一、改造的腺病毒5型E1A基因对TNF-α诱导的猪血管内皮细胞中NF-κB活性的抑制作用(论文文献综述)
崔英丽[1](2021)在《双特异性溶瘤腺病毒Ad-VT对卵巢癌抑制作用研究》文中研究表明癌症是人类死亡的主要原因之一。2020年全球癌症确诊患者1930万例,1000万人因癌症死亡。其中卵巢癌发病率和死亡率均居女性癌症发病率和死亡率的第八位。卵巢位于盆腔深部,早期病变不易被发现,一经发现,多为晚期,目前针对卵巢癌的治疗以手术与化疗相结合的方式为主,但化疗副作用大,易产生耐药。因此,仍然需要继续寻找更有效地治疗手段。当前随着分子生物学、细胞生物学和病毒学的快速进步和不断发展,基因治疗已经逐渐发展成为一种新型治疗卵巢癌的治疗手段,其中新型溶瘤腺病毒已充分显示表现出了一种不可替代治疗优势,发挥了病毒治疗和基因治疗的双重重要作用及其功能,有望尽快使其发展成为一种治疗卵巢癌的有效治疗手段。Apoptin是一种源自于鸡贫血病毒(CAV)的凋亡诱导蛋白,在正常细胞中没有细胞毒性,而在肿瘤细胞中能够特异性诱导肿瘤细胞发生凋亡。人端粒酶逆转录酶(h TERT)的长度和生存能力与细胞衰老和永生化有关。由于端粒酶逆转录酶(h TERT)基因的限速和催化成分的紧密转录抑制作用,大多数正常人体细胞缺乏端粒酶活性。然而,在高达90%的人类恶性肿瘤中观察到h TERT表达和端粒酶激活,使其具有无限的增殖能力。本课题组前期已构建了含有凋亡素(apoptin)蛋白和h TERTp启动子的人五型腺病毒Ad-Apoptin-h TERTp-E1a(Ad-VT),该病毒具有只在肿瘤细胞中复制并特异性杀伤多种肿瘤细胞的能力。本研究利用本课题组自行构建的双特异性溶瘤腺病毒Ad-VT以及其对照病毒Ad-T、Ad-VP3和Ad-MOCK进行了对人卵巢癌A2780和SKOV3细胞的体内外抑制作用研究。研究目的:通过体内外多种实验分析Ad-VT对人卵巢癌A2780和SKOV3细胞的抑制作用。研究方法:1.利用pGL4.51转染卵巢癌A2780和SKOV3细胞,并用G418加压筛选稳定表达荧光素酶基因的人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞,并进行生物学特性分析检测。2.通过结晶紫染色和WST-1检测等方法分析Ad-VT对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞的杀伤作用。3.通过Hoechst染色、Annexin V流式分析、caspase酶活性检测、活性氧检测以及JC-1染色等方法分析Ad-VT杀伤人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞的主要方式。4.通过细胞划痕、Transwell小室侵袭等方法分析Ad-VT对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞迁移和侵袭能力的影响。5.用人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞分别建立裸鼠荷瘤模型,并每周观测肿瘤发光强度、肿瘤大小以及小鼠生存情况来分析Ad-VT在体内对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞的抑制作用。研究结果:1.构建成功了表达荧光素酶基因的人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞,并筛选出稳定表达的细胞系,且所构建的细胞与原始细胞没有明显的生物学差异。2.通过结晶紫染色和WST-1实验,显示了Ad-VT对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞具有杀伤作用,且杀伤作用具有剂量效应和时间效应关系。3.通过Hochest染色、Annexin V流式分析、caspase酶活性检测、活性氧检测以及JC-1染色等方法表明,Ad-VT主要通过内源性凋亡途径杀伤人卵巢癌A2780-LUC和人卵巢癌SKOV3-LUC细胞。4.细胞划痕实验、Transwell小室侵袭实验等方法表明,Ad-VT对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞的迁移和侵袭具有明显的抑制作用。5.通过构建表达荧光素酶的人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞的裸鼠肿瘤模型,Ad-VT也可以在体内显着抑制人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC,并延长裸鼠生存期。研究结论:本研究成功构建了人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞,并通过多种体内外实验证实了Ad-VT对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞具有显着的细胞杀伤作用,表明,Ad-VT具有成为卵巢癌治疗药物的潜力。
徐阳[2](2020)在《阳离子PCL-b-P(GMA-EA)载体递送pGRIM-19抗神经母细胞瘤的研究》文中研究指明背景:近年来,采用微生物载体递送靶向炎症通路的基因在肿瘤治疗中取得了良好的效果。微生物载体主要包括病毒与细菌。病毒类载体可以分成两类:整合型和非整合型病毒载体,细菌主要包括厌氧菌和兼性厌氧菌。尽管已有大量的研究表明,应用减毒沙门菌体内递送基因能取得良好的治疗效果,但是,由于生物载体的安全性问题,限制了其临床转化过程。近期,人工合成载体递送基因抗肿瘤成为研究热点。人工合成载体包括脂质体和阳离子聚合物。聚醚酰亚胺(Polyetherimide,PEI)是经典的阳离子聚合物,并作为阳离子基因载体研究的金标准被广泛应用。但是PEI毒性较高,体内转染效率不高,这使得开发新型阳离子基因载体成为现阶段的研究热点。现阶段国内已开发出一系列合成基因载体用于治疗肿瘤,但是相关的体内研究仅局限于肿瘤本身,机体对合成载体递送基因抗肿瘤的综合反应仍未知。神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)是儿童最常见的颅外实体肿瘤,最常见的发生部位是肾上腺。约有50%以上的患儿生存率低于40%,探寻有效的治疗靶点是神经母细胞瘤研究的热点。在临床上,神经母细胞瘤组织血运丰富,常出现早期转移,且伴有大量出血、坏死和钙化。抑制炎症致癌信号通路在该肿瘤的治疗中发挥明显作用。维甲酸/干扰素联合应用诱导的细胞凋亡调控基因19(Genes associated with retinoid-interferon-induced mortality 19,GRIM-19)可以通过抑制转录因子信号转导和转录激活因子3(Signal transducer and activator of transcription-3,STAT3)通路抑制恶性肿瘤的生长。虽然近期的研究表明,STAT3信号通路在神经母细胞瘤转移和化疗耐药的患儿中至关重要,但是尚缺乏临床病理分期与GRIM-19的相关性报道。异种移植瘤的体内实验提示抑制STAT3信号通路可以抑制神经母细胞瘤的生长,但是不足以评估抑制该通路后肿瘤局部微环境的改变。我们推测在神经母细胞瘤同种移植瘤中,过表达GRIM-19可能通过抑制STAT3信号通路的机制,抑制肿瘤细胞的生长,促进凋亡,而且抑制MMP-9表达,减轻瘤内出血,提高治疗效果。众所周知,多数肿瘤化疗的一线药物顺铂具有明显的内皮细胞毒性,治疗后可明显增加血浆血管性血友病因子(Von Willebrand factor,v WF)水平。针对致病机制的基因治疗具有高效低毒的特点,理论上对机体毒副作用较小。虽然已经开发出许多脂质体、阳离子载体用于神经母细胞瘤的治疗研究,可是如何在体内达到最大的治疗效果仍需仔细评估。方法:1、基因载体的合成与表征:通过酶促聚合反应合成双亲性嵌段共聚物PCL-b-P(GMA-EA)(PCG),核磁检测PCG的化学结构,凝胶电泳检测PCG与GRIM-19质粒的结合能力,动态光散射评估PCG与GRIM-19质粒复合物的粒径和ζ电位。在人宫颈癌Hela细胞、人肝癌Hep G2细胞和鼠神经母细胞瘤Neuro2a细胞中,用细胞增殖活性检测(CCK-8)检测PCG与EGFP-N1质粒复合物的细胞毒性,用流式细胞仪或荧光显微镜检测PCG的转染效率。2、临床样本的分析:收集吉林大学白求恩第一医院住院确诊为神经母细胞瘤的28例患儿手术标本的石蜡切片,通过免疫组化分析GRIM-19的表达与神经母细胞瘤患儿年龄、性别、肿瘤大小、INSS分期、INPC分期、淋巴结和/或脉管转移的相关性。3、PCG递送GRIM-19基因抑制神经母细胞瘤的体内外研究:用PEI作为阳性对照,采用Western blot检测PCG介导的GRIM-19在鼠神经母细胞瘤Neuro2a细胞中的转染效率。体外实验分为6组,分别为对照组、PCG组、裸p GRIM-19组、PCG/p CDNA组、PCG/p GRIM-19组和PEI/p GRIM-19组,应用细胞增殖实验(CCK-8)、克隆形成实验、Brd U检测、流式凋亡检测、免疫荧光、划痕及Transwell实验,探讨PCG介导的GRIM-19过表达对肿瘤增殖、凋亡及转移的影响。体内实验中,分为对照组、PEI/p GRIM-19组和PCG/p GRIM-19共3组,应用免疫组化及Western blot检测GRIM-19的转染效率,通过免疫组化检测PCNA的表达,细胞凋亡检测(TUNEL)及Western blot检测分析裸鼠移植瘤治疗后增殖及凋亡的改变。进一步的体内实验分为对照组、顺铂组和PCG/p GRIM-19组共3组,检测各组裸鼠生存期的差异,自动血液分析仪检测裸鼠血红蛋白,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血浆中v WF,HE染色检测荷瘤鼠肺部改变,免疫组化检测肿瘤组织p-STAT3、MMP-9的表达,评价肿瘤组织学、瘤内出血、贫血及肺栓塞等肿瘤相关并发症改变。结果:1、N/P=1(阳离子聚合物中的N和DNA中的P的摩尔比)时,PCG完全阻止GRIM-19质粒DNA在凝胶电泳中的泳动。在w/w(质量比)为5-50的范围内,PCG能将p GRIM-19质粒压缩成200-400 nm大小,表面电势为25-30 m V的纳米粒子。在人宫颈癌Hela细胞、人肝癌Hep G2细胞和鼠神经母细胞瘤Neuro2a细胞中,PCG(w/w=20)在细胞中有效递送EGFP-N1质粒,同时对细胞的毒性较小。2、神经母细胞瘤组织中GRIM-19蛋白表达水平较癌旁正常组织下调或缺失。肿瘤组织中GRIM-19表达水平与年龄(P=0.0012)、INSS分期(P=0.0012)、INPC分期(P=0.0299)、淋巴结和/或脉管转移(P=0.0062)呈负相关,与性别及肿瘤原发部位无关。3、体外实验中,PCG载体可以将GRIM-19基因转染进Neuro2a细胞并提高GRIM-19基因的蛋白表达水平,其转染效率高于PEI。在对照组、PCG组、裸p GRIM-19组、PCG/p CDNA组、PCG/p GRIM-19组和PEI/p GRIM-19组中,PCG/p GRIM-19组和PEI/p GRIM-19组细胞凋亡增加,细胞增殖和细胞迁移抑制。PCG介导细胞内过表达GRIM-19蛋白抑制了STAT3信号通路,抑制了Cyclin D1、Bcl-2、MMP2和MMP9的表达。体内实验中,在对照组、PEI/p GRIM-19组和PCG/p GRIM-19组中,PCG/p GRIM-19组移植瘤生长抑制最明显,该组GRIM-19蛋白表达增加,PCNA表达下调,TUNEL染色及Cleaved caspase-3上调。在对照组、顺铂组和PCG/p GRIM-19组中,PCG/p GRIM-19组小鼠生存期延长最明显,该组大体观见瘤内出血减少,裸鼠血红蛋白升高,v WF下调,HE提示肺栓塞减少,肿瘤组织内p-STAT3下调,下游靶基因MMP-9表达下调。结论:1.人工合成的双亲性阳离子聚合物PCG能在体内外进行有效的基因转染。2.神经母细胞瘤肿瘤组织中GRIM-19的表达下调或缺失,其表达水平与年龄、INSS分期、INPC分期、淋巴结和/或脉管转移呈负相关。3.在裸鼠同种移植瘤模型中,PCG递送p GRIM-19可以有效抑制STAT3信号通路,不仅直接抑制肿瘤细胞的生长,而且抑制MMP-9表达,减轻瘤内出血。顺铂化疗引起荷瘤裸鼠内皮损伤及肺血栓增加,基因递送组v WF下调,肺血栓减少,小鼠生存期延长。阳离子PCG载体递送p GRIM-19抑制神经母细胞瘤的治疗策略可能为肿瘤治疗提供有价值的参考。
沈阳坤[3](2020)在《HSV-1溶瘤病毒用于肿瘤精准治疗及肿瘤耐受机制的研究》文中研究说明溶瘤病毒疗法(Oncolytic virus therapy,OVT)作为一种前景广阔的肿瘤治疗手段,具有安全、高效和副作用低的特点,已经成为肿瘤治疗研究中的热点。其中,I型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)作为研究最为广泛的一类溶瘤病毒,已有几十种候选药物处于临床前或临床研究阶段。然而,多年的临床试验表明,单一的溶瘤病毒疗法只有有限的治疗效果,且具体机制尚不明确。宿主中的一些蛋白质对病毒的侵染、繁殖以及传染至关重要,被称为病毒的宿主依赖因子(Host Dependency Factor,HDF)。已有证据表明,细胞和动物水平HDF的缺陷,会导致病毒的感染失败。然而尽管目前已有针对HSV-1复制周期及HSV-1的免疫机制等方面的深入研究,但对病毒与宿主间的相互作用的理解,特别是涉及病毒感染和裂解复制的细胞质蛋白的作用仍然所知甚少。此外,肿瘤患者体内的HDF突变是否影响HSV-1类溶瘤病毒的治疗尚未见系统研究。本论文研究的目的是探讨HSV-1病毒HDF突变在溶瘤病毒精准治疗中的作用及肿瘤耐受的机制。方法:(1)利用CRISPR/Cas9技术制备ICP34.5基因缺失的HSV-1溶瘤病毒HSV-1-ΔICP34.5、HSV-1病毒受体Nectin1基因缺失的小鼠结肠癌MC38细胞MC38Nectin1-/-和表达NEO-2/15的HSV-1溶瘤病毒HSV-1-NEO-2/15。(2)制备小鼠B16黑色素瘤模型和小鼠MC38结肠肿瘤模型,利用HSV-1-ΔICP34.5溶瘤病毒治疗并评估治疗效果。(3)制备小鼠MC38结肠肿瘤模型,利用HSV-1-ΔICP34.5和HSV-1-NEO-2/15溶瘤病毒治疗并评估治疗效果。(4)利用人类CRISPR全基因组敲除文库结合高通量测序技术筛选HSV-1病毒的HDF。(5)通过统计学、基因富集分析、KEGG通路分析、PANTHER GO分析和基因重叠分析等方法确定HSV-1病毒HDF的候选基因。(6)利用CRISPR/Cas9技术制备Nectin1、ENTPD1、HCFC1R1、EXT1、EXT2、EXTL3、Tm9sf3和B3GALT6等基因的敲除细胞并通过病毒感染、台盼蓝法、细胞计数法、q PCR和Western Blotting检测HDF缺失对病毒感染的影响。(7)通过HSV-1病毒的膜结合实验评估HSV-1病毒的HDF缺失后病毒和宿主细胞的结合能力。(8)通过共聚焦显微镜追踪HSV-1病毒进入细胞的过程。(9)利用TCGA数据库分析临床肿瘤患者体内HSV-1病毒HDF的突变频率。结果:(1)HSV-1-ΔICP34.5溶瘤病毒治疗对小鼠MC38结肠癌治疗效果显着,然而对B16黑色素瘤未见明显效果。接着,我们利用HSV-1-ΔICP34.5溶瘤病毒治疗HSV-1病毒受体Nectin1基因缺失的小鼠结肠癌,结果显示,和对照组相比,Nectin1基因缺失的小鼠肿瘤体积未见明显缩小,证实溶瘤病毒对小鼠MC38-ΔNectin1结肠肿瘤的治疗无效。(2)本研究中,利用CRISPR基因编辑技术,我们成功制备HSV-1-NEO-2/15新型溶瘤病毒。通过对小鼠MC38结肠肿瘤的治疗,我们的研究结果表明,NEO-2/15不仅可以和HSV-1溶瘤病毒同时使用,并且NEO-2/15的整合能够显着增强溶瘤病毒的治疗效果。(3)利用人类CRISPR全基因组敲除文库结合高通量测序技术,结合统计学、基因富集分析、KEGG通路分析、PANTHER GO分析和基因重叠分析等分析方法,我们最终得到了31个HSV-1病毒的候选HDF基因。通个基因敲除验证,我们已经证实细胞水平敲除Nectin1、ENTPD1、HCFC1R1、EXT1、EXT2、EXTL3、Tm9sf3和B3GALT6可以显着增强细胞抵抗HSV-1病毒感染的能力。此外,KEGG分析结果表明EXT1、EXT2、EXTL3和B3GALT6等基因在硫酸乙酰肝素合成通路中扮演重要作用。基因敲除结果表明这些基因的突变不仅能够显着降低HSV-1病毒对宿主的感染水平,而且还能降低病毒与宿主细胞的结合能力。ENTPD1基因的缺失只影响HSV-1病毒进入宿主细胞,并不影响病毒与细胞膜的结合。(4)根据TCGA数据库提供的肿瘤患者基因信息,大部分基因在至少一种肿瘤中存在突变,且部分基因的突变频率高达5%以上,意味着HSV-1溶瘤病毒对这些肿瘤可能得不到很好的治疗效果,暗示HDF的精准检测在溶瘤病毒治疗前的必要性。结论:本研究中,基于HDF突变引起的溶瘤病毒感染失败的现象,我们首次提出溶瘤病毒抵抗(Oncolytic virus resistance)的概念,即当患者体内发生溶瘤病毒HDF的突变,溶瘤病毒的治疗效果就会消失;或者治疗前期溶瘤病毒对肿瘤的效果显着,但是随着肿瘤细胞增殖过程中异质性分化的更加明显,部分肿瘤细胞的HSV-1宿主依赖因子的表达水平降低或者发生基因突变,导致HSV-1病毒的感染减少或者失败,最终影响溶瘤病毒的治疗效果。基于此概念,寻找新的肿瘤治疗药物并用于溶瘤病毒的联合治疗是该治疗领域的一个重要研究方向。因此,我们构建了一种新型HSV-1类溶瘤病毒HSV-1-NEO-2/15,能显着增强肿瘤的治疗效果。此外,利用CRISPR全基因组敲除文库筛选出多个HSV-1的HDF,并深入探讨了部分基因的功能。近年来国内溶瘤病毒治疗的临床研究越来越多,而专门针对溶瘤病毒的精准医疗检测尚未见报道。本研究证实了根据HSV-1病毒HDF的突变与否可以判断患者能否获益于溶瘤病毒的治疗,以减少不当治疗带来的病情延误和资源浪费。未来,通过对这些蛋白的深入研究,将为开发HSV-1类溶瘤病毒耐药检测试剂盒以及为肿瘤患者制定个性化治疗方案提供研究依据。同时依据这些靶点,可以开发出新的抗HSV-1病毒药物,为溶瘤病毒治疗后因病毒残留带来的潜在感染风险提供新的解决方案,把溶瘤病毒治疗的副作用降到最低。
戴薇[4](2019)在《NF-κB和端粒酶启动的肿瘤基因治疗新技术研究》文中研究指明癌症是目前困扰人类健康、威胁人类生命的重大疾病之一。传统的手术切除、放疗、化疗和最新的免疫疗法已被用于癌症治疗,提高了病人的五年存活率,但由于不可避免的毒副反应使得疗效还与病人对于生命健康的期望相差甚远。NF-κB是一种序列特异性DNA结合型转录因子,通过与细胞核内DNA靶点结合,调控靶基因的表达,从而参与炎症反应、免疫应答以及细胞生长、分裂和凋亡等多种生理病理过程。NF-κB在各种癌症中过度活化,是抗肿瘤药物筛选和癌症治疗的优良靶点。由于NF-κB是一把“双刃剑”,传统的NF-κB活性抑制剂因其显着的毒副作用而未能成为临床药物。抑制从来不是解决问题的好办法,应采用因势利导的策略,创制新的肿瘤治疗技术。本研究发展了三种肿瘤基因治疗新技术,并探索了其生物医学研究领域的应用价值,主要研究成果包括以下:1.人肝癌细胞中NF-κB结合靶点和靶基因的鉴定及其应用研究发现,过度活化的NF-κB与肝炎和肝细胞癌(HCC)的发生密切相关,但其完整而精确的分子途径和机制目前还不清楚。本研究使用Ch IP-seq和RNA-seq高通量测序技术,在TNFα诱导的人HCC细胞系Hep G2细胞中共计鉴定出699个NF-κB直接靶基因(direct target gene,DTG),包括399个激活基因和300个抑制基因。其中,216个基因(包括126个激活基因和90个抑制基因)是目前已经鉴定出的HCC基因标志物。比较TNFα诱导的Hep G2细胞、LPS诱导的THP-1细胞和TNFα诱导的He La细胞中NF-κB靶基因数目,仅有24–46个NF-κB靶基因由两种细胞系共有,表明本研究鉴定出的NF-κB DTG具有HCC细胞特异性。基因功能注释分析表明,Hep G2细胞中的NF-κB DTG主要富集在经典的NF-κB生物学过程,如免疫系统过程、压力反应、刺激反应、防御反应和细胞死亡,并且涉及MAPK、TNF、TGF-β、趋化因子、NF-κB和Toll样受体KEGG信号通路。部分NF-κB DTG也与丙型肝炎和乙型肝炎病毒密切相关。此外,82个NF-κB DTG编码的分泌蛋白是目前临床上已经使用的HCC生物标志物,如CCL2和DKK1。最后,通过Ch IP-q PCR和RT-q PCR实验证实,NFKB1、NFKBIA、CCL2、IL1A、IL1B、PTX3、NUDT7、EFNA5、ID4、GPC6、KLF15、DKK1、OAZ2和IGFBP3这14个基因是TNFα诱导的Hep G2细胞中NF-κB DTG。这些结果为进一步研究NF-κB相关的分子机制和HCC生物标志物诊疗技术的发展提供了有价值的基因信息。2.NF-κB激活的肿瘤细胞特异性基因疗法及其应用研究转录因子NF-κB在各种肿瘤细胞/组织中过度活化,已经成为抗肿瘤药物研发和肿瘤治疗的优良靶点。正因如此,过去几十年发展了无数的NF-κB活性抑制剂,然而由于不可避免的毒副反应,没有一例抑制剂成为临床使用的药物。本研究中,利用NF-κB在肿瘤细胞中高度活化的生物学特性,发展了一种肿瘤细胞特异性基因疗法,即NF-κB激活的基因表达(NF-κB-activated gene expression,Nage)载体用于癌症治疗。Nage载体通过将NF-κB诱骗子序列(decoy)与最小启动子序列(minimal promoter)融合构成NF-κB特异性启动子(decoy minimal promoter,DMP),DMP与肿瘤细胞内高表达的NF-κB结合,从而激活下游效应基因的表达。本研究首先使用Western-blotting方法验证了NF-κB p65蛋白在肿瘤细胞中特异性表达。随后以绿色荧光蛋白Zs Green作为效应基因,证实Nage载体可在肿瘤细胞中特异性表达效应基因,产生绿色荧光,而在正常细胞中不表达效应基因。随后,以CRISPR/Cas9作为效应基因,在靶向端粒重复序列的sg RNA(Tsg RNA)的引导下,Nage载体特异性地诱导多种肿瘤细胞死亡,包括Hep G2、He La、PANC-1、MDA-MB-453、A549、HT-29、SKOV-3、Hepa1-6和RAW264.7,而对正常细胞293T、MRC-5和HL7702不产生影响。最后,将表达Cas9-Tsg RNA的Nage载体包装进腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)中,构建肿瘤基因治疗载体AAV-Nage,通过静脉注射给药途径注入小鼠体内,显着地抑制小鼠体内肿瘤的生长。本研究发展的肿瘤细胞特异性基因疗法Nage载体为抗肿瘤药物研发提供了一种新思路。3.端粒酶激活的肿瘤基因疗法及其应用研究癌症是由一系列表观基因突变引起的,以多种复杂形式存在的难以预防和治疗的疾病。端粒酶是真核细胞中负责端粒延长的一种RNA聚合酶。研究发现,端粒酶的活性在大多数正常细胞中被程序性关闭,而在90%的肿瘤细胞中被重新激活,使其成为癌症治疗中的重要靶点。目前,已开发出多种端粒酶活性抑制剂用于治疗癌症,但由于不可避免的毒副反应均已失败告终。本研究中,利用肿瘤细胞中端粒酶的活性发展了一种名为端粒酶激活的基因表达(telomerase-activated gene expression,Tage)系统用于治疗癌症。Tage系统由一段携带端粒酶可识别的3’粘性末端效应基因表达载体、表达d Cas9-VP64人工转录因子的表达载体和靶向端粒重复序列的sg RNA(Tsg RNA)组成。以CRISPR/Cas9作为效应基因,Tage系统有效地杀灭多种肿瘤细胞,包括Hep G2、He La、PANC-1、MDA-MB-453、A549、HT-29、SKOV-3、Hepa1-6和RAW264.7,但对正常细胞293T、MRC-5、HL7702和骨髓间充质干细胞(BMSC)不产生影响。更重要的是,酵母同宗接合切换内切酶(homothallic switching endonuclease,HO)切割产生的4碱基3?粘性末端可被细胞中端粒酶识别并延伸,为Tage系统体内应用奠定基础。以腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)作为基因载体,实现了Tage系统体内安全有效治疗肿瘤的目的。荷载Tage系统的AAV经静脉注射给药,显着地抑制小鼠体内肿瘤的生长,并且没有观察到明显的毒副反应。4.肿瘤干细胞基因治疗载体的构建及其应用研究癌症由不同分化等级和致瘤潜力的肿瘤细胞构成,是一种高度异质性、难以预防和治疗的疾病。癌干细胞或肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)是具有自我更新、多能分化和无限增殖潜能的肿瘤细胞亚群,对维持肿瘤细胞异质性和致瘤性起关键作用。CSC可抵抗常规抗癌药物,并在肿瘤转移和复发中发挥重要作用,使得抗肿瘤药物研发面临巨大挑战。本研究中,使用前期发展的两种肿瘤细胞特异性基因疗法,端粒酶激活的基因表达(Tage)系统和NF-κB激活的基因表达(Nage)载体24 h内有效地杀灭旺盛分裂的肿瘤细胞,残存细胞具有CSC自我更新增殖特性。q PCR检测发现,涉及上皮/间充质细胞转换、Wnt信号通路、细胞间粘附以及干细胞标志基因VIM、TWIST、p53、p16INK4α、p21、CD24、CD326、DLL4、JAG1、Notch1、MUC1、DACH1、CD133、CD44、ATXN1、BMP7、CXCR4、GATA3、JAK2、KLF4、LIN28a、LIN28b、MYCN、NANOG和SOX2,在残存肿瘤细胞中均高表达,表明Tage系统和Nage载体可在24 h内有效分离得到CSC。研究发现,NF-κB不仅在各种肿瘤细胞中高度活化,在CSC中也显示出高活性,使其有望成为针对CSC的肿瘤治疗靶点。将前期发展的新型NF-κB活性抑制剂,即NF-κB特异性启动子DMP调控的靶向Rel A的mi R533包装进腺相关病毒(AAV)中,构成肿瘤干细胞基因治疗载体AAV-mi R533。AAV-mi R533有效地杀灭Hep G2 CSC,感染病毒20 d后的CSC仍没有再生长增殖迹象。本研究为分离CSC和开发针对CSC的抗肿瘤药物提供了新方法。总之,本研究通过联合运用高通量测序技术、生物信息学技术和传统的分子生物学技术,鉴定出了肝癌细胞中NF-κB的结合靶点和靶基因,发展了三种肿瘤细胞基因治疗新技术—NF-κB激活的基因表达(Nage)载体、端粒酶激活的基因表达(Tage)系统和肿瘤干细胞基因治疗载体,这些基因技术在肿瘤基因治疗领域具有重要的应用价值。
黄晨[5](2014)在《RGD修饰的腺病毒介导ING4和PTEN双基因对人白血病细胞的抑制作用》文中研究说明目的:研究经RGD修饰的腺病毒介导ING4或/和PTEN基因表达对人白血病细胞的感染效率及体内外抑制效应与分子机制。方法:在本实验室成功构建并保存的经RGD-4C修饰的腺病毒的基础上,体外检测对比未经修饰的空载体腺病毒和经RGD-4C修饰的空载体腺病毒对多种人白血病细胞系细胞的感染效率,并采用Real-Time PCR和Western blot法检测多种人白血病细胞内腺病毒-柯萨奇病毒受体(CAR)和相关整合素的表达情况。将携带外源基因ING4的腺病毒Ad.RGD-ING4、携带外源基因PTEN的腺病毒Ad.RGD-PTEN、携带外源双基因ING4和PTEN的腺病毒Ad.RGD-ING4-PTEN体外感染MEG-01人白血病细胞,Western blot法检测目的基因ING4或/和PTEN在MEG-01细胞中的表达,CCK-8法和AnnexinV-PE/7-AAD双染法检测携带外源基因的腺病毒体外抑制MEG-01细胞生长和诱导凋亡的效应,PI染色法检测外源基因导入后MEG-01细胞的细胞周期阻滞效应,Transwell法检测外源基因导入后对MEG-01细胞侵袭能力的影响。Western blot法检测细胞凋亡和周期相关基因P53、Bax、Bad、Bcl-2、Bcl-xl、P21的表达情况。同时建立MEG-01人白血病裸鼠移植瘤模型,观察Ad.RGD-ING4-PTEN体内对裸鼠移植瘤的抑瘤增效作用。石蜡切片后免疫组化检测相关因子P53、Bax、Bad、Casepas-3、Bcl-2、Bcl-xl、P21表达情况。结果:与未经修饰的腺病毒比较,RGD-4C的修饰明显提高了腺病毒对部分人白血病细胞的感染能力。外源基因ING4或/和PTEN具有抑制MEG-01人白血病细胞生长、诱导凋亡、阻滞细胞周期于G2/M期和抑制细胞侵袭能力的作用,且双基因共表达具有协同增效作用。体内实验中皮下注射携带外源基因ING4或/和PTEN的腺病毒后,同样能明显抑制MEG-01人白血病裸鼠移植瘤的生长,且双基因共表达有协同抑瘤增效作用。分子机制检测结果表明:双基因共表达的Ad.RGD-ING4-PTEN能上调MEG-01细胞内P53、Bax、Bad、Casepas-3、P21的表达,下调Bcl-2、Bcl-xl的表达且其效应较表达单基因的Ad.RGD-ING4、Ad.RGD-PTEN更为显着。结论:1、经RGD修饰后的腺病毒载体较普通腺病毒载体,大大提高了对部分人白血病细胞系细胞的感染能力。2、不同人白血病细胞间相关整合素的表达差异可能是经RGD修饰后的腺病毒对各种白血病细胞系感染效率差异的原因。3、Ad.RGD-ING4-PTEN双基因共表达较ING4或PTEN单基因表达体外能更显着地抑制MEG-01人白血病细胞的生长、诱导细胞凋亡、产生G2/M期细胞周期阻滞和抑制细胞侵袭。4、Ad.RGD-ING4-PTEN双基因共表达较ING4或PTEN单基因表达体内对MEG-01人白血病细胞裸鼠移植瘤能产生更显着的抑瘤作用。5、Ad.RGD-ING4-PTEN双基因共表达较ING4或PTEN单基因表达能更显着地上调P53、Bax、Bad、Casepas-3、P21和下调Bcl-2、Bcl-xl等细胞凋亡和周期相关蛋白,这可能是双基因共表达较单基因表达在体内外抑制MEG-01人白血病细胞作用中具有协同抑制作用的重要机制之一。
郭园园[6](2012)在《腺病毒E1A蛋白对糖皮质激素抗炎作用的影响及其机制研究》文中认为目的:探讨腺病毒E1A蛋白对细胞炎症反应及皮质激素抗炎作用的影响及其可能的机制,并进一步了解腺病毒潜伏感染对COPD发生、发展的影响,为寻找COPD有效的治疗方法打下基础。方法1.稳定表达腺病毒E1A蛋白的人肺泡上皮细胞株的构建:将已构建成功的pneo-E1A、pneo质粒转染人肺泡上皮细胞,通过G418抗性筛选和单克隆化操作最终获得稳定表达腺病毒E1A蛋白的抗性细胞克隆;用RT-PCR、western blot及免疫细胞化学等方法对E1A基因表达进行鉴定;2.腺病毒E1A基因对人肺泡上皮细胞炎症因子的影响及其机制:10ng.ml-1TNFα作用于E1A+组细胞和E1A-组细胞,分别于刺激因素作用24h后收集细胞上清,用ELISA试剂盒检测细胞因子IL-8的表达;收集细胞悬液用流式细胞术检测ICAM-1蛋白的表达;3.腺病毒E1A蛋白对不同浓度糖皮质激素抗炎作用的影响及其机制:3.1分别用终浓度10-5mol.L-1、10-6mol.L-1、10-7mol.L-1、10-8mol.L-1的DXM作用于E1A-组细胞及E1A+组细胞,检测细胞HDAC1、HDAC2的表达情况;3.2用人ELISA试剂盒、流式细胞术检测腺病毒E1A蛋白对TNF-α诱导及DXM干预下细胞因子IL-8及ICAM-1表达的影响;3.3用western blot检测腺病毒E1A蛋白对TNF-α诱导及DXM干预下HDAC1、HDAC2、GR、NF-κB的影响,用比色法检测TNF-α作用及DXM干预对HDAC活性的影响。结果1. pneo质粒及pneo-E1A质粒转染A549细胞后经G418抗性筛选,经RT-PCR检测E1A+组细胞克隆能扩增出238bp和375bp特异性片段,而E1A-组细胞无特异性条带显示;免疫组化结果显示:E1A+组细胞克隆均在细胞核内出现棕黄色细胞染色,而E1A-组细胞未见阳性染色;western blot结果显示:E1A+细胞克隆出现大小约为45~48、50~52kD E1A特异性的蛋白条带,而E1A-细胞组未检测出蛋白条带,稳定表达E1A蛋白的人肺泡上皮细胞株构建成功;2.在TNF-α作用下,E1A+组细胞和E1A-组细胞IL-8、ICAM-1蛋白表达增加,相对于E1A-组细胞,E1A+组细胞能明显上调TNF-α作用下炎症因子的表达;3.不同浓度的地塞米松均可以明显增加E1A+和E1A-组细胞HDAC1及HDAC2的蛋白表达,10-5mol.l-1地塞米松作用最强。E1A蛋白对HDAC1、HDAC2表达无明显影响。4.糖皮质激素主要通过与GR结合作用于HDAC及NF-κB发挥抗炎作用,用western blot检测TNF-α或DXM干预下E1A+和E1A-组细胞HDAC1、HDAC2、GR和NF-κB的表达情况;用比色法检测各组细胞HDAC的活性。结果显示在E1A+和E1A-组细胞,DXM能拮抗TNF-α抑制HDAC1、HDAC2蛋白表达的作用;DXM均能抑制TNF-α诱导的NF-κB活化作用,腺病毒E1A蛋白对GR入核作用无影响。结论1.腺病毒E1A蛋白能够放大致炎因素诱导下炎症因子IL-8、ICAM-1的表达;2.E1A蛋白主要通过上调转录因子NF-κB的转录活性促进炎症因子的表达;3.糖皮质激素主要通过作用于GR、HDAC及NF-κB发挥抗炎作用,腺病毒E1A蛋白对其抗炎作用无影响。
彭程飞[7](2011)在《E1A基因阻遏子基因抑制TNF-α诱导的骨髓间充质干细胞凋亡的作用与机制研究》文中研究表明目的骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)可以修复缺血损伤心肌的血管再生,改善损伤区域心肌的存活能力,可是BMSCs被移植到缺血损伤的心肌部位后存活率极低的现象却严重妨碍了其血管再生和损伤修复功能的发挥。研究发现:缺血心肌区域炎症反应所产生的炎性介质是致使移植的BMSCs大面积凋亡的重要原因之一。本室前期研究证实,E1A激活基因阻遏子(Cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)具有抑制多种细胞凋亡的生物学功能。因此,我们希望探讨CREG修饰能否有效的抑制炎症因子所诱导的BMSCs凋亡及其调控机制。方法○1应用原代培养的大鼠BMSCs为实验细胞模型。○2应用表达CREG的腺病毒载体感染BMSCs,以制备CREG基因修饰的BMSCs,应用Western blot方法鉴定CREG基因在BMSCs中的表达效率。○3用FITC-Annexin V/PI双染色法和TUNEL法检测添加20 ng /mL肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激10 h后(control)BMSCs组、(norm)BMSCs组、GFPBMSCs组、(CREG)BMSCs组的BMSCs凋亡率。○4 Western blot方法检测各相关蛋白的表达。结果通过FITC-Annexin V/PI双染色法和TUNEL法研究发现,Ad-CREG瞬时转染的BMSCs可以有效抑制20 ng /mL TNF-α刺激10 h后诱导的凋亡,凋亡率明显低于其他三组并且具有统计学意义(P<0.05)。通过Western blot检测发现,正常的BMSCs在20 ng /mL TNF-α刺激15min后细胞浆核转录因子κB(NF-κB)表达量开始减少,而NF-κB结合抑制蛋白IκB的磷酸化活化现象增加。(norm)BMSCs组和(GFP)BMSCs组细胞胞浆蛋白NF-κB和IκB的变化与(control)BMSCs组相似。与之相反,TNF-α刺激15min后,检测(CREG)BMSCs组的细胞胞浆蛋白发现, NF-κB表达未见显着减少,磷酸化的IκB表达也未见增加。进一步的核蛋白提取物检测研究发现,(norm)BMSCs组和GFPBMSCs组的NF-κB蛋白在TNF-α刺激15min后在核内开始表达,而(CREG)BMSCs组则没有NF-κB蛋白入核转位的现象发生。通过NF-κB的抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)200μM与细胞共培养预处理进一步证明, CREG表达抑制TNF-α诱导的BMSCs凋亡是通过抑制NF-κB活化和入核转位完成的。CREG基因的表达抑制了NF -κB入核转录,从而使其调控的促凋亡相关蛋白(P53、Fas)激活的死亡受体通道活性降低,对抗了BMSCs凋亡的发生。结论BSMCs过表达CREG可以有效抑制炎性因子TNF-α诱导的凋亡,促使其能够在缺血心肌坏死后的移植治疗中存活并发挥作用。
李艳博[8](2009)在《pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES双基因—放射治疗的体外抑瘤效应实验研究》文中研究表明放射治疗是目前临床治疗肿瘤的重要手段之一,但是由于肿瘤周边组织的放射损伤及某些肿瘤的辐射抗性问题,使放疗的疗效和应用受到限制。恶性肿瘤基因-放射治疗是近年来肿瘤治疗领域新的研究热点之一,是根据放射治疗和基因治疗的各自特点,将二者联合应用,即将辐射诱导性基因的调控序列与肿瘤杀伤基因相偶联,转染肿瘤细胞,在对肿瘤实施局部放疗的同时诱导肿瘤杀伤基因表达的增强,产生辐射和基因表达产物的协同抑瘤作用。该疗法一方面将放疗与基因治疗有机地结合,发挥协同作用;另一方面,由于辐射具有靶向性和可控性,实现了对杀伤基因表达的时空调控。利用Egr-1启动子具有辐射诱导特性,即电离辐射诱导下可启动其下游基因的表达,本实验构建了含Egr-1启动子和TRAIL、endostatin双基因的重组质粒pshuttle-Egr1- shTRAIL-shES,研究在电离辐射诱导下,该重组质粒携带的双基因TRAIL和endostatin mRNA及蛋白表达的时效和量效规律,以及观察其联合X射线照射后,分别对人乳腺癌细胞MCF-7和人血管内皮细胞ECV304增殖、周期和凋亡的影响。结果表明,重组质粒pshuttle-Egr1-shTRAIl-shES中TRAIL和endostatin mRNA和蛋白的表达具有辐射诱导双基因共表达特性,且在联合X射线照射后,对MCF-7和ECV304细胞均具有明显的增殖抑制和促凋亡作用,并可改变细胞周期进程。本研究为提高基因-放射治疗效果开辟了新途径,为双基因-放射治疗的临床应用提供理论和实验依据。
张宏伟[9](2009)在《IκBαM重组腺相关病毒载体的构建及其对大鼠自体原位肝移植胆道缺血再灌注损伤的保护作用》文中认为背景:肝移植术后胆道并发症发生率高,是影响患者长期存活及导致移植物丢失的最主要原因之一,因此肝移植后胆道并发症的防治是进一步提高移植受体存活率和远期疗效的关键。移植肝胆管缺血再灌注损伤是肝移植术后胆道并发症的重要病因学因素,肝脏缺血再灌注损伤是早期多种炎性因子激活的结果。NF-κB作为一种普遍存在的转录因子在调节炎症反应的基因中起关键作用。研究肝胆管缺血再灌注损伤过程中NF-κB的作用,并以其为靶点的干预措施有可能对移植肝胆管缺血再灌注损伤具有保护作用。本研究拟观察腺相关病毒携带NF-κB超抑制物IκBαM( rAAV- IκBαM)对肝移植胆道缺血再灌注损伤的保护作用。第一部分大鼠自体原位肝移植胆道缺血再灌注损伤模型的建立及肝脏再灌注损伤中NF-κB激活的研究目的建立稳定的大鼠自体原位肝移植胆道缺血再灌注损伤模型,观察建立模型手术并发症、存活率及肝脏缺血再灌注损伤中NF-κB的激活。方法门静脉和腹主动脉双重灌注法建立大鼠自体原位肝移植胆道缺血再灌注损伤模型,将Weistar大鼠随机分成两组:肝移植胆道缺血再灌注损伤手术组(liver transplantation-IRI group,LT-IRI group):行大鼠原位肝移植胆道缺血再灌注损伤;假手术组(Sham group, SH group):仅行开腹和肝门区解剖手术;分别于术后12h, 24h,72h,7d取肝组织行NF-κB免疫组化检测,取外周血检测肝脏酶学指标。结果共进行大鼠自体原位肝移植胆道缺血再灌注损伤模型80例,其中稳定模型60例,稳定模型期手术存活率约90%,一周存活率约为81.7%。免疫组化显示术后2hLT-IRI组NF-κB激活细胞明显多于SH组(p<0.01 );而其肝功能损伤指标(外周血ALT)在各时点LT-IRI组均较SH组亦明显增加,两组比较具有明显差异,以术后24h最为显着(417.2±45.3 vs 57.6±5.4, p<0.01)。结论成功建立大鼠自体原位肝移植胆道缺血再灌注损伤模型,无肝期约14±3 min。肝移植缺血再灌注过程中早期即有NF-κB的激活。第二部分IκBαM基因重组腺相关病毒载体的构建及鉴定目的构建携带NF-κB超抑制物IκBαM基因的重组腺病毒载体。方法应用BamHI和XholI内切酶双酶切pAAV-MCS质粒和PcDNA3.0-IκBαM,经过胶回收和纯化后,在T4连接酶作用下,构建pAAV-MCS-IκBαM,酶切和测序鉴定,293细胞病毒包装,重组腺病毒载体大量扩增,病毒滴度的测定及浓缩纯化。结果经双酶切和连接成重组质粒pAAV-MCS-IκBαM,双酶切pAAV-MCS-IκBαM得到大小分别为6.4Kb和970bp的载体和目的基因片段;经PCR鉴定得到大小为970bp的IκBαM片段;测序鉴定正确;经测定分离浓缩和纯化重组腺相关病毒获得病毒滴度约为7×108pfu/ml~5×109pfu/ml。结论成功构建IκBαM基因重组腺相关病毒载体,病毒浓缩纯化滴度满足实验要求。第三部分rAAV-IκBαM对大鼠自体原位肝移植胆道缺血再灌注损伤的保护作用目的观察rAAV-IκBαM转染肝脏术后肝内NF-κB及其下游炎性分子的表达,胆管内皮细胞的凋亡和电镜形态学变化情况,探讨rAAV-IκBαM在大鼠肝移植胆道缺血再灌注损伤中的作用。方法将Weistar大鼠分为三组:假手术组(单纯行开关腹手术),对照组(行肝移植胆道缺血再灌注损伤手术), rAAV- IκBαM转染组(术前两天行rAAV-IκBαM转染)。分别于术后2h, 24h, 72h, 7d取材。常规HE染色观察肝外胆管和肝组织学变化,用western blot检测NF-κB p65的表达, RT-PCR测定肝组织中TNF-α、ICAM-1 mRNA的表达,免疫组化检测TNF-α、ICAM-1的表达,ELESA检测血清TNF-α的水平,各时点肝脏酶学的变化及胆管内皮细胞的凋亡和电镜形态学变化。结果rAAV- IκBαM转染组与对照组相比:NF-κB p65于术后2h、24h表达具有显着性差异,核内蛋白水平明显降低,72h后各时点NF-κB p65核内蛋白差异不明显;术后2h、24h TNF-α及ICAM-1 mRNA的表达水平具有显着性差异;免疫组化示TNF-α、ICAM-1于移植后24h、72h的表达具有显着性差异;术后24h血清TNF-α具有显着性差异;肝脏酶学指标(ALT、GGT)在各时点具有显着性差异,尤其在术后24h, 72h最为显着;术后2h、24h、72h胆管内皮细胞的凋亡明显减少;术后24h电镜下胆管内皮细胞的损伤明显减轻。各移植组与假手术组差异显着。结论IκBαM通过抑制NF-κB核移位抑制其激活及抑制其下游基因的表达,从而减轻大鼠肝移植胆管缺血再灌注损伤。
郭朝晖[10](2008)在《转染人热休克蛋白70基因(hHSP70)对大鼠同种异体移植肺缺血再灌注的影响》文中认为目的1.构建热休克蛋白70基因(HSP 70 )重组5型腺病毒载体,为研究HSP 70的基因治疗奠定基础。2.采用“两袖套一支架管”法建立大鼠的左肺原位移植动物模型,为研究肺移植再灌注损伤提供较为稳定的实验基础。3.利用HSP 70内源性细胞保护的生物学特性,以大鼠同种异体左肺原位移植为动物模型,以人HSP 70为目的基因,复制缺陷的5型重组腺病毒载体为介导,通过离体肺的肺静脉灌注,诱导体内高表达HSP 70,观察其对大鼠移植肺IRI的影响。方法1.利用基因重组技术,构建hHSP70转基因载体,制备、包装腺病毒。2.应用改良的“两袖套一支架管”法,通过对套管的制作、供肺的灌注和获取及套接技术等方面进行改进,单人肉眼直视下完成供受体肺动脉、肺静脉和支气管的吻合。3.以SD大鼠为供受体,改良的“两袖套一支架管”法建立大鼠的左肺原位移植动物模型,实验分LPDG保存液对照组、空白载体组和hHSP70基因转染组,分别灌注10℃加入肝素的LPD-glucose液、单纯腺病毒载体和hHSP70基因重组腺病毒载体(5×109PFU),然后在10℃LPD-glucose液中保存3小时后移入受体,另设假手术对照组。移植肺再灌注后4h,检测以下指标:血气分析;干-湿重比率;移植肺组织中MDA含量、SOD和MPO的活性;病理组织学检查;hHSP70、TNF-α、IFN-γ、IL-6、NF-κB、Bax、Bcl-2的表达情况;细胞凋亡检测。结果1.成功构建了HSP 70基因重组5型腺病毒载体。2.连续进行大鼠左肺原位移植20例,手术成功率85%,平均总手术操作时间65±10 min,病理组织学检查证实移植肺再灌注后4h成功复制了典型的肺IRI。3.基因转染组再灌注后4h,RT-PCR、免疫组化染色证实移植肺成功表达特异性的hHSP 70基因产物。与对照组比较, PaO2明显上升,W/D降低,差别有显着意义(P<0.05);MDA含量和MPO活性明显下降,SOD活性明显升高(P<0.05);TNF-α、IFN-γ、IL-6、NF-κB和Bax的表达水平下降(P<0.05);Bcl-2表达水平升高(P<0.05)。光镜观察转染组肺泡间质水肿减轻,炎症细胞侵润减少,细胞凋亡减少。结论1.成功构建携带hHSP70基因的重组腺病毒载体能在239细胞系中包装成具有感染性的重组腺病毒。病毒颗粒滴度高、纯度好,重组腺病毒感染哺乳动物细胞后能表达目的蛋白,为重组腺病毒应用研究奠定基础。2.应用改良的“两袖套一支架管”法,通过技术改进,成功建立大鼠左肺原位移植动物模型。手术由单人肉眼直视下完成,能基本模拟临床的肺移植过程,适合研究肺的IRI。3.离体供肺经肺静脉灌注转染外源性目的基因切实有效。4.腺病毒载体介导hHSP 70转基因治疗通过抑制TNF-α、IFN-γ和IL-6等炎性细胞因子,减轻过氧化作用,有效地抑制移植肺的IRI。5.HSP 70转基因治疗使bax/bcl-2比值减少,起到抗细胞凋亡的作用。
二、改造的腺病毒5型E1A基因对TNF-α诱导的猪血管内皮细胞中NF-κB活性的抑制作用(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、改造的腺病毒5型E1A基因对TNF-α诱导的猪血管内皮细胞中NF-κB活性的抑制作用(论文提纲范文)
(1)双特异性溶瘤腺病毒Ad-VT对卵巢癌抑制作用研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
abstract |
英文缩略词 |
绪论 |
第一篇 文献综述 |
1.卵巢癌概述 |
2.溶瘤腺病毒 |
2.1 腺病毒的细胞进入、复制和免疫原性 |
2.2 肿瘤选择性复制腺病毒的研究现状 |
2.3 溶瘤腺病毒的临床发展 |
2.4 改造溶瘤腺病毒 |
3 凋亡素 |
3.1 凋亡素的序列和结构 |
3.2 凋亡素的IDP性质允许与细胞蛋白进行广泛的相互作用 |
3.3 凋亡素与DNA的相互作用 |
3.4 几种激酶介导凋亡素的细胞毒活性 |
3.5 通过细胞周期检查点感知细胞增殖状态 |
3.6 细胞是如何死亡的 |
3.7 凋亡素的传递方式 |
第二篇 研究内容 |
第1章 荧光素酶标记的人卵巢癌细胞的构建与鉴定 |
1.1 材料和方法 |
1.2 结果 |
1.3 讨论 |
1.4 小结 |
第2章 重组腺病毒Ad-VT对 A2780-LUC和 SKOV3-LUC细胞的抑制作用和抑制途径的研究 |
2.1 材料和方法 |
2.2 结果 |
2.3 讨论 |
2.4 小结 |
第3章 重组腺病毒Ad-VT对 A2780-LUC和 SKOV3-LUC细胞的体内抑制研究 |
3.1 材料和方法 |
3.2 结果 |
3.3 讨论 |
3.4 小结 |
结论 |
参考文献 |
导师简介 |
作者简介 |
攻读学位期间所取得的科研成果 |
致谢 |
(2)阳离子PCL-b-P(GMA-EA)载体递送pGRIM-19抗神经母细胞瘤的研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
abstract |
英文缩写词表 |
第1章 文献综述 |
1.1 基因治疗载体的研究进展 |
1.1.1 病毒载体 |
1.1.2 细菌载体 |
1.1.3 人工合成载体 |
1.1.4 结语与展望 |
1.2 神经母细胞瘤 |
1.2.1 神经母细胞瘤的发生及流行病学 |
1.2.2 神经母细胞瘤分子生物学特征及动物研究模型 |
1.2.3 神经母细胞瘤的临床表现及分期分层 |
1.2.4 神经母细胞瘤的治疗 |
1.2.5 结语与展望 |
1.3 GRIM-19的研究进展 |
1.3.1 GRIM-19的发现、结构及分布 |
1.3.2 GRIM-19的突变及下调与恶性肿瘤的关系 |
1.3.3 GRIM-19的功能 |
1.3.4 结语与展望 |
第2章 实验部分 |
2.1 PCG阳离子聚合物的合成及转染肿瘤细胞的检测 |
2.1.1 前言 |
2.1.2 材料和方法 |
2.1.3 实验结果 |
2.1.4 讨论 |
2.1.5 小结 |
2.2 GRIM-19蛋白在神经母细胞瘤组织中的表达 |
2.2.1 前言 |
2.2.2 材料和方法 |
2.2.3 实验结果 |
2.2.4 讨论 |
2.2.5 小结 |
2.3 阳离子聚合物递送pGRIM-19抗神经母细胞瘤的作用及机制研究 |
2.3.1 前言 |
2.3.2 材料和方法 |
2.3.3 实验结果 |
2.3.4 讨论 |
2.3.5 小结 |
第3章 结论 |
参考文献 |
作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
致谢 |
(3)HSV-1溶瘤病毒用于肿瘤精准治疗及肿瘤耐受机制的研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
绪论 |
1 疱疹病毒概述 |
1.1 疱疹病毒的分类 |
1.2 单纯疱疹病毒 |
2 溶瘤病毒研究进展 |
2.1 溶瘤病毒的种类 |
3 CRISPR/Cas9 系统概述 |
3.1 CRISPR/Cas9 系统的分子机制 |
3.2 CRISPR/Cas9 系统在HSV-1 病毒基因改造中的应用 |
4 研究的目的和意义 |
第一章 HSV-1 溶瘤病毒治疗小鼠恶性肿瘤 |
1.1 前言 |
1.2 仪器耗材 |
1.2.1 主要仪器 |
1.2.2 材料 |
1.3 实验方法 |
1.3.1 细胞培养 |
1.3.2 细胞转染 |
1.3.3 HSV-1 病毒的扩增与保存 |
1.3.4 HSV-1 对细胞增殖影响的曲线制备 |
1.3.5 HSV-1 对细胞存活影响的曲线制备 |
1.3.6 利用CRISPR/Cas9 系统构建基因改造溶瘤病毒 |
1.3.7 图像分析和数据统计 |
1.4 结果 |
1.4.1 制备ICP34.5 缺失的HSV-1 溶瘤病毒 |
1.4.2 HSV-1-ΔICP34.5 病毒对小鼠黑色素瘤的治疗效果 |
1.4.3 多种细胞系对HSV-1-ΔICP34.5 病毒的敏感性分析 |
1.4.4 HSV-1-ΔICP34.5 病毒对小鼠结肠癌的治疗效果 |
1.4.5 Nectin1 缺失抵抗HSV-1-ΔICP34.5 病毒对小鼠结肠癌的治疗 |
1.4.6 HSV-1-NEO2/15 溶瘤病毒制备 |
1.4.7 HSV-1-NEO-2/15 溶瘤病毒对小鼠结肠癌的治疗效果 |
1.5 讨论 |
第二章 利用全基因组CRISPR-Cas9敲除文库进行HSV-1宿主依赖因子的筛选及富集 |
2.1 前言 |
2.2 仪器耗材 |
2.2.1 主要仪器 |
2.2.2 材料 |
2.2.4 主要溶液的配制 |
2.3 实验方法 |
2.3.1 利用CRISPR/Cas9 系统构建基因敲除细胞 |
2.3.3 Western Blot验证敲除细胞株 |
2.3.4 细胞免疫荧光 |
2.3.5 慢病毒包装 |
2.3.6 细胞总RNA提取 |
2.3.7 cDNA的合成 |
2.3.8 cDNA的普通PCR反应 |
2.3.9 病毒结合实验 |
2.3.10 图像分析和数据统计 |
2.4 实验结果 |
2.4.1 制备L929 全基因组细胞敲除文库 |
2.4.2 利用全基因组敲除库筛选抗HSV-1 的细胞 |
2.4.3 筛选后抗病毒细胞对HSV-1 病毒的敏感性分析 |
2.4.4 筛选过程中sg RNA以及其靶向基因的动力学变化 |
2.4.5 PANTHER GO富集度分析 |
2.4.6 富集HSV-1 病毒的宿主依赖因子 |
2.4.7 临床肿瘤患者体内HSV-1 病毒HDF的突变频率分析 |
2.5 讨论 |
第三章 HSV-1 宿主依赖因子候选基因的验证与分析 |
3.1 前言 |
3.2 仪器耗材 |
3.3 方法 |
3.3.1 利用CRISPR/Cas9 系统构建基因敲除细胞 |
3.3.2 利用PANTHER网站分析基因功能 |
3.3.3 利用KEGG网站分析目的基因通路关系 |
3.3.4 图像分析和数据统计 |
3.4 实验结果 |
3.4.1 Nectin1和ENTPD1 基因缺失对病毒的抵抗 |
3.4.2 ENTPD1 基因是一个HSV-1 病毒新的宿主依赖因子 |
3.4.3 敲除ENTPD1对HSV-1 感染后病毒增殖的影响 |
3.4.4 ENTPD1 缺失抵抗HSV-1 感染不依赖I型干扰素通路 |
3.4.5 ENTPD1 缺失阻止HSV-1 病毒进入细胞,但不影响病毒和细胞膜结合 |
3.4.6 BGC-823 细胞缺失ENTPD1 基因抵抗HSV-1 感染 |
3.4.7 其他HSV-1 病毒HDF候选基因验证与分析 |
3.4.8 硫酸乙酰肝素合成途径对HSV-1 进入细胞至关重要 |
3.4.9 KEGG通路分析 |
3.4.10 确定硫酸乙酰肝素合成途径候选基因 |
3.5 讨论 |
第四章 结论 |
附录 Ⅰ |
附录 Ⅱ |
参考文献 |
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
致谢 |
个人简历 |
(4)NF-κB和端粒酶启动的肿瘤基因治疗新技术研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
第一章 绪论 |
1.1 NF-κB在癌症治疗中的应用 |
1.1.1 NF-κB的生物学特性 |
1.1.2 NF-κB的结合靶点和靶基因 |
1.1.3 NF-κB与肿瘤 |
1.2 基因编辑技术用于癌症治疗 |
1.2.1 CRISPR/Cas9 系统介导的基因编辑技术 |
1.2.2 CRISPR/Cas9 系统在癌症研究中的应用 |
1.3 端粒酶与癌症 |
1.3.1 端粒和端粒酶 |
1.3.2 端粒酶在癌症治疗中的应用 |
1.4 癌症干细胞 |
1.4.1 CSC的生物学特性 |
1.4.2 CSC的分离与鉴定 |
1.4.3 NF-κB与 CSC |
1.5 本论文研究内容及意义 |
第二章 人肝癌细胞中NF-κB结合靶点和靶基因的鉴定及其应用 |
2.1 引言 |
2.2 试验材料 |
2.2.1 主要试验材料 |
2.2.2 主要试验仪器 |
2.3 试验方法 |
2.3.1 细胞siRNA干扰 |
2.3.2 RNA-seq和数据分析 |
2.3.3 染色质免疫沉淀(ChIP) |
2.3.4 Ch IP-seq和数据分析 |
2.3.5 RT-qPCR |
2.3.6 Ch IP-qPCR |
2.3.7 数据分析 |
2.4 结果与分析 |
2.4.1 NF-κB结合区域鉴定 |
2.4.2 增强子区NF-κB的结合 |
2.4.3 NF-κB差异表达基因鉴定 |
2.4.4 NF-κB直接靶基因鉴定 |
2.4.5 细胞特异性NF-κB直接靶基因 |
2.4.6 NF-κB直接靶基因GO分析 |
2.4.7 NF-κB直接靶基因KEGG分析 |
2.4.8 编码分泌蛋白的NF-κB直接靶基因鉴定 |
2.4.9 qPCR检测 |
2.5 讨论 |
2.6 本章小结 |
第三章 NF-κB激活的肿瘤细胞特异性基因疗法及其应用研究 |
3.1 引言 |
3.2 试验材料 |
3.2.1 主要试验材料 |
3.2.2 主要试验仪器 |
3.3 试验方法 |
3.3.1 载体构建 |
3.3.2 细胞培养和转染 |
3.3.3 Western blotting |
3.3.4 细胞增殖能力测定 |
3.3.5 相对端粒长度检测 |
3.3.6 病毒包装和纯化 |
3.3.7 病毒滴度测定 |
3.3.8 病毒感染 |
3.3.9 动物实验 |
3.3.10 qPCR检测 |
3.3.11 数据分析 |
3.4 结果与分析 |
3.4.1 不同细胞系中NF-κB蛋白表达检测 |
3.4.2 Nage载体特异性验证 |
3.4.3 Nage载体杀灭肿瘤细胞 |
3.4.4 相对端粒长度检测 |
3.4.5 rAAV-Nage载体杀灭肿瘤细胞 |
3.4.6 Nage载体体内肿瘤治疗 |
3.4.7 qPCR和 Western blotting检测 |
3.5 讨论 |
3.6 本章小结 |
第四章 端粒酶激活的肿瘤基因疗法及其应用研究 |
4.1 引言 |
4.2 试验材料 |
4.2.1 主要试验材料 |
4.2.2 主要试验仪器 |
4.3 试验方法 |
4.3.1 载体构建 |
4.3.2 细胞培养和转染 |
4.3.3 细胞活力和增值能力测定 |
4.3.4 端粒合成检测 |
4.3.5 相对端粒长度检测 |
4.3.6 病毒包装和滴度测定 |
4.3.7 病毒感染 |
4.3.8 动物实验 |
4.3.9 qPCR检测 |
4.3.10 数据分析 |
4.4 结果与分析 |
4.4.1 Tage系统特异性验证 |
4.4.2 细胞内端粒合成验证 |
4.4.3 Tage系统杀灭肿瘤细胞 |
4.4.4 相对端粒长度检测 |
4.4.5 四碱基粘性末端Tage系统验证 |
4.4.6 HO酶在Tage系统中的应用 |
4.4.7 Tage系统优化 |
4.4.8 rAAV-Tage系统杀灭肿瘤细胞 |
4.4.9 Tage系统体内肿瘤治疗 |
4.5 讨论 |
4.6 本章小结 |
第五章 肿瘤干细胞基因治疗载体的构建及其应用研究 |
5.1 引言 |
5.2 试验材料 |
5.2.1 主要试验材料 |
5.2.2 主要试验仪器 |
5.3 试验方法 |
5.3.1 载体构建 |
5.3.2 细胞培养和转染 |
5.3.3 病毒包装和滴度测定 |
5.3.4 病毒感染 |
5.3.5 细胞活力测定 |
5.3.6 RT-qPCR检测 |
5.3.7 数据分析 |
5.4 结果与分析 |
5.4.1 Tage系统和Nage载体杀灭肿瘤细胞 |
5.4.2 Tage系统和Nage载体连续杀灭Hep G2 细胞 |
5.4.3 动态观察和检测残存细胞 |
5.4.4 rAAV杀灭残存细胞 |
5.4.5 rAAV-mi R533 杀灭CSC |
5.4.6 rAAV杀灭急性白血病细胞 |
5.4.7 AML CSC标志基因q PCR检测 |
5.5 讨论 |
5.6 本章小结 |
第六章 总结与展望 |
参考文献 |
作者简介 |
个人履历 |
攻读博士学位期间参与的科研项目 |
攻读博士学位期间学术成果 |
中英文对照缩略词表 |
致谢 |
(5)RGD修饰的腺病毒介导ING4和PTEN双基因对人白血病细胞的抑制作用(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
前言 |
参考文献 |
第一部分 有/无 RGD-4C 修饰的腺病毒对人白血病细胞感染效率的区别 |
1 材料与方法 |
1.1 实验材料 |
1.2 主要仪器设备 |
1.3 实验方法 |
2 实验结果 |
2.1 Ad-GFP 和 Ad.RGD-GFP 空载体腺病毒的获得和扩增 |
2.2 经 RGD 修饰后的腺病毒大大提高了病毒效价 |
2.3 带有 RGD 修饰的腺病毒载体较普通腺病毒有更高的感染效率 |
2.4 RGD 修饰的腺病毒通过 RGD 与靶细胞表面的整合素αvβ3、整合素αvβ5结合大大提高腺病毒对白血病细胞的感染能力 |
3 讨论 |
参考文献 |
第二部分 RGD 修饰的腺病毒介导 ING4 和 PTEN 双基因对人白血病细胞抑制作用的体外实验研究 |
1 材料与方法 |
1.1 实验材料 |
1.2 主要仪器设备 |
1.3 实验方法 |
2 实验结果 |
2.1 经 RGD 修饰的各组腺病毒的获得和扩增 |
2.2 RGD 修饰的腺病毒 Ad.RGD-ING4 、 Ad.RGD-PTEN 、Ad.RGD-ING4-PTEN 具有较高的效价 |
2.3 荧光显微镜观察腺病毒感染人白血病 MEG-01 细胞后 GFP 的表达情况 |
2.4 流式细胞仪检测腺病毒对人白血病 MEG-01 细胞的感染效率 |
2.5 Western blot 检测外源基因在 MEG-01 细胞中的表达 |
2.6 CCK8 法检测外源基因导入后对 MEG-01 细胞生长的影响 |
2.7 AnnexinV-PE/7-AAD 双染法检测外源基因对 MEG01 细胞凋亡的影响 |
2.8 外源基因 ING4 和/或 PTEN 导入后,MEG-01 细胞内凋亡相关蛋白的表达变化 |
2.9 PI 染色检测外源基因对 MEG-01 细胞周期的影响 |
2.10 周期调控相关基因 P21 在外源基因导入后的蛋白表达水平上调 |
2.11 重组腺病毒对 MEG-01 人白血病细胞体外侵袭能力影响 |
3 讨论 |
参考文献 |
第三部分 RGD 修饰的腺病毒介导 ING4 和 PTEN 双基因对人白血病细胞抑制作用的体内实验研究 |
1 材料与方法 |
1.1 实验材料 |
1.2 主要仪器设备 |
1.3 方法 |
2 结果 |
2.1 MEG-01 人白血病裸鼠移植瘤模型的建立及成功率 |
2.2 裸鼠体内药物实验安全性观察 |
2.3 各重组腺病毒对 MEG-01 人白血病细胞裸鼠移植瘤的体内抗肿瘤效应观察 |
2.4 免疫组化检测腺病毒在裸鼠体内抗人白血病移植瘤效应的分子机制 |
3. 讨论 |
参考文献 |
综述 |
参考文献 |
发表和待发表的论文 |
本论文受下列课题资助 |
缩略词表 |
致谢 |
(6)腺病毒E1A蛋白对糖皮质激素抗炎作用的影响及其机制研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
ABSTRACT |
前言 |
第一章 稳定表达腺病毒 E1A 蛋白的人肺泡上皮细胞株的构建 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
第二章 腺病毒 E1A 蛋白对人肺泡上皮细胞炎症因子的影响 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
第三章 腺病毒 E1A 蛋白对糖皮质激素抗炎作用的影响及可能的信号通路 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
论文综述 |
综述参考文献 |
致谢 |
攻读学位期间发表的论文 |
个人简介 |
(7)E1A基因阻遏子基因抑制TNF-α诱导的骨髓间充质干细胞凋亡的作用与机制研究(论文提纲范文)
缩略语表 |
中文摘要 |
Abstract |
前言 |
文献回顾 |
1 骨髓间充质干细胞概述及其临床应用 |
2 人E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes, CREG)概述及最新研究进展 |
3 核转录因子κB(Nuclear translocation of the transcription factor nuclear factor-κB NF-κB)与细胞凋亡 |
实验一 过表达CREG抑制TNF-α诱导的骨髓间充质干细胞的凋亡 |
1 材料 |
2 方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
实验二 过表达CREG通过NF-κB 信号通路抑制 TNF-α诱导的骨髓间充质干细胞的凋亡 |
1 材料 |
2 方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
实验三 过表达CREG 抑制TNF-α刺激的BMSC中 NF-κB 的核转位及相关凋亡蛋白的转录 |
1 材料 |
2 方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
小结 |
参考文献 |
个人简历和研究成果 |
致谢 |
(8)pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES双基因—放射治疗的体外抑瘤效应实验研究(论文提纲范文)
内容提要 |
英文缩略词 |
第1章 绪论 |
1.1 基因治疗的研究进展及发展前景 |
1.1.1 基因治疗的基本概念 |
1.1.2 基因治疗的发展现状 |
1.1.3 基因治疗的途径 |
1.1.4 基因治疗的导入系统 |
1.1.4.1 病毒载体系统 |
1.1.4.2 非病毒载体系统 |
1.1.5 基因治疗中的关键点 |
1.1.5.1 有效目的基因的选择 |
1.1.5.2 目的基因的稳定表达 |
1.1.5.3 目的基因转染的靶向性 |
1.1.5.4 完善的载体系统 |
1.1.6 基因治疗中存在的问题 |
1.1.6.1 基因治疗的安全性问题 |
1.1.6.2 基因治疗中的伦理问题 |
1.1.6.3 基因治疗中专利争夺问题 |
1.1.7 基因治疗的前景 |
1.2 肿瘤的基因治疗 |
1.2.1 抑癌基因治疗 |
1.2.2 抗致癌基因治疗 |
1.2.3 抗肿瘤血管生成基因治疗 |
1.2.4 药物敏感基因治疗 |
1.2.5 免疫基因治疗 |
1.2.6 多药耐药基因治疗 |
1.3 肿瘤基因-放射治疗 |
1.3.1 肿瘤基因-放射治疗的理论 |
1.3.2 基因-放射治疗分类 |
1.3.2.1 药物敏感基因系统与放射治疗的联合 |
1.3.2.2 肿瘤抑制基因与放射治疗的联合 |
1.3.2.3 免疫基因治疗与放射治疗的联合 |
1.3.2.4 电离辐射诱导启动子的基因治疗 |
1.3.2.5 双(多)基因治疗与放射治疗的联合 |
1.3.2.6 放疗保护性基因治疗 |
1.3.3 Egr-1 介导的肿瘤基因-放射治疗研究进展 |
1.3.3.1 Egr-1 基因的结构及辐射诱导特性 |
1.3.3.2 辐射诱导Egr-1 启动下游基因表达的研究进展 |
1.4 TRAIL与肿瘤 |
1.4.1 TRAIL的结构特点 |
1.4.2 TRAIL的表达调控 |
1.4.3 TRAIL的受体 |
1.4.3.1 TRAILR1(DR4) |
1.4.3.2 TRAILR2(DR5) |
1.4.3.3 TRAILR3(DcR1) |
1.4.3.4 TRAILR4(DcR2) |
1.4.3.5 OPG |
1.4.3.6 TRAIL受体的表达调控 |
1.4.4 TRAIL诱导调亡的分子机制 |
1.4.4.1 TRAIL诱导凋亡的死亡受体途径 |
1.4.4.2 TRAIL诱导凋亡的线粒体途径 |
1.4.4.3 TRAIL诱导凋亡的NF-κB途径 |
1.4.5 正常细胞逃逸凋亡的机制 |
1.4.5.1 诱骗受体的保护作用 |
1.4.5.2 cFLIP对凋亡通路的封闭 |
1.4.5.3 凋亡抑制蛋白的作用 |
1.4.5.4 其他 |
1.4.6 TRAIL在肿瘤研究中的应用 |
1.4.6.1 TRAIL抗肿瘤研究现状 |
1.4.6.2 TRAIL抗肿瘤作用 |
1.4.6.3 TRAIL 的安全性 |
1.5 endostatin与肿瘤 |
1.5.1 endostatin的发现及结构特点 |
1.5.2 endostatin的组织分布 |
1.5.3 endostatin的抗血管生成作用及机制 |
1.5.3.1 endostatin抑制血管内皮细胞增殖 |
1.5.3.2 endostatin诱导内皮细胞周期阻滞和细胞凋亡 |
1.5.3.3 endostatin抑制内皮细胞迁移、粘附过程 |
1.5.4 endostatin与肿瘤的相关性 |
1.5.5 内皮抑素抗肿瘤血管生成治疗的研究 |
1.5.5.1 直接使用重组内皮抑素蛋白 |
1.5.5.2 通过载体转导内皮抑素基因 |
1.5.5.3 其他内皮抑素治疗方法 |
1.5.5.4 内皮抑素与其他治疗手段联合应用 |
第2章 材料与方法 |
2.1 主要试剂及器材 |
2.1.1 试剂 |
2.1.2 器材 |
2.2 主要仪器 |
2.3 质粒与菌株 |
2.4 细胞株 |
2.5 照射条件 |
2.6 细胞生物学实验方法 |
2.6.1 培养液配制 |
2.6.2 胎牛血清制备 |
2.6.3 D-Hank’s液的配制 |
2.6.4 胰酶的配制 |
2.6.5 细胞培养 |
2.6.6 细胞冻存 |
2.6.7 细胞转染 |
2.6.8 细胞毒性检测 |
2.6.9 FCM检测细胞凋亡 |
2.6.10 FCM检测细胞周期 |
2.7 分子生物学实验方法 |
2.7.1 细菌培养技术 |
2.7.1.1 溶液的配制 |
2.7.1.2 细菌复苏 |
2.7.1.3 细菌培养 |
2.7.1.4 细菌冻存 |
2.7.1.5 感受态菌的制备(氯化钙法) |
2.7.1.6 细菌转化 |
2.7.1.7 质粒提取 |
2.7.2 重组表达载体的构建 |
2.7.2.1 组织和细胞中总RNA提取 |
2.7.2.2 RNA的定量 |
2.7.2.3 引物设计及合成 |
2.7.2.4 RT-PCR法钓取shES基因 |
2.7.2.5 PCR获得Egr-1 启动子和shTRAIL基因 |
2.7.2.6 琼脂糖凝胶电泳 |
2.7.2.7 RT-PCR产物鉴定及测序 |
2.7.2.8 DNA操作 |
2.7.2.9 重组子的鉴定 |
2.7.2.10 目的基因的表达 |
2.8 统计学方法 |
第3章 实验结果 |
3.1 重组质粒的构建及鉴定 |
3.1.1 目的基因的获得 |
3.1.1.1 Egr-1 启动子的获得和鉴定 |
3.1.1.2 shTRAIL基因的获得和鉴定 |
3.1.1.3 shES基因的获得和鉴定 |
3.1.2 重组质粒的构建及鉴定 |
3.1.2.1 重组单基因质粒pshuttle-Egr1-shES的构建及鉴定 |
3.1.2.2 重组单基因质粒pshuttle-Egr1-shTRAIL的构建及鉴定 |
3.1.2.3 重组双基因质粒pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES的构建及鉴定 |
3.2 X射线照射后重组质粒在MCF-7 细胞中的辐射诱导表达规律 |
3.2.1 X射线照射后重组质粒转染的MCF-7 细胞中shTRAIL表达水平变化 |
3.2.1.1 2.0 Gy X射线照射后重组质粒转染的MCF-7 细胞中shTRAIL mRNA表达的时程变化 |
3.2.1.2 2.0 Gy X射线照射后重组质粒转染的MCF-7 细胞上清中shTRAIL蛋白表达的时程变化 |
3.2.1.3 不同剂量X射线照射后重组质粒转染的MCF-7 细胞中 shTRAIL mRNA表达的量效变化 |
3.2.1.4 不同剂量X射线照射后重组质粒转染的MCF-7 细胞上清中shTRAIL蛋白表达的量效变化 |
3.2.2 X射线照射后重组质粒转染的MCF-7 细胞中shES表达水平变化 |
3.2.2.1 2.0 Gy X射线照射后重组质粒转染的MCF-7 细胞中shES mRNA表达的时程变化 |
3.2.2.2 2.0 Gy X射线照射后重组质粒转染的MCF-7 细胞上清中shES蛋白表达的时程变化 |
3.2.2.3 不同剂量X射线照射后重组质粒转染的MCF-7 细胞中shES mRNA表达的量效变化 |
3.2.2.4 不同剂量X射线照射后重组质粒转染的MCF-7 细胞上清中shES蛋白表达的量效变化 |
3.3 X射线照射后重组质粒在ECV304 细胞中的辐射诱导表达规律 |
3.3.1 X射线照射后重组质粒转染的ECV304 细胞中shTRAIL表达水平变化 |
3.3.1.1 2.0 Gy X射线照射后重组质粒转染的ECV304 细胞中shTRAIL mRNA表达的时程变化 |
3.3.1.2 2.0 Gy X射线照射后重组质粒转染的ECV304 细胞上清中shTRAIL蛋白表达的时程变化 |
3.3.1.3 不同剂量X射线照射后重组质粒转染的ECV304 细胞中shTRAIL mRNA表达的量效变化 |
3.3.1.4 不同剂量X射线照射后重组质粒转染的ECV304 细胞上清中shTRAIL蛋白表达的量效变化 |
3.3.2 X射线照射后重组质粒转染的ECV304 细胞中shES表达水平变化 |
3.3.2.1 2.0 Gy X射线照射后重组质粒转染的ECV304 细胞中shES mRNA表达的时程变化 |
3.3.2.2 2.0 Gy X射线照射后重组质粒转染的ECV304 细胞上清中shES蛋白表达的时程变化 |
3.3.2.3 不同剂量X射线照射后重组质粒转染的ECV304 细胞中shES mRNA表达的量效变化 |
3.3.2.4 不同剂量X射线照射后重组质粒转染的ECV304 细胞上清中shES蛋白表达的量效变化 |
3.4 重组质粒联合X射线照射对MCF-7 细胞作用的实验研究 |
3.4.1 重组质粒联合X射线照射对MCF-7 细胞的生长抑制作用 |
3.4.1.1 重组质粒联合2.0 Gy X射线照射对MCF-7细胞生长抑制的时程效应 |
3.4.1.2 重组质粒联合不同剂量X射线照射对MCF-7 细胞生长抑制的剂量效应 |
3.4.2 重组质粒联合X射线照射对MCF-7 细胞凋亡的影响 |
3.4.3 重组质粒联合X射线照射对MCF-7 细胞周期的影响 |
3.5 重组质粒联合X射线照射对ECV304 细胞作用的实验研究 |
3.5.1 重组质粒联合X射线照射对ECV304 细胞的生长抑制作用 |
3.5.1.1 重组质粒联合2.0 Gy X射线照射对ECV304 细胞生长抑制的时程效应 |
3.5.1.2 重组质粒联合不同剂量X射线照射对ECV304 细胞生长抑制的剂量效应 |
3.5.2 重组质粒联合X射线照射对ECV304 细胞凋亡的影响 |
3.5.3 重组质粒联合X射线照射对ECV304 细胞周期的影响 |
第4章 讨论 |
4.1 目的基因的获得和重组质粒的构建 |
4.1.1 Egr-1 启动子的获得及其辐射敏感特性 |
4.1.2 shTRAIL基因的获得 |
4.1.3 shES基因的获得 |
4.1.4 多基因共表达系统 |
4.1.5 辐射诱导重组质粒的构建 |
4.2 重组质粒pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES体外辐射诱导表达规律 |
4.2.1 2.0 Gy X射线照射后重组质粒转染的MCF-7 细胞/上清中shTRAIL和shES mRNA和蛋白表达的时程变化 |
4.2.2 不同剂量X射线照射后重组质粒转染的MCF-7 细胞/上清中shTRAIL和shES mRNA和蛋白表达的量效变化 |
4.2.3 2.0 Gy X射线照射后重组质粒转染的ECV304 细胞/上清中shTRAIL和shES mRNA和蛋白表达的时程变化 |
4.2.4 不同剂量X射线照射后重组质粒转染的ECV304 细胞/上清中shTRAIL和shES mRNA和蛋白表达的量效变化 |
4.3 重组质粒联合X射线照射对MCF-7 和ECV304 细胞作用的实验研究 |
4.3.1 重组质粒联合X射线照射对MCF-7和ECV304细胞的生长抑制作用 |
4.3.2 重组质粒联合X射线照射对MCF-7 和ECV304 细胞凋亡的影响 |
4.3.3 重组质粒联合X射线照射对MCF-7 和ECV304 细胞周期的影响 |
结论 |
参考文献 |
攻博期间发表的学术论文及其他成果 |
致谢 |
中文摘要 |
ABSTRACT |
(9)IκBαM重组腺相关病毒载体的构建及其对大鼠自体原位肝移植胆道缺血再灌注损伤的保护作用(论文提纲范文)
中文提要 |
Abstract |
引言 |
第一部分:大鼠自体原位肝移植胆道缺血再灌注损伤模型的建立及肝脏再灌注损伤中NF-κB激活的研究 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
附图 |
第二部分:IκBαM基因重组腺相关病毒载体的构建及鉴定 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
第三部分:rAAV- IκBαM 对大鼠自体原位肝移植胆道缺血再灌注损伤的保护作用 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
综述 |
攻读学位期间公开发表的论文 |
缩略词表 |
致谢 |
(10)转染人热休克蛋白70基因(hHSP70)对大鼠同种异体移植肺缺血再灌注的影响(论文提纲范文)
英汉缩略词表 |
中文摘要 |
英文摘要 |
前言 |
第一部分 hHSP 70 基因腺病毒载体的构建 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
第二部分 “两袖套一支架管”大鼠左肺原位移植模型的建立 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
第三部分 腺病毒介导 hHSP 70 离体转基因对大鼠同种异体移植肺缺血再灌注损伤的影响 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
致谢 |
在学期间发表的论文 |
四、改造的腺病毒5型E1A基因对TNF-α诱导的猪血管内皮细胞中NF-κB活性的抑制作用(论文参考文献)
- [1]双特异性溶瘤腺病毒Ad-VT对卵巢癌抑制作用研究[D]. 崔英丽. 吉林大学, 2021(01)
- [2]阳离子PCL-b-P(GMA-EA)载体递送pGRIM-19抗神经母细胞瘤的研究[D]. 徐阳. 吉林大学, 2020(03)
- [3]HSV-1溶瘤病毒用于肿瘤精准治疗及肿瘤耐受机制的研究[D]. 沈阳坤. 福建师范大学, 2020(12)
- [4]NF-κB和端粒酶启动的肿瘤基因治疗新技术研究[D]. 戴薇. 东南大学, 2019(01)
- [5]RGD修饰的腺病毒介导ING4和PTEN双基因对人白血病细胞的抑制作用[D]. 黄晨. 苏州大学, 2014(09)
- [6]腺病毒E1A蛋白对糖皮质激素抗炎作用的影响及其机制研究[D]. 郭园园. 宁夏医科大学, 2012(08)
- [7]E1A基因阻遏子基因抑制TNF-α诱导的骨髓间充质干细胞凋亡的作用与机制研究[D]. 彭程飞. 第四军医大学, 2011(04)
- [8]pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES双基因—放射治疗的体外抑瘤效应实验研究[D]. 李艳博. 吉林大学, 2009(08)
- [9]IκBαM重组腺相关病毒载体的构建及其对大鼠自体原位肝移植胆道缺血再灌注损伤的保护作用[D]. 张宏伟. 苏州大学, 2009(06)
- [10]转染人热休克蛋白70基因(hHSP70)对大鼠同种异体移植肺缺血再灌注的影响[D]. 郭朝晖. 福建医科大学, 2008(12)