亡;应用免疫细胞化学染色法等初步探讨AST对细胞分化的作用。4.通过RT-PCR测定bcr-ablmRNA、Bcl-XLmRNA表达,探讨AST诱导K562细胞系CD34+细胞凋亡的分子机制。结果1.K562细胞系CD34+细胞的分离、纯化、鉴定和培养结果显示:分选的K562细胞系CD34+细胞具有一定的白血病干/祖细胞性质,如:始终保持自身一定比例,处于低分化状态,处于G0/G1期细胞的比率较高,成瘤能力强,表达多药耐药基因等。2. K562细胞系CD34+细胞SCID小鼠移植性白血病模型的建立与鉴定K562细胞系CD34+细胞能在SCID小鼠成功建立移植性白血病模型;与普通K562细胞相比,K562细胞系CD34+细胞具有更强的成瘤能力。3.青蒿琥酯对体外培养的K562细胞系CD34+细胞的作用3.1 AST在12.5~50μg/ml能够剂量依赖性地抑制K562系CD34+细胞CFC的形成;当浓度为50μg/ml时,抑制率达100%。3.2 AST可剂量及时间依赖性诱导K562系CD34+细胞凋亡。3.3 AST可能具有诱导K562系CD34+细胞向较成熟粒系细胞分化的趋势。4.青蒿琥酯对K562细胞系CD34+细胞SCID小鼠移植性白血病模型作用观察4.1 AST腹腔注射移植性白血病模型SCID小鼠,小鼠一般状况较对照组有明显改善,体重较对照组降低程度变轻,存活时间明显延长。4.2 AST腹腔注射两周后外周血白细胞数明显减少。4.3 25mg/ml、50mg/mlAST对移植瘤体的抑制率分别为37.85%、49.66%;5.青蒿琥酯对脐血造血干/祖细胞的影响5.1 50μg/mlAST对脐血CD34+HSC/HPC的体外扩增无明显抑制作用。5.2 50μg/mlAST作用48h、72h,对脐血CD34+造血干/祖细胞无明显诱导凋亡的作用。6.青蒿琥酯诱导K562细胞系CD34+细胞凋亡的分子机制初步研究AST呈剂量及时间依赖性降低K562细胞系CD34+细胞bcr-abl mRNA、Bcl-XL mRNA的表达结论1.体内外实验证实,K562细胞系CD34+细胞具有一定的白血病干/祖细胞性质;2.青蒿琥酯对体外培养的K562细胞系CD34+细胞有抑制增殖、诱导凋亡的作用,并可能诱导细胞向粒系细胞方向分化;3.青蒿琥酯对K562细胞系CD34+细胞SCID小鼠移植性白血病模型有一定治疗作用。4.≤50μg/ml的青蒿琥酯对脐血CD34+细胞的增殖、分化无明显抑制作用,也无明显诱导凋亡的作用。5.青蒿琥酯对K562细胞系CD34+细胞的作用可能与下调bcr-ablmRNA、Bcl-XL mRNA,启动凋亡有关。
二、SCID小鼠在脐血造血干/祖细胞移植研究中的应用(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、SCID小鼠在脐血造血干/祖细胞移植研究中的应用(论文提纲范文)
(1)单细胞水平解析体外扩增对脐带血造血干细胞自我更新和分化的影响(论文提纲范文)
缩略语表 |
摘要 |
Abstract |
前言 |
1.细胞因子在HSC体外扩增中的研究现状 |
2.小分子化合物扩增HSC的研究现状 |
3.调节HSC自我更新的信号通路 |
4.单细胞RNA测序技术在HSC研究中的应用现状 |
第一章 脐带血造血干细胞体外扩增体系的建立 |
1.1 材料与方法 |
1.1.1 材料 |
1.1.2 方法 |
1.2 结果 |
1.2.1 USK小分子组合体外培养增加了HSPC和LT-HSC 的比例和数量 |
1.2.2 USK体外培养促进了HSPC向NK细胞分化 |
1.2.3 USK体外培养维持了HSPC向各系祖细胞分化的能力 |
1.3 讨论 |
第二章 动物体内评价扩增后HSC的植入和自我更新能力 |
2.1 材料与方法 |
2.1.1 材料 |
2.1.2 方法 |
2.2 结果 |
2.2.1 移植低数量级USK扩增后的细胞在首次移植早期的植入能力增加 |
2.2.2 USK扩增后的细胞在二次移植NPG小鼠体内的植入未见优势 |
2.2.3 USK扩增后的细胞在首次移植小鼠体内SRC数量增加 |
2.3 讨论 |
第三章 单细胞水平解析体外扩增体系对HSC功能的影响 |
3.1 材料与方法 |
3.1.1 材料 |
3.1.2 方法 |
3.2 结果 |
3.2.1 scRNA-seq数据质控结果 |
3.2.2 脐带血来源的CD34+细胞无监督聚类分群 |
3.2.3 scRNA-seq揭示了体外扩增体系对HSC谱系分化的影响 |
3.2.4 USK体外培养促进了HSPC特异性基因的表达 |
3.2.5 USK体外培养前后差异性基因的表达 |
3.2.6 scRNA-seq揭示了影响HSC自我更新的关键基因和信号通路 |
3.2.7 scRNA-seq揭示了调控HSC自我更新和分化的关键分子 |
3.3 讨论 |
第四章 结论与展望 |
参考文献 |
文献综述 造血干细胞体外扩增策略及分子机制研究进展 |
参考文献 |
作者在学期间取得的学术成果 |
致谢 |
(2)脐血源内皮祖细胞在造血干细胞移植中的作用及机制探究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
引言 |
参考文献 |
技术路线 |
第一部分:脐血源内皮祖细胞的体外分离、培养及鉴定 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
第二部分 脐血源内皮祖细胞为基质对体外扩增造血干细胞的作用及机制探究 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
第三部分 脐血源内皮祖细胞联合造血干细胞移植在造血重建和移植物抗宿主病中的作用初探 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
结论 |
综述:内皮细胞损伤在造血干细胞移植后移植物抗宿主病中的研究现状 |
参考文献 |
攻读学位期间公开发表的论文 |
攻读学位期间科研立项及所获奖项 |
课题基金资助 |
缩略词表 |
致谢 |
(3)MLL重排急性白血病的临床和遗传学特点研究及MLL白血病原代细胞异种移植小鼠模型的建立(论文提纲范文)
中英文对照 |
第一部分 MLL重排急性白血病的临床和遗传学特点研究 |
中文摘要 |
Abstract |
前言 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
References |
第二部分 MLL白血病原代细胞异种移植小鼠模型的建立 |
中文摘要 |
Abstract |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
References |
综述一 |
References |
综述二 |
References |
攻读研究生期间发表的论文 |
致谢 |
(4)骨形成蛋白对造血干细胞体外扩增特性和生理功能的影响(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
前言 |
第1章 文献综述 |
1.1 造血干细胞和造血调控 |
1.1.1 造血干细胞和造血 |
1.1.2 造血调控和体外扩增 |
1.2 骨形成蛋白(BMPs)的作用机制 |
1.2.1 BMPs作用途径 |
1.2.2 BMP信号的强度及持续 |
1.2.3 Smad1/Smad5补偿机制 |
1.2.4 BMP信号与其他信号之间的关联 |
1.3 BMPs对造血干细胞的体内外调控 |
1.3.1 BMPs促进胚胎干细胞的造血分化 |
1.3.2 BMPs在体外培养中对造血干细胞的影响 |
1.3.3 体内实验中BMPs对造血的影响 |
1.4 造血干细胞生理功能的检测 |
1.4.1 造血干细胞生理功能的体外检测 |
1.4.2 造血干细胞生理功能的体内评价 |
1.5 实验意义和研究内容 |
第2章 材料与方法 |
2.1 实验仪器与设备 |
2.2 实验材料与试剂 |
2.2.1 脐血与脐血细胞分离 |
2.2.2 培养基 |
2.2.3 细胞因子 |
2.2.4 免疫荧光抗体 |
2.2.5 NOD/SCID小鼠 |
2.2.6 其他试剂 |
2.3 实验方法 |
2.3.1 脐血造血干/祖细胞的分离 |
2.3.2 脐血造血干/祖细胞的体外培养 |
2.3.3 细胞计数 |
2.3.4 细胞表型分析 |
2.3.5 集落形成细胞分析 |
2.3.6 NOD/SCID小鼠移植实验 |
2.3.7 NOD/SCID小鼠骨髓和脾脏人源细胞检测 |
2.3.8 数据分析 |
第3章 骨形成蛋白对造血干细胞体外扩增特性的影响 |
3.1. BMP2对脐血造血干/祖细胞扩增特性的影响 |
3.1.1 BMP2对总细胞扩增的影响 |
3.1.2 BMP2对CD34~+细胞和CD34~+CD38~-细胞扩增的影响 |
3.1.3 BMP2对CD34~+细胞集落形成能力的影响 |
3.1.4 BMP2对扩增后培养物中各系血细胞组成的影响 |
3.2 BMP4对脐血造血干/祖细胞扩增特性的影响 |
3.2.1 BMP4对总细胞扩增的影响 |
3.2.2 BMP4对CD34~+细胞和CD34~+CD38~-细胞扩增的影响 |
3.2.3 BMP4对CD34~+细胞集落形成能力的影响 |
3.2.4 BMP4对扩增后培养物中各系血细胞组成的影响 |
3.3 BMP7对脐血造血干/祖细胞扩增特性的影响 |
3.3.1 BMP7对总细胞扩增的影响 |
3.3.2 BMP7对CD34~+细胞和CD34~+CD38~-细胞扩增的影响 |
3.3.3 BMP7对CD34~+细胞集落形成能力的影响 |
3.3.4 BMP7对扩增后培养物中各系血细胞组成的影响 |
3.4 本章小结 |
第4章 骨形成蛋白对造血干细胞生理功能的影响 |
4.1 第1批NOD/SCID小鼠体内移植实验结果 |
4.1.1 脐血CD34~+细胞体外扩增情况 |
4.1.2 扩增后造血细胞对NOD/SCID小鼠存活率的影响 |
4.1.3 BMP蛋白对造血细胞在NOD/SCID小鼠体内植入能力的影响 |
4.1.4 BMP蛋白对造血细胞在NOD/SCID小鼠体内造血重建功能的影响 |
4.2 第2批NOD/SCID小鼠体内移植实验结果 |
4.2.1 脐血CD34~+细胞的体外扩增情况 |
4.2.2 扩增后造血细胞对NOD/SCID小鼠存活率的影响 |
4.2.3 BMP蛋白对造血细胞在NOD/SCID小鼠体内植入能力的影响 |
4.2.4 BMP蛋白对造血细胞在NOD/SCID小鼠体内造血重建功能的影响 |
4.3 本章小结 |
第5章 全文总结和展望 |
5.1 全文总结 |
5.2 结果讨论 |
5.3 展望 |
参考文献 |
致谢 |
(5)脐血造血细胞体外扩增的研究进展(论文提纲范文)
1 脐血造血细胞体外扩增培养时起始细胞的选择 |
2 脐血造血细胞体外扩增时细胞因子的选择 |
3 脐血造血细胞体外扩增时选择的培养体系 |
4 黏附分子和CXCR4的表达和脐血造血细胞的扩增 |
5 体外扩增脐血造血细胞效率的评价方法 |
6 体外扩增的脐血造血细胞的临床应用 |
7 结束语 |
(6)hLIF转基因饲养层细胞对脐血CD34+造血干/祖细胞增殖和分化的影响(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
引言 |
第一部分 逆转录病毒载体介导的转 hLIF 基因饲养层 细胞对脐血 CD34~+造血干/祖细胞的扩增作用 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
第二部分 Ad-hLIF 转基因饲养层细胞对脐血 CD34~+ 造血干/祖细胞增殖和分化的影响 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
第三部分 扩增后脐血 CD34~+细胞移植亚致死剂量辐 照的 SCID 小鼠的研究 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
结论 |
参考文献 |
综述:造血干/祖细胞移植研究新进展 |
发表和待发表的论文 |
本论文受下列课题资助 |
缩略词表 |
致谢 |
(7)体外扩增人脐血造血干祖细胞方法初步研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
前言 |
参考文献 |
第一部份 藻酸盐三维培养系统体外扩增人脐血造血干祖细胞 |
引言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
第二部份 下调细胞周期素依赖激酶抑制因子p18ink4c体外扩增人脐血造血干祖细胞 |
引言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
全文总结 |
致谢 |
(8)NOD/SCID小鼠在实验血液学研究中的应用(论文提纲范文)
NOD/SCID小鼠的生物学特性 |
NOD/SCID小鼠在建立白血病小鼠模 |
型中的应用 |
NOD/SCID小鼠在白血病干细胞研究中的应用 |
NOD/SCID小鼠模型的不足和新改良品种 |
(9)体外扩增脐血巨核细胞的生物学特性及其体内功能的研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
符号说明 |
前言 |
第一部分 脐血CD34~+细胞向巨核细胞的体外扩增及生物学特性的研究 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
附图表Ⅰ |
第二部分 体外扩增脐血巨核细胞在NOD/SCID小鼠体内功能的研究 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
附图表Ⅱ |
结论 |
致谢 |
攻读学位期间发表的学术论文 |
学位论文评阅及答辩情况表 |
(10)青蒿琥酯对K562细胞系CD34~+细胞的作用及分子机制(论文提纲范文)
英汉缩略语名词对照 |
中文摘要 |
英文摘要 |
第一部分 K562 细胞系CD34~+细胞的分离、纯化、鉴定和培养 |
前言 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 结论 |
5 参考文献 |
6 图片 |
第二部分 K562 细胞系CD34~+细胞SCID 小鼠移植性白血病模型的建立与鉴定 |
前言 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 结论 |
5 参考文献 |
6 图片 |
第三部分 青蒿琥酯对体外培养的K562 细胞系CD34~+细胞的作用 |
前言 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 结论 |
5 参考文献 |
6 图片 |
第四部分 青蒿琥酯对K562 细胞系CD34~+细胞SCID 小鼠移植性白血病模型的作用 |
前言 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 结论 |
5 参考文献 |
6 图片 |
第五部分 青蒿琥酯对人脐血CD34~+造血干/祖细胞的影响 |
前言 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 结论 |
5 参考文献 |
6 图片 |
第六部分 青蒿琥酯诱导K562 细胞系CD34~+细胞凋亡的分子机制初探 |
前言 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 结论 |
5 参考文献 |
文献综述 |
攻读学位期间撰写发表的论文及承担的课题 |
致谢 |
四、SCID小鼠在脐血造血干/祖细胞移植研究中的应用(论文参考文献)
- [1]单细胞水平解析体外扩增对脐带血造血干细胞自我更新和分化的影响[D]. 文瑞婷. 军事科学院, 2020(02)
- [2]脐血源内皮祖细胞在造血干细胞移植中的作用及机制探究[D]. 曲琦. 苏州大学, 2016(11)
- [3]MLL重排急性白血病的临床和遗传学特点研究及MLL白血病原代细胞异种移植小鼠模型的建立[D]. 耿哲. 华中科技大学, 2012(09)
- [4]骨形成蛋白对造血干细胞体外扩增特性和生理功能的影响[D]. 苏约翰. 华东理工大学, 2014(05)
- [5]脐血造血细胞体外扩增的研究进展[J]. 许力. 内科, 2009(04)
- [6]hLIF转基因饲养层细胞对脐血CD34+造血干/祖细胞增殖和分化的影响[D]. 井莹莹. 苏州大学, 2009(09)
- [7]体外扩增人脐血造血干祖细胞方法初步研究[D]. 袁燕. 复旦大学, 2008(04)
- [8]NOD/SCID小鼠在实验血液学研究中的应用[J]. 于文俊,杨文华,史哲新,杨向东,王慧娟. 中国实验血液学杂志, 2008(04)
- [9]体外扩增脐血巨核细胞的生物学特性及其体内功能的研究[D]. 王海莲. 山东大学, 2008(01)
- [10]青蒿琥酯对K562细胞系CD34~+细胞的作用及分子机制[D]. 林雪梅. 重庆医科大学, 2007(02)