一、纤维连接蛋白降解片段(MAD2)单抗的制备及肝细胞癌患者血浆含量检测（论文文献综述）
殷慧慧[1]（2021）在《第一部分：基于胆汁DNA中突变和甲基化的平行分析建立胆胰系统恶性肿瘤辅助诊断模型 第二部分：肠道微生物中有益菌群与晚期胸部肿瘤患者接受抗PD-1免疫治疗疗效相关性的研究》文中研究说明目的:本研究基于胆汁DNA中突变和甲基化的平行分析,拟建立胆胰系统恶性肿瘤辅助诊断模型,为目前临床中经内窥镜逆行胰胆管造影术（ERCP）诊断结果不明确的患者提供辅助性诊断的方法,从而提高胆胰系统疾病中恶性肿瘤的检出率,使患者能更及时、准确的就诊,提高患者的治愈率及生存水平。内容:本研究共采集来自5家医院的259例胆汁样本,通过提取胆汁中DNA并分析DNA的基因突变和甲基化差异,结合临床的诊断结果,建立并优化胆胰系统恶性肿瘤辅助诊断模型（Bilescreen）,并在测试数据集中对ERCP诊断结果不明确的患者进行恶性肿瘤的检测及灵敏度和特异度分析。同时将Bilescreen的检测结果,相应患者的血清CA19-9的检测结果以及两者联合的检测结果对胆胰系统良恶性疾病的诊断能力进行比较。另外,本文还对部分患者胆汁样本中微生物的分布情况进行研究,分析微生物菌群分布与胆胰系统良恶性疾病的相关性。方法:收集胆胰系统疾病患者的胆汁样本,分为训练数据集、验证数据集和测试数据集,分别提取胆汁样本中的DNA,以qPCR技术对胆汁DNA所含人源DNA和细菌DNA进行定量检测。对于人源DNA含量较高的样本,利用Mutation Capsule的实验方法进行二代测序文库构建,分析胆汁DNA中基因突变和甲基化的测序结果;通过分析训练数据集中基因突变和甲基化差异与临床诊断为胆胰系统良恶性疾病的患者相关性,建立胆胰系统恶性肿瘤辅助诊断模型（Bilescreen）,将Bilescreen在验证数据集中进行参数优化,在测试数据集中进行恶性肿瘤辅助诊断。同时收集患者的血清CA19-9的检测结果,根据患者的临床信息分析比较血清CA19-9、Bilescreen的检测结果对这部分患者的诊断的灵敏度和特异度。对于胆汁中细菌DNA含量较高的样本,使用16S rDNAV4扩增子测序技术对胆汁中细菌DNA的V4区域进行扩增以及二代测序,根据测序结果分析微生物菌群在胆胰系统疾病患者胆汁中的分布,比较菌群分布与胆胰系统良恶性疾病的相关性。成果:在训练数据集样本中,血清CA19-9与Bilescreen中基于胆汁DNA的突变和甲基化检测诊断恶性肿瘤的灵敏度相当,分别是88.10%和90.48%;Bilescreen中基于胆汁DNA的突变检测诊断恶性肿瘤的特异度为100%,DNA突变结合甲基化检测诊断恶性肿瘤的特异度为97.56%,而血清CA19-9检测的特异度只有65.85%。在ERCP不能明确诊断的测试数据集样本中,Bilescreen中基于胆汁DNA的突变和甲基化检测恶性肿瘤的灵敏度为83.87%,特异度为85.71%,而血清CA19-9对恶性肿瘤诊断的灵敏度为83.87%,但特异度仅有14.29%。在胆汁微生物分析中,本研究发现胆胰系统良性疾病患者组中主要存在的细菌门是厚壁菌门（Firmicutes）,在胆胰系统恶性肿瘤患者组中主要存在的细菌门是变形菌门（Proteobacteria）。这两种主要的细菌门在良恶性组别患者中的分布未见显着差异（p=0.267和p=0.215）。在细菌科的差异分析中,本研究发现6种细菌科显着富集于胆胰系统恶性肿瘤患者组样本中,分别是气单胞菌科（Aeromonadaceae,p=0.019）,毛螺菌科（Lachnospiraceae,p=0.030）,微杆菌科（Microbacteriaceae,p=0.045）,紫单胞菌科（Porphyromonadaceae,p=0.030）,普雷沃氏菌科（Prevotellaceae,p=0.045）和韦荣氏菌科（Veillonellaceae,p=0.045）。结论:本研究通过对胆汁中DNA进行二代测序分析,构建基于胆汁DNA中基因突变和甲基化检测的胆胰系统恶性肿瘤辅助诊断模型,在两个维度上对于胆胰系统恶性肿瘤进行诊断预测,其诊断能力与目前临床中常规的诊断结果相当。本方法还可以对ERCP不能明确诊断的患者进行有效的恶性肿瘤辅助诊断,或有望在今后的临床的辅助诊断中得到应用。同时,本研究还在胆胰系统恶性肿瘤患者胆汁中发现特异的细菌科,说明胆胰系统良恶性疾病患者胆汁中微生物的分布存在差别,该指标有望作为另一个维度的生物学标记物,提高对胆胰系统良恶性疾病的诊断水平。目的:本研究通过测序分析抗PD-1免疫抑制剂治疗晚期胸部肿瘤患者的有效组和无效组基线粪便样品中的肠道菌群差异,探讨了在抗PD-1免疫抑制剂治疗过程中患者基线粪便样品中肠道菌群差异与免疫治疗疗效之间的关系。期望以患者基线粪便样品中与抗PD-1免疫抑制剂治疗疗效相关的差异菌种作为生物标记物,在治疗前预测免疫治疗疗效,使更多患者从免疫治疗中获益。内容:本研究探讨了在晚期胸部肿瘤患者抗PD-1免疫抑制剂治疗过程中,基线粪便样品中肠道菌群与免疫治疗疗效之间的关系。首先收集在接受抗PD-1治疗的晚期胸部肿瘤患者的基线以及治疗期间的粪便样本,通过提取粪便样本中细菌DNA、建立16S rDNAV4扩增子文库,并进行16S rDNAV4测序;通过对测序结果分析治疗有效组患者和治疗无效组患者基线和治疗期间的粪便样品中肠道菌群Alpha多样性和Beta多样性方面的区别以及肠道菌群的分布情况,并进一步确定两组患者肠道菌群在细菌科水平的差异菌种;结合临床资料分析患者免疫治疗的疗效与差异菌种的相关性。方法:本研究入组42名接受抗PD-1治疗的晚期胸部肿瘤患者,收集患者的基线以及治疗期间的粪便样本,提取粪便样品中细菌DNA并构建16S rDNA V4扩增子文库进行二代测序。以测序结果分析治疗有效组患者和治疗无效组患者基线和治疗期间粪便样品中肠道菌群在Alpha多样性和Beta多样性方面的区别,以及两组患者肠道菌群在细菌门水平和细菌科水平的组成成分的差异。使用客观反应率、疾病控制率作为近期疗效,疾病无进展期和总生存期作为远期疗效,评估基线肠道菌群中菌种差异对患者的临床治疗效果的影响。采用单因素分析和多因素回归分析对患者免疫治疗的疾病无进展期有影响的肠道菌群和临床资料特征。结果:免疫治疗有效组患者（n=23）和无效组患者（n=19）的基线便样品中肠道菌群在Alpha多样性和Beta多样分析中无显着性差异。在基线便样品中肠道菌群的细菌门水平的分析中,主要分布的细菌门类是厚壁菌门（Firmicutes）,拟杆菌门（Bacteroidetes）,变形杆菌门（Proteobacteria）和放线杆菌门（Actinobacteria）,两组患者在细菌门类的分布没有显着差异。在细菌科水平的分析中,免疫治疗有效组患者的基线便样品中有5类细菌科的相对丰度显着高于免疫治疗无效组,它们分别是阿克曼菌科（Akkermansiaceae）,肠杆菌科（Enterobacteriaceae）,梭菌目分类下的Family Ⅺ科（Clostridiales family XI）,肉杆菌科（Carnobacteriaceae）,肠球菌科（Enterococcaceae）。以这5类细菌科作为一个共生菌混合物,可有效的区分有效组患者和无效组患者（p=0.014）,且患者在免疫治疗前具有更高丰度的该类共生菌混合物时疾病无进展期显着延长（p=0.00016）。多因素回归分析显示,基线便样品中肠道菌群共生菌混合物的丰度是影响晚期胸部肿瘤患者抗PD-1免疫治疗的中位疾病无进展生存期的独立风险因素（HR=0.17,95%CI为0.05-0.55,p=0.003）。另外,在免疫治疗期间患者肠道菌群中共生菌混合物的丰度是存在一定波动的,但是其变化未见显着差异（p=0.878）。结论:晚期胸部肿瘤患者治疗前的便样品中肠道菌群组成成分及其丰度对抗PD-1免疫治疗有重要影响。基线肠道菌群中共生菌混合物（即阿克曼菌科,肠杆菌科,梭菌目分类下的Family XI科,肉杆菌科,肠球菌科）有望成为晚期胸部肿瘤患者进行抗PD-1免疫治疗疗效预测的生物标记物,通过检测其丰度可对抗PD-1免疫治疗疗效进行有效预测。
宋华琛[2]（2021）在《第一部分：SNORD-X通过ILF2调控T细胞活性介导食管鳞癌免疫逃逸的分子机制研究 第二部分：miR-3653-5p调控细胞自噬抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭及迁移的分子机制研究》文中研究说明SNORD-X通过ILF2调控T细胞活性介导食管鳞癌免疫逃逸的分子机制研究食管癌是最常见的恶性肿瘤之一,中国癌症统计数据结果显示食管癌已经成为了我国第六位高发肿瘤和第四位致死肿瘤,其中食管鳞癌是中国大陆食管癌病例的主要组织类型。食管鳞癌晚期预后差,化疗的治疗效果有限而且长期疗效不佳,其发生发展的机制仍不清楚。临床试验数据显示了PD-1免疫治疗在食管鳞癌中的重点作用和巨大潜力。但临床上只有少数患者可从免疫检验点PD-1/PD-L1抑制中持久获益,目前尚无能在治疗前或治疗早期准确识别食管鳞癌是否可从PD-1/PD-L1治疗中获益的生物标志物,因此,发掘可预测食管癌PD-1/PD-L1免疫治疗的生物标志物并阐明其作用机制对食管癌的免疫治疗至关重要。研究表明,snoRNAs在恶性肿瘤的发生发展中发挥关键作用。snoRNAs在外周血中稳定表达且易于检测,可作为肿瘤筛查和疗效预测的生物标志物。本课题旨在寻找可预测食管鳞癌患者PD-1治疗疗效的生物标志物并阐明其作用机制,首先通过对接受PD-1免疫治疗的食管鳞癌患者血清进行基因芯片分析,发现SNORD-X在疾病进展的患者血清中表达明显高于完全缓解及部分缓解的患者血清,并且SNORD-X在食管鳞癌患者的组织和血清中相较于癌旁组织和健康人血清高表达,SNORD-X在食管鳞癌中的表达与淋巴结转移正相关。TCGA数据库拷贝数变异数据显示,SNORD-X基因所在区域为食管鳞癌基因拷贝数高度扩增区。细胞表型实验表明,SNORD-X在体外促进食管鳞癌细胞恶性表型的形成。动物实验表明,SNORD-X在体内促进食管鳞癌的生长和肺转移。为了探究SNORD-X在食管鳞癌中的作用机制,我们利用RNA pulldown实验结合质谱技术筛选,并通过RIP等实验验证SNORD-X与ILF2特异性结合。进一步研究发现,SNORD-X能够结合ILF2将其稳定在细胞核,阻止其进入细胞浆发生泛素化降解,从而增强其蛋白稳定性。IL2是T细胞激活的关键因子,已有报道,ILF2与ILF3形成复合体,在细胞核内可作为IL2的转录因子促进其转录,在细胞浆中可与IL2的mRNA结合增强其mRNA稳定性。本研究发现,在食管鳞癌细胞中过表达SNORD-X后,SNORD-X虽将ILF2稳定在细胞核内,但IL2基因的转录活性却下调,细胞浆中的ILF2减少导致IL2的mRNA稳定性降低,最终导致IL2蛋白水平下降。我们由此推测,ILF2与SNORD-X结合使ILF2结合IL2的启动子区减少,IL2的转录活性降低。此外,SNORD-X结合并上调ILF2后,在细胞核内的其它作用机制有待后续深入研究。食管鳞癌患者血清中可检测到SNORD-X,食管鳞癌细胞产生的外泌体中也可检测到SNORD-X的表达,由此,我们推测食管鳞癌中的SNORD-X可被外泌体包裹分泌至肿瘤微环境发挥作用。因SNORD-X在PD-1治疗的疾病进展组高表达,而PD-1治疗与T细胞活性密切相关,我们首先考虑SNORD-X对肿瘤微环境中T细胞活性的影响。利用高表达SNORD-X的食管鳞癌细胞产生的外泌体处理人外周血白血病T细胞Jurkat,可促进Jurkat细胞中ILF2的表达并且抑制IL2的表达。这提示外泌体中的SNORD-X可能通过ILF2调控IL2的表达抑制T细胞激活,相关的分子机制有待深入研究。综上所述,本课题首次发现SNORD-X可通过ILF2调控T细胞活性进而介导食管鳞癌免疫逃逸。SNORD-X有望作为预测PD-1治疗疗效的分子标志物,且靶向SNORD-X联合PD-1治疗可能成为食管鳞癌免疫治疗的新策略。miR-3653-5p调控细胞自噬抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭及迁移的分子机制研究乳腺癌是中国女性发病率最高的恶性肿瘤,尽管近年来乳腺癌的诊断和治疗已有巨大突破,但其仍是全世界女性癌症死亡的主要原因。乳腺癌分型复杂,发病机制仍不够明确,这极大的阻碍了乳腺癌分子靶向治疗和化疗药物的研究进程。细胞自噬是细胞内重要的物质分解代谢过程,恶性肿瘤发生发展的诸多步骤中均与细胞自噬相关,许多化疗药物可诱发肿瘤细胞自噬,因此针对细胞自噬而采取相关干预有望成为肿瘤治疗的新策略。抗疟疾的老药氯喹作为溶酶体抑制剂,抑制自噬体与溶酶体的融合,导致细胞自噬减少,从而增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性。氯喹是进入临床研究的靶向自噬化合物,已在结肠癌、胶质瘤、黑色素瘤中进行了初步的临床研究,然而,氯喹治疗乳腺癌的作用及临床获益人群仍不明确。MicroRNAs（miRNAs）是内源性的非编码小RNA分子,通过促进靶基因mRNA降解或抑制其翻译,下调靶基因的表达,从而调控一系列生物学过程参与肿瘤的发生发展。miRNAs在肿瘤患者的体液中表达稳定,易于检测,并可一定程度上反应肿瘤的大小、转移情况及对药物的敏感性,是肿瘤诊断的理想标志物。已有报道,miR-3653-5p在多种肿瘤中发挥癌基因的作用,但其在乳腺癌中的作用机制尚不明确。对100例乳腺癌及配对的癌旁组织进行实时定量PCR检测,发现miR-3653-5p在乳腺癌组织中表达下调。细胞功能实验显示,miR-3653-5p抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭迁移及克隆形成。构建miR-3653-5p稳定高表达的乳腺癌细胞进行动物实验,结果表明,过表达miR-3653-5p的乳腺癌细胞转移发生减少。通过TargetScan等网站预测miR-3653-5p的靶基因结合双荧光酶报告基因等实验验证,miR-3653-5p可结合自噬相关基因ATG12和AMBRA1的3’UTR并抑制二者的表达。对上述100例乳腺癌中的41对乳腺癌组织及配对癌旁组织进行实时定量PCR检测,发现乳腺癌组织中ATG12和AMBRA1表达明显增高,且与miR-3653-5p的表达呈负相关。进一步研究发现,miR-3653-5p可通过靶向ATG12和AMBRA1抑制乳腺癌细胞自噬,进而抑制乳腺癌细胞上皮细胞间质化过程。因miR-3653-5p的靶基因ATG12和AMBRA1是自噬过程中的关键分子,且miR-3653-5p高表达可抑制细胞自噬。我们在乳腺癌细胞中敲降miR-3653-5p导致细胞自噬水平升高,细胞对自噬抑制剂氯喹的敏感性更高;而过表达miR-3653-5p后,细胞自噬水平降低,细胞对氯喹的敏感性下降。这提示miR-3653-5p本底表达较低的乳腺癌患者处于自噬状态的乳腺癌细胞更多,可能对氯喹的治疗更敏感。综上所述,本研究首次提出了 miR-3653-5p通过细胞自噬参与乳腺癌的发生发展,并提出miR-3653-5p可作为区分氯喹治疗乳腺癌获益人群的标志物,为乳腺癌的治疗提供新思路。
毕意辉[3]（2021）在《肝星状细胞来源的旁分泌信号分子IL-11促进肝细胞癌进展的机制研究》文中认为大约90%的肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是由慢性肝脏纤维性病变发展而来。在肝纤维化发展为肝癌之前,肝内微环境主要表现为炎症和纤维化这两个特点,我们称之为癌前微环境（premalignant microenvironment,PME）。在PME中,炎症主要由肝损伤导致的大量免疫细胞浸润引起,其中单核细胞分化为M1型巨噬细胞后通过分泌TGF-β,IL-1β,TNF-α,IL-6等促炎因子导致炎症快速扩大。肝内炎症的一个重要的效应细胞为肝星状细胞（Hepatic Stellate Cells,HSCs）,其受到TGF-β等细胞因子刺激后活化,进而转分化为肌成纤维母细胞样细胞,这种细胞的特征是通过大量分泌多种胶原蛋白、非胶原糖蛋白,蛋白聚糖等重塑细胞外基质（extracellular matrix,ECM）,最终导致肝纤维化形成。近年来,研究发现在HCC中PME通常与肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）共存。PME中的ECM包含大量的多功能细胞因子,这些细胞因子与TME中的肿瘤细胞相关作用,促进肿瘤增殖和转移。活化的HSCs作为PME中ECM的主要来源细胞,被认为是驱动HCC发生发展的关键因素,然而具体调控机制仍不明确。因此本论文重点探究活化的HSCs是如何调控HCC进展的。将肝癌细胞与活化的HSCs共同培养后进行转录组测序（RNA-seq）,我们发现肝癌细胞内大量基因的表达水平发生显着变化。对其中发生表达上调的基因进行基因功能富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）,结果表明这些基因主要与上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal Transition,EMT）及细胞增殖（E2F target）等功能相关。进一步将肝癌细胞与活化的HSCs混合（10:90）植入裸鼠皮下,结果发现皮下瘤增殖迅速且出现大量肝癌细胞肝转移的现象,这与RNA-seq结果相一致。活化的HSCs以大量分泌多种细胞因子和细胞外基质成分为特点,因此我们猜测上述现象是由肝星状细胞通过旁分泌途径所产生的。旁分泌途径一般通过激活靶细胞内磷酸化信号转导来发挥功能,因此,我们将活化的HSCs来源的条件培养基（Condition Medium,CM）与肝癌细胞孵育10分钟,随后进行高通量蛋白磷酸化质谱实验。结果发现CM刺激导致肝癌细胞内促进肿瘤增殖和转移的JAKSTAT、MAPK和PI3K-Akt等信号通路被显着激活,且Western Blotting实验进一步证实了这一结果,这提示活化的HSCs可以通过旁分泌途径促进肝癌细胞增殖和转移。为了进一步探究HSCs的CM中发挥促肿瘤增殖和转移功能的关键旁分泌信号分子,并同时排除肝癌细胞自分泌的影响,我们利用RNA-seq分析了HSCs活化前后的转录水平变化,并分别对肝癌细胞和活化的HSCs来源的CM进行分泌蛋白质质谱分析。结果发现白介素-11（IL-11）在活化后的肝星状细胞内高表达且仅由肝星状细胞特异性分泌而肝癌细胞几乎不分泌,因此推测其可能是我们正在寻找的关键旁分泌信号分子。进一步通过Western Blotting实验证实肝癌细胞在介绍接受IL-11刺激后,肝癌细胞内的JAK-STAT、MAPK和PI3K-Akt信号通路显着激活。利用RNA干扰技术敲低肝癌细胞表面的IL-11受体（IL-11RA）后,由CM刺激引起的肝癌细胞内信号通路激活的现象被显着抑制。因此,上述结果均提示肝星状细胞可能通过旁分泌IL-11来促进肝癌细胞的增殖和转移。为了进一步在体内研究IL-11对肝癌细胞的影响,通过慢病毒感染,我们赋予了肝癌细胞自分泌IL11的能力。将获得分泌IL-11能力的肝癌细胞重新植入裸鼠皮下,观察发现该组裸鼠皮下肿瘤生长异常迅速,且在肿瘤长到一定体积后,裸鼠出现体重下降、腹部膨隆的恶病质现象。不仅如此,该组裸鼠肝脏内出现大量转移的肝癌细胞,而不能分泌IL11的肝癌细胞并不能发生肝转移。在探究IL11促进肝癌细胞转移的研究过程中我们发现IL-11不仅可以在活体内诱导小鼠血管渗透性增加,其还是一种非经典的中性粒细胞趋化因子,可以诱导中性粒细胞强烈的释放细胞外诱捕网（Neutrophils extracellular traps,NETs）。NETs中包含大量的蛋白酶,这些蛋白酶可以切割肿瘤外围的基底膜,导致基底膜结构被破坏,进而帮助肿瘤细胞发生远处转移。同时,在临床肝癌病人的组织内发现癌巢周围存在大量的IL-11,IL-11富集的区域中性粒细胞浸润明显,且伴随着大量NETs的释放。以上研究提示活化的肝星状细胞可以通过特异性旁分泌IL-11促进肝癌细胞增殖,同时诱导血管渗漏性增加并诱导中性粒细胞浸润,浸润的中性粒细胞在IL-11的作用下以释放NETs的方式破坏基底膜结构,促进肝癌细胞的远处转移。IL-11的这些功能都将促进肝癌的快速进展以及肝癌病人的生存率极大降低。因此由肝星状细胞特异性分泌的IL-11可能成为肝细胞癌精准治疗的新靶点。
张月明[4]（2021）在《光声成像联合肝癌靶向分子探针在非规则肝切除术中导航的应用研究》文中指出研究背景肝细胞癌是最常见的恶性肿瘤之一,与肝炎病毒感染、酒精性肝硬化等因素相关。目前,外科手术仍然是肝癌的首选治疗方法。自1950年代中期以来,基于解剖学描述的常规肝切除术已被肝胆外科医师广泛接受,但是在临床实践中,存在大量患者因为各种原因而无法耐受大范围的解剖性肝切除术。因此,非规则肝切除术便应运而生。尽管解剖性肝切除术和非规则肝切除术在其应用范围和优劣势方面仍存在争议,但对于具有严重肝硬化、剩余肝体积严重不足和小型局部肝转移瘤的患者,将非规则性肝切除术作为治疗首选,已基本达成共识。在非规则肝切除术中,并未根据肝叶或肝段的解剖范围来切除肝脏,而是在肿瘤病变周围非规则的切除了局部肝脏,这就使确定术中肿瘤的边界、明确安全切除范围显得尤为重要。精准非规则肝切除术的应用在很大程度上取决于能否明确术中肿瘤的边界,这将能够同时优化手术操作的精确性、治疗效果、手术安全性和微创性。因此,急需一种快速灵敏、高分辨率和高特异性的明确术中肿瘤边界的影像学方法。研究目的目前,临床上用于有效识别非规则肝切除术中肿瘤边界的工具有限。光声成像结合了光学成像和声学成像的特点,具有高分辨率、高灵敏度、高穿透深度的特性。通过将已批准的研究新药18F-Alfatide转化为小分子探针IR820-E[c（RGDfK）]2,我们希望将多光谱光声成像与靶向小分子探针相结合,能够更精准的明确术中肿瘤边界,使其转化为导航精准非规则肝切除术的临床应用方法。研究方法首先设计、合成并表征了靶向整合素αβ3的小分子探针IR820-E[c（RGDfK）]2。其次对该探针进行了体外实验研究,以确定其光学特性、靶向细胞的亲和力、特异性和生物相容性;评价了该探针的药代动力学特性和生物安全性。明确了多光谱光声成像的最佳成像时间点和对比度;进行了多光谱光声成像导航下的皮下瘤切除术和非规则肝切除术。最后对取自临床的肝癌手术标本进行了 IR820-E[c（RGDfK）]2染色的体外宏观三维光声成像。研究结果靶向小分子探针IR820-E[c（RGDfK）]2的合成方法简便,光稳定性、生物相容性良好,对整合素αvβ3有较强的亲和力和特异性,具有良好的药代动力学特性和生物安全性;该探针与多光谱光声成像技术相结合,能有效地鉴别肿瘤组织与正常肝脏组织。在皮下瘤切除术及非规则肝切除术中,成功地完成了术前肿瘤定位、术中肿瘤边界精准划定和导航肿瘤完整切除。在人体肝癌标本3D光声成像研究中,靶向小分子探针IR820-E[c（RGDfK）]2能有效靶向肝癌组织并显影,能精确清楚地显示肿瘤区域的边界。研究结论靶向小分子探针IR820-E[c（RGDfK）]2与多光谱光声成像技术相结合,有望成为未来临床工作中非规则肝切除术的有效辅助工具。
马雨水[5]（2020）在《肝癌中lncRNA OIP5-AS1和miR-302调控机制及洛那法尼联合Degrasyn疗效研究》文中研究指明作为目前最常见的致死性肿瘤疾病之一,肝癌的五年生存率仅7%。肝癌发生隐袭,其早期诊断十分困难,大约90%的肝癌患者被诊断时已是中晚期而丧失外科手术切除机会,导致肝癌的预后非常差。常规化疗药物治疗不仅毒副作用大,而且不能明显缓解疾病进展或延长患者生命。因此需要对于肝癌的发病机制和其中的关键调控因子进行深入的研究,提高肝癌的早期诊断、开发新型肝癌治疗药物,提高肝癌治疗疗效,延缓肿瘤复发与转移,改善患者预后。据报道,lnc RNA OIP5-AS1在几种癌症中表达增加。然而,lnc RNA OIP5-AS1在肝癌中的作用仍有待研究。在本文第一部分中,我们通过实时定量PCR实验,证实lnc RNA OIP5-AS1在肝癌组织标本中上调,其过表达与肝癌患者的低生存率有关。细胞和裸鼠的体内外功能实验也表明,lnc RNA OIP5-AS1可以促进肝癌细胞增殖,抑制细胞凋亡。此外,荧光素酶分析证实lnc RNA OIP5-AS1与hsa-mi R-26a-3p,EPHA2之间的结合位点。回复实验进一步证实lnc RNA OIP5-AS1对肝癌细胞生物学行为的影响。基于以上实验探讨,我们的研究结果提示lnc RNA OIP5-AS1可能通过调节hsa-mi R-26a-3p/EPHA2信号轴来促进肝癌细胞的增殖和侵袭。实验证据表明,肝细胞癌的发生和发展过程中,肝癌干细胞（LCSCs）可能起重要的作用。其中,微小RNA（mi RNA）在LCSCs诱发的肝癌中起着重要的作用,但mi RNA-302家族在LCSCs中的作用和相关分子机制却鲜为人知。本文第二部分中,我们应用Mi RNAs微阵列技术,检测参与LCSCs维持和分化的mi RNAs;进而我们探讨mi R-302a/d及其靶基因E2F7在肝癌中的生物学作用及其分子机制。同时,我们采用定量PCR和Kaplan-Meier生存分析法检测mi R-302a/d和E2F7在HCC患者中的表达及相关性。我们的结果显示:mi RNA-302家族成员在HCC细胞球形形成过程中下调,mi R-302a/d表达低的肝癌患者的生存期（OS）和无进展生存期（PFS）相对较短。此外,荧光素酶分析证实mi R-302a/d直接靶向抑制E2F7。过表达mi R-302a/d抑制E2F7 m RNA和蛋白表达。而且mi R-302a/d的低表达和E2F7的高表达与肝癌患者OS和PFS较短显着相关。进一步的细胞功能分析也表明mi R-302a/d可能通过直接抑制靶基因E2F7及其下游AKT/β-catenin/CCND1信号通路,负调控肝癌干细胞的自我更新能力和细胞周期转换。因此,我们的结果提示:E2F7是mi R-302a/d的直接靶点,mi R-302a/d通过靶向E2F7/AKT/β-catenin/CCND1信号通路抑制LCSCs的干细胞和肝癌细胞的增殖。在论文第三部分中,我们通过条件性c Myc转基因小鼠与Alb-Cre工具小鼠杂交,在肝脏内形成自发肝癌,用于肝癌模型的建立与后续的机制研究,以及洛那法尼联合Degrasyn对Alb-c Myc自发成瘤肝癌小鼠治疗作用及其机制的初步探讨。我们的结果发现洛那法尼联合Degrasyn治疗组的小鼠肝表面癌结节明显减少、体重恢复,中位生存期延长,提示洛那法尼联合Degrasyn没有明显的毒副作用,并且对Alb-c Myc自发成瘤小鼠有一定的治疗效果。机制上,我们通过全转录组测序发现,与对照组相比,Alb-c Myc组样本中发现2655个dif-m RNAs、96个dif-mi RNAs以及158个dif-lnc RNAs。对与m RNA相关的差异表达基因的富集分析证实参与染色体稳定性和蛋白质降解过程的基因可能在肝癌的发病机制中起重要作用。进一步的实验验证,与对照组相比,lnc RNA OIP5-AS1和E2F7在Alb-c Myc自发成瘤小鼠的肝癌组织中显着上调,而洛那法尼联合Degrasyn治疗后显着降低;相关mi R-26a-3p,mi R-302a/d和EPHA2在Alb-c Myc自发成瘤小鼠的肝癌组织中显着下调,而洛那法尼联合Degrasyn治疗后显着升高。这些结果暗示:洛那法尼联合Degrasyn具有Alb-c Myc自发性肝癌小鼠模型治疗作用,其机制涉及对lnc RNA OIP5-AS1,mi R-26a-3p,EPHA2,mi R-302a/d和E2F7表达的调控效应。总之,本论文揭示肝癌中lnc RNA OIP5-AS1通过hsa-mi R-26a-3p/EPHA2轴和mi R-302a/d通过靶向E2F7/AKT/β-catenin/CCND1信号通路调控肝癌细胞恶性生物学行为的分子机制;洛那法尼联合Degrasyn具有Alb-c Myc自发性肝癌小鼠模型治疗作用。以上两部分机制研究加深我们对第三部分洛那法尼联合Degrasyn对肝癌治疗效果作用的理解,为肝癌的诊断和治疗提供理论和实践基础。
祁增[6]（2020）在《人参皂苷及融合毒素的生物活性研究》文中指出第一篇 人参皂苷的化学成分和减毒活性研究五加科植物人参（Panax ginseng C.A.Meyer）,主要分布在中国东北、韩国和日本,在我国人参的药用历史已有千年之久。通过对化学成分的深入研究,为更好地开发和利用我国东北地区道地中药材资源——人参和西洋参提供了科学依据和物质基础;通过催化氢化反应对一系列达玛烷型人参皂苷（元）进行结构修饰,完善了人参皂苷（元）二氢产物化合物库;采用体内外实验对人参皂苷及其衍生物的减毒作用进行研究。取得的创新科学成果如下:1.林下山参,又称“籽海”,是指在深山或森林中播种后不加人工干预的半野生人参。通过对林下山参“珍珠疙瘩”的研究,分离得到四个新的三萜皂苷类化合物 ginsengenin-S1（1）、ginsengenin-S2（2）、ginsenoside-S3（3）、ginsenoside-S4（4）和一个首次从该部位提取得到的新天然产物ginsenoside-S5（5）。采用香烟烟雾刺激诱导的人肺上皮细胞氧化损伤模型研究了这5个化合物的抗氧化活性发现,ginsengenin-S2能有效抑制香烟烟雾诱导的氧化应激和炎症反应,其抗氧化抗炎作用和Nrf2和HDAC2通路有关。2.西洋参茎叶中发现一个奥克梯隆型新人参皂苷——12-酮-拟人参皂苷F11（21）,其结构式为6-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-（1-2）-β-D-吡喃葡萄糖基]-达玛-12-酮-20S,24R-环氧-3,6α,12β,25-四醇。采用过氧化氢刺激诱导的人肺上皮细胞氧化损伤模型研究该化合物的抗氧化活性发现,12-酮-拟人参皂苷F11能呈剂量依赖性地提高细胞活力,通过抑制MDA的生成、提高SOD和GSH水平、上调Nrf2和HO-1蛋白表达,缓解过氧化氢引起的肺上皮细胞氧化损伤。3.通过催化氢化反应对一系列人参皂苷（元）化合物进行结构修饰,获得18个二氢人参皂苷（元）衍生物,包括10个新化合物:2H-Rb2（23）、2H-Rb3（24）、2H-Rc（25）、（20S）-2H-Rh2（28）、2H-F2（29）、2H-gypenoside ⅩⅦ（30）、2H-gypenoside LⅩⅩⅤ（31）、2H-Rg1（35）、2H-Rg2（36）、2H-Rh1（37）,完善了人参皂苷（元）二氢产物化合物库;基于人参茎叶,大量制备了稀有皂苷人参皂苷Rh2及其衍生物二氢人参皂苷Rh2、（24R）-拟人参皂苷HQ（40）和（24S）-拟人参皂苷HQ（41）,为开展体内减毒药效学研究提供物质基础。4.采用顺铂诱导的急性肾损伤动物模型,对Rh2的预防性治疗肾损伤作用和相关机制进行研究。研究发现,Rh2能缓解CDDP诱发的肾功能不全和肾脏器质性损伤,减轻氧化应激、炎症反应和肾小管凋亡,同时调节肾脏组织中Bcl-2、p53、Bax、cytochrome c、caspase-8、caspase-9、caspase-3 的蛋白表达水平,提示Rh2的肾脏保护作用与caspase相关信号通路有关;代谢组学分析显示,Rh2能使29个血清代谢物恢复至正常水平。5.（24R）-pseudo-ginsenoside HQ（R-PHQ）和（24S）-pseudo-ginsenoside HQ（S-PHQ）是人参皂苷Rh2的潜在体内代谢物。Rh2、R-PHQ和S-PHQ能上调环磷酰胺（CTX）诱导的免疫抑制动物模型的先天和适应性免疫应答,其表现为白细胞数量、细胞免疫和巨噬细胞吞噬功能的恢复,同时观测到给药使T淋巴细胞亚群和血清细胞因子的水平也恢复正常;另外,联合给药R-PHQ或S-PHQ不影响CTX对H22肝癌的治疗作用。体内抗肿瘤研究发现,R-PHQ和S-PHQ可抑制肿瘤生长并诱导肝癌细胞的凋亡,调节肿瘤组织中Bax、Bcl-2和VEGF的表达,提示其抗肿瘤作用可能与caspase和VEGF相关信号通路有关。本研究为R-PHQ和S-PHQ的后续开发提供理论基础。第二篇 融合毒素靶向治疗头颈部鳞状细胞癌的研究表皮生长因子受体在的大多数头颈部鳞状细胞癌肿瘤组织上呈高表达,现有靶向表皮生长因子受体疗法对头颈部鳞状细胞癌的临床疗效并不是很理想,头颈部鳞状细胞癌患者的总体生存率仍然很低,迫切需要开发新颖的治疗方法来改善其临床治疗需求。在这项研究中,开发了一款新颖的基于白喉毒素的重组双价人表皮生长因子融合毒素。在体外,单价与双价融合毒素均对表皮生长因子受体阳性的头颈部鳞状细胞癌细胞有特异性的结合和杀伤,而对表皮生长因子受体阴性细胞无非特异性结合与杀伤。与单价融合毒素相比,双价融合毒素具有更好的体外结合亲和力。与FDA批准的表皮生长因子受体靶向药物特罗凯相比,本文报道的双价融合毒素在抑制头颈癌实体瘤生长、延长动物带瘤生存期方面表现出同等效力;在原位舌癌模型中也观察到双价融合毒素可延长动物带瘤生存期;值得一提的是,与其他受试药相比,双价融合毒素能更好地延长实验性转移头颈癌荷瘤小鼠的生存期。结果表明,双价人表皮生长因子融合毒素,在抑制原发性肿瘤生长方面优于单价人表皮生长因子融合毒素,在治疗转移性头颈癌方面优于特罗凯。因此,这款新型的双价人表皮生长因子融合毒素作为更好的靶向治疗表皮生长因子受体阳性头颈部鳞状细胞癌的候选药物具有巨大的开发潜力。
李祖俐[7]（2020）在《高、低转移肝癌细胞系外显子测序及进化分析》文中认为目的:肝癌是全球第六常见的癌症,也是排名第四的癌症死亡原因。中国肝癌每年新发病例和死亡病例占全球50%以上,大多数肝癌初次诊断时已经伴随远处转移。由于肝癌异质性的存在,肝癌在化疗、靶向治疗、免疫治疗等治疗容易产生耐药,探究肝癌异质性显得格外重要。方法:对来自同一患者具有不同转移潜能的肝癌细胞系（MHCC97-L、MHCC97-H、HCC97LM3）进行了全外显子测序。在Oncotator中注释了测序数据,并找到非沉默类型突变基因。为了探究三株细胞进化关系,用Mega X软件构建了基于基因组单核苷酸多态性（SNP）的进化树。根据三株细胞突变位点和基因绘制维恩图并计算了异质性。在Excel中统计三株细胞的碱基改变情况、已知肝癌驱动基因和10个经典致癌信号通路上的基因突变情况。为了进一步探究三株细胞的不同,通过分析突变位点找到三株细胞的主干差异突变基因和各自特有的基因,利用STRING构建了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络找到hub突变基因,在c Bio Portal数据库中查询hub基因的突变与肝癌总生存期（OS）的关系。由于基因突变会影响基因表达,在ULCAN数据库探究了关键基因在肝癌中的表达及其对肝癌病人预后影响。挑选感兴趣的突变基因,根据突变位点设计引物后用PCR进行验证。结果:三株细胞的突变基因维恩图显示,三株细胞共有4691个突变基因,MHCC97-L特有突变基因243个,MHCC97-H特有突变基因315个,HCC97LM3特有突变基因289个。三株细胞的平均异质性突变率（三株细胞非共有的突变数占的百分比）为16.55%（范围15.38%～18.17%）。基于SNP的进化树显示,MHCC97-H和HCC97LM3在进化关系更近。三株细胞株在7个肝癌驱动基因（ARID1A、CDKN1A、P53、KEAP1、APOB、XPO1、HIST1H1E）和10个经典致癌信号通路基因（如ALK、RET、EGFR、ROS1、KRAS、HRAS、APC等）中存在非沉默突变。在c Bio Portal数据库中,部分从主干差异突变和特有突变中筛选的hub基因突变（SDC1、ITGB4、ITGA4、BPTF、COL4A1、MYOD1、AR、EFTUD2）与肝癌患者更短生存期相关。在ULCAN数据库中,部分关键基因（CDC27、RELA、EIF4E、POXO3、EZH2、POLR2G、WDTC1、DLG、EPRS、EFTUD2）不仅在肝癌组织中高表达,还与肝癌病人更短生存期相关。在MHCC97-H和HCC97LM3细胞中发现了肝癌驱动基因KEAP1的一个新的纯合移码缺失突变（1334del C,p.P445fs）,这导致了KEAP1蛋白的c末端（Nrf2结合区）缺失。结论:WES数据表明,来自同一患者的肿瘤活检标本的HCC细胞系通过在小鼠体内的重复选择获得了不同的转移潜能,它们在基因组水平上具有遗传关系。肝癌驱动基因中和经典致癌通路上的突变基因,以及从主干突变和特有突变中筛选出来的hub基因,在肝癌的发生发展中可能发挥着重要的作用。
纪伟[8]（2019）在《HCV和HBV的特异性T细胞免疫反应和分子机制研究》文中进行了进一步梳理丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（hepatitis Cvirus,HCV）引起的一种主要经血液传播的传染病,呈世界性流行。根据世界卫生组织报告,全球丙型肝炎的流行率平均为3%,估计有1.7亿人感染丙型肝炎病毒,每年新增感染者300万-400万例,死亡25万例,占所有传染病死因的第10位。丙型肝炎已经成为困扰全球公共卫生的一个重要问题。目前,由于HCV基因的多样性以及缺乏理想的动物和细胞感染模型,HCV疫苗研究仍面临很多难题。T细胞免疫在急性HCV感染中病毒是否能自发清除起到关键作用。研究表明,在自限性HCV感染的患者或黑猩猩中发生了强烈的HCV特异性CD8+T细胞应答,但在慢性感染的宿主中观察到较弱CD8+T细胞应答。为了探究T细胞在HCV感染自然进程中的特征,及T细胞免疫与疾病进程的相关性,我们招募河北省某村因献血感染HCV的聚集性人群为研究对象,其中的HCV感染者是1970-1990年左右因献血感染,没有接受过任何治疗。我们用NS3蛋白overlapping多肽库体外刺激PBMC,通过流式分析T细胞细胞因子分泌、记忆细胞分型及抑制性分子表达等,探究T细胞免疫在HCV病毒清除组和慢性感染组的特征及差异。结果表明,病毒清除组的CD8+T和CD4+T细胞因子分泌能力显着高于慢性感染组和健康对照组。两组HCV特异性CD8+T细胞主要以效应性记忆T细胞（TEM）和效应性T细胞为主（TEMRA）,而HCV特异性CD4+T细胞主要以效应性记忆T细胞（TEM）和中心记忆T细胞（TCM）为主。在抑制性分子的表达分析中,慢性感染者病毒特异性CD8+T细胞抑制受体的表达以PD-1高、TIM-3高表达为主要特征,其与以AST或ALT水平异常和形态病理学变化为特征的肝损伤相关。有趣的是,LAG-3在慢性感染者CD8+T细胞上的表达较低,与ALT或AST呈负相关。我们对长时期的HCV感染者的病毒特异性T细胞免疫的特征进行了研究,并有助于阐明免疫应答在相关临床过程中的作用。同时,我们也对慢性感染者感染的HCV病毒进行了分子水平的研究工作。我们对其感染的HCV病毒通过分子生物学实验进行基因分型,并利用一代测序和二代测序手段获得26条全基因组序列。根据基因分型结果,这些感染者感染的是HCV1b（17）、HCV2a（9）两种基因型。对于一代测序的全基因序列,我们根据MEGA7.0的进化距离分析发现,HCV1b间及HCV2a间的序列都有很高的同源性。通过与国内外序列进行系统发育进化树分析,HCV2a的序列相对聚集,聚集在一个独立的分支上,与国外测得的NDM228等株亲缘关系相对较近。HCV1b的17条序列相对分散。对各蛋白编码区也进行了系统进化分析,结果同全基因序列的分析基本一致。通过二代测序,我们获得的信息有原始reads、拼接序列、每条序列每个位点的测序深度、entropy、mutrate等。26条序列的拼接工作已经完成,数据分析还在进行中。我们在病毒“准种”、重要的T细胞表位和中和抗体表位的免疫逃逸突变等角度进行分析,结合临床数据,探究其与肝脏损伤程度的相关性。另外,MHC分子结构在T细胞免疫研究中起了很重要的作用。MHC分子可以限制TCR对多肽的识别,而且多肽与MHC之间的构象协调作用对于TCR的识别至关重要。如果将构像改变的关键氨基酸突变,就会导致pMHC复合物与TCR的结合变弱。同一 MHC-多肽可以被不同TCR识别,MHC-多肽复合物的柔性变化也是TCR可以交叉识别的原因之一。可以看出,MHC-多肽的结合能力以及它们的构象变化影响了TCR识别。我们通过对H-2Kd-HBV peptide复合物分子结构的分析,并结合HLA-B*4001的结构解析及分析,发现两个复合物结构中都有在一个带正电的氨基酸R和负电氨基酸E构成的两种不同形式的盐桥参与MHC与多肽的结合。我们对两个氨基酸进行了单突变和双突变,通过refolding、CD检测MHC与多肽结合的稳定性,以及H-2Kdtetramer对HBV特异性CD8+T的识别,结果证明了盐桥氨基酸的突变影响了多肽与MHC分子的结合能力及多肽-MHC复合物对TCR的识别。综上所述,本研究探究了 T细胞免疫在HCV感染自然进程中的特征和T细胞免疫与肝脏损伤程度的相关性,并对感染者感染的HCV病毒全序列进行了分析。另外,我们基于H-2Kd-HBV peptide HBc87-95和 HLA-B*4001-SARS N216-225复合物结构发现了盐桥在MHC与多肽结合及MHC-多肽复合物对TCR识别的重要性。该研究工作对HCV和HBV的预防和治疗具有一定的提示性和指导性。
吕慧珍[9]（2019）在《Ⅰ.microRNA介导的内皮型一氧化氮合酶和胰岛素受体底物蛋白2之间的相互调节 Ⅱ.软骨寡聚基质蛋白COMP可以通过与integrinα5相互作用抑制内皮激活》文中研究表明第一部分micro RNA介导的内皮型一氧化氮合酶和胰岛素受体底物蛋白2之间的相互调节血管内皮作为血液循环中物质与血管壁之间的选择性屏障,既可以维持血管壁的完整性,还可以接受来自循环血液中各种机械和化学信号等刺激,产生多种细胞因子、生长因子等生物活性物质,在调节心血管的功能中起着关键作用。血管内皮是机体炎性反应的主要部位,内皮功能紊乱是多种心血管疾病如动脉粥样硬化发生发展的早期环节。而内皮型一氧化氮合酶（e NOS）作为其重要内皮功能的判断指标主要由内皮细胞表达,内皮细胞可通过释放一氧化氮（NO）发挥扩张血管、调节血压、控制血小板聚集、抗平滑肌细胞增殖等作用。e NOS的表达可受转录及转录后水平等多种修饰调节,当其功能出现障碍时,可造成NO生物利用度降低及氧化应激增加,导致或加重内皮功能障碍。竞争性内源RNA（competitive endogenous RNA,ce RNA）假说于2011年由哈佛医学院Pier Paolo Pandolfi研究小组提出,它是一种新的基因表达调控模式,是指不同m RNA之间可以通过相同的micro RNA反应元件（micro RNA response elements,MREs）达到相互调控的目的。已知mi RNAs可以通过结合m RNA导致基因沉默,而ce RNA可以通过MREs与mi RNAs结合从而影响mi RNAs导致的基因沉默,具有重要生物意义。ce RNA假说的提出赋予了m RNA和非编码RNA新的、更为广泛的生物学功能。各种类型RNA之间通过RNA-RNA对话所构成的调控网络在生物学和病理生理过程中发挥作用。eNOS的表达可受转录及转录后水平等多种修饰调节,但目前对于ce RNA是否参与调节e NOS m RNA及其潜在机制尚不清楚。我们运用生物信息学技术筛查到在人的内皮细胞中高度表达并且能够调控e NOS的mi RNAs为mi R-15b,mi R-16和mi R-30b,这三个mi RNAs共同调节的靶基因有1103个,均可称为e NOS的ce RNA,其中有15个ce RNA与e NOS之间存在着密切的疾病关联性,通过检测临床上患有心血管疾病病人的主动脉血管和股动脉血管样本的e NOS-ce RNAs表达并对其进行相关性分析,我们进一步确定了7个ce RNA与e NOS之间具有显着的相关性,分别为胰岛素受体底物蛋白1（IRS1）,胰岛素受体底物蛋白2（IRS2）,肾上腺素能受体β2（ADRB2）,C反应蛋白（CRP）,神经源性分化因子1（NEUROD1）,溶质载体家族30成员8（SLC30A8）和泛素交联酶E2（UBE2E2）,其中IRS2与e NOS的表达相关性最为显着。为验证IRS2与e NOS这对ce RNA之间的cross-talk,我们通过层流在转录水平上上调e NOS的表达或用e NOS的干扰RNA下调e NOS的表达,结果发现IRS2的表达随着e NOS的表达变化而变化,即层流使IRS2的表达上调,e NOS的干扰RNA下调了IRS2的表达,同样的,IRS2的干扰RNA也会引起e NOS的表达下调,然而e NOS和IRS2之间的相互调控在给予内皮细胞敲除Dicer这个mi RNAs的工具酶之后被阻断,说明e NOS和IRS2这对ce RNA之间的相互调节依赖于mi RNAs的桥梁作用。为进一步验证mi R-15b,mi R-16和mi R-30b这三种mi RNAs对e NOS和IRS2的调节是在转录后水平上进行的,我们构建了含e NOS和IRS2 3’UTR的荧光素酶报告基因的质粒,并将其与三种mi RNAs的类似物和抑制剂分别共转染到人的脐静脉内皮细胞（HUVECs）中,通过检测荧光素酶的活性发现这三种mi RNAs的类似物显着降低了荧光素酶的活性,而其抑制剂显着上调了荧光素酶的活性,从而验证了mi RNAs对其靶基因的转录后调控。同样的,这三种mi RNAs的类似物显着降低了e NOS和IRS2的m RNA和蛋白水平,其抑制剂显着上调了e NOS和IRS2的m RNA和蛋白水平。最后我们运用功能学实验验证了e NOS与IRS2在功能上的相互调节,即在内皮细胞中敲除IRS2会降低一氧化氮NO的释放,同样的,在内皮细胞中敲除e NOS也会影响胰岛素信号通路,抑制AKT的磷酸化水平,而这种降低或抑制均依赖于mi RNAs的桥梁作用。综上所述,我们预测到人的e NOS的ce RNAs,并在人血管内皮细胞和人的血管样本中确认IRS2作为主要的ce RNA,二者以mi RNAs桥梁,相互调节彼此的表达。因此,我们的研究提供了调控e NOS表达的新模式,并在一定程度上揭示了临床上多种心血管疾病如高血压和糖尿病之间密切联系的新机制。第二部分软骨寡聚基质蛋白COMP可以通过与integrinα5相互作用抑制内皮激活心血管疾病如动脉粥样硬化作为全球发病率和死亡率较高的疾病,严重威胁人类健康。内皮激活（内皮功能紊乱）作为多种心血管疾病如动脉粥样硬化发生发展的早期环节,对其具体机制的研究可为临床治疗心血管疾病提供新的靶点。近年来越来越多的研究集中在软骨寡聚基质蛋白COMP在心血管系统中的重要作用,但目前对于COMP是否影响内皮激活以及其潜在作用机制尚不清楚。因此,本研究的目的在于明确COMP是否影响内皮激活及其具体作用机制。软骨寡聚基质蛋白COMP,也可称为血小板反应蛋白TSP5,是一种主要表达在软骨系统和心血管系统的基质蛋白。多项研究表明COMP可以维持血管稳态;COMP的缺失可引起平滑肌细胞迁移增加;促进平滑肌细胞的钙化和动脉粥样硬化的发生和发展。考虑到内皮激活在多种心血管疾病中的重要作用,以及COMP在心血管中的保护作用,我们展开了一系列的研究以探索COMP是否影响内皮激活以及其具体作用机制。首先,在正常生理状态下,我们使用wild-type（WT）,COMP全身敲除小鼠（COMP-/-）和平滑肌特异性过表达COMP的小鼠（SMC-COMPTg）三种小鼠分离其主动脉弓部小弯侧,弓部大弯侧和直部进行免疫荧光染色。检测内皮激活的标志物VCAM-1和ICAM-1,结果发现在内皮激活显着且易发动脉粥样硬化的血管弓部尤其是小弯侧VCAM-1和ICAM-1的表达在COMP-/-小鼠中显着高于WT小鼠,而在SMC-COMPTg小鼠中的表达较低。同样,相对于WT小鼠,COMP-/-小鼠主动脉血管中VCAM-1和ICAM-1的蛋白水平也显着增加,而SMC-COMPTg小鼠内皮激活的标志物则显着下调。在病理状态下,我们给予WT,COMP-/-和COMPTg三种小鼠行左颈总动脉部分结扎术并给两周高脂饮食在体模拟湍流状态,左颈总动脉免疫组化和免疫荧光染色结果发现相比WT和SMC-COMPTg小鼠,COMP-/-小鼠左颈总动脉内皮激活情况明显加重。体外细胞实验也证实COMP可抑制具有内皮激活和促动脉粥样硬化的湍流引起的内皮激活。整合素integrin作为一大类细胞膜受体蛋白,由α和β两个亚基通过非共价键连接组成异源二聚体,可与胞外基质或其它细胞表面的受体结合,介导细胞-细胞、细胞-细胞外基质之间的相互作用,通过由内到外（inside-out）和由外到内（outside-in）双向传递跨膜信号。目前报道的与内皮激活相关的integrin有α3β1,α6β1,α5β1,αvβ3和αvβ5,我们通过体内外的免疫共沉淀实验和双杂交实验证实COMP可通过其TYP3和C端结构域与integrinα5相互作用。进一步的体内外实验我们验证了COMP与integrinα5的相互作用可抑制FN和湍流引起的integrinα5的激活以及下游FAK和Src的磷酸化进而抑制内皮的激活。最后,我们运用生物信息学预测了COMP与integrinα5结合位点,并根据该结合序列在体外合成了含24个氨基酸的短肽,体内外实验均证实了此短肽可通过抑制integrinα5引起的内皮激活进而起到抗动脉粥样硬化的作用。综上所述,本研究发现细胞外基质蛋白COMP可通过其TYP3和C端结构域与integrinα5相互作用,抑制其激活进而抑制内皮的激活。最后我们根据COMP与integrinα5结合序列在体外合成的短肽可抑制内皮的激活,从而减缓了动脉粥样硬化的发展,具有一定的治疗作用。本研究揭示了COMP在内皮细胞中激活的新机制并为临床上治疗动脉粥样硬化提供了新的靶点。
苏志鹏[10]（2019）在《抗c-MET纳米抗体的抗肿瘤作用研究》文中指出受体酪氨酸激酶属于蛋白酪氨酸激酶家族,是一类细胞膜表面受体,其配体一般为生长因子,细胞因子以及激素。受体酪氨酸激酶不仅可以在正常细胞中调节细胞活动,而且在许多的癌细胞中会促进其增殖。受体酪氨酸激酶上的一些氨基酸突变会引发下游的级联信号,从而影响多个蛋白的表达水平,进一步影响细胞增殖。C-MET蛋白是受体酪氨酸激酶家族的一个成员,由MET基因编码,为单次跨膜受体,其配体为肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor,HGF）。C-MET蛋白通常由上皮细胞表达,肝细胞生长因子一般由间叶细胞表达,一旦肝细胞生长因子与c-MET结合,肝细胞生长因子就会引起c-MET的二聚化并激活c-MET的激酶活性。在癌细胞中的非正常c-MET蛋白激活与癌症的不良预后相关,其激活可以促进肿瘤的增殖、肿瘤组织部位血管发生和肿瘤细胞转移。该信号通路在包括肾脏、肝脏、胃和乳腺等诸多组织中的肿瘤中都存在失调,这就使c-MET成为肿瘤靶向治疗的重要靶点。阻断肝细胞生长因子和c-MET蛋白的结合是c-MET靶向治疗的主要策略。抗体药物由于其靶向性好,副作用小的优势在肿瘤相关抗原的靶向治疗中发挥了很强大的功能,而纳米抗体以其分子小、易改造、稳定性高等特点受到研究者关注,目前纳米抗体药物的研究也如火如荼。本研究中以c-MET蛋白为靶标,研究针对c-MET蛋白的纳米抗体,并检测该纳米抗体对c-MET蛋白特异性肿瘤细胞的抑制作用。本论文具体内容如下:1、靶向c-MET特异性纳米抗体的制备已有的研究显示,c-MET/HGF信号通路中,c-MET蛋白是通过其信号素（Semaphorin,Sema）结构域与HGF发生结合,为获得可阻断二者结合的抗体,本研究中分别采用了Sema结构域和c-MET蛋白胞外全长用于动物的免疫和抗体的筛选。在动物免疫以后,成功构建库容为1×108的c-MET纳米抗体文库,通过噬菌体展示的技术,结合生物淘选的方法,经ELISA鉴定和测序分析,最终确定有33株纳米抗体与c-MET蛋白胞外全长具有特异性结合。将33株纯化后纳米抗体分别处理肝癌细胞HepG2,结果显示有18株纳米抗体对HepG2细胞的增殖有抑制作用,另外15株抗体对HepG2细胞的增殖有促进作用,其中具有抑制作用的18株抗体中有10株抗体的抑制作用较强。2、靶向c-MET特异性纳米抗体的原核表达、表征和功能分析将10株对癌细胞增殖抑制能力较强的纳米抗体分别亚克隆到原核表达载体中,成功纯化制备了大量的10株纯化后纳米抗体,并利用生物膜干涉技术测定了纳米抗体与c-MET蛋白的亲和力常数以及每株抗体间的抗原表位竞争关系,通过免疫印迹的方法检测单个纳米抗体和10株纳米抗体混合物（TOP10MIX）对HepG2细胞的c-MET蛋白及其磷酸化水平的影响,结果显示TOP10MIX对癌细胞中c-MET蛋白的降解和去磷酸作用最强。随后本研究又检测了TOP10MIX对不同癌细胞的增殖和克隆形成能力的影响,结果显示TOP10MIX对不同癌细胞的抑制效果都非常显着。为了检测抗体数量更少的纳米抗体组合的癌细胞抑制效果,依据抗原表位竞争关系以及纳米抗体氨基酸序列CDR3区的差别,我们将10个纳米抗体分组,通过肿瘤细胞增殖抑制实验,最终确定包含不同抗体数目的最优组合分别为5G7、4G3、3G4和2G1。通过免疫印迹的方法检测5G7、4G3、3G4、2G1和TOP10MIX对HepG2中c-MET蛋白及其磷酸化水平的影响,结合其癌细胞增殖抑制能力,结果显示在体外癌细胞抑制实验中TOP10MIX的效果要显着优于2G1。3、TOP10MIX在动物肿瘤模型的作用和机理研究制备了总量约200mg的纯化后纳米抗体,检测了TOP10MIX对不同肿瘤细胞中c-MET及其磷酸化蛋白的影响,结果显示TOP10MIX同样可以诱发c-MET蛋白的降解并降低了磷酸化MET蛋白的水平,在动物肿瘤模型中具有很强的肿瘤抑制作用,通过肿瘤组织的免疫印迹检测,我们发现TOP10MIX在动物肿瘤模型中也可以诱发c-MET蛋白的降解且抑制c-MET蛋白的磷酸化。通过膜蛋白分离实验分析,我们发现c-MET的降解主要是通过膜蛋白的内吞实现的,而该内吞作用是网格蛋白介导的。与单价抗体5D5相比,TOP10MIX具有更强的肿瘤抑制作用。
二、纤维连接蛋白降解片段(MAD2)单抗的制备及肝细胞癌患者血浆含量检测（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、纤维连接蛋白降解片段(MAD2)单抗的制备及肝细胞癌患者血浆含量检测（论文提纲范文）
（1）第一部分：基于胆汁DNA中突变和甲基化的平行分析建立胆胰系统恶性肿瘤辅助诊断模型 第二部分：肠道微生物中有益菌群与晚期胸部肿瘤患者接受抗PD-1免疫治疗疗效相关性的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 第一部分 基于胆汁DNA中突变和甲基化的平行分析建立胆胰系统恶性肿瘤辅助诊断模型 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 临床样本 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 引物合成 |
| 2.4 Bilescreen靶向测序区域的选择和引物设计 |
| 2.5 Exkubit工作溶液的配制 |
| 2.6 活检组织基因组DNA提取 |
| 2.7 胆管细胞刷中脱落细胞基因组DNA提取 |
| 2.8 胆汁的分装和保存 |
| 2.9 胆汁沉淀基因组DNA提取 |
| 2.10 胆汁上清液中游离DNA提取 |
| 2.11 胆汁DNA中人源DNA质量评价 |
| 2.12 胆汁DNA中细菌来源DNA的质量评价 |
| 2.13 超声打断胆汁基因组DNA |
| 2.14 胆汁样本MC文库构建 |
| 2.15 测序数据的生物信息分析流程 |
| 2.16 胆汁16S rDNA V4扩增子测序 |
| 2.17 胆汁16S rDNA V4扩增子上机测序 |
| 2.18 胆汁16S rDNA V4扩增子数据分析 |
| 实验结果 |
| 1. 患者临床资料 |
| 2. 胆汁中DNA片段大小分布 |
| 3. 胆汁样本中细菌DNA和人源DNA质量评估 |
| 4. 胆汁DNA测序质控结果 |
| 5. 胆汁DNA与配对的活检组织/细胞刷样本的突变一致性分析 |
| 6. 胆胰系统恶性肿瘤辅助诊断模型(Bilescreen)的建立 |
| 6.1 训练数据集(Training set)模型的建立 |
| 6.2 验证数据集( Validation set)对Bilescreen模型的优化 |
| 6.3 以测试数据集(test set)评估Bilescreen模型泛化能力 |
| 6.4 Bilescreen的检测结果与血清CA19-9的检测结果比较分析 |
| 7. 胆汁中细菌16S rDNA V4扩增子测序结果分析 |
| 7.1 利用荧光定量PCR方法初步评估胆汁DNA中细菌DNA含量 |
| 7.2 胆汁中细菌16S rDNA V4扩增子文库构建 |
| 7.3 胆汁中微生物多样性的初步分析 |
| 7.4 良性组患者和恶性组患者的胆汁中微生物菌群差异分析 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 肠道微生物中有益菌群与晚期胸部肿瘤患者接受抗PD-1免疫治疗疗效相关性的研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 临床样本 |
| 1.2 主要耗材及试剂 |
| 2. 实验步骤 |
| 2.1 粪便样本采集 |
| 2.2 粪便样本中微生物DNA提取 |
| 2.3 粪便样本16S rDNA V4扩增子建库 |
| 2.4 粪便样本PCR2纯化产物质量评价 |
| 2.5 上机测序 |
| 2.6 肠道16S rDNA V4扩增子文库的生物信息学分析 |
| 2.7 统计方法 |
| 实验结果 |
| 1 临床资料 |
| 2 有效组和无效组患者基线便样品中肠道菌群多样性的比较分析 |
| 3 有效组和无效组患者基线便样本微生物组成成分分析 |
| 4 基线便样本中肠道共生菌混合物与免疫治疗疗效的关系 |
| 5 肠道菌群在抗PD-1免疫治疗过程中的变化情况 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 已发表与学位论文相关的英文论文 |
| 文献综述 肠道菌群与免疫治疗 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）第一部分：SNORD-X通过ILF2调控T细胞活性介导食管鳞癌免疫逃逸的分子机制研究 第二部分：miR-3653-5p调控细胞自噬抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭及迁移的分子机制研究（论文提纲范文）
| 第一部分 SNORD-X通过ILF2调控T细胞活性介导食管鳞癌免疫逃逸的分子机制研究 |
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 菌种 |
| 1.2 质粒 |
| 1.3 细胞株及培养条件 |
| 1.4 实验动物 |
| 1.5 人组织及血清来源 |
| 1.6 抗体 |
| 1.7 主要试剂盒 |
| 1.8 其他试剂 |
| 1.9 引物的设计及合成 |
| 1.10 其他序列 |
| 1.11 主要仪器设备 |
| 1.12 常用试剂的配制 |
| 1.13 生物学软件和网站 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞培养及处理 |
| 2.2 细胞瞬时转染 |
| 2.3 构建稳定转染细胞 |
| 2.4 细胞增殖实验 |
| 2.5 细胞侵袭迁移实验 |
| 2.6 细胞克隆形成实验 |
| 2.7 细胞总RNA提取、逆转录及RT-qPCR检测 |
| 2.8 质粒转化、提取 |
| 2.9 细胞总蛋白提取及蛋白质定量 |
| 2.10 蛋白质免疫印迹 |
| 2.11 RNA puldown |
| 2.12 RNA免疫沉淀(RNA Immunoprecipitation,RIP) |
| 2.13 免疫共沉淀 |
| 2.14 检测mRNA稳定性 |
| 2.15 外泌体的提取、观察以及鉴定 |
| 2.16 染色质免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP) |
| 2.17 双荧光素酶报告实验 |
| 2.18 Nanosight颗粒跟踪分析 |
| 2.19 裸鼠实验 |
| 2.20 统计分析 |
| 实验结果 |
| 1. SNORD-X在PD-1抑制剂治疗食管鳞癌的疾病进展组患者血清中高表达 |
| 2. SNORD-X在食管鳞癌中异常高表达 |
| 2.1 SNORD-X在食管鳞癌基因芯片转移组织中高表达 |
| 2.2 SNORD-X在食管鳞癌组织中高表达 |
| 2.3 SNORD-X高表达与食管鳞癌的淋巴结转移成正比 |
| 2.4 SNORD-X在食管鳞癌患者血清中高表达 |
| 3. SNORD-X促进食管鳞癌细胞恶性表型的形成 |
| 3.1 SNORD-X的基本信息 |
| 3.2 SNORD-X所在区域在食管鳞癌中扩增 |
| 3.3 SNORD-X的宿主基因GAS5在食管鳞癌中表达没有明显变化 |
| 3.4 SNORD-X在食管鳞癌细胞中高表达,并可独立发挥作用 |
| 3.5 SNORD-X敲降及过表达效率验证 |
| 3.6 SNORD-X促进食管鳞癌细胞的增殖 |
| 3.7 SNORD-X促进食管鳞癌细胞的侵袭迁移 |
| 3.8 SNORD-X促进食管鳞癌细胞的克隆形成能力 |
| 4. SNORD-X促进食管鳞癌细胞的皮下成瘤及体内转移能力 |
| 4.1 稳定敲降SNORD-X细胞的构建与验证 |
| 4.2 稳定敲降SNORD-X抑制食管鳞癌皮下成瘤能力 |
| 4.3 稳定敲降SNORD-X抑制食管鳞癌体内转移能力 |
| 5. SNORD-X可通过特异性结合ILF2降低其稳定性 |
| 5.1 RNA pull down联合质谱技术筛选与SNORD-X结合的蛋白 |
| 5.2 SNORD-X可与ILF2特异性结合 |
| 5.3 SNORD-X正向调控ILF2的蛋白表达水平 |
| 5.4 SNORD-X不影响ILF2的mRNA表达水平 |
| 5.5 SNORD-X可以将ILF2稳定在核内,阻止其泛素化降解 |
| 6. SNORD-X抑制食管鳞癌细胞IL2的mRNA和蛋白表达 |
| 6.1 IL2在IL2 mRNA的降解 |
| 6.2 SNORD-X降低IL2的mRNA表达水平 |
| 6.3 SNORD-X降低IL2的蛋白表达水平 |
| 6.4 SNORD-X降低IL2启动子区的转录活性 |
| 6.5 SNORD-X促进泌体中SNORD-X抑制T细胞IL2的表达 |
| 7.外泌体中SNORD-X抑制T细胞IL2的表达 |
| 7.1 食管鳞癌细胞外泌体中含有SNORD-X,并且外泌体含量几乎与血液中含量相等 |
| 7.2 SNORD-X抑制Jurkat细胞中IL2的表达 |
| 8. SNORD-X发挥功能的模式图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 不足与展望 |
| 第二部分 miR-3653-5p调控细胞自楼抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭及迁移的分子机制研究 |
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 菌种 |
| 1.2 质粒 |
| 1.3 细胞株及培养条件 |
| 1.4 抗体 |
| 1.5 主要试剂(盒) |
| 1.6 引物的设计及合成 |
| 1.7 其他序列 |
| 1.8 主要仪器设备 |
| 1.9 常用试剂的配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 免疫荧光 |
| 2.2 CCK-8实验 |
| 2.3 裸鼠转移实验 |
| 实验结果 |
| 1. miR-3653-5p在乳腺癌中表达下调 |
| 1.1 miR-3653-5p在乳腺癌组织中异常低表达 |
| 1.2 miR-3653-5p在多种癌种中异常表达 |
| 1.3 miR-3653-5p在淋巴结转移组织中低表达 |
| 1.4 miR-3653-5p低表达与乳腺癌患者预后不良相关 |
| 1.5 miR-3653-5p在乳腺癌细胞中低表达 |
| 2. miR-3653-5p抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭迁移以及克隆形成 |
| 2.1 miR-3653-5p敲降及过表达效率验证 |
| 2.2 miR-3653-5p抑制乳腺癌细胞的增殖 |
| 2.3 miR-3653-5p抑制乳腺癌细胞的侵袭与迁移 |
| 2.4 miR-3653-5p抑制乳腺癌细胞的克隆形成 |
| 3. 过表达miR-3653-5p抑制乳腺癌细胞的体内转移 |
| 3.1 稳定过表达miR-3653-5p乳腺癌细胞的构建与验证 |
| 3.2 稳定过表达miR-3653-5p抑制乳腺癌细胞增殖 |
| 3.3 稳定过表达miR-3653-5p抑制乳腺癌细胞侵袭与迁移 |
| 3.4 稳定过表达miR-3653-5p抑制乳腺癌细胞克隆形成 |
| 3.5 稳定过表达miR-3653-5p抑制乳腺癌体内转移能力 |
| 4. miR-3653-5p能够靶向ATG12和AMBRA 1发挥作用 |
| 4.1 筛选miR-3653-5p可能靶向的蛋白 |
| 4.2 miR-3653-5p能够直接与ATG12和AMBRA1的3'UTR结合 |
| 4.3 miR-3653-5p抑制ATG12和AMBRA1的mRNA表达 |
| 4.4 miR-3653-5p抑制ATG12和AMBRA1的蛋白表达 |
| 4.5 ATG12和AMBRA1在乳腺癌细胞系中表达情况 |
| 4.6 ATG12和AMBRA1在乳腺癌组织中异常高表达 |
| 4.7 ATG12和AMBRA1高表达与乳腺癌患者预后不良相关 |
| 4.8 乳腺癌组织中ATG12和AMBRA1表达与miR-3653-5p表达呈负相关 |
| 5. miR-3653-5p能够抑制乳腺癌细胞自噬水平 |
| 6. miR-3653-5p能够靶向ATG12和AMBRA1抑制乳腺癌细胞恶性表型 |
| 6.1 miR-3653-5p能够靶向ATG12和AMBRA1抑制乳腺癌细胞增殖 |
| 6.2 miR-3653-5p通过靶向ATG12和AMBRA1抑制乳腺癌细胞的侵袭与迁移 |
| 6.3 miR-3653-5p通过靶向ATG12和AMBRA1抑制乳腺癌细胞的克隆形成 |
| 7. miR-3653-5p能够靶向ATG12和AMBRA1抑制乳腺癌细胞自噬水平 |
| 8. miR-3653-5p通过靶向ATG12和AMBRA1抑制EMT过程 |
| 9. miR-3653-5p低表达增加乳腺癌细胞对氯喹的敏感性 |
| 9.1 氯喹处理miR-3653-5p低表达乳腺癌细胞的IC50值更低 |
| 9.2 miR-3653-5p低表达乳腺癌细胞在氯喹处理后细胞活力更低 |
| 9.3 miR-3653-5p低表达增加乳腺癌细胞对氯喹抑制增殖的敏感性 |
| 9.4 miR-3653-5p低表达增加乳腺癌细胞对氯喹抑制克隆形成的敏感性 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| SnoRNAs主要功能概述(文献综述) |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 致谢 |
（3）肝星状细胞来源的旁分泌信号分子IL-11促进肝细胞癌进展的机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验细胞 |
| 2.3 构建的质粒及细胞株 |
| 2.4 药品与试剂 |
| 2.4.1 抗体 |
| 2.4.2 细胞培养相关试剂 |
| 2.4.3 细胞处理相关试剂 |
| 2.4.4 分子生物学相关试剂 |
| 2.4.5 生化实验相关试剂 |
| 2.4.6 动物实验相关试剂 |
| 2.5 主要仪器与设备 |
| 2.6 qPCR引物序列 |
| 2.7 本文所使用的专业数据处理软件 |
| 2.8 本文所使用的统计方法 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 分子克隆实验 |
| 3.1.1 感受态细胞的制备 |
| 3.1.2 质粒构建过程 |
| 3.1.3 从cDNA文库钓取基因 |
| 3.2 细胞实验 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 细胞冻存和复苏 |
| 3.2.3 人外周血中性粒细胞的提取和纯化 |
| 3.2.4 过表达细胞株的构建 |
| 3.2.5 Knock out细胞株的构建 |
| 3.2.6 siRNA敲低实验 |
| 3.2.7 LX2 细胞条件培养基的制备 |
| 3.2.8 肝癌细胞磷酸化实验 |
| 3.2.9 免疫印迹Western Blot(WB)实验 |
| 3.2.10 荧光定量PCR实验(RT-qPCR) |
| 3.2.11 中性粒细胞Transwell实验 |
| 3.2.12 中性粒细胞NETs释放实验 |
| 3.3 小鼠IL11(m IL11)重组蛋白体外纯化实验 |
| 3.4 动物实验 |
| 3.4.1 裸鼠皮下瘤实验 |
| 3.4.2 小鼠肝纤维化模型的建立 |
| 3.4.3 Hepa1-6 细胞肝脏原位移植瘤模型的建立 |
| 3.4.4 IL-11 小鼠单克隆中和抗体的制备 |
| 3.4.5 石蜡切片免疫组织化学染色 |
| 3.4.6 石蜡切片RNA-FISH实验 |
| 4 结果 |
| 4.1 活化的HSCs促进HCCs增殖和转移 |
| 4.1.1 EGFP-HCCLM3和m Cherry-LX2 细胞系共培养及分选后进行RNA-seq测序 |
| 4.1.2 RNA-seq结果的分析 |
| 4.1.3 Luciferase-HCCLM3和LX2 细胞共培养后的裸鼠皮下瘤实验 |
| 4.2 活化的肝星状细胞通过旁分泌IL11 促进肝癌细胞增殖和转移 |
| 4.2.1 肝星状细胞来源的条件培养基(Condition medium,CM)引起肝癌细胞内磷酸化水平变化的实验 |
| 4.2.2 RNA-seq检测肝星状细胞激活前后的基因转录水平的变化 |
| 4.2.3 肝星状细胞LX2 来源的条件培养基CM的蛋白质质谱分析 |
| 4.2.4 体外实验验证IL11 在肝星状细胞内特异性表达及其对肝癌细胞的影响 |
| 4.2.5 体内实验验证IL11 对肝癌细胞生长和转移的影响 |
| 4.3 IL11 促进中性粒细胞趋化并诱导其释放NETs |
| 4.3.1 IL11 引起裸鼠血液内嗜中性粒细胞增多 |
| 4.3.2 IL11 可以诱导中性粒细胞趋化 |
| 4.3.3 重组小鼠IL11(rm IL11)的表达与纯化及在体内诱导中性粒细胞趋化 |
| 4.3.4 IL11 是一种强中性粒细胞NETs释放的诱导剂 |
| 4.3.5 人肝癌组织标本内可以检测到大量IL11 在癌巢周围分布 |
| 4.3.6 RNA-FISH实验验证IL11 在人肝癌组织内由肝星状细胞特异性分泌 |
| 4.3.7 IL11 高表达的肝癌组织内存在大量中性粒细胞浸润,且这些中性粒细胞大量释放NETs |
| 4.4 靶向IL11 和中性粒细胞干预肝细胞癌进展 |
| 4.4.1 IL11 在小鼠肝纤维化时期开始表达升高,并特异性由肝星状细胞分泌 |
| 4.4.2 小鼠肝癌细胞He Pa1-6 的皮下及原位肝癌移植瘤实验 |
| 4.4.3 IL11 中和抗体的制备与功能验证 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 7 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 关于靶向肝星状细胞治疗肝细胞癌的研究进展 |
| 参考文献 |
（4）光声成像联合肝癌靶向分子探针在非规则肝切除术中导航的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 光声探针IR820-E[c(RGDfK)]2的设计、合成及体外显像中的研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 参考文献 |
| 第二章 IR820-E[c(RGDfK)]2用于光声成像技术指导下的非规则肝脏切除术的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 参考文献 |
| 第三章 光声探针IR820-E[c(RGDfK)]2的在体光学成像的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 参考文献 |
| 第四章 人肝癌标本的离体三维光声成像检测 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 参考文献 |
| 总结与展望 |
| 总结 |
| 展望 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（5）肝癌中lncRNA OIP5-AS1和miR-302调控机制及洛那法尼联合Degrasyn疗效研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肝癌的现状 |
| 1.2 非编码RNA概述 |
| 1.2.1 lncRNA及其在肿瘤发生发展中的作用 |
| 1.2.2 MicroRNA及其在肿瘤发生发展中的作用 |
| 1.3 小分子靶向药物在肝癌中的研究进展 |
| 1.4 洛那法尼与Degrasyn在肿瘤研究中的应用 |
| 第二章 lncRNA OIP5-AS1 在肝癌中的作用与机制 |
| 2.1 引言 |
| 2.1.1 lncRNA OIP5-AS1与肝癌 |
| 2.1.2 研究目标 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.2.1 肝癌中明显表达失调的lncRNAs鉴定 |
| 2.2.2 lncRNA OIP5-AS1敲低细胞系 |
| 2.2.3 lncRNA OIP5-AS1作用体外实验检测 |
| 2.2.4 探讨lncRNA OIP5-AS1对hsa-miR-26a-3p的调控 |
| 2.2.5 lncRNA OIP5-AS1参与hsa-miR-26a-3p对EPHA2调控机制 |
| 2.2.6 明确lncRNA OIP5-AS1、hsa-miR-26a-3p和EPHA2相互关系 |
| 2.2.7 lncRNA OIP5-AS1和hsa-miR-26a-3p体内成瘤实验 |
| 2.2.8 验证肝癌中三者的表达相关性及其临床意义 |
| 2.3 材料与方法 |
| 2.3.1 试剂与耗材 |
| 2.3.2 主要实验设备 |
| 2.3.3 组织样本和细胞系与动物 |
| 2.3.4 实验方法 |
| 2.3.5 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 肝癌中失调lncRNA的鉴定 |
| 2.4.2 肝癌中lncRNA明显失调的验证 |
| 2.4.3 肝癌组织和细胞系lncRNA OIP5-AS1 的表达 |
| 2.4.4 干扰lncRNA OIP5-AS1抑制细胞增殖和体外侵袭能力 |
| 2.4.5 lncRNA OIP5-AS1 是调节hsa-miR-26a-3p的分子海绵 |
| 2.4.6 hsa-miR-26a-3p在肝癌患者中的表达及其预后价值评估 |
| 2.4.7 lncRNA OIP5-AS1 负调控hsa-miR-26a-3p促进细胞增殖和侵袭 |
| 2.4.8 lncRNA OIP5-AS1 充当hsa-miR-26a-3p ce RNA调控EPHA2 |
| 2.4.9 敲低lncRNA OIP5-AS1 抑制体内肿瘤发生 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 miR-302a/d在肝癌干细胞中的作用机制 |
| 3.1 引言 |
| 3.1.1 miR-302家族与肝癌 |
| 3.1.2 研究目标 |
| 3.2 研究内容 |
| 3.2.1 HCC细胞系的肿瘤球体外形成和鉴定 |
| 3.2.2 miR-302a/d,RNAi和E2F7过表达细胞系构建与鉴定 |
| 3.2.3 miR-302a/d作用体外实验检测作用体外实验检测 |
| 3.2.4 miR-302a/d和E2F7相互关系裸鼠体内成瘤实验 |
| 3.2.5 验证肝癌中miR-302a/d和E2F7表达相关性及其临床意义 |
| 3.3 材料与方法 |
| 3.3.1 试剂与耗材 |
| 3.3.2 主要实验设备 |
| 3.3.3 组织样本和细胞系与动物 |
| 3.3.4 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 HCC细胞系的肿瘤球的体外形成和鉴定 |
| 3.4.2 miRNA芯片分析表明,miR-302 家族参与LCSC干性维持 |
| 3.4.3 LCSC的分化和CSC标志物表达 |
| 3.4.4 miR-302a/d抑制HCC细胞的增殖和球体形成并促进细胞凋亡 |
| 3.4.5 miR-302a/d直接靶向HCC细胞E2F7 |
| 3.4.6 E2F7在LCSC形成和分化中的表达 |
| 3.4.7 miR-302a/d通过抑制细胞周期进入来抑制LCSC干性 |
| 3.4.8 E2F7激活AKT1细胞周期蛋白D1信号和下游细胞周期 |
| 3.4.9 miR-302a/d协同E2F7 调控β-catenin/CCND1 信号转导 |
| 3.4.10 miR-302a/d和E2F7 在肝癌中的表达及相关性 |
| 3.4.11 miR-302a/d和E2F7在LCSC中的表达及相关性 |
| 3.4.12 miR-302a/d和E2F7在肝癌中的临床意义 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 洛那法尼联合Degrasyn治疗作用初探 |
| 4.1 引言 |
| 4.1.1 肝癌治疗 |
| 4.1.2 研究目标 |
| 4.2 研究内容 |
| 4.2.1 繁殖和鉴定自发成瘤肝癌小鼠 |
| 4.2.2 洛那法尼联合Degrasyn对HCC自发成瘤小鼠疗效的观察 |
| 4.2.3 洛那法尼联合Degrasyn作用于HCC自发成瘤小鼠机制探 |
| 4.3 材料与方法 |
| 4.3.1 试剂与耗材 |
| 4.3.2 主要实验设备 |
| 4.3.3 实验动物 |
| 4.3.4 实验方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 Alb-c Myc小鼠基因型鉴定 |
| 4.4.2 Alb-c Myc小鼠表型及洛那法尼联合Degrasyn治疗效果探讨 |
| 4.4.3 洛那法尼联合Degrasyn对小鼠器官组织的影响 |
| 4.4.4 Alb-c Myc自发成瘤肝癌小鼠分子检测 |
| 4.4.5 洛那法尼联合Degrasyn治疗对相关分子的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 肝癌非编码 RNA 调控机制及相关药物研发进展 |
| 主要参考文献 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简历及在读期间取得的科研成果 |
| 附件 |
（6）人参皂苷及融合毒素的生物活性研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一篇 人参皂苷的化学成分及生物活性研究 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 二氢类天然产物的研究进展 |
| 1.1.1 二氢类天然产物的化学研究 |
| 1.1.2 二氢类天然产物的生物活性研究 |
| 1.2 人参皂苷的结构修饰研究进展 |
| 1.2.1 降解反应 |
| 1.2.2 对C-17 位侧链的修饰 |
| 1.2.3 取代反应 |
| 1.2.4 开环反应 |
| 1.3 天然产物小分子减毒的研究进展 |
| 1.3.1 对顺铂毒副作用的减毒作用 |
| 1.3.2 对环磷酰胺副作用的减毒作用 |
| 1.4 立题依据与研究思路 |
| 1.4.1 立题依据 |
| 1.4.2 研究思路 |
| 1.5 本文拟解决的科学问题 |
| 第2章 人参皂苷(元)化学成分、结构修饰及生物活性研究 |
| 2.1 林下山参“珍珠疙瘩”化学成分及生物活性研究 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 实验结果 |
| 2.1.4 小结与讨论 |
| 2.2 拟人参皂苷 12-酮-F11的分离及生物活性研究 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 2.2.4 小结与讨论 |
| 2.3 人参皂苷(元)的结构修饰研究 |
| 2.3.1 实验材料 |
| 2.3.2 实验方法 |
| 2.3.3 结构解析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 人参皂苷Rh_2对顺铂诱导肾毒性的保护作用研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 药品与试剂 |
| 3.1.3 仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 肾损伤疾病模型的建立及药物评价 |
| 3.2.2 肿瘤模型的建立及药物评价 |
| 3.2.3 数据分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 对肾脏功能的保护作用 |
| 3.3.2 对氧化应激的影响 |
| 3.3.3 对肾脏组织病理学损伤的影响 |
| 3.3.4 对炎症反应的影响 |
| 3.3.5 对肾小管细胞凋亡的影响 |
| 3.3.6 对caspase介导的信号通路的调节作用 |
| 3.3.7 抗肾损伤靶点预测 |
| 3.3.8 抗肾损伤的代谢组学分析 |
| 3.3.9 联合给药的抗肿瘤药效学研究 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第4章 人参皂苷Rh_2及衍生物的免疫调节和抗肿瘤作用研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 药品与试剂 |
| 4.1.3 仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 免疫抑制模型的建立及药物评价 |
| 4.2.2 荷瘤小鼠模型的建立及药物抗肿瘤活性评价 |
| 4.2.3 数据分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 对免疫功能的调节作用 |
| 4.3.2 抗肿瘤活性研究 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第二篇 融合毒素的构建及靶向治疗头颈部鳞状细胞癌的研究 |
| 第5章 重组人表皮生长因子融合毒素的构建 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 试剂与耗材 |
| 5.1.2 仪器 |
| 5.1.3 主要载体与宿主菌 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 质粒构建 |
| 5.2.2 酵母蛋白表达系统的构建 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 重组质粒的鉴定 |
| 5.3.2 重组蛋白的鉴定 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 融合毒素靶向治疗头颈部鳞状细胞癌的研究 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 实验动物 |
| 6.1.2 试剂与耗材 |
| 6.1.3 仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 药物体外功能试验 |
| 6.2.2 药物体内功能试验 |
| 6.2.3 数据分析 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 EGFR单靶点药物体外功能分析 |
| 6.3.2 EGFR单靶点药物体内功能分析 |
| 6.3.3 双特异性药物体外功能分析 |
| 6.3.4 双特异性药物体内功能分析 |
| 6.4 小结与讨论 |
| 第7章 总结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（7）高、低转移肝癌细胞系外显子测序及进化分析（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞培养 |
| 1.2 DNA提取 |
| 1.3 DNA样本评估及全外显子测序 |
| 1.4 Oncotator注释突变体 |
| 1.5 三株细胞的进化树以及突变基因分布 |
| 1.6 功能富集分析 |
| 1.7 蛋白质网络互作分析 |
| 1.8 HUB基因突变与HCC病人预后关联分析 |
| 1.9 HCC中 HUB基因的表达与病人预后关联分析 |
| 1.10 三株细胞的差异蛋白质中的基因突变分析 |
| 1.11 突变基因KEAP1 分析及PCR验证 |
| 2 结果 |
| 2.1 根据WES分析三株细胞的突变情况 |
| 2.2 肿瘤驱动突变基因和致癌信号通路上的突变情况 |
| 2.3 三株细胞的共有突变基因分析 |
| 2.4 三株细胞的特有突变基因分析 |
| 2.5 HCC中 HUB基因的表达与病人预后关联分析 |
| 2.6 三株细胞差异蛋白质中的基因突变分析 |
| 2.7 突变KEAP1 基因分析和PCR验证 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 肝癌的主要驱动基因与肿瘤 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 参与的课题项目 |
（8）HCV和HBV的特异性T细胞免疫反应和分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 ABSTRACT 第一部分 研究内容 |
| 第一章 聚集性献血导致的HCV感染的T细胞免疫研究 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.2.1 主要实验仪器 |
| 1.2.2 主要实验试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 研究对象 |
| 1.3.2 血样的采集与处理 |
| 1.3.3 抗HCV抗体的定性检测 |
| 1.3.4 临床信息的获得 |
| 1.3.5 HCV基因分型 |
| 1.3.6 HCV RNA足量 |
| 1.3.7 HCV多肽库的设计与合成 |
| 1.3.8 HCV特异性T细胞的刺激及流式分析 |
| 1.3.9 统计分析 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 研究对象的人口学特征 |
| 1.4.2 研究对象的临床特征 |
| 1.4.3 HCV慢性感染者的病毒特征 |
| 1.4.4 HCV病毒清除组与HCV慢性感染组有持续的CD8~+T细胞及CD4~+T细胞应答 |
| 1.4.5 多因子分泌 |
| 1.4.6 HCV特异性T细胞的表型特征 |
| 1.4.7 免疫抑制分子的表达特点 |
| 1.4.8 T细胞免疫与肝功能 |
| 1.5 小结与讨论 |
| 第二章 聚集性献血感染HCV的分子生物学研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 主要的试剂及耗材 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 HCV RNA提取 |
| 2.3.2 RNA反转录 |
| 2.3.3 全序列引物设计及测序 |
| 2.3.4 序列组装及分析 |
| 2.3.5 二代测序 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 HCV病毒基因组的各片段反转录PCR结果 |
| 2.4.2 HCV病毒5'/3' RACE扩增结果 |
| 2.4.3 全基因序列拼接 |
| 2.4.4 序列同源性分析及进化分析 |
| 2.4.5 二代测序 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 第三章 盐桥在HBV特异性多肽呈递和T细胞识别中的作用机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验主要仪器 |
| 3.2.2 主要实验耗材及商品试剂 |
| 3.2.3 实验试剂及其配方 |
| 3.2.4 实验动物、菌株、载体 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 实验所用的多肽合成和载体构建 |
| 3.3.2 H-2K~d-HBV多肽免疫小鼠及脾细胞的获得 |
| 3.3.3 ELISPOT实验 |
| 3.3.4 H-2K~d和HLA-B~*4001分子的表达与纯化 |
| 3.3.5 HLA-B*4001-peptide(GETALALLLL)的结晶条件的筛选 |
| 3.3.6 HLA-B*4001 Χ-射线衍射及结构解析 |
| 3.3.7 圆二色谱实验检测H-2K~d-HBVpeptide的热稳定性 |
| 3.3.8 H-2K~d-HBV peptide四聚体的制备及流式染色 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 H-2K~d分子和HLA-B~*4001-分子的蛋白纯化 |
| 3.4.2 探究H-2K~d/HLA-B~*4001野生型/突变体与多肽的结合能力 |
| 3.4.3 探究H-2-K~d野生型及突变体结合多肽识别TCR |
| 3.4.4 H-2K~d和HLA-B~*4001形成的两种不同的盐桥 |
| 3.4.5 盐桥对MHCI和结合肽的结构构象的影响 |
| 3.4.6 潜在盐桥广泛存在不同脊椎动物中 |
| 3.5 讨论 第二部分 文献综述 |
| 第四章 HCV病毒及细胞免疫概述 |
| 4.1 HCV病毒的流行病学及临床 |
| 4.1.1 HCV的流行 |
| 4.1.2 HCV的临床表现 |
| 4.1.3 HCV病毒的检测和实验室诊断 |
| 4.1.4 HCV的防控及治疗 |
| 4.2 HCV病毒的基本特征 |
| 4.2.1 HCV病毒的形态特征 |
| 4.2.2 HCV病毒的基因组成及全基因组测序 |
| 4.2.3 HCV病毒的生活周期 |
| 4.2.4 HCV病毒的传播及变异 |
| 4.3 HCV病毒感染的免疫反应特征 |
| 4.3.1 血清学反应 |
| 4.3.2 T细胞免疫 |
| 第五章 MHC分子结构免疫学概述 |
| 5.1 MHC的概念 |
| 5.2 MHC的抗原呈递及T细胞识别 |
| 5.2.1 MHCⅠ类途径 |
| 5.2.2 MHCⅡ类途径 |
| 5.2.3 外源抗原的MHCⅠ类途径交叉呈递 |
| 5.3 MHC及相关分子的结构特征 |
| 5.3.1 MHCⅠ类分子的结构特征 |
| 5.3.2 MHCⅡ类分子的结构 |
| 5.3.3 非经典的MHCⅠ类分子结构 |
| 5.4 MHC分子结构在T细胞免疫研究中的应用 |
| 5.4.1 MHC结构研究对于MHC分子分类的影响-HLA超级型及其意义 |
| 5.4.2 MHC分子对TCR识别的限制性 |
| 5.4.3 MHC交叉呈递和TCR交叉识别的结构基础 全文总结 参考文献 附录1 缩略表 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文 致谢 |
（9）Ⅰ.microRNA介导的内皮型一氧化氮合酶和胰岛素受体底物蛋白2之间的相互调节 Ⅱ.软骨寡聚基质蛋白COMP可以通过与integrinα5相互作用抑制内皮激活（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、对象和方法 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.1.1 常用的普通化学试剂 |
| 1.1.2 抗体 |
| 1.1.3 细胞分离和培养相关试剂 |
| 1.1.4 RNA提取,逆转录和实时定量荧光PCR(qRT-PCR)相关试剂 |
| 1.1.5 蛋白质提取和免疫蛋白印迹(Western Blotting)实验相关试剂 |
| 1.1.6 质粒的构建及荧光素酶活性检测相关试剂 |
| 1.1.7 小分子干扰RNA和微小RNA的转染技术相关试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.3.1 分离原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)相关试剂的配制 |
| 1.3.2 细胞培养相关试剂的配制 |
| 1.3.3 免疫蛋白质印迹实验相关试剂的配制 |
| 1.3.4 质粒转化相关试剂的配制 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 原代人脐静脉内皮细胞的分离与培养 |
| 1.4.2 RNA的提取与定量(以6 孔板为例) |
| 1.4.3 实时定量荧光PCR分析 |
| 1.4.4 蛋白质提取与定量 |
| 1.4.5免疫蛋白印迹实验 |
| 1.4.6 荧光素酶报告基因质粒的构建 |
| 1.4.7 质粒与miRNAs共转染和luciferase活性检测 |
| 1.4.8 siRNA介导的细胞内源性基因沉默 |
| 1.4.9 剪切力流室系统的建立(层流系统) |
| 1.4.10 一氧化氮的检测 |
| 1.4.11 统计方法 |
| 1.5 临床样本信息 |
| 二、结果 |
| 2.1 通过生物信息学手段筛查e NOS的 ce RNA |
| 2.1.1 生物信息学方法分析调控e NOS的 miRNAs和 ce RNA |
| 2.1.2 筛选与e NOS有疾病关联性的ce RNA |
| 2.2 eNOS-ceRNAS中有7 个与e NOS具体显着相关性 |
| 2.3 eNOS和 IRS2 之间的相互调节是依赖于miRNAS的桥梁作用 |
| 2.3.1 siRNA敲除e NOS或 IRS2 后,IRS2或eNOS的表达随之降低,且这种降低依赖于miRNAs |
| 2.3.2 通过层流在转录水平上调e NOS的表达,IRS2 的表达随之增加,且这种增加依赖于miRNAs |
| 2.4 miR-15b,miR-16和miR-30b在转录水平上调控e NOS和IRS2 的表达。 |
| 2.4.1 体外合成miR-15b,miR-16和miR-30b的类似物和抑制剂并验证其效果 |
| 2.4.2 miR-15b,miR-16和miR-30b在转录水平上调控e NOS和IRS2 的表达 |
| 2.4.3 miR-15b,miR-16和miR-30b负向调控e NOS和IRS2 的表达 |
| 2.5 eNOS和 e NOS-ceRNA IRS2 在功能上相互调节。 |
| 2.5.1 IRS2 的缺陷引起一氧化氮NO的释放减少 |
| 2.5.2 eNOS的缺陷引起胰岛素信号通路中AKT磷酸化受阻 |
| 三、讨论 |
| 论文第一部分结论 |
| 论文第一部分创新点 |
| 第二部分 |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、对象和方法 |
| 1.5 实验试剂 |
| 1.5.1 常用的普通化学试剂 |
| 1.5.2 抗体 |
| 1.5.3 细胞分离和培养相关试剂 |
| 1.5.4 RNA提取,逆转录和实时定量荧光PCR(qRT-PCR)相关试剂 |
| 1.5.5 蛋白质提取和免疫蛋白质印迹(Western Blotting)相关试剂 |
| 1.5.6 脂质提取试剂盒 |
| 1.5.7 其它主要试剂 |
| 1.6 主要试剂配制 |
| 1.6.1 分离原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)及细胞培养相关试剂的配制 |
| 1.6.2 1640 培养基的配制 |
| 1.6.3 COMP纯化相关试剂的配制 |
| 1.6.3.1 Tris缓冲盐溶液 |
| 1.6.3.2 洗脱液 |
| 1.6.4 Western Blotting相关试剂的配制 |
| 1.6.5 CO-IP相关试剂(IP缓冲液)的配制 |
| 1.6.6 4%多聚甲醛的配置 |
| 1.6.7 油红O染液 |
| 1.7 实验仪器 |
| 1.8 实验方法 |
| 1.8.1 细胞分离与培养 |
| 1.8.2 纯化COMP蛋白制备 |
| 1.8.3单核细胞黏附实验 |
| 1.8.4 分子克隆 |
| 1.8.5 免疫共沉淀实验 |
| 1.8.6 哺乳动物双杂交实验 |
| 1.8.7 剪切力流室系统的建立(湍流系统) |
| 1.8.8 蛋白质提取与定量及Western Blotting |
| 1.8.9 RNA的提取与定量及实时定量PCR技术 |
| 1.8.10 引物序列 |
| 1.8.11 小鼠左颈总动脉部分结扎术(在体模拟湍流模型) |
| 1.8.12 组织取材 |
| 1.8.13 血管en face/切片免疫荧光染色 |
| 1.8.14 免疫组化染色 |
| 1.8.15 生化指标检查 |
| 1.9 实验动物 |
| 1.9.1 COMP~(-/-)小鼠的基因鉴定 |
| 1.9.2 SMC-COMP Tg小鼠的基因鉴定 |
| 1.9.3 24肽干预饮食诱导的ApoE~(-/-)小鼠动脉粥样硬化实验 |
| 1.9.4 统计方法 |
| 二、结果 |
| 2.6 基质细胞蛋白COMP可抑制内皮激活 |
| 2.6.1 基质细胞蛋白COMP可抑制湍流引起的内皮细胞的激活 |
| 2.6.2 生理状态下COMP~(-/-)小鼠血管内皮激活标志物表达上调 |
| 2.6.3 病理状态下COMP~(-/-)小鼠血管内皮激活标志物表达上调 |
| 2.6.4 体外COMP纯化蛋白可抑制湍流引起的内皮细胞炎症反应 |
| 小结 |
| 2.7 COMP通过其TYP3和C-端结构域与integrinα5 相互结合 |
| 2.7.1 COMP可以与内皮激活相关的integrinα5 相互作用 |
| 2.7.2 COMP可通过其TYP3和C端结构域与integrinα5 相互作用 |
| 2.7.3 敲除COMP在 integrinα5 上的结合区域后,二者之间不再存在相互作用 |
| 小结 |
| 2.8 COMP可抑制integrinα5 信号通路 |
| 2.8.1 在体实验中,COMP可抑制integrinα5 的激活以及其下游FAK和 Src的磷酸化水平 |
| 2.8.2 COMP可抑制由湍流(OSS)或纤维连接蛋白(FN)引起的integrinα5的激活以及其下游FAK和 Src的磷酸化水平 |
| 小结 |
| 2.9 体外合成的源于COMP的短肽可抑制内皮激活 |
| 2.9.1 体外合成的短肽可抑制integrinα5 的激活以及其下游FAK和 Src的磷酸化水平 |
| 2.9.2 体外合成的短肽可抑制integrinα5 与纤维连接蛋白FN的相互作用 |
| 2.9.3 24 肽减缓西方饮食诱导的动脉粥样硬化 |
| 2.9.4 24 肽减缓ApoE~(-/-)小鼠主动脉流出道斑块损伤面积和脂质沉积 |
| 小结 |
| 三、讨论 |
| 论文第二部分结论 |
| 论文第二部分创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 软骨寡聚基质蛋白COMP在心血管系统中的保护性作用 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）抗c-MET纳米抗体的抗肿瘤作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 HGF/c-MET信号通路及其研究现状 |
| 1.2 纳米抗体及其研究进展 |
| 1.3 主要研究内容和意义 |
| 第二章 抗c-MET纳米抗体噬菌体文库的构建、鉴定和筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料、仪器与试剂 |
| 2.3 方法与步骤 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 抗c-MET纳米抗体的原核表达、表征和功能分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料、仪器与试剂 |
| 3.3 方法与步骤 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 TOP10MIX在动物肿瘤模型中作用研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料、仪器和试剂 |
| 4.3 方法和步骤 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 主要科研成果 |
四、纤维连接蛋白降解片段(MAD2)单抗的制备及肝细胞癌患者血浆含量检测（论文参考文献）
- [1]第一部分：基于胆汁DNA中突变和甲基化的平行分析建立胆胰系统恶性肿瘤辅助诊断模型 第二部分：肠道微生物中有益菌群与晚期胸部肿瘤患者接受抗PD-1免疫治疗疗效相关性的研究[D]. 殷慧慧. 北京协和医学院, 2021
- [2]第一部分：SNORD-X通过ILF2调控T细胞活性介导食管鳞癌免疫逃逸的分子机制研究 第二部分：miR-3653-5p调控细胞自噬抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭及迁移的分子机制研究[D]. 宋华琛. 北京协和医学院, 2021
- [3]肝星状细胞来源的旁分泌信号分子IL-11促进肝细胞癌进展的机制研究[D]. 毕意辉. 安徽医科大学, 2021(01)
- [4]光声成像联合肝癌靶向分子探针在非规则肝切除术中导航的应用研究[D]. 张月明. 南方医科大学, 2021
- [5]肝癌中lncRNA OIP5-AS1和miR-302调控机制及洛那法尼联合Degrasyn疗效研究[D]. 马雨水. 华东师范大学, 2020(02)
- [6]人参皂苷及融合毒素的生物活性研究[D]. 祁增. 吉林大学, 2020(08)
- [7]高、低转移肝癌细胞系外显子测序及进化分析[D]. 李祖俐. 重庆医科大学, 2020(02)
- [8]HCV和HBV的特异性T细胞免疫反应和分子机制研究[D]. 纪伟. 中国疾病预防控制中心, 2019(12)
- [9]Ⅰ.microRNA介导的内皮型一氧化氮合酶和胰岛素受体底物蛋白2之间的相互调节 Ⅱ.软骨寡聚基质蛋白COMP可以通过与integrinα5相互作用抑制内皮激活[D]. 吕慧珍. 天津医科大学, 2019(02)
- [10]抗c-MET纳米抗体的抗肿瘤作用研究[D]. 苏志鹏. 东南大学, 2019