一、金属硫蛋白溶液聚合状态的研究（论文文献综述）
陈亚楠[1]（2021）在《构建荧光海水青鳉用于海水中重金属监测》文中指出工业革命以来,海洋重金属污染在沿海地区频频发生,已严重威胁近岸海域的生态环境和人类健康。对海洋重金属进行生物学监测研究是生态环境保护的重要环节,引起了很多研究者们的关注。海水青鳉（Oryzias melastigma）具有体型小、性成熟时间短、胚胎透明、体外发育、可在实验室大量培养等优点,这使其成为海洋污染监测和生态毒理研究中重要的模式生物。本实验通过克隆野生型海水青鳉金属硫蛋白基因（metallothionein,mt）的启动子,并对其进行改造,构建了8个含不同修饰启动子的质粒。通过293T细胞实验对8个质粒进行重金属敏感性筛选,发现以Om MT（D1&2）为启动子构建的p ISce I-Om MT（D1&2）-e GFP质粒对Zn2+的敏感型最高,当浓度达到200μM时,荧光强度达到最大值,此时金属硫蛋白表达效果也显着增加,外源性绿色荧光基因（e GFP）的表达水平与内源性mt的表达水平具有良好的相关性。利用显微注射技术,将质粒p ISce I-Om MT（D1&2）-e GFP转入海水青鳉未分裂受精卵中,筛选出能够表达e GFP的海水青鳉(Tg（Om MT-e GFP）作为F0代。以Tg（Om MT-e GFP）海水青鳉1-3 dpf幼鱼为实验对象,分别进行Cd2+、Zn2+、Hg2+和Cu2+的急性毒性实验（72 h）,发现转基因海水青鳉对环境中重金属响应敏感(0.005μM Zn2+,0.001μM Cd2+,0.002μM Cu2+和0.0002μM Hg2+),低于国标,这表明低浓度的重金属可可诱发转基因海水青鳉荧光蛋白的表达。实时荧光定量检测发现高浓度的重金属均能诱导上调Om MT和e GFP基因的表达,内外两个基因与环境重金属浓度均表现出明显的正相关,特别在肝脏中,绿色荧光蛋白的表达能够随着环境重金属浓度升高而明显增强。本研究获得了能够敏感响应海水重金属浓度并表达e GFP的转基因海水青鳉Tg（Om MT-e GFP）,为海水重金属污染提供了一种实时高效的生物学监测技术,有望成为海洋环境中重金属检测的生物感应器。同时,研究结果也为进一步利用转基因生物进行环境监测研究提供了有价值的参考资料。
许志楠[2]（2020）在《土壤锑镉对赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）的生态毒理学效应》文中认为我国锑（Antimony,Sb）和镉（Cadmium,Cd）的储备量和开采量均位居世界第一。我国是纺织印染大国,锑镉复合污染已出现于纺织印染行业聚集区。锑和镉在土壤和水环境中迁移转化和归宿已有较多研究,但锑和锑镉复合污染对蚯蚓的生态毒理学效应的研究极少。本文以土壤锑、镉为研究对象,选择赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）作为受试生物,采用土培法,探讨了土壤锑及锑镉复合胁迫对土壤质量的可靠指示者蚯蚓的生态毒理学效应,主要研究结果有:（1）采用Logistic函数评价土壤锑在老化前后对赤子爱胜蚓的影响,建立了土壤锑的处理水平与蚯蚓的回避效应、逃逸率和死亡率的剂量-效应关系。以15 d的800 mg/kg的处理水平为例,30d的老化过程可以显着降低蚯蚓对锑的死亡率（93.33%降至66.67%）、净回避效应值（36.67%降至13.33%）和逃逸率（100%降至53.33%）。72 h、7 d和15 d的半致死含量依次由老化前的355.27 mg/kg、322.19mg/kg和282.74 mg/kg上升至老化后的2324.55 mg/kg、1743.19 mg/kg和745.94mg/kg,表明老化过程降低土壤锑对蚯蚓的毒性。老化后弱酸提取态锑占总锑的平均比例由23.09%下降到14.00%,24 h的蚯蚓死亡率随之下降。（2）采用生物标志物响应指数（Biomarker Response Index,BRI）和效应添加指数（Effect addition index,EAI）表征了蚯蚓锑镉复合污染土壤中暴露7 d、14 d、21 d和28 d后的联合效应。结果表明,蚯蚓体内锑的积累不明显;其次,在锑镉单一及复合胁迫下蛋白质含量整体下降了13.86%～58.87%,丙二醛含量和金属硫蛋白可提升至1.23 nmol/mg Pr和40.82μg/mg Pr,超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶活性整体上升37.10%～708.11%、18.94%～184.80%、9.38%～150.54%,BRI和EAI分别为1.32～3.35和﹣0.1549～﹣0.7561,表明锑镉复合污染对蚯蚓产生了拮抗效应。（3）通过土培法,评估了蚯蚓对锑镉污染土壤的土壤酶活性、锑镉形态分布、生物有效性和生物可给性的影响。结果表明,蚯蚓对污染土壤的蔗糖酶、脲酶和中性磷酸酶的活性具有提升效应,最大可分别提高56.68%、114.56%和118.97%,但能抑制了土壤过氧化氢酶活性最高可达65.59%,对土壤蛋白酶则无显着影响。蚯蚓可促进锑、镉污染土壤的酶指数（几何均值指数）上升,具有潜在的土壤改良功能。但蚯蚓可导致土壤锑的弱酸提取态上升4.02%～28.39%,并导致土壤锑的生物有效性与生物可给性至多提升33.33%和20.09%,但使得土壤镉的生物有效性和生物可给性至多下降30.71%和13.96%（4）采用微生物群落组成谱分析法评价蚯蚓对锑镉污染土壤细菌的生物多样性影响。结果表明,蚯蚓处理后Chao1、Pielou和Shannon指数分别为3701.51～4165.40、0.815699～0.849948和9.6081～10.0925,蚯蚓促进了锑镉污染土壤中细菌的均匀度、丰富度和多样性,并导致土壤细菌组成丰度和优势地位发生改变,使得鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）等在蚯蚓处理土壤中相对占优,而乳杆菌属（Lactobacillus）、Sphingomonas jaspsi等的优势地位下降。蚯蚓对锑镉污染土壤的微生物多样性具有促进效果。本文研究了土壤锑及锑镉复合污染对蚯蚓的生态毒理效应,阐明了锑镉复合污染的交互作用机制,为土壤锑、镉污染的治理提供了重要支持,对土壤环境中锑的危害和风险评价具有科学意义。
许霞青[3]（2020）在《PARP1负性调控MT1M在卵巢癌转移中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景:卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一,其发病率在我国位居第三位仅次于宫颈癌和宫体癌,严重影响人类健康。近年来,ADP核糖聚合酶（Poly ADP-ribose Polymerase,PARP）抑制剂在卵巢癌的治疗中取得显着成效,开启了小分子抑制剂靶向治疗卵巢癌的大门。目前,PARP抑制剂主要被批准用于BRCA（Breast cancer）突变的卵巢癌患者。然而,随着临床试验数据的累积,研究者发现不论患者是否存在BRCA突变,使用PARP抑制剂Niraparib Rucaparib治疗的卵巢癌患者均能获益,显着改善了患者的无疾病生存期。因此,如何从PARP1（Poly ADP-ribose Polymerase 1）的生物学功能出发理解临床上这一现象成为该领域的研究热点。随着PARP1研究的深入关于它的其他生物学功能也开始受到关注。近年来的研究发现PARP1可以通过激活转录因子、抑制转录因子活性的方式或直接作为转录因子调控基因表达,从而调控肿瘤细胞的多种生物学功能。本研究通过分析TCGA数据库（The cancer genome atlas）发现PARP1 m RNA高度表达与卵巢癌、乳头状肾细胞癌、ER+（Estrogen receptor-positive）乳腺癌以子宫体癌患者的无疾病生存期（Progress free survival,PFS）呈显着负相关,并将这四种肿瘤中与无疾病生存期相关的基因进行重合分析,发现91个基因的表达与PARP1 m RNA的高度表达呈负相关。同时,在卵巢癌细胞上分别敲除PARP1、过表达PARP1和给予PARP抑制剂Olaparib,采用全基因组芯片检测基因变化,发现13个基因与PARP1的高度表达呈显着负相关。进而将从TCGA数据分析获得的91个基因与芯片分析获得的13个基因进行重合对比分析,发现PARP1蛋白表达与金属硫蛋白-1M（Metallothionein 1M,MT1M）基因转录呈显着负相关,这提示MT1M可能是PARP1调控的靶基因。那么,PARP1是否通过负性调控MT1M,从而调控卵巢癌的哪些生物学行为?金属硫蛋白-1M（MT1M）是半胱氨酸富集的小分子蛋白,属于金属硫蛋白（MT-1）家族成员,特异性结合金属离子,在金属解毒氧化应激保护方面发挥重要作用。近年来研究表明MT1M能够显着抑制多种肿瘤的增殖与转移,如肝细胞癌、甲状腺乳头状癌,是潜在的抑癌基因。考虑到MT1M在肿瘤细胞中抑制肿瘤细胞增殖与转移的作用,本研究推断PARP1可能通过负性调控MT1M参与肿瘤细胞的增殖与转移。本研究将围绕PARP1负性调控MT1M表达这一生物学现象,考察PARP1负性调控MT1M在卵巢癌增殖与转移中的作用具体的分子机制:（1）分析TCGA数据库中PARP1 m RNA的高度表达与多种肿瘤无疾病进展期的相关性,结合卵巢癌细胞基因芯片的数据,发现PARP1负性调控卵巢癌细胞中MT1M的表达;（2）明确MT1M的表达对卵巢癌细胞增殖与迁移的影响,并寻找PARP1调控MT1M表达的具体分子机制;（3）MT1M的表达在PARP抑制剂抗卵巢癌转移的作用。本研究发现了PARP1新的靶基因MT1M以调控卵巢癌转移的新机制即PARP1通过抑制MT1M表达促进卵巢癌转移,并为PARP抑制剂在卵巢癌治疗中的应用提供新的理论依据。第一部分PARP1抑制MT1M转录促进卵巢癌转移的作用研究研究方法:（1）采用TCGA数据库分析在PARP1 m RNA表达与与卵巢癌、乳头状肾细胞癌、ER+乳腺癌、子宫体癌、膀胱癌、睾丸生殖细胞肿瘤、头颈鳞状细胞癌、以胰腺导管腺癌患者的无疾病生存期的相关性;（2）进一步采用Kmplot数据库分析,找到与PARP1 m RNA表达呈负相关性的基因;（3）在非BRCA突变的卵巢细胞OVCAR8上分别敲除PARP1、过表达PARP1和给予PARP抑制剂Olaparib,采用全基因芯片检测基因变化,寻找与PARP1表达呈负相关的基因;（4）将TCGA数据库分析出与PARP1表达呈负相关的基因,与卵巢癌细胞OVCAR8中与PARP1表达呈负相关的基因进行重合对比分析,发现了PARP1调控新的靶基因MT1M;（5）在非BRCA突变的卵巢癌SKOV3、Ca OV3和OVCAR8,沉默PARP1,采用Western blotting法、荧光实时定量PCR法以Elisa法验证PARP1对MT1M表达的影响。（6）在卵巢癌细胞SKOV3、Ca OV3中过表达MT1M,采用SRB实验考察过表达MT1M对卵巢癌细胞增殖的影响;（7）在卵巢癌细胞SKOV3、Ca OV3中过表达MT1M或敲除MT1M,采用Transwell实验和划痕愈合实验考察MT1M的表达对卵巢癌细胞迁移的影响;（8）在SKOV3细胞中过表达MT1M,并收集上清作条件培养基,考察MT1M的分泌对卵巢癌细胞迁移的影响;（9）在卵巢癌细胞OVCAR8上过表达PARP1,采用划痕实验考察PARP1的高度表达对卵巢癌细胞迁移的影响;同时在SKOV3和Ca OV3上敲除PARP1,采用Transwell实验考察沉默PARP1对卵巢癌细胞迁移的影响。研究结果:（1）PARP1 m RNA表达与与卵巢癌、乳头状肾细胞癌、ER+乳腺癌、子宫体癌等的无疾病生存期呈负相关。而PARP1 m RNA的表达与膀胱癌、睾丸生殖细胞肿瘤、头颈鳞状细胞癌、以胰腺导管腺癌患者的无疾病生存期没有明显的相关性。（2）采用Kmplot数据库分析卵巢癌、子宫体癌、乳头状肾细胞癌、ER+乳腺癌,这四种肿瘤中与PARP1表达呈负相关的基因,发现91个基因与PARP1的表达呈负相关。（3）在卵巢癌细胞OVCAR8上,分析过表达PARP1转录表达显着降低的基因,沉默PARP1转录表达显着增加的基因以给予Olaparib转录表达显着增加的基因,发现13个基因与PARP1的表达呈负相关。（4）对比重合分析TCGA数据库得到的91个基因与卵巢癌细胞OVCAR8基因芯片得到的13个基因,发现了与PARP1表达呈负相关的靶基因-MT1M。（5）在卵巢癌细胞SKOV3、Ca OV3和OVCAR8,沉默PARP1,MT1M的转录表达显着增加,其蛋白表达也显着增加。同时发现敲除PARP1,能够促进MT1M的分泌。（6）过表达MT1M不影响卵巢癌细胞的增殖。在卵巢癌细胞SKOV3和Ca OV3上,过表达MT1M,通过SRB法检测细胞增殖,结果显示MT1M的高度表达对卵巢肿瘤细胞增殖没有影响。（7）MT1M的表达可影响卵巢癌细胞的迁移。在卵巢癌细胞SKOV3和Ca OV3上,过表达MT1M能够显着抑制卵巢癌细胞的迁移;而敲除MT1M,SKOV3的迁移能力显着增强。（8）MT1M的分泌可影响卵巢细胞的迁移。在SKOV3上,首先过表达MT1M,并收集过表达成功后的细胞上清作为条件培养基,再通过Traswell法发现过表达MT1M的条件培养基可显着抑制SKOV3细胞的迁移。（9）PARP1的表达可影响卵巢癌细胞的迁移。在卵巢癌细胞OVCAR8上,过表达PARP1,通过划痕实验法发现PARP1的高度表达可显着抑制卵巢细胞迁移;而敲除PARP1则明显抑制卵巢癌细胞SKOV3和Ca OV3的迁移能力。第二部分PARP1抑制卵巢癌MT1M转录的分子机制研究研究方法:（1）采用数据库预测分析潜在调控MT1M表达的转录因子,采用q RT-PCR实验考察在卵巢癌细胞SKOV3中,沉默预测的转录因子在Olaparib上调MT1M转录表达中的作用,筛选到转录因子FOXP3（Forkhead box 3）;（2）考察FOXP3的表达对MT1M转录表达蛋白表达的影响;（3）采用免疫共沉淀方法,考察PARP1与FOXP3的结合情况;（4）采用检测PAR修饰的实验方法,考察PARP1对FOXP3核糖基化修饰的情况;（5）采用检测PAR修饰的实验方法,考察给予Olaparib对PARP1核糖基化FOXP3的影响;（6）采用核糖基化位点突变的PARP1（Flag-PARP1-E988K）,考察位点突变Flag-PARP1-E988K对FOXP3核糖基化修饰的影响;（7）采用荧光素酶报告基因法,考察PARP1和Flag-PARP1-E988K对FOXP3介导的MT1M转录表达的影响;（8）采用Western blotting实验方法考察在卵巢癌细胞OVCAR8上,给予Olaparib和敲除PARP1对FOXP3蛋白表达的影响。研究结果:（1）PARP1通过FOXP3调控MT1M的转录首先,采用数据库预测分析MT1M潜在的转录因子,发现STAT1、STAT3、FOXP3和E2F1等转录因子可能是调控MT1M表达的转录因子,进一步采用q RT-PCR实验考察在卵巢癌细胞SKOV3中,沉默这些转录因子考察其在Olaparib上调MT1M转录表达中的作用,筛选到转录因子FOXP3即沉默FOXP3,Olaparib上调MT1M的作用消失。（2）FOXP3调控MT1M的转录表达蛋白表达在SKOV3细胞中过表达FOXP3和敲除FOXP3,采用western blotting和q RT-PCR实验方法考察过表达FOXP3和沉默FOXP3对MT1M转录蛋白表达的影响,发现过表达FOXP3能够显着增加MT1M的转录水平和蛋白水平;而敲除FOXP3则明显下调MT1M的转录蛋白水平。（3）PARP1与FOXP3直接结合。在293T细胞中,过表达Flag-PARP1和HA-FOXP3,采用免疫沉淀的方法,发现PARP1与FOXP3之间存在结合。（4）PARP1促使FOXP3发生核糖基化修饰在293T细胞中,过表达Flag-PARP1和HA-FOXP3,采用检测PAR修饰的方法,发现PARP1促使FOXP3发生核糖基化修饰。（5）Olaprib能够抑制由PARP1介导FOXP3发生核糖基化修饰在293T细胞中,过表达Flag-PARP1和HA-FOXP3,并给予Olaparib作用6h,采用检测PAR修饰的方法,发现给予PARP抑制剂Olaparib后则抑制PARP1促使FOXP3发生核糖基化修饰。（6）核糖基化活性突变的质粒Flag-PARP1-E988K不能使FOXP3发生核糖基化修饰。同时在293T细胞上,过表达Flag-PARP1-E988K和HA-FOXP3,采用检测PAR修饰的方法,发现Flag-PARP1-E988K不能使FOXP3发生核糖基化修饰。（7）PARP1通过调控FOXP3的核糖基化修饰从而调控MT1M的转录表达。在卵巢癌细胞SKOV3上,过表达Vector、HA-FOXP3、Flag-PARP1、Flag-PARP1-E988K、HA-FOXP3+Flag-PARP以HA-FOXP3+Flag-PARP1-E988K,采用荧光素酶报告基因法,发现HA-FOXP3促进MT1M的转录表达,而PARP1则抑制由FOXP3介导的MT1M的转录表达;PARP1-E988K由于其核糖基化功能缺失不影响由FOXP3介导的MT1M的转录表达。（8）在卵巢癌细胞中,给予Olaparib以沉默PARP1对FOXP3表达的影响在卵巢癌细胞OVCAR8上,给予Olaparib,发现FOXP3的蛋白表达随着Olaparib浓度的增加而增加;而在SKOV3和Ca OV3上敲除PARP1,则促进FOXP3的蛋白表达。第三部分PARP抑制剂促进MT1M表达抗卵巢癌转移的作用研究研究方法:（1）在卵巢癌细胞SKOV3和OVCAR8中,给予不同浓度的Olaparib,采用Western blotting法、q RT-PCR法以Elisa法来考察Olaparib对MT1M蛋白表达、转录表达以分泌的影响;（2）在卵巢细胞SKOV3和Ca OV3上,给予不同的PARP抑制剂Olaparib、Veliparib和Niraparib,采用划痕愈合实验和Transwell小室法来考察不同的PARP抑制剂对卵巢细胞迁移的影响;（3）采用慢病毒构建MT1M稳定敲除的卵巢癌细胞SKOV3（sh-MT1M）,再给予PARP抑制剂Olaparib,考察MT1M在PARP抑制剂抑制卵巢癌细胞迁移中的作用;（4）采用尾静脉接种Ca OV3形成转移的裸鼠模型,给予Olaparib,考察PARP抑制剂对卵巢癌细胞转移的影响;（5）采用人源高转移卵巢癌PDX模型,通过腋下接种方式,并给予Olaparib,考察Olaparib对卵巢癌转移的影响,以MT1M在PARP抑制剂抗肿瘤转移中的作用。研究结果:（1）PARP抑制剂可以上调卵巢癌细胞MT1M转录表达以分泌在卵巢癌细胞SKOV3、Ca OV3和OVCAR8上,给予浓度梯度的Olaparib,Western blotting法和q RT-PCR法检测MT1M的表达分泌,发现Olaparib浓度依赖上调MT1M的转录蛋白表达。同时给予不同的PARP抑制剂,采用Elisa法检测对MT1M分泌的影响,发现这些PARP抑制剂均能促进MT1M的分泌。（2）不同的PARP抑制剂均能明显抑制卵巢癌细胞的迁移在卵巢癌细胞SKOV3和Ca OV3,采用划痕愈合实验和Transwell小室法,考察不同抑制剂对卵巢癌细胞迁移的影响。结果显示不同的PARP抑制剂均能显着抑制卵巢癌细胞的迁移。（3）敲除MT1M能够显着抑制PARP抑制剂抑制卵巢癌细胞迁移的能力构建稳定敲除MT1M的卵巢癌细胞株,在此基础上给予Olaparib作用,采用Transwell法检测对卵巢癌细胞迁移的影响。结果显示,敲除MT1M的卵巢癌细胞的迁移能力明显增强,而在敲除MT1M的卵巢癌细胞中给予Olaparib,发现Olaparib抑制卵巢癌细胞迁移的作用消失。（4）体内动物实验显示Olaparib可以显着卵巢癌转移,并促进MT1M的表达在尾静脉接种Ca OV3卵巢癌转移模型中,H&E染色结果显示Olaparib明显抑制肺内肿瘤转移灶点的形成。采用Elisa法检测血清中的MT1M,发现Olaparib促进MT1M的分泌。在人源高转移卵巢癌PDX模型,Olaparib抑制剂不影响肿瘤的生长。采用包氏固定法以H&E染色结果显示,Olaparib可以抑制卵巢细胞的肺转移。采用Western blotting法、q RT-PCR法以Elisa法来考察Olaparib对肿瘤内MT1M蛋白表达、转录表达以分泌的影响,结果显示Olaparib可以上调肿瘤内MT1M的转录表达以蛋白表达,并促进MT1M的分泌。研究结论:本研究发现PARP1新的靶基因MT1M,且在卵巢癌细胞中PARP1负性调控卵巢癌细胞MT1M的表达;而MT1M的高度表达能够抑制卵巢癌细胞迁移但不影响肿瘤细胞增殖;进一步研究发现FOXP3调控MT1M的表达并参与PARP1负性调控MT1M的转录表达,即PARP1与FOXP3结合使FOXP3发生核糖基化修饰,抑制FOXP3的转录活性,进而抑制MT1M的转录表达。体内动物实验验证了PARP抑制剂Olaparib确实能够抑制卵巢癌细胞的转移,促进肿瘤细胞表达MT1M。本研究不仅发现了调控卵巢癌转移的新机制,也为PARP抑制剂在卵巢癌治疗中的应用提供新的理论依据。
徐伟[4]（2020）在《金属硫蛋白1M通路与非小细胞肺癌关系的研究》文中研究表明【研究目的】1、利用实时荧光定量PCR与Western Blot分析,金属硫蛋白1M（MT1M）在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达特征。2、利用细胞增殖能力、细胞侵袭以及细胞迁移实验等研究,分析MT1M在NSCLC中的作用。研究MT1M参与肺癌形成的机制,为治疗药物研发提供新的研究方向。3、生物信息学分析筛选,MT1M表达所受转录调控因子调控的信号通路。研究MT1M构成的信号通路是否影响了NSCLC细胞增殖和细胞迁移,并探讨其可能的作用机制。【研究方法】通过基因芯片数据分析差异表达的基因,筛选出MT1M（GSE81292）在肺腺癌（LUAD）中呈现出低表达。我们收集了6例肺腺癌患者的癌组织与癌旁组织,分别运用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）和Western Blot技术,在转录水平和蛋白水平层面检测MT1M的表达量。进一步我们选取了NSCLC细胞株A549进行MT1M相关功能实验研究,在A549细胞中转染MT1M质粒,分别检测过表达MT1M后的细胞,对细胞增殖、细胞侵袭以及细胞迁移愈合能力的影响,以及高表达MT1M后对其他凋亡蛋白表达量的检测。我们通过基因相关性分析,MT1M基因的上游信号通路为p53,与MT1M基因启动子有结合位点。通过对A549分别转染MT1M质粒、p53抑制剂以及MT1M和p53抑制剂联合,验证细胞增殖能力、细胞侵袭以及细胞迁移愈合能力,同时对转染组细胞进行细胞相关迁移蛋白的检测。由于鼠双微体2（MDM2）对p53有调控作用,且在NSCLC中高表达,故排除其对p53的影响。首先,我们在A549细胞中敲低MDM2的表达,验证转染细胞株相关的细胞增殖能力、细胞侵袭和细胞迁移愈合能力;然后,对MDM2敲低组细胞联合MT1M过表达,验证细胞的增殖能力、细胞侵袭和细胞迁移愈合能力,以及对其他一些相关的细胞迁移蛋白表达量的检测;最后,进行免疫组化和免疫共沉淀实验验证MT1M、p53和MDM2蛋白之间是否存在调控作用。【研究结果】1、MT1M在NSCLC中的作用通过细胞转染MT1M质粒,培养48h后细胞增殖能力较对照组有所降低,继续培养72h后,实验组细胞的增殖能力则显着降低;实验组细胞的迁移愈合能力和细胞侵袭能力,均较对照组显着降低。Western Blot结果亦显示,在转染MT1M质粒的实验组细胞中,细胞迁移相关蛋白（MMP2、MMP9、MMP14）的表达量下降。2、p53对MT1M的调控p53可与MT1M启动子结合,加强MT1M双荧光素酶的荧光强度。抑制p53的功能,可拮抗过表达MT1M对细胞增殖、细胞迁移愈合能力和细胞侵袭能力的抑制作用。3、MDM2对p53-MT1M的调控在细胞中,敲低MDM2联合高表达MT1M后,对细胞增殖、细胞迁移愈合能力和细胞侵袭能力具有协同抑制作用。【结论】1、MT1M在NSCLC中低表达,且具有抑制肿瘤细胞活性的作用,可以考虑作为治疗的新靶点。2、MT1M基因的启动子序列存在和p53结合的位点,受到p53调控参与细胞增殖与迁移过程。3、MDM2-p53-MT1M构成的信号通路,与NSCLC细胞增殖和迁移能力密切相关。
杜晓宇[5]（2020）在《基于碳量子点的荧光共振能量转移型传感器对金属硫蛋白的检测》文中提出金属硫蛋白（Metallothioneins,MTs）是一类广泛存在于生物体的低分子量、富含半胱氨酸的热稳定性蛋白质,具有维持体内微量元素的平衡、隔离和保护免受镉、汞和铅等有毒金属的侵害、保护细胞免受氧化应激等功能。金属硫蛋白被认为是重金属污染的生物标志物,也被认为是有前途的肿瘤标志物之一。迄今为止,有关金属硫蛋白的测定方法已有很多报道,如金属饱和法、原子吸收光谱法、免疫分析法、电化学方法等。但是,这些方法大多数要么需要繁琐而复杂的过程,要么需要复杂的设备,要么缺乏足够的专一性和灵敏性。因此,找到一种能方便、灵敏的检测金属硫蛋白的方法,对其进行更加深入的研究,使其能够在各个领域发挥更大的作用具有重要的意义。近几年,基于纳米材料的光学传感器由于具有特异性高和检测限低、响应时间快,而且技术简单等特点而得到了普及。本论文主要以新型的碳纳米材料碳量子点来构建纳米荧光传感器,通过荧光共振能量转移（FRET）的方法实现对金属硫蛋白的检测的目的。主要研究内容如下:1.以对氨基水杨酸和L-谷氨酸为原料,采用一步水热法合成了发绿色荧光的氮掺杂碳量子点（N-CQDs）。探究了不同反应温度、反应时间和反应物配比对N-CQDs荧光性质的影响,得出在本实验条件下对氨基水杨酸为碳源,L-谷氨酸为氮源,两者摩尔比为2:1,反应温度为200℃,反应时间为7 h时,合成的N-CQDs的性能最优。对合成的N-CQDs进行表征,显示N-CQDs呈球形或准球形、分散性好、无明显团聚,粒径小且分布窄,范围为1-3.5 nm,平均粒径为1.93±0.46 nm;由部分石墨化的无定形碳组成,荧光量子产率约为12.8%;N-CQDs具有优异的水溶性、激发波长独立性、良好的光学稳定性。2.在第一章合成N-CQDs基础上,对其进行传感实验探究,建立了基于N-CQDs和金纳米粒子（Au NPs）的荧光共振能量转移型传感器,实现了对金属硫蛋白的识别和检测。讨论N-CQDs和Au NPs之间的结合方式及Au NPs对N-CQDs的荧光猝灭作用;研究了溶液p H、Au NPs浓度反应时间和反应温度对MTs检测的影响;考察了N-CQDs-Au NPs体系对MTs检测的灵敏性及选择性,最后将此体系用于人尿液样品中MTs的定量。结果分析表明,N-CQDs作为能量转移供体与Au NPs结合形成N-CQDs/Au NPs纳米复合物,N-CQDs的荧光发射通过FRET猝灭,猝灭常数KSV为1.77×109L·mol-1,两者之间的能量转移效率约为11.9%。加入MTs后,MTs与Au NPs通过Au-S共价键结合,系统的荧光强度随着MTs浓度的增大逐渐恢复。在优化的实验条件下N-CQDs/Au NPs FRET传感器对MTs响应灵敏度高,线性方程式（F-F0）/F0=0.00432c MTs-0.0144,检出限LOD为5.25×10-9mol·L-1,并成功用于实际样品（尿液）中痕量MTs的测定。
张珂[6]（2020）在《在茶氨酸作用下的铜介导绿茶EGCG氧化的机制研究》文中指出绿茶多酚提取物是有美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration,FDA）批准的植物性处方药,其含量最高且主要的活性物质为表没食子儿茶素没食子酸酯（（-）-epigallocatechin-3-gallate,EGCG）。EGCG具有多种益于生物体的效应,如抗氧化,预防癌症、心血管疾病,调节糖脂代谢等作用。研究发现,EGCG的作用发挥与其抗氧化或促氧化性相关,这种特性的表达与剂量及生物环境有关。临床上发现,高剂量口服以EGCG为主的绿茶多酚提取物会出现肝毒性,恶心,腹痛等副作用,而这种副作用归咎于EGCG的自氧化作用。EGCG的自氧化会产生超氧阴离子（superoxide anion,·O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）等活性氧（reactive oxygen species,ROS）;而变价金属离子,如铜、铁离子,能够促进EGCG的自氧化,并与H2O2发生芬顿反应（Fenton Reaction）,产生毒性更强的羟基自由基（hydroxyl radicals,·OH-）。EGCG自氧化会转化为醌,随后攻击蛋白质的半胱氨酸残基上的巯基,并与其共价结合形成醌化蛋白（quinoprotein,QP）。铜是人体第三大微量元素,在肝脏中含量最高,是组成多种辅酶的重要组成部分。铜离子具有氧化还原活力,过多的铜离子会对人体造成损伤,引发机体紊乱,因此游离铜含量是被严格控制在细胞需要的水平,即大约平均每个细胞含有远低于一个铜离子。二硫代氨基甲酸酯（dithiocarbamates,DTC）一族的化合物广泛用于农业,工业及医疗领域,因此在人们日常生活中接触此类化合物几率很高。戒酒硫（disulfiram,DSF）及其代谢产物二乙基二硫代氨基甲酸酯（diethyldithiocarbamate,DEDTC）作为其中的代表,具有强大的金属离子络合能力,能够络合铜离子。DSF或DEDTC进入机体能够络合铜离子,从而显着抑制了含铜酶的活力,如铜/锌-超氧歧化酶（Cu/Zn-superoxide dismutase,SOD）,形成铜复合体（Cu（DEDTC）2）。DEDTC具有脂溶性能自由进出细胞膜,因此可作为铜转运体,携带铜于肝脏中富集。本研究发现Cu（DEDTC）2仍具有氧化还原性。EGCG产生自氧化毒性的靶器官是肝脏,当体内具有清除活性氧的SOD被DEDTC削弱,同时在肝脏中富集大量氧化还原铜,会极大地提高了EGCG的毒性。已有研究报道,在EGCG和DEDTC均为药理剂量,同时腹腔注射于小鼠时会造成严重的伤亡现象,其原因是EGCG的氧化得到显着促进,从而毒性增强。本研究则进一步具体去阐释这种损伤的机制:1.DEDTC抑制血中SOD活力,使得EGCG自氧化水平提高,消耗加快,富集于肝中的氧化还原铜促进EGCG氧化消耗;2.增强的EGCG氧化毒性会显着提高肝细胞中炎症与凋亡相关基因及蛋白的表达;3.产生大量醌化蛋白;4.脂质过氧化。茶氨酸（L-theanine,L-T）是茶树（Camellia Sinensis）中特有的也是含量最高的非蛋白质氨基酸,为茶汤滋味提供鲜味。据报道,茶氨酸具有多种有益功能,主要是对大脑的作用,能够镇定舒缓。由于EGCG大量摄入会引发机体氧化逆境,本研究探索在茶氨酸干预下,EGCG的自氧化,及其对生物体的影响。由于茶氨酸能够有效结合铜,因此通过体外实验发现,茶氨酸保护了由铜离子或一种主要含铜的,具有多酚氧化能力的酶,铜蓝蛋白（ceruloplasmin,Cp）,介导的EGCG促氧化、DNA损伤及醌化蛋白形成等;而在动物实验上,采用亚急性毒性剂量的EGCG（55 mg/kg）腹腔注射一天一次,共5次,造成了小鼠转氨酶升高,肝脏p53相关基因上调,氧化逆境产生,DNA损伤以及肝脏醌化蛋白含量显着提高;而作为抗氧化系统的Nrf2相关基因显着上调;保护组采用茶氨酸与EGCG同时腹腔注射于小鼠,上述损伤皆被抑制,甚至有的指标与正常对照组水平相当,而Nrf2基因并没有明显上调,由此推断,茶氨酸抑制了EGCG的自氧化。这些结果证明了茶氨酸能有效保护EGCG的自氧化引起的毒性,对于儿茶素健康功能的安全利用有重要意义。综上所述,铜能够促进EGCG的氧化,增强其氧化毒性。而DEDTC可通过抑制SOD活力,与运载氧化还原性铜进入肝细胞并富集两种效果共同促进EGCG的自氧化,增强其毒性,降低EGCG等儿茶素类化合物的安全使用阈值。茶氨酸是与EGCG共同出自茶树,茶氨酸对铜的络合效应较强,能有效抑制氧化还原铜,以及含铜多酚氧化酶—铜蓝蛋白对EGCG的促进作用,从而提高EGCG为代表的儿茶素类化合物的安全利用阈值。
王庆玲[7]（2019）在《汉麻蛋白改性对蛋白功能性质及营养价值的影响研究》文中认为近年来,由于人们对植物蛋白的需求不断增加以及对膳食蛋白功能性质和营养价值的认识逐渐提高,促进了营养和食品行业对新型蛋白质资源的探索。汉麻蛋白由于具有极高的营养价值、低致敏性和易消化的特性,已经引起科学和工业领域的极大兴趣,市场上已陆续出现许多汉麻蛋白产品,例如饮品、功能原料、营养添加剂以及各种个人护理用品。汉麻蛋白在食品中的应用价值与其自身的结构和功能性质密切相关,但是由于汉麻蛋白结构紧凑,存在溶解度低的缺点,这严重影响了汉麻蛋白的功能性质,限制了其营养价值的发挥。因此,本课题利用pH偏移处理、蛋白质交联和酶水解等方式对汉麻蛋白进行结构修饰,其主要目的是:一、改善汉麻蛋白的乳化性质,为其作为乳化剂在食品中的应用奠定理论基础;二、构建稳固的凝胶网络结构,实现对乳化油滴的包裹和稳定,提高蛋白凝胶体系的综合营养价值和健康效益;三、研究汉麻蛋白水解物与Zn2+的相互作用,从而改善锌的生物利用度并强化汉麻蛋白的营养价值,为汉麻蛋白在功能性食品领域的应用提供理论依据。首先,在汉麻乳体系中,研究了pH偏移处理（pH7→pH12→pH7）结合高压均质（0、30、60 MPa）处理对乳液微观结构、物理和化学稳定性的影响。研究发现高压均质处理可以使油滴更好地被蛋白质包裹,均质压力的增加导致乳滴粒径变小并且分布更加均匀（2.2–2.7μm）。当在高压均质之前采用pH偏移处理汉麻乳时,发现有大的团簇和聚集体形成,而且均质压力的提高会导致这些团簇和聚集体变得更加密集（3.5–8.2μm）;采用Turbiscan稳定分析仪对汉麻乳物理稳定性进行分析,发现拥有这种相互作用结构的汉麻乳十分稳定,在4°C下储存3天后未产生明显的相分离现象。而且,在贮藏过程中,经pH偏移结合高压均质处理的汉麻乳中氧化产物（氢过氧化物和丙二醛）生成变得迟缓,表明这种团簇状乳液结构对自由基具有抵抗能力。另一方面,微生物分析发现,pH偏移和高压均质结合处理具有抑菌效果,使汉麻乳中的微生物含量显着降低。在此基础上,以汉麻蛋白（HPI）为研究对象,深入探究pH偏移处理对蛋白质结构、界面性质及其乳液性质的影响,并着重考察了pH偏移处理时温度（20–80°C）和时间因素（1、5、60 min）的影响。研究结果显示,随着pH偏移处理温度的升高和时间的延长,HPI的溶解度（约20%）显着提高（P?0.05）,在80°C下处理60 min时,溶解度可以提高到97.5%。凝胶电泳分析结果显示处理过的HPI表现出形成可溶性大聚集体的强烈趋势。为了限制赖丙氨酸（LAL）的生成,将热处理温度控制在60°C以下（5min）,使得LAL含量始终低于100 mg/100 g蛋白质,且半胱氨酸和赖氨酸的损失也很小。进一步采用动态滴结合振荡滴形法考察了温热辅助pH偏移处理对HPI在油–水界面性质的影响,结果表明,HPI可以在油–水界面形成以弹性为主的粘弹性吸附膜,且吸附过程由蛋白质结构展开和重排所主导。温热辅助pH偏移处理可促使蛋白质结构展开、疏水基团暴露,能显着提高HPI的表面活性,表现为更高的表面压（π）;但是该处理会导致界面膨胀弹性模量Ed值明显下降,并且温度越高,影响效果越明显,这可能是由于油–水界面上多层膜结构的形成,阻碍了界面吸附蛋白质分子间的相互作用。表面活性的增强和多层膜结构的形成使得经温热辅助pH偏移处理的HPI的乳化活性指数（EAI）和所形成乳液的稳定性明显提高,而且乳滴的分布更加均一。接下来,采用具有药学功效和健康益处的天然交联剂京尼平来修饰HPI,研究京尼平处理对蛋白质结构、聚集模式的影响;在填充有乳化汉麻油的汉麻蛋白复合体系中,进一步探究京尼平辅助交联对复合体系凝胶性质及体外消化特性的影响。研究发现,京尼平修饰会导致HPI总巯基和游离氨基含量显着减少、表面疏水性降低。电泳分析表明京尼平修饰会引起HPI交联,导致聚合物的生成。该高交联度聚合物的形成有利于改善HPI–乳液复合体系的凝胶性质,凝胶强度和凝胶弹性分别增加了3.3和2.6倍。而且经京尼平改性的复合凝胶还表现出卓越的持水能力。微观结构分析显示凝胶网络结构紧密,充满了蛋白质包裹的油滴,而京尼平修饰显着加强了油滴与蛋白质基质以及蛋白质基质之间的相互作用,从而提高了复合体系凝胶性质。具有高度交联结构的复合凝胶仍可以被持续消化,且消化程度与交联程度有关。细胞毒性试验表明,高浓度京尼平（≥400μM）会引起细胞损伤,而京尼平–HPI复合物能显着降低对细胞的毒性,具有良好的生物相容性。京尼平–HPI复合物在Caco-2细胞中的摄入实验表明,复合物可以被细胞摄入,且摄入量与摄入时间和复合物浓度呈正相关。最后,采用蛋白酶（Alcalase、Flavourzyme、Papain、Protamex、Pepsin和Trypsin）对HPI进行修饰,研究水解物（HPHs）与金属Zn2+的相互作用,进而考察Zn2+–HPH复合物的形成对锌的生物利用度的影响。通过离心沉淀和乙醇沉淀的方式分离得到了两种溶解性不同的Zn2+–肽复合物:水不溶性（P1）和水溶性（P2）复合物。对Pepsin-HPH的FTIR分析表明,P1和P2具有不同的Zn2+结合位点,分别对应于N–H和C=O位点;凝胶电泳显示P2主要由低分子量肽组成。进一步对HPI和六种HPHs的Zn2+结合能力（P1+P2）进行比较,结果表明,HPI的Zn2+结合能力最强（高达90.7%）,而HPHs的结合能力相对较弱,但是其所形成的Zn2+–HPHs复合物中P2含量却比Zn2+–HPI中更加丰富,说明其溶解性更高;等温滴定热量法佐证了不同HPHs的Zn2+结合能力。所有HPHs中,Flavourzyme–HPH具有最高的Zn2+结合能力,而Pepsin–HPH与Zn2+形成的复合物却具有最高的溶解度和抗氧化能力。细胞毒性实验发现,与ZnSO4相比,Zn2+–HPH复合物对细胞具有一定保护作用;此外,细胞摄取和转运实验表明Zn2+–HPH复合物的形成可以明显提高锌转运量,改善锌的生物利用度。综上所述,本研究为汉麻蛋白功能性质的改善以及附加营养价值的提高提供了新的思路,也为更好地拓展汉麻蛋白作为功能性营养成分在食品和保健品中的应用奠定了理论基础。
贾艳荣[8]（2019）在《酵母表面展示体系在单链抗体筛选及镉离子富集中的优化和应用》文中指出酵母表面展示和噬菌体展示技术已成为蛋白质工程,尤其是抗体工程中广泛应用的强大工具。其中酵母展示技术可以结合流式细胞术,直接分析展示蛋白的表达、稳定性以及与互作蛋白的亲和力,从而成为高效的文库筛选体系。酵母表面展示技术已被广泛用于针对各种抗原的单链抗体（scFv）筛选及其优化。然而,基于酵母表面展示技术的scFv文库筛选流程中仍存在一些缺陷,限制了系统筛选效率。本研究主要针对scFv文库构建与筛选中存在的两个限制因素,对酵母表面展示体系进行优化。首先,scFv文库多样性片段是通过PCR扩增、PCR法随机突变获得,再整合到酵母表面展示载体上,构成scFv文库。然而,这一过程中往往会不可避免地在部分scFv片段内部引入终止密码子,导致不能表达完整的单链抗体。文库中这样的片段占比增加,不仅影响有效库容量,还影响筛选效率。其次,筛选的scFv亚文库一般需要进行高温稳定性验证,获得稳定性更高的目标scFv。而传统验证体系中存在的问题是,当筛选出的scFv库需要进行高温稳定性筛选或验证时,往往由于酵母本身不耐高温而需要将热激后的细胞收集起来提取文库质粒,再重新转入工程酵母中流式分选。这个过程不仅耗时耗力而且会造成文库质粒丢失,降低其多样性。本研究通过引入核糖体跳跃肽（T2A）对基于Aga1-Aga2的酵母表面展示系统进行改造,即在Aga2的碳末端插入T2A-Leu2序列,使得scFv、T2A序列与营养筛选基因LEU2能转录成同一条mRNA。翻译时核糖体识别T2A序列,跳跃翻译成scFv和Leu2两个独立蛋白。若前端的scFv序列中含有内部终止密码子,核糖体就无法继续向后翻译,则不能表达Leu2蛋白,因此含此质粒的酵母不能在亮氨酸缺乏的培养基中生长。基于这一策略,本课题通过试验证明,T2A-Leu2体系可以有效排除含内部终止密码子的scFv序列。此外,本课题将针对CD38的scFv亚文库片段分别构建在T2A-Leu2体系及改造前体系中,通过流式分选验证,证明改造后的展示系统能更高效地筛选到阳性抗体。同时,本研究通过甲基磺酸甲酯（MMS）随机诱变法,获得了既耐温又不影响展示功能的工程菌。接着通过高温热激,免疫印迹及流式分选的方式证明了筛选获得的耐温菌株可以正常表达及展示scFv,不影响其筛选scFv文库的功能。在操作中使用耐温展示酵母进行筛选和热激检测,热激后的酵母可直接扩增培养,进行流式分选。这一改造简化操作步骤,极大地优化了scFv筛选体系。本课题另一方面,利用表面展示系统提高了酵母钝化重金属的能力。这一策略是将金属硫蛋白展示在酵母细胞表面,直接与环境中重金属离子结合,从而使重金属离子由游离态变为结合态,降低其毒性。通过免疫印迹及流式分选技术证明金属硫蛋白正常表达并展示在细胞表面。通过原子吸收光谱法检测表明展示金属硫蛋白的酵母能有效提升其结合重金属的能力。为治理环境重金属污染提供了一个有效策略。
王俊凯[9]（2019）在《固定化重组金属硫蛋白对镉和铜离子的吸附研究》文中提出环境污染导致的食品重金属安全问题严重威胁着人体的健康。在生态环境中,降解重金属离子困难,重金属离子在食物链中不断累积,导致食品重金属含量超标,且在食品生产加工、贮存运输过程中会出现重金属的二次污染,金属污染成为影响中国食品质量和安全的主要原因之一。因此建立有效的重金属检测和去除的方法,对于食品安全具有重要意义。金属硫蛋白能够有效螯合重金属离子,并且不同的金属硫蛋白在进化过程中获得螯合不同重金属离子的能力。嗜热四膜虫具有5种不同的金属硫蛋白,能够有效螯合Cu2+和Cd2+,是去除重金属方面的研究热点。固定化技术的花费低,具有较好的吸附性能和吸附效率,并且在处理过程中不会污染环境。本文采用海藻酸钠-聚乙烯醇-二氧化硅作为载体材料,制备包埋有重组嗜热四膜虫金属硫蛋白的固定化球体,并探究其吸附重金属离子的性能。获得主要结果如下:1.选定海藻酸钠浓度为2%、氯化钡浓度为3%、二氧化硅用量为5 mg/mL。采用单因素试验和正交试验,以成球情况和重金属离子吸附量为参考指标,得到制备用于吸附镉离子的固定化球体的条件为:聚乙烯醇1%、硼酸1%、20 mg/mL重组金属硫蛋白MTT1大肠杆菌,镉离子吸附量为7.53 mg;固定化球体吸附铜离子的制备条件为:聚乙烯醇2%、硼酸1%、20 mg/mL重组金属硫蛋白MTT2大肠杆菌,铜离子吸附量为7.44 mg。2.分别以重组金属硫蛋白MTT1、MTT2、MTT5、TM1、TM2,重组GST标签等6种菌制备固定化球体,并同时制备对应的固定化破碎菌体小球,进行吸附Cd2+、Cu2+实验。结果表明,固定化重组金属硫蛋白MTT1具有更好的镉离子吸附性能,固定化重组金属硫蛋白MTT2具有更好的铜离子吸附性能。固定化破碎菌体的小球吸附重金属离子的能力显着高于固定化完整菌体小球,其中固定化重组金属硫蛋白MTT1破碎菌体小球的镉离子吸附量达到7.45 mg;固定化重组金属硫蛋白MTT2破碎菌体小球的铜离子吸附量达到7.15 mg。3.扫描电镜观察结果表明,固定化重组金属硫蛋白硫蛋白球体表面存在大量褶皱,内部结构较为疏松,存在大量孔隙,具有较大的比表面积,有利于对重金属离子的吸附。对直径、密度、机械强度等物理特性进行表征,结果显示,固定化重组金属硫蛋白球体成形情况稳定,机械强度较高。4.从pH值、时间、重金属离子初始浓度等方面,建立了固定化球体吸附Cd2+、Cu2+的优化参数。分别设置梯度,进行吸附实验,结果表明,在pH值为4左右时,固定化重组金属硫蛋白球体的吸附性能较好。当pH值为4,吸附时间为4 h,重金属离子初始浓度为200μg/mL时,固定化重组金属硫蛋白球体对于Cd2+、Cu2+的吸附达到动态平衡状态,固定化重组金属硫蛋白MTT1破碎菌体的镉离子吸附量达到了7.95 mg,固定化重组金属硫蛋白MTT2破碎菌体的铜离子吸附量达到了7.65 mg。在吸附—解吸循环实验中,固定化重组金属硫蛋白球体显示出一定的重复利用性。5.通过拟合动力学方程发现,吸附Cd2+、Cu2+的准二级反应动力学的R2分别为0.9963、0.9970,吸附过程更加符合准二级反应动力学的描述,这说明在吸附过程中,化学吸附是控制反应速率的关键步骤。拟合等温线模型的结果表明,Langmuir模型的R2分别为0.9692和0.9395,Langmuir等温线模型适用于描述固定化重组金属硫蛋白球体对Cd2+、Cu2+的吸附过程,说明吸附过程是在单分子层上的吸附。总之,本实验成功制备了固定化重组金属硫蛋白球体。小球成形稳定、机械强度较高,比表面积大,具有优秀的Cd2+和Cu2+吸附性能,并具有一定的重复利用性,可以为重金属离子的有效去除提供理论和技术支持。
李停停[10]（2019）在《毛蚶中金属硫蛋白的提取纯化及抗氧化活性分析》文中认为金属硫蛋白（metallothionein,MT）是一类富含半胱氨酸、具有金属结合特性、广泛存在于动物、植物、微生物体内一类低分子量多功能诱导性蛋白。独特的生物学功能使金属硫蛋白成为环境科学、生物毒理学、医学等领域的研究热点之一。国内外学者先后研究了金属硫蛋白多种提取纯化方法及相应的分析技术,但是有关MT的分离和定量分析尚无国际性的标准方法。本研究选取海洋源生物毛蚶为研究对象,探究毛蚶中的活性成分金属硫蛋白的高效提取纯化技术,并对其抗氧化活性进行研究,以期为海洋活性物质质量控制与功能性评价提供理论基础。主要研究内容如下:（1）金属硫蛋白提取原材料的选择:选取毛蚶（Scapharca subcrenata）为研究对象。毛蚶属于滤食性双壳贝类,体内易富集重金属,在我国分布广泛,资源尤为丰富,是提取金属硫蛋白理想的原料。本研究采用50mmol/L氯化锌诱导毛蚶机体产生金属硫蛋白,探究毛蚶中金属硫蛋白的提取方法并优化其制备工艺。诱导后毛蚶组织中Zn2+含量由21.84mg/g增加到72.40mg/g,MT含量由0.39 mg/g增加到0.65 mg/g,诱导效果显着。（2）毛蚶中金属硫蛋白提取工艺的研究:采用性质稳定且与生理体液的相容性好Tris-HCl缓冲液作为提取剂,匀浆离心提取毛蚶中MT。在单因素实验的基础上,以金属硫蛋白提取量作为响应值,根据Box-Behnke实验原理,在四因素三水平的基础上进行毛蚶金属硫蛋白提取工艺响应面优化分析,得到MT最佳的提取条件。当提取缓冲液pH为8.45,缓冲液浓度0.18 mol/L,提取温度35℃,物料比为1:6时,提取时间为30 min时毛蚶组织MT可获得最佳提取效果,平均提取含量为0.69 mg/g。（3）毛蚶中金属硫蛋白分离纯化技术的优化:首先通过蛋白纯化仪确定毛蚶中Zn-MT最佳紫外监测波长,采用Enrich SEC 70高分辨率分子筛预装柱将毛蚶粗提物中MT与杂蛋白分开,0.01 mol/L的Tris-HCI缓冲溶液进行洗脱,流速为1.00 mL/min,得到初步纯化目标产物毛蚶MTs,提取率为37.96%,纯度为92.43%;将凝胶过滤层析初步纯化得到的MTs进行DEAE阴离子交换层析,0.50 mol/L NaCl缓冲溶液梯度洗脱,流速为1.00 mL/min,分离得到毛蚶中MT-I与MT-Ⅱ组分;最后将分离纯化得到的MT-I与MT-Ⅱ组分进行脱盐处理,收集最终产物,MT-I的提取率为43.66%,纯度为95.12%,MT-Ⅱ的提取率为45.83%,纯度为95.56%。通过ICP-MS检测不同纯化阶段金属硫蛋白锌离子信号值与紫外检测相结合的办法区分不同种MT,建立金属硫蛋白准确高效的双重检测方法,并根据金属硫蛋白结合金属元素的特点实现蛋白的定量分析。（4）毛蚶中金属硫蛋白分子量的测定。通过Tris-Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳测得毛蚶与兔肝中的金属硫蛋白相对分子量较为接近。毛蚶初步纯化产物MTs相对分子量为17.79 kDa,阴离子交换层析分离得到的MT-I、MT-Ⅱ相对分子量分别为17.63kDa、17.16 kDa,对照品兔肝Zn-MTs相对分子量18.12 kDa。（5）毛蚶金属硫蛋白不同纯化阶段抗氧化活性的研究:实验结果表明,通过凝胶过滤层析、阴离子交换层析不同纯化阶段得到的金属硫蛋白,与抗坏血酸（Vc）作对照,具有较好的抗氧化能力（T-AOC）,对羟基自由基（·OH）、DPPH自由基具有很强的清除能力。初步纯化得到的毛蚶MTs总抗氧化能力为4.25 U/mg,MT-Ⅰ总抗氧化能力为3.30 U/mg,MT-Ⅱ的总抗氧化能力为3.21 U/mg。50mg/mL的样品溶液对羟自由基清除率大小顺序为:初步纯化MTs（70%）﹥Vc（62%）﹥MT-Ⅰ（57%）﹥MT-Ⅱ（51%）。60mg/mL的样品溶液对DPPH清除率大小顺序为:初步纯化MTs（89%）﹥Vc（78%）﹥MT-Ⅰ（56%）﹥MT-Ⅱ（50%）。
二、金属硫蛋白溶液聚合状态的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、金属硫蛋白溶液聚合状态的研究（论文提纲范文）
（1）构建荧光海水青鳉用于海水中重金属监测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 海洋污染 |
| 1.1.1 我国海洋污染状况 |
| 1.1.2 海洋重金属污染的危害 |
| 1.1.3 海洋重金属污染的监测方法 |
| 1.2 海洋模式生物海水青鳉鱼 |
| 1.2.1 金属硫蛋白 |
| 1.2.2 金属硫蛋白的研究进展 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 2 重组质粒PISce1-Om MT的构建 |
| 2.0 引言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验主要的质粒和缓冲液 |
| 2.1.2 主要化学试剂和仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 海水青鳉金属硫蛋白基因启动子的扩增 |
| 2.2.2 真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 目的基因与载体的连接转化 |
| 2.2.4 阳性单克隆的筛选 |
| 2.2.5 提取质粒 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 海水青鳉金属硫蛋白MT启动子的克隆 |
| 2.3.2 质粒载体的双酶切反应后胶回收 |
| 2.4 讨论 |
| 3 质粒的改造以及活性检测筛选 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验用主要材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 质粒改造的结果 |
| 3.3.2 CCK8 实验结果 |
| 3.3.3 双荧光素酶实验结果 |
| 3.3.4 293T细胞转染实验和QPCR实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 4 转基因海水青鳉的构建及其验证 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验主要用材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果分析 |
| 4.4 讨论 |
| 5 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 6 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（2）土壤锑镉对赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）的生态毒理学效应（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 绪论 |
| 1.1 土壤锑、镉污染 |
| 1.1.1 锑镉资源与产品 |
| 1.1.2 锑、镉在土壤中的积累 |
| 1.1.3 纺织印染型锑镉复合污染 |
| 1.2 锑、镉在土壤中的迁移转化 |
| 1.2.1 锑在土壤中的迁移转化 |
| 1.2.2 镉在土壤中的迁移转化 |
| 1.3 土壤重金属的形态与生物可给性 |
| 1.3.1 土壤重金属的形态分析 |
| 1.3.2 土壤锑、镉的形态分析 |
| 1.3.3 土壤重金属的生物可给性分析 |
| 1.3.4 土壤锑、镉的生物可给性 |
| 1.4 土壤污染物对蚯蚓的生态毒理学效应 |
| 1.4.1 蚯蚓的生态毒理学实验方法 |
| 1.4.2 蚯蚓对土壤重金属的富集作用及其对重金属形态的影响 |
| 1.4.3 蚓体生物标志物对土壤污染物的响应 |
| 1.5 土壤酶与土壤微生物 |
| 1.5.1 土壤污染物对土壤酶的影响 |
| 1.5.2 土壤污染物对土壤微生物的影响 |
| 1.5.3 蚯蚓对污染土壤的改良作用 |
| 1.6 技术路线与创新点 |
| 1.6.1 技术路线 |
| 1.6.2 创新点 |
| 2 土壤锑在老化前后对赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)的急性毒性 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 受试物种 |
| 2.2.2 药品、仪器和试剂 |
| 2.2.3 土壤采集及参数 |
| 2.2.4 污染土壤的配置 |
| 2.2.5 消解及元素测定 |
| 2.2.6 废弃物的回收处理 |
| 2.2.7 数据统计与分析 |
| 2.3 实验设计 |
| 2.3.1 锑的处理水平 |
| 2.3.2 锑在老化前后的形态分布 |
| 2.3.3 回避实验 |
| 2.3.4 急性毒性实验 |
| 2.3.5 剂量-效应关系 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 老化前后锑的形态 |
| 2.4.2 回避效应 |
| 2.4.3 逃逸与形态学异常 |
| 2.4.4 剂量-效应关系 |
| 2.4.5 死亡率与锑的形态的关系 |
| 2.5 小结 |
| 3 土壤锑镉对赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)的联合毒性:富集量、生物标志物响应及效应评价 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验设计 |
| 3.2.1 锑镉的处理水平 |
| 3.2.2 蚯蚓暴露实验 |
| 3.2.3 生物标志物的表征 |
| 3.2.4 生物标志物响应指数 |
| 3.2.5 联合效应评价 |
| 3.2.6 蚓体对锑镉的富集量及生物富集系数 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 蚯蚓对锑镉的富集 |
| 3.3.2 生物标志物响应 |
| 3.3.3 变异系数 |
| 3.3.4 生物标志物响应指数 |
| 3.3.5 联合效应评价 |
| 3.4 小结 |
| 4 赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)对锑镉污染土壤的改良作用:形态与酶活性变化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验设计 |
| 4.2.1 锑镉的处理水平 |
| 4.2.2 土壤实验 |
| 4.2.3 土壤酶活性的表征 |
| 4.2.4 几何均值指数 |
| 4.2.5 土壤中锑镉的形态 |
| 4.2.6 土壤锑镉的生物可给性和生物有效性 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 土壤酶活性 |
| 4.3.2 几何均值指数 |
| 4.3.3 锑镉的形态 |
| 4.3.4 生物有效性和生物可给性 |
| 4.4 小结 |
| 5 赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)对锑镉污染土壤中的微生物的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验设计 |
| 5.2.1 锑镉的处理水平 |
| 5.2.2 土壤实验 |
| 5.2.3 测序步骤 |
| 5.2.4 信息处理 |
| 5.2.5 Alpha多样性指数 |
| 5.2.6 数据分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 样品名称解释 |
| 5.3.2 序列处理分析 |
| 5.3.3 种群丰度和Alpha多样性分析 |
| 5.3.4 物种差异性分析 |
| 5.4 小结 |
| 6 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.1.1 急性毒性与老化过程 |
| 6.1.2 生物标志物响应与联合效应 |
| 6.1.3 酶活性与锑、镉形态 |
| 6.1.4 微生物群落 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
| 致谢 |
（3）PARP1负性调控MT1M在卵巢癌转移中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 1 第一部分PARP1 抑制MT1M转录促进卵巢癌转移的作用研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 实验材料与仪器 |
| 1.2.1 细胞株 |
| 1.2.2 感受态细菌 |
| 1.2.3 质粒 |
| 1.2.4 药物与主要试剂 |
| 1.2.5 实验仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 细胞培养 |
| 1.3.2 siRNA转染 |
| 1.3.3 质粒扩增 |
| 1.3.4 质粒转染 |
| 1.3.5 Western blotting法检测蛋白含量 |
| 1.3.6 蛋白质免疫印迹实验(Western blotting) |
| 1.3.7 q RT-PCR检测目的基因m RNA水平 |
| 1.3.8 Elisa检测 |
| 1.3.9 SRB实验检测细胞增殖 |
| 1.3.10 划痕愈合实验 |
| 1.3.11 Transwell小室迁移实验 |
| 1.3.12 条件培养基制备 |
| 1.3.13 数据分析 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 PARP1 调控的潜在靶基因MT1M |
| 1.4.2 卵巢癌基因芯片数据 |
| 1.4.3 PARP1 负性调控MT1M的表达 |
| 1.4.3.1 敲除PARP1对MT1M转录表达与蛋白表达的影响 |
| 1.4.3.2 过表达PARP1对MT1M转录表达与蛋白表达的影响 |
| 1.4.4 敲除PARP1对MT1M分泌的影响 |
| 1.4.5 PARP2和PARP3对MT1M表达的影响 |
| 1.4.6 MT1M表达对卵巢细胞增殖的影响 |
| 1.4.7 MT1M的表达对卵巢细胞迁移影响 |
| 1.4.7.1 MT1M高度表达抑制卵巢细胞迁移 |
| 1.4.7.2 MT1M的低表达促进卵巢细胞迁移 |
| 1.4.8 分泌的MT1M抑制卵巢细胞迁移 |
| 1.4.9 PARP1的表达对卵巢细胞迁移的影响 |
| 1.4.9.1 高度表达PARP1促进卵巢细胞迁移 |
| 1.4.9.2 敲除PARP1抑制卵巢细胞迁移 |
| 1.5 讨论 |
| 2 第二部分PARP1 抑制卵巢癌MT1M转录的分子机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 细胞株 |
| 2.2.2 药物与主要试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 siRNA转染 |
| 2.3.3 质粒扩增 |
| 2.3.4 质粒转染 |
| 2.3.5 Western blotting法检测蛋白含量以Western blotting方法 |
| 2.3.6 q RT-PCR检测目的基因m RNA水平 |
| 2.3.7 免疫共沉淀实验 |
| 2.3.8 PAR修饰实验 |
| 2.3.9 荧光素酶报告基因法(Dual-Luciferase reporter assay) |
| 2.3.10 荧光素酶报告基因信号测定 |
| 2.3.11 数据分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 PARP1 通过FOXP3 调控MT1M的转录表达 |
| 2.4.2 FOXP3 调控MT1M的转录表达 |
| 2.4.3 PARP1与FOXP3 相互结合 |
| 2.4.4 FOXP3发生核糖基化修饰 |
| 2.4.5 PARP1 抑制由FOXP3 介导的MT1M的转录表达 |
| 2.4.6 敲除PARP1 增强卵巢癌细胞FOXP3 的表达 |
| 2.4.7 PARP抑制剂增强卵巢癌细胞FOXP3 的表达 |
| 2.5 讨论 |
| 3 第三部分PARP抑制剂促进MT1M表达抗卵巢癌转移的作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 细胞株 |
| 3.2.2 实验动物 |
| 3.2.3 药物与主要试剂 |
| 3.2.4 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 Western blotting法检测蛋白含量以Western blotting方法 |
| 3.3.3 q RT-PCR检测目的基因m RNA水平 |
| 3.3.4 SRB实验检测细胞增殖 |
| 3.3.5 Elisa实验法 |
| 3.3.6 划痕愈合实验 |
| 3.3.7 Transwell小室实验 |
| 3.3.8 苏木素(Hematoxylin)和伊红(Eosin)染色:H&E染色 |
| 3.3.9 免疫组化染色: |
| 3.3.10 包装慢病毒与感染慢病毒 |
| 3.3.11 动物实验 |
| 3.3.12 数据分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 PARP抑制剂促进MT1M的转录表达与分泌 |
| 3.4.2 PARP抑制剂抑制卵巢癌细胞的迁移 |
| 3.4.3 MT1M在 PARP抑制剂抑制卵巢癌细胞的迁移中的作用 |
| 3.4.4 Olaparib抑制尾静脉接种卵巢癌细胞CaOV3 的肺转移 |
| 3.4.5 Olaparib抑制原代卵巢癌HO-8910PM PDX的动物模型的肺转移 |
| 3.5 讨论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 综述 PARP1的其他生物学功能:DNA修复之外 |
| 参考文献 |
| 作者简历在学期间所取得的科研成果 |
（4）金属硫蛋白1M通路与非小细胞肺癌关系的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 MT1M在NSCLC中的作用 |
| 材料和方法 |
| 一、实验试剂及仪器 |
| 二、实验方法 |
| 实验结果 |
| 1、确立MT1M为研究目标基因 |
| 2、MT1M表达量的验证 |
| 3、细胞株的选取 |
| 4、构建MT1M过表达细胞稳定株 |
| 5、MT1M功能验证 |
| 第二部分 在NSCLC中 p53对MT1M的调控作用 |
| 材料和方法 |
| 一、实验试剂及仪器 |
| 二、实验方法 |
| 实验结果 |
| 1、MT1M基因相关性分析 |
| 2、荧光素酶检测 |
| 3、构建抑制p53功能的细胞株 |
| 4、p53基因功能验证 |
| 第三部分 MDM2/p53/MT1M信号通路在NSCLC中的作用 |
| 材料和方法 |
| 一、实验试剂及仪器 |
| 二、实验方法 |
| 实验结果 |
| 1、构建MDM2敲低细胞株 |
| 2、MDM2功能验证 |
| 3、敲低MDM2 联合MT1M过表达对细胞功能影响 |
| 4、抑制MDM2对相关细胞蛋白表达验证 |
| 5、免疫荧光检测 |
| 6、免疫共沉淀实验 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 免疫抑制剂治疗在非小细胞肺癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读学位期间的科研成果 |
| 致谢 |
（5）基于碳量子点的荧光共振能量转移型传感器对金属硫蛋白的检测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 金属硫蛋白 |
| 1.1.1 金属硫蛋白的主要特征 |
| 1.1.2 金属硫蛋白的生物学功能 |
| 1.1.3 金属硫蛋白的检测 |
| 1.2 碳量子点 |
| 1.2.1 碳量子点的结构与性质 |
| 1.2.2 碳量子点的制备 |
| 1.2.3 碳量子点的应用 |
| 1.3 荧光共振能量转移 |
| 1.4 本课题研究意义与研究内容 |
| 1.4.1 研究意义 |
| 1.4.2 本研究的主要内容 |
| 第2章 实验原料和方法 |
| 2.1 碳量子点的制备 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 荧光量子产率(QY)的测定 |
| 2.2 FRET型荧光传感器构建 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 金纳米粒子浓度计算方法 |
| 2.3 荧光传感器用于MTs的检测 |
| 2.3.1 实验仪器 |
| 2.3.2 实验试剂 |
| 2.3.3 溶液的配制 |
| 2.4 结构表征和性能测试 |
| 2.4.1 透射电子显微镜(TEM) |
| 2.4.2 X射线粉末衍射(XRD) |
| 2.4.3 傅里叶变换红外光谱(FTIR) |
| 2.4.4 X射线光电子能谱(XPS) |
| 2.4.5 紫外-可见吸收光谱(UV-Vis) |
| 2.4.6 荧光光谱(FS) |
| 2.4.7 时间分辨荧光光谱 |
| 第3章 发绿光碳量子点的制备及发光性能研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 碳量子点的制备 |
| 3.2.2 碳量子点制备条件探究 |
| 3.2.3 碳量子点的表征 |
| 3.2.4 光学稳定性测定 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 碳量子点的制备条件优化 |
| 3.3.2 碳量子点的形貌和结构 |
| 3.3.3 碳量子点的光学性质 |
| 3.3.4 碳量子点的光稳定性 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 基于碳量子点和金纳米的荧光传感器检测金属硫蛋白 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 金纳米粒子的制备 |
| 4.2.2 N-CQDs的制备与纯化 |
| 4.2.3 N-CQDs与 Au NPs的结合 |
| 4.2.4 金属硫蛋白的检测 |
| 4.2.5 实际样品的预处理 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 AuNPs的表征 |
| 4.3.2 FRET体系的构建 |
| 4.3.3 Au NPs对 N-CQDs的荧光猝灭作用 |
| 4.3.4 MTs荧光“开启”检测原理 |
| 4.3.5 实验条件的优化 |
| 4.3.6 灵敏性实验 |
| 4.3.7 选择性实验 |
| 4.3.8 实际样品的分析应用 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 结论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）在茶氨酸作用下的铜介导绿茶EGCG氧化的机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 铜在生物体中的角色 |
| 1.1.1 铜的生物学功能 |
| 1.1.2 铜的毒性 |
| 1.2 二乙基二硫代氨基甲酸酯(DEDTC)和戒酒硫(DSF) |
| 1.2.1 DEDTC和 DSF简介 |
| 1.2.2 DEDTC和 DSF的作用机制 |
| 1.3 绿茶多酚提取物EGCG |
| 1.3.1 EGCG的自氧化 |
| 1.3.2 EGCG激活自适反应转录因子Nrf2 |
| 1.3.3 EGCG的毒性 |
| 1.3.4 EGCG与其他物质联用 |
| 1.4 茶氨酸 |
| 1.4.1 茶氨酸及其性质简介 |
| 1.4.2 茶氨酸的健康作用 |
| 1.5 研究内容、目的和意义 |
| 1.5.1 研究内容和目的 |
| 1.5.2 研究的意义 |
| 第二章 DEDTC与 EGCG联用致肝损伤机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试剂和仪器 |
| 2.2.2 动物实验设计 |
| 2.2.3 样品的采集和制备 |
| 2.2.4 相关生物指标检测 |
| 2.2.5 肝脏中基因提取、反转录及表达测定 |
| 2.2.6 蛋白质印迹法(western blot)评估肝脏中蛋白质表达 |
| 2.2.7 EGCG氧化评估 |
| 2.2.8 EGCG含量的测定 |
| 2.2.9 活性氧检测 |
| 2.2.10 EGCG/GAPDH在体外形成醌化蛋白的模型及评估 |
| 2.2.11 检测肝中醌化蛋白水平 |
| 2.2.12 DNA损伤检测 |
| 2.2.13 肝组织中DNA水平检测 |
| 2.2.14 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 EGCG与 DSF联用导致小鼠死亡 |
| 2.3.2 EGCG和 DEDTC联用加剧脂质过氧化和炎症反应 |
| 2.3.3 联用EGCG和 DEDTC导致肝组织DNA损伤及多种凋亡相关蛋白表达 |
| 2.3.4 联用EGCG和 DEDTC诱导肝脏中多种有害基因的转录 |
| 2.3.5 联用EGCG和 DEDTC扰乱肝脏中铜稳态 |
| 2.3.6 体外非酶体系中Cu(DEDTC)2可促进EGCG氧化 |
| 2.3.7 铜离子和Cu(DEDTC)2促EGCG氧化产生醌化蛋白和损伤DNA |
| 2.3.8 DEDTC促进EGCG在血浆及肝组织中氧化消失及肝中醌化蛋白形成 |
| 2.3.9 急性毒性剂量EGCG造成的氧化逆境响应 |
| 2.3.10 DEDTC与不同剂量EGCG联用引发小鼠肝毒性 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 茶氨酸通过抑制铜促进EGCG氧化预防其肝毒性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试剂和仪器 |
| 3.2.2 动物实验设计 |
| 3.2.3 样品的采集和处理 |
| 3.2.4 生物指标的测定 |
| 3.2.5 肝脏的表达测定 |
| 3.2.6 Western blot评估肝脏中蛋白质表达 |
| 3.2.7 体外实验部分 |
| 3.2.8 肝脏中醌化蛋白检测 |
| 3.2.9 统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 体外非酶体系中茶氨酸抑制铜促EGCG氧化效应 |
| 3.3.2 茶氨酸与铜结合效应 |
| 3.3.3 茶氨酸抑制铜促EGCG氧化产生醌化蛋白和损伤DNA |
| 3.3.4 铜蓝蛋白促EGCG氧化效应 |
| 3.3.5 茶氨酸抑制铜蓝蛋白促EGCG氧化效应 |
| 3.3.6 茶氨酸对铜蓝蛋白经典活力不产生影响 |
| 3.3.7 茶氨酸抑制亚急性毒性剂量的EGCG对小鼠产生的相关损伤指标 |
| 3.3.8 茶氨酸抑制EGCG引起的γH2AX和p53 相关基因的上调 |
| 3.3.9 茶氨酸限制EGCG引起的Nrf2 相关基因的上调 |
| 3.3.10 茶氨酸促进Nrf2 相关蛋白表达以对抗EGCG毒性 |
| 3.3.11 茶氨酸对亚急性毒性剂量的EGCG的早期作用 |
| 3.3.12 茶氨酸无法保护由急性毒性剂量EGCG造成的小鼠肝毒性 |
| 3.3.13 茶氨酸保护由剂量逐渐升高的EGCG造成的小鼠死亡 |
| 3.3.14 茶氨酸不妨碍EGCG调控的糖脂代谢相关基因的转录 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论与创新点 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词清单 |
| 作者简介 |
（7）汉麻蛋白改性对蛋白功能性质及营养价值的影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词注释表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 汉麻籽 |
| 1.2 汉麻蛋白的结构与营养价值 |
| 1.2.1 汉麻蛋白的组成与结构 |
| 1.2.2 汉麻蛋白的营养价值 |
| 1.3 汉麻蛋白的功能性质 |
| 1.3.1 溶解性 |
| 1.3.2 乳化性 |
| 1.3.3 凝胶性 |
| 1.4 蛋白质改性 |
| 1.4.1 热处理对蛋白质结构和功能性质的影响 |
| 1.4.2 pH偏移处理对蛋白质结构和功能性质的影响 |
| 1.4.3 蛋白质交联对蛋白质结构和功能性质的影响 |
| 1.4.4 酶水解处理蛋白质结构和功能性质的影响 |
| 1.5 蛋白质的体外模拟消化与吸收 |
| 1.5.1 体外模拟消化模型 |
| 1.5.2 Caco-2 细胞模型 |
| 1.6 本课题立题背景及意义 |
| 1.7 本课题主要研究内容 |
| 第二章 pH偏移结合高压均质处理对汉麻乳物理和氧化稳定性的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与设备 |
| 2.2.1 主要材料 |
| 2.2.2 主要设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 汉麻乳的制备 |
| 2.3.2 汉麻乳的处理 |
| 2.3.3 微观结构的观察 |
| 2.3.4 粒径的测定 |
| 2.3.5 剪切粘度的测定 |
| 2.3.6 乳液稳定性的测定 |
| 2.3.7 微生物的分析 |
| 2.3.8 数据分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 pH偏移结合HH处理对汉麻乳结构和粒径分布的影响 |
| 2.4.2 pH偏移结合HH处理对汉麻乳剪切粘度的影响 |
| 2.4.3 pH偏移结合HH处理对汉麻乳物理稳定性的影响 |
| 2.4.4 pH偏移结合HH处理对汉麻乳氧化稳定性的影响 |
| 2.4.5 pH偏移结合HH处理对汉麻乳中微生物生长情况的影响 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 热辅助pH偏移处理对汉麻蛋白结构和乳化性质的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 主要材料 |
| 3.2.2 主要设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 汉麻分离蛋白的提取 |
| 3.3.2 pH偏移处理和热处理 |
| 3.3.3 溶解度的测定 |
| 3.3.4 电泳 |
| 3.3.5 LAL含量和氨基酸组成分析 |
| 3.3.6 内源性色氨酸荧光分析 |
| 3.3.7 蛋白质疏水性测定 |
| 3.3.8 动态油–水界面性质分析 |
| 3.3.9 乳液的制备及乳化性测定 |
| 3.3.10 乳液微观结构观察 |
| 3.3.11 数据分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 pH偏移和热处理引起HPI溶解度的变化 |
| 3.4.2 pH偏移和热处理引起HPI交联 |
| 3.4.3 pH偏移和热处理引起LAL形成以及HPI氨基酸组成变化 |
| 3.4.4 pH偏移和热处理引起HPI三级结构变化 |
| 3.4.5 pH偏移和热处理对HPI在油–水界面吸附性质的影响 |
| 3.4.6 pH偏移和热处理对HPI在油–水界面膨胀流变特性的影响 |
| 3.4.7 pH偏移和热处理对HPI乳化性质的影响 |
| 3.4.8 pH偏移和热处理对HPI乳液微观结构的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 京尼平辅助蛋白交联对汉麻蛋白–乳液复合水凝胶的结构和流变性质的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 主要材料 |
| 4.2.2 主要设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 HPI的提取 |
| 4.3.2 HPI与京尼平反应 |
| 4.3.3 凝胶形成能力的测定 |
| 4.3.4 HPI结构变化和聚合表征 |
| 4.3.5 HPI–乳液复合液的配制 |
| 4.3.6 HPI–乳液复合凝胶特性 |
| 4.3.7 HPI–乳液复合凝胶微观结构 |
| 4.3.8 体外消化模型 |
| 4.3.9 Caco-2 细胞的培养 |
| 4.3.10 Caco-2 细胞活性测定 |
| 4.3.11 京尼平在Caco-2 细胞的摄入 |
| 4.3.12 数据分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 京尼平处理对HPI凝胶强度的影响 |
| 4.4.2 京尼平处理对HPI中游离氨基和巯基的影响 |
| 4.4.3 京尼平处理对HPI蛋白结构的影响 |
| 4.4.4 京尼平引起HPI交联 |
| 4.4.5 京尼平处理对HPI–乳液复合体系凝胶性质的影响 |
| 4.4.6 京尼平处理对HPI–乳液复合凝胶微观结构的影响 |
| 4.4.7 京尼平交联对HPI–乳液复合凝胶体外消化的影响 |
| 4.4.8 京尼平–HPI复合物的细胞毒性 |
| 4.4.9 京尼平–HPI复合物在Caco-2 细胞的摄取 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 酶法水解汉麻蛋白与金属锌离子的相互作用及对锌生物利用度的影响 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料与设备 |
| 5.2.1 主要材料 |
| 5.2.2 主要设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 HPI的提取 |
| 5.3.2 HPH的制备 |
| 5.3.3 Zn~(2+)–HPH复合物的形成 |
| 5.3.4 Zn~(2+)结合能力测定 |
| 5.3.5 傅里叶红外光谱(FTIR) |
| 5.3.6 电泳 |
| 5.3.7 凝胶过滤色谱 |
| 5.3.8 等温滴定量热法(ITC) |
| 5.3.9 抗氧化能力 |
| 5.3.10 Caco-2 细胞的培养 |
| 5.3.11 Caco-2 细胞毒性分析 |
| 5.3.12 Zn~(2+)–HPH复合物在Caco-2 细胞的摄入和转运 |
| 5.3.13 数据分析 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 FTIR表征Zn~(2+)–肽相互作用 |
| 5.4.2 肽谱和分子量分布 |
| 5.4.3 HPHs与 Zn~(2+)的相互作用 |
| 5.4.4 Zn~(2+)–HPH复合物的抗氧化能力 |
| 5.4.5 Zn~(2+)–HPH复合物对细胞的毒性 |
| 5.4.6 Zn~(2+)–HPH复合物在Caco-2 细胞中的摄取和转运 |
| 5.4.7 Zn~(2+)–HPH复合物对Caco-2 细胞中金属硫蛋白表达量的影响 |
| 5.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 :作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（8）酵母表面展示体系在单链抗体筛选及镉离子富集中的优化和应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩写词表 |
| 1.引言 |
| 1.1 单链抗体 |
| 1.1.1 单链抗体(scFv)的发展 |
| 1.1.2 scFv抗体的筛选 |
| 1.2 核糖体跳跃肽 |
| 1.3 体外诱变技术 |
| 1.4 流式分选技术 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试菌株和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要溶液及培养基配制 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 实验中所用引物 |
| 2.2 酵母表面展示系统的优化 |
| 2.2.1 重组质粒pDJ21-T2A-Leu2 的构建 |
| 2.2.2 重组质粒pDJ21-T2A-Leu2-K4/K6 的构建 |
| 2.2.3 连续稀释法(serial dilution test) |
| 2.2.4 T2A-Leu2 工作效率的验证 |
| 2.2.5 T2A-Leu2 系统筛选阳性抗体效率的验证 |
| 2.3 耐高温酵母表面展示工程菌的诱变 |
| 2.3.1 诱变的方法及条件 |
| 2.3.2 MMS诱导基因突变 |
| 2.3.3 不同温度下耐温菌与野生型菌株生长速率的测定 |
| 2.3.4 免疫印迹检测目的蛋白的表达 |
| 2.3.5 流式细胞术检测目的蛋白的展示 |
| 2.3.6 耐温菌与T2A-Leu2 系统兼容的验证 |
| 2.4 酵母表面展示技术的应用 |
| 2.4.1 金属硫蛋白重组质粒的构建 |
| 2.4.2 金属硫蛋白表达与展示的验证 |
| 2.4.3 菌体Cd~(2+)残留量的测定 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 酵母表面展示筛选单链抗体库的体系优化策略 |
| 3.1.1 T2A-Leu2 系统的构建 |
| 3.1.2 重组质粒p DJ21-T2A-Leu2-K4/K6 的构建 |
| 3.1.3 T2A-Leu2 的可行性验证 |
| 3.1.4 T2A-Leu2 系统可提升sc Fv库的筛选效率 |
| 3.2 酵母表面展示工程菌的耐高温筛选 |
| 3.2.1 耐温酵母候选菌株的筛选及其耐温性分析 |
| 3.2.2 耐温展示菌株TR1 的蛋白展示功能不受影响 |
| 3.2.3 scFv文库筛选程序的优化策略 |
| 3.3 酵母表面展示技术的新应用 |
| 3.3.1 金属硫蛋白展示载体的成功构建 |
| 3.3.2 金属硫蛋白的酵母表面展示 |
| 3.3.3 酵母表面展示金属硫蛋白提高酵母结合Cd~(2+)能力 |
| 4.讨论 |
| 4.1 核糖体跳跃肽的剪切效率 |
| 4.2 耐温诱变菌株的稳定性 |
| 4.3 重金属离子的污染现状及生物治理 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| Ⅰ.酵母展示载体p DJ21 图谱 |
| Ⅱ.pRS305 图谱 |
| Ⅲ.pDJ22 图谱 |
| Ⅳ.pDJ22-K4/K6 图谱 |
| Ⅴ.各金属硫蛋白展示载体图谱 |
| Ⅵ.实验中所用编码目的蛋白序列 |
| 在读期间发表的论文及专利 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（9）固定化重组金属硫蛋白对镉和铜离子的吸附研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 食品重金属污染现状 |
| 1.2 处理重金属常用方法 |
| 1.3 固定化微生物技术 |
| 1.3.1 固定化微生物技术的分类 |
| 1.3.2 固定化微生物技术的载体 |
| 1.4 嗜热四膜虫金属硫蛋白 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 第二章 固定化重组金属硫蛋白的制备及条件优化 |
| 2.1 基因工程细胞株 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验试剂 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 培养基的配制 |
| 2.4.2 转化重组嗜热四膜虫金属硫蛋白大肠杆菌 |
| 2.4.3 固定化重组金属硫蛋白球体的制备 |
| 2.4.4 固定化球体制备条件的优化选取 |
| 2.4.5 正交实验 |
| 2.4.6 铜、镉离子吸附量的测定 |
| 2.4.7 固定化球体的表征 |
| 2.5 结果与讨论 |
| 2.5.1 制备条件的优化选取 |
| 2.5.2 正交实验 |
| 2.5.3 固定化球体的表征 |
| 小结 |
| 第三章 固定化重组金属硫蛋白吸附镉和铜离子的条件优化 |
| 3.1 实验仪器 |
| 3.2 实验试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 pH值对吸附的影响 |
| 3.3.2 时间对吸附的影响 |
| 3.3.3 金属离子初始浓度对吸附的影响 |
| 3.3.4 解吸与再吸附试验 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 pH值对吸附的影响 |
| 3.4.2 时间对吸附的影响 |
| 3.4.3 金属离子初始浓度对吸附的影响 |
| 3.4.4 解吸与再吸附试验 |
| 小结 |
| 第四章 固定化重组金属硫蛋白吸附镉和铜离子的动力学和等温线方程拟合 |
| 4.1 实验仪器 |
| 4.2 实验试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 拟合吸附动力学方程 |
| 4.3.2 拟合吸附等温线方程 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 拟合吸附动力学方程 |
| 4.4.2 拟合吸附等温线方程 |
| 小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（10）毛蚶中金属硫蛋白的提取纯化及抗氧化活性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 金属硫蛋白的概述 |
| 1.1.1 金属硫蛋白的概念 |
| 1.1.2 金属硫蛋白的理化性质 |
| 1.1.3 金属硫蛋白的提取和纯化技术 |
| 1.1.4 金属硫蛋白的检测技术 |
| 1.1.5 金属硫蛋白的生物学功能 |
| 1.1.6 金属硫蛋白的研究现状 |
| 1.2 本课题的立项依据、意义及研究内容 |
| 1.2.1 研究内容 |
| 1.2.2 研究意义 |
| 第二章 毛蚶中金属硫蛋白提取工艺研究 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 原料与试剂 |
| 2.1.2 仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 毛蚶体内MT的诱导表达 |
| 2.2.2 毛蚶中金属元素的测定 |
| 2.2.3 毛蚶中MT含量的测定 |
| 2.2.4 提取毛蚶中MT的单因素实验 |
| 2.2.5 提取毛蚶中MT的响应面优化设计 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 诱导前后毛蚶组织中Zn2+含量与MT含量变化 |
| 2.3.2 单因素结果分析 |
| 2.3.3 响应面优化实验结果及分析 |
| 2.3.4 最佳工艺条件的验证 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 毛蚶中金属硫蛋白的分离纯化及鉴定 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.1.1 原料与试剂 |
| 3.1.2 仪器与设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 凝胶过滤层析初步纯化毛蚶MT |
| 3.2.2 DEAE阴离子交换层析分离MT-Ⅱ、MT-I |
| 3.2.3 目标产物MT-Ⅱ、MT-I的脱盐 |
| 3.2.4 ICP-MS检测不同纯化阶段MT |
| 3.2.5 凝胶电泳表征MT分子量 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 凝胶过滤层析初步纯化结果分析 |
| 3.3.2 DEAE阴离子交换层析结果分析 |
| 3.3.3 金属硫蛋白脱盐处理结果分析 |
| 3.3.4 ICP-MS检测不同纯化阶段金属硫蛋白 |
| 3.3.5 不同纯化阶段MT提取率及产物纯度 |
| 3.3.6 毛蚶金属硫蛋白电泳结果 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 毛蚶中金属硫蛋白的抗氧化活性研究 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.1.1 原料与试剂 |
| 4.1.2 仪器与设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 毛蚶MT总抗氧化能力(T-AOC)的测定 |
| 4.2.2 毛蚶MT清除羟基自由基能力的测定 |
| 4.2.3 毛蚶MT对 DPPH自由基清除率的测定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 毛蚶MT总抗氧化能力 |
| 4.3.2 毛蚶MT清除羟自由基的能力 |
| 4.3.3 毛蚶MT清除DPPH自由基的能力 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 |
四、金属硫蛋白溶液聚合状态的研究（论文参考文献）
- [1]构建荧光海水青鳉用于海水中重金属监测[D]. 陈亚楠. 海南大学, 2021
- [2]土壤锑镉对赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）的生态毒理学效应[D]. 许志楠. 东华大学, 2020(01)
- [3]PARP1负性调控MT1M在卵巢癌转移中的作用及机制研究[D]. 许霞青. 浙江大学, 2020(02)
- [4]金属硫蛋白1M通路与非小细胞肺癌关系的研究[D]. 徐伟. 苏州大学, 2020(06)
- [5]基于碳量子点的荧光共振能量转移型传感器对金属硫蛋白的检测[D]. 杜晓宇. 太原理工大学, 2020(07)
- [6]在茶氨酸作用下的铜介导绿茶EGCG氧化的机制研究[D]. 张珂. 安徽农业大学, 2020(03)
- [7]汉麻蛋白改性对蛋白功能性质及营养价值的影响研究[D]. 王庆玲. 江南大学, 2019(05)
- [8]酵母表面展示体系在单链抗体筛选及镉离子富集中的优化和应用[D]. 贾艳荣. 河北农业大学, 2019(03)
- [9]固定化重组金属硫蛋白对镉和铜离子的吸附研究[D]. 王俊凯. 山西大学, 2019(01)
- [10]毛蚶中金属硫蛋白的提取纯化及抗氧化活性分析[D]. 李停停. 浙江海洋大学, 2019(02)