一、雌激素对脾脏中Bcl-2和Bax蛋白表达的影响（论文文献综述）
杨艳艳[1]（2021）在《雌激素对血管性痴呆大鼠认知功能及凋亡自噬相关蛋白和Wnt/β-catenin信号通路的影响》文中研究说明血管性痴呆（Vascular dementia,VD）是由各种脑血管疾病（缺血或出血或急慢性缺氧性脑血管病等）导致脑功能障碍而引起的一组获得性认知功能障碍临床综合征。随着全球人口老龄化时代的到来,脑血管病患病人数逐年增多,VD已成为仅次于阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）导致认知功能障碍的第二大病因。迄今为止,VD的发病机制尚未完全明确,治疗方面主要是控制相关的心脑血管危险因素及伴随症状,缺乏确切有效的治疗药物。因此,深入探讨VD的发病机制,并寻求有效的VD防治药物显得尤为重要和迫切。雌激素是一种类固醇激素,不仅影响女性生殖系统,还能调节糖脂代谢、骨代谢,保护心血管系统。脑是雌激素作用的靶器官之一,雌激素受体广泛分布于海马、大脑皮层、下丘脑、基底前脑等与认知相关的区域。流行病学资料显示,脑卒中发病率在绝经前女性中明显低于同年龄阶段男性,但绝经后男女发病率无明显差异。近年研究发现,应用雌激素替代治疗的绝经后女性,其痴呆的发病率明显降低,表明雌激素可能是一种有希望的治疗VD的新方法。在中枢神经系统中,海马是学习记忆、信息处理和信号传输的重要部位,当海马受到缺血缺氧损伤时,细胞内多条信号转导通路出现异常,细胞凋亡及自噬同时激活,从而加速神经元的死亡。Wnt/β-catenin信号通路是一条在中枢神经系统发育过程中发挥重要作用的关键性通路,而且也参与各种细胞内程序,包括细胞增殖、存活、分化、调亡,是调控细胞生长、增殖分化的关键途径。但到目前为止,在血管性痴呆模型中,雌激素能否通过调节海马神经元凋亡、自噬及Wnt/β-catenin信号通路,从而影响VD大鼠学习记忆能力的文献报道很少。基于上述研究背景,本研究选取雌性SD大鼠,采用双侧卵巢切除术（Ovariectomy,OVX）联合双侧颈总动脉结扎术（Bilateral common carotid artery occlusion,BCCAO）制备去势VD大鼠模型,应用雌激素连续干预8周,采用Morris水迷宫评估大鼠学习和记忆能力的改善情况,采用HE染色和透射电子显微镜观察雌激素对海马神经元形态学影响,采用免疫组织化学染色和Western blot法观察雌激素对细胞凋亡、自噬相关蛋白的表达影响。在此基础上,进一步探讨雌激素发挥神经保护作用是否与激活Wnt/β-catenin信号转导通路有关,为雌激素改善认知障碍的作用机制提供更全面的理论依据。第一部分 去卵巢血管性痴呆大鼠模型的建立及雌激素对去卵巢血管性痴呆大鼠认知功能的影响目的:通过OVX联合BCCAO的方法,建立去势大鼠VD动物模型,通过行为学评估VD大鼠学习记忆能力,观察雌激素对VD大鼠认知功能的影响。方法:1.清洁级成年健康雌性SD大鼠48只,随机分为假手术组（sham组）、模型组（model组）、雌激素早期治疗组（E2-early组）、雌激素晚期治疗组（E2-later 组）。2.假手术组大鼠仅切除卵巢周围少量脂肪组织,其余三组大鼠予OVX术切除双侧卵巢。OVX术后1周,假手术组大鼠接受BCCAO假手术,其余三组大鼠接受BCCAO制备VD模型。3.E2-early组大鼠于BCCAO术后第一天开始接受17β-雌二醇（E2）腹腔注射,100 μg/kg/day,溶剂为芝麻油;E2-later组大鼠于BCCAO术后一周开始接受E2腹腔注射,100 ug/kg/day;假手术组和模型组大鼠分别接受等量芝麻油腹腔注射。每组大鼠每天腹腔注射一次,连续8周。4.最后一次给药的次日,对大鼠进行Morris水迷宫实验,评估大鼠的空间学习记忆能力。前5天为定位航行实验,第6天为空间探索实验。结果:1.定位航行实验将逃逸潜伏期（escape latency）即SD大鼠从入水到上台的时间,作为评估大鼠空间学习能力的指标。随着训练天数的增加,四组大鼠的平均逃逸潜伏期逐渐缩短,统计学显示同组各时间点逃逸潜伏期具有显着性差异（F=173.481,P<0.01）。在定位航行实验的第1天,四组大鼠的逃逸潜伏期尚无明显差异;在定位航行实验的第2～5天,模型组大鼠逃逸潜伏期较假手术组明显增加（第2天,P<0.05;第3～5天,P<0.01）。雌激素干预后,E2-early组大鼠逃逸潜伏期较模型组明显缩短（第3天和第4天,P<0.05;第5天,P<0.01）。E2-later组仅在第5天逃逸潜伏期较模型组明显缩短（P<0.05）。2.空间探索实验在实验的第6天,撤除平台,记录大鼠120秒内在原平台象限停留时间占总时间的百分比（目标象限时间百分比）、原平台象限路程占总路程的百分比（目标象限路程百分比）以及穿越原平台所在位置的次数（穿台次数）,作为评估大鼠空间记忆能力的指标。模型组大鼠目标象限时间百分比和路程百分比均明显缩短,表明BCCAO导致了大鼠记忆缺陷,而E2-early组大鼠目标象限时间百分比和路程百分比均较模型组明显增多。模型组大鼠穿台次数较假手术组显着减少;E2-early组大鼠穿台次数较模型组明显增加。虽然E2-later组大鼠的目标象限时间百分比、目标象限泳程百分比、穿台次数均高于模型组,但差异无统计学意义。3.四组大鼠游泳轨迹的变化大鼠初入水时随机游动寻找水下平台,游泳轨迹多在水迷宫边缘。随着训练天数增加,假手术组、雌激素治疗组大鼠寻台方式逐渐变为趋向式,尤其是假手术组大鼠的游泳轨迹甚至接近直线模式,而模型组大鼠直至训练结束,寻台方式仍多为边缘模式,反映出模型组大鼠出现了明显的认知功能损害。结论:1.通过OVX联合BCCAO方法能够成功建立去势VD大鼠模型,能模拟慢性脑低灌注造成的学习及记忆功能障碍。2.雌激素治疗可以明显改善VD大鼠的学习和记忆能力,并且早期雌激素干预比晚期雌激素干预更有效。第二部分 雌激素对血管痴呆性大鼠海马组织形态学的影响目的:观察VD大鼠海马神经元病理形态学的改变以及雌激素不同给药时机对VD大鼠海马神经元形态学的影响。方法:行为学测试结束后,大鼠麻醉,心脏采血,采用ELISA法测定各组大鼠血清雌二醇数值。灌注固定,断头取脑,制备标本,光镜下HE染色和透射电镜观察海马CA1区神经元细胞形态学变化。结果:1.血清雌二醇浓度的测定结果模型组大鼠血清中雌激素的浓度较假手术组和雌激素治疗组均显着降低。雌激素治疗组和假手术组比较,血清中雌激素的浓度差异无统计学意义。2.大鼠海马CA1区神经元HE染色结果假手术组大鼠海马CA1区椎体神经元细胞数量丰富,排列紧密,细胞轮廓清晰,形状规则饱满,核仁清晰,染色质分布均匀。模型组大鼠海马CA1区椎体神经元排列松散紊乱,胞体缩小,大部分胞体呈多角形或梭形,细胞核固缩深染,核仁模糊甚至完全消失,胞浆周围空晕。经雌激素治疗后的大鼠,尤其是E2-early组,海马CA1区椎体神经元细胞损伤较轻,细胞排列相对致密,细胞结构相对完整,核仁清晰,偶见核固缩的神经元。E2-later组海马CA1区神经元细胞数量减少,排列较为松散,多数细胞形态模糊,可见少部分核固缩变性的神经元。3.大鼠海马CA1区神经元超微结构改变假手术组大鼠海马CA1区神经元细胞核形态规则饱满,双层膜结构清晰,核内染色质分布均匀,胞浆内细胞器丰富,超微结构完整,只有少量神经元内可见自噬小体。模型组大鼠海马CA1区神经元细胞轮廓异型,核固缩,核周隙变大,核膜溶解内陷,核内异染色质增多,并凝集成块边聚化,胞浆内细胞器明显减少,残存的线粒体肿胀呈空泡样,粗面内质网扩张断裂,自噬小体增多。雌激素干预后,细胞核和细胞器的超微结构损伤明显减轻,细胞核形态正常,细胞器清晰。值得注意的是,与E2-early组相比,E2-later组大鼠海马CA1区神经元的超微结构损伤仍较为明显。结论:VD大鼠的海马CA1区神经元细胞出现了显着的组织病理学变化。经过雌激素治疗后,尤其是早期治疗组,海马神经元的损伤明显减轻,雌激素可能以一种治疗时间依赖的方式发挥其作用。第三部分 雌激素对血管性痴呆大鼠海马神经元凋亡和自噬相关蛋白表达的影响目的:观察VD大鼠海马组织中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3及自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin1的表达,进一步观察雌激素对神经元凋亡及自噬的调控作用,探讨雌激素发挥神经保护作用的机制。方法:1.动物分组及干预方式同第一部分。2.采用免疫组化的方法检测大鼠海马组织CA1区Bcl-2、Bax、caspase-3、Beclin1阳性细胞的表达,采用免疫荧光染色观察大鼠海马组织中LC3Ⅱ阳性细胞的表达。采用蛋白质免疫印迹技术检测大鼠海马组织中Bcl-2、Bax、caspase-3、LC3Ⅱ、Beclin1 蛋白的表达变化。结果:1 免疫组化方法检测大鼠海马Bcl-2、Bax、caspase-3、Beclin1的表达变化1.1 光镜下Bcl-2免疫阳性产物呈棕黄色颗粒,神经元胞浆和胞核均有定位。与假手术组相比,模型组海马CA1区神经元Bcl-2的IOD/area值明显降低（P<0.05）。与模型组相比,E2-early组Bcl-2的IOD/area值显着增高（P<0.05）,而E2-later组Bcl-2的IOD/area值虽较模型组有增高,但无统计学差异。1.2 光镜下Bax免疫阳性产物呈棕黄色颗粒,主要定位于神经元胞浆。与假手术组相比,模型组海马CA1区神经元Bax的IOD/area值明显增高（P<0.05）。与模型组相比,E2-early组Bax的IOD/area值显着降低（P<0.05）,而E2-later组Bax的IOD/area值虽较模型组有所降低,但无统计学差异。1.3 光镜下caspase-3免疫阳性产物为棕色颗粒,神经元胞浆及胞核均有定位。与假手术组相比,模型组海马CA1区caspase-3的IOD/area值明显增高（P<0.05）。与模型组相比,E2-early组caspase-3的IOD/area值显着降低（P<0.05）,而E2-later组caspase-3的IOD/area值虽较模型组有降低,但无统计学差异。1.4 光镜下Beclin1免疫阳性产物为棕黄色颗粒,定位于神经元胞浆。与假手术组相比,模型组海马CA1区Beclinl的IOD/area值显着增加（P<0.01）。与模型组相比,E2-early 组及 E2-later 组 Beclinl 的 IOD/area 值均显着降低（P<0.01 E2-early组vs.Model组;P<0.05 E2-later组vs.Model组）,但E2-early组与E2-later组之间差异无统计学差异。2 免疫荧光观察大鼠海马LC3Ⅱ的表达LC3Ⅱ蛋白在本实验中标记为黄绿色荧光。荧光显微镜观察假手术组神经元细胞免疫荧光表达较微弱,模型组LC3Ⅱ免疫荧光强度明显增加（P<0.01）。与模型组比较,E2-early组和E2-later组LC3Ⅱ免疫荧光表达强度均显着减少（P<0.01 E2-early 组 vs.Model 组;P<0.05 E2-later组vs.Model组）,但E2-early组与E2-later组之间差异无统计学差异。3 Western blot 结果3.1 模型组大鼠海马中Bcl-2、Bax、caspase-3、LC3Ⅱ、Beclinl蛋白的表达3.1.1 与假手术组相比,模型组Bcl-2蛋白表达量显着下降（P<0.05）,Bax蛋白、caspase-3蛋白表达量均显着升高（均P<0.05）,有统计学意义。3.1.2 与假手术组对比,模型组LC3Ⅱ蛋白及Beclin1蛋白表达量显着升高（均P<0.05）,有统计学意义。3.2 雌激素对 VD 大鼠海马 Bcl-2、Bax、caspase-3、LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表达的影响3.2.1 与模型组相比,E2-early组及E2-later组Bcl-2蛋白表达量均显着增加（均P<0.05）,Bax蛋白表达量均显着下降（均P<0.05）,caspase-3蛋白表达量均显着下降（均P<0.05）,有统计学差异。3.2.2 与模型组相比,E2-early组及E2-later组LC3Ⅱ蛋白表达量显着下降（均P<0.05）,E2-early组及E2-later组Beclin1蛋白表达量明显下降（P<0.01 E2-early组vs.Model组;P<0.05 E2-later 组 vs.Model 组）,有统计学差异。结论:VD大鼠海马神经元细胞凋亡增加及自噬被激活,导致海马神经元变性及死亡。雌激素可以通过减轻海马神经元凋亡及下调自噬的激活来改善海马损伤。第四部分 雌激素对血管性痴呆大鼠海马组织Wnt/β-catenin信号通路的影响目的:观察雌激素对VD大鼠Wnt/β-catenin信号转导通路的影响,并对其分子生物学机制进行探讨。方法:1.清洁级成年健康雌性SD大鼠48只随机分为四组:假手术组（sham组）、模型组（model组）、雌激素组（E2组）、雌激素+Wnt通路抑制剂组（E2+DKK1 组）。2.模型组大鼠仅切除卵巢周围少量脂肪组织,其余三组大鼠予OVX术。OVX术后1周,模型组、E2组、E2+DKK1组接受BCCAO手术制备VD模型,假手术组行BCCAO假手术。E2+DKK1组大鼠于BCCAO术后第一天接受侧脑室置管术。3.E2组大鼠及E2+DKK1组大鼠分别于BCCAO术后第1天开始接受17β-雌二醇腹腔注射,100 μg/kg/day,溶剂为芝麻油,假手术组大鼠和模型组大鼠分别接受等量芝麻油腹腔注射。每日1次,连续7天。重组人类DKK1蛋白用于阻断Wnt/β-catenin信号转导通路。E2+DKK1组大鼠于BCCAO术后第1天和第4天接受侧脑室注射DKK1 10 μl,浓度为1μg/μl。4.BCCAO术后7天后取材,光镜下HE染色及透射电镜观察海马CA1区神经元细胞形态学变化,免疫组化法及Western blot技术检测海马组织中β-catenin、Cyclin D1、GSK-3β 的蛋白表达。结果:1.光镜下大鼠海马CA1区神经元HE染色结果假手术组大鼠海马CA1区神经元细胞排列致密有序,胞核规则饱满,核仁清晰。模型组大鼠海马CA1区神经元排列紊乱,胞体缩小呈梭形或多角形,胞核深染、固缩,核仁消失。E2组大鼠海马CA1区神经元损伤明显减轻,神经元排列整齐,大部分细胞形态清晰,少部分神经元细胞形态模糊,偶见核固缩的神经元。E2+DKK1组大鼠海马CA1区神经元排列松散紊乱,大部分神经元细胞形态模糊,胞核形状不规则,深染、固缩,胞浆周围发现空晕,胞间距较大。2.透射电镜下大鼠海马CA1区神经元超微结构的改变假手术组大鼠海马CA1区神经元细胞核形态规则饱满,双层膜结构清晰,核内染色质分布均匀,胞浆内细胞器丰富,超微结构完整。模型组大鼠海马CA1区神经元细胞轮廓异型,核固缩,核周隙变大,核膜溶解内陷,核内异染色质增多,并凝集成块边聚化,胞浆内细胞器溶解消失。E2组大鼠海马CA1区神经元细胞核形态正常,双层核膜模糊,胞浆内细胞器虽然较丰富,但内质网明显扩张,高尔基体及线粒体均明显肿胀。E2+DKK1组大鼠海马CA1区神经元固缩,形态不规则,核膜溶解断裂,核内异染色质增多,并凝集成块边聚化,胞浆内细胞器明显减少,糖原颗粒消失,线粒体消失,残存的内质网及高尔基体明显扩张。3免疫组化法观察大鼠海马β-catenin、Cyclin D1及GSK-3β的表达3.1光镜下β-catenin免疫阳性产物呈棕黄色颗粒,定位于神经元胞浆。模型组大鼠海马CA1区β-catenin的IOD/area值较假手术组显着降低（P<0.05）。经过雌激素治疗后,E2组较模型组的β-catenin的IOD/area值显着增高（P<0.05）,而给予Wnt通路抑制剂后,E2+DKK1组与模型组相比较,β-catenin的IOD/area值虽有所增高,但无统计学差异,E2+DKK1组的IOD/area值较E2组显着降低（P<0.05）。3.2光镜下GSK-3β免疫阳性产物呈棕黄色颗粒,定位于神经元胞浆。模型组大鼠海马CA1区GSK-3β的IOD/area值较假手术组显着增高（P<0.01）。经过雌激素治疗后,E2组较模型组的GSK-3β的IOD/area值显着降低（P<0.01）,而给予Wnt通路抑制剂后,E2+DKK1组与模型组相比较,GSK-3β的IOD/area值虽有所降低,但无统计学差异,E2+DKK1组的IOD/area值较E2组显着增加（P<0.05）。3.3光镜下Cyclin D1免疫阳性产物呈棕黄色颗粒,定位于神经元胞浆。模型组大鼠海马CA1区Cyclin D1的IOD/area值较假手术组显着降低（P<0.01）。经过雌激素治疗后,E2组较模型组的Cyclin D1的IOD/area值显着增加（P<0.01）,而给予Wnt通路抑制剂后,E2+DKK1组与模型组相比较,CyclinD1的IOD/area值虽略所增加,但无统计学差异,E2+DKK1组的IOD/area值较E2组显着降低（P<0.01）。4 Western blot 结果4.1 模型组:与假手术组相比,大鼠海马组织β-catenin蛋白表达量均显着减少（P<0.05）,Cyclin D1蛋白表达量显着减少（P<0.01）,GSK-3β蛋白表达量显着增加（P<0.01）。4.2 E2组:与模型组比较,经雌激素干预治疗后,这种趋势得到了明显逆转,β-catenin蛋白表达量显着增加（P<0.05）,Cyclin D1蛋白表达量显着增加（P<0.01）,GSK-3β蛋白表达量显着减少（P<0.01）。4.3 E2+DKK1组:与单独给予雌激素治疗相比,同时给予DKK1,大鼠β-catenin蛋白表达量显着减少（P<0.01）,Cyclin D1蛋白表达量显着减少（P<0.05）,GSK-3β蛋白表达量显着增加（P<0.05）。结论:雌激素治疗可减轻VD大鼠海马神经元损伤,给予Wnt通路抑制剂DKK1,使得雌激素的保护作用明显减弱,表明雌激素可能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路发挥其作用。第五部分 雌激素替代治疗对手术绝经患者术后认知功能的影响目的:探究雌激素替代治疗对手术绝经患者术后认知功能的影响。方法:选取河北省人民医院妇科2019年1月至2020年1月收治的42例因良性病变行子宫及双侧卵巢切除患者为研究对象（术前均未绝经）,年龄48～54岁,分为两组,实验组为自愿接受雌激素治疗的患者22例,给予戊酸雌二醇片口服6个月;对照组20例,不接受激素治疗。比较用药后6个月两组患者血清雌二醇水平及认知功能变化。结果:治疗后实验组患者血清雌二醇水平较对照组显着增加（P<0.05）,蒙特利尔认知评估量表（Montreal cognitive assessment,MoCA）评分较对照组显着增加（P<0.05）。结论:雌激素替代治疗有助于改善手术绝经患者术后认知功能。
陈燕霞[2]（2020）在《补肾促卵方调控PI3K和Nrf2信号通路保护卵巢储备功能低下的机制研究》文中研究说明研究背景随着人们生活方式和生育观念的改变,女性生育年龄不断后移,全球生育率呈逐年下降的趋势,而不孕不育的发病率呈逐年攀升的趋势。流行病学调查结果显示,在我国育龄人群中不孕不育的发病率高达15%～20%,患者累计超过6000万,尤其是在我国二孩政策开放后,高龄妇女成为不孕不育的主要就诊人群。其中,卵巢储备功能低下（Diminished Ovarian Reserve,DOR）是造成育龄女性发生不孕不育的重要致病因素,若未能及时干预则可在1～6年内进一步恶化并发展成为卵巢早衰。DOR不仅影响患者的生殖和心理健康,远期还可增加骨折、骨质疏松、心血管事件的发生风险。现代医学主要采用激素替代疗法改善患者临床症状和预防远期并发症,并通过辅助生殖技术进行人工助孕,但由于许多患者无法获得成熟的卵子进行体外受精,因此最终不能获得成功妊娠。中医药在防治不孕不育方面具有悠久的历史并积累了丰富的经验。前期通过查阅相关文献发现,肾虚血瘀是贯穿DOR发生发展全过程的基本病机,补肾活血是治疗DOR的重要治法。导师马堃研究员三十余年来一直致力于补肾活血中药治疗排卵障碍性不孕不育的临床及基础研究,根据多年临床诊疗经验,以补肾活血法为组方原则拟定补肾促卵方,长期应用于临床以治疗DOR,效果颇佳。现代药理研究显示,补肾促卵方可以通过抑制卵泡颗粒细胞凋亡,减少卵泡闭锁,增加原始卵泡,从而起到保护卵巢储备功能的作用。对于大多数雌性哺乳动物而言,卵巢中原始卵泡的数量是相对固定且不可再生的,因此不论何种因素诱导DOR的发生,最终都可将其归咎于卵巢中原始卵泡库提前耗竭,导致卵巢储备衰减,因而不能提供充足数量的原始卵泡以被募集进入生长卵泡池,卵泡发育障碍,最终无法形成具有受精能力的成熟卵子。因此,寻求有效治疗药物,积极改善卵巢储备功能、保护原始卵泡库是防治DOR的关键策略之一,而这正是中医“治未病”思想的体现。随着研究的不断深入,越来越多的证据支持原始卵泡过度激活是诱导卵巢储备提前耗竭的重要病理机制。为了维持生殖寿命,卵巢中绝大部分原始卵泡都处于静息休眠状态,每个周期中只有极少一部分原始卵泡会被激活进入生长卵泡池。其中,PI3K/AKT/mTOR信号通路在维持原始卵泡静息状态和启动募集过程中发挥着至关重要的作用,对于维持原始卵泡激活与休眠、存活与凋亡之间的动态平衡具有重要的意义。一旦原始卵泡过度激活进入生长卵泡池,将伴随着大量生长卵泡发生异常闭锁,而颗粒细胞凋亡是导致卵泡闭锁的中心环节,其中Bax/Cyt C/Caspase-3信号通路在细胞凋亡途径中起着关键的调控作用,而氧化应激又是启动细胞凋亡程序的重要刺激因素。细胞凋亡的实质就是细胞内氧化系统与抗氧化系统之间动态平衡被打破的结果,其中,Nrf2/ARE信号通路是体内最为重要的抗氧化应激防御体系,在维持细胞稳定、抑制细胞凋亡等方面具有重要的作用。因此,本研究拟从PI3K/AKT/mTOR信号通路、Bax/Cyt C/Caspase-3信号通路以及Nrf2/ARE信号通路探讨补肾促卵方保护雷公藤多苷诱导DOR的作用机制。在此基础上,并对补肾促卵方进行了急性毒性实验研究,以评价其用药安全性,以期为临床应用提供科学依据。研究目的本研究通过雷公藤多苷构建DOR小鼠模型,筛选出最适补肾促卵方给药浓度后,观察其对模型小鼠卵巢储备功能的保护作用,进而从分子角度深入探讨补肾促卵方通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路逆转雷公藤多苷诱导卵巢原始卵泡过度激活的作用机制,以及补肾促卵方通过激活Nrf2/ARE信号通路,抑制雷公藤多苷所致氧化应激对卵巢Bax/Cyt C/Caspase-3信号通路的激活,减少颗粒细胞凋亡,防止生长卵泡过度闭锁,从而起到保护卵巢储备功能的作用机制。与此同时,本研究开展了补肾促卵方急性毒性实验研究,以期为临床用药安全性提供客观依据。研究方法一、补肾促卵方急毒实验为了验证补肾促卵方的安全性,以小鼠为研究对象,进行急性毒性实验研究。在预实验中将20只小鼠随机分为给药组和对照组,灌胃前12h每组小鼠均禁食不禁水,给药组予最高给药浓度和小鼠可承受的最大给药体积的补肾促卵方溶液,1日灌胃3次,每次间隔约4h,对照组予等体积生理盐水灌胃,连续观察7天,测定LD50值。根据预实验结果,正式急毒实验采用药物最大耐受量实验的方法进行研究,将40只小鼠随机分为给药组和对照组,给药组灌胃当日予小鼠可承受最大给药体积和最高给药浓度的补肾促卵方浓溶液3次,对照组灌胃给予等体积生理盐水,每次间隔约4h,连续观察14天,密切观察小鼠的死亡情况、反应症状、体重变化、饲料消耗量,以及主要脏器大体形态改变和脏器指数情况。二、补肾促卵方浓度筛选实验雌性Balb/c小鼠随机分为:空白组、模型组、补肾促卵方低剂量组、补肾促卵方中剂量组、补肾促卵方高剂量组和戊酸雌二醇组。除空白组外,其余各组每日均予40mg/kg雷公藤多苷混悬液灌胃,同时补肾促卵方低剂量、中剂量和高剂量组分别予浓度为0.13g/mL、0.27g/mL和0.53g/mL补肾促卵方混悬液0.2mL灌胃;戊酸雌二醇组予0.015mg/mL戊酸雌二醇混悬液0.2mL灌胃;空白组和模型组予0.2mL生理盐水灌胃。每组均连续干预30天,观察各组小鼠一般情况、动情周期变化,计算性腺指数,测定血清性激素（FSH、LH、E2）含量,并通过HE染色观察卵巢组织形态及卵泡计数情况。三、补肾促卵方调控PI3K/AKT/mTOR信号通路保护原始卵泡池的作用机制雌性Balb/c小鼠随机分为:空白组、模型组、补肾促卵方组和激素序贯组。除空白组外,其余各组每日均予40mg/kg雷公藤多苷混悬液灌胃,同时补肾促卵方组予0.27g/mL补肾促卵方混悬液灌胃;激素序贯组予戊酸雌二醇联合醋酸甲羟孕酮进行序贯治疗;空白组和模型组予等体积生理盐水灌胃。每组均连续干预30天,观察各组小鼠一般情况、动情周期变化,测量并计算各个脏器指数情况,检测血清性激素（AMH、INHB、FSH、LH、E2）水平,并通过HE染色观察子宫、卵巢形态学改变以及卵泡计数情况。为了进一步明确补肾促卵方保护雷公藤多苷诱导DOR小鼠原始卵泡池的作用机制,采用Western blot法检测卵巢组织PI3K/AKT/mTOR 信号通路关键蛋白 PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT、mTOR、P-mTOR表达水平,并采用RT-PCT分别检测PI3K、AKT、mTOR mRNA表达水平。四、补肾促卵方调控Bax/Cyt C/Caspase-3信号通路保护生长卵泡的作用机制在实验三的基础上,研究发现雷公藤多苷除了诱导原始卵泡发生过度激活外,还可引起卵泡发生过度闭锁。为了深入探讨雷公藤多苷诱导DOR是通过使原始卵泡过度激活、致使生长卵泡闭锁增加,还是直接诱导原始卵泡发生闭锁。在此基础上本实验对小鼠卵巢组织进行了 TUNEL荧光染色,并通过免疫组化法观察卵巢组织Cyt C、Caspase-3表达情况。为了进一步明确补肾促卵方抑制雷公藤多苷引起卵泡过度闭锁的作用机制,本实验采用Western blot法检测卵巢组织凋亡相关蛋白CytC、Caspase-3、Bax、Bcl-2表达水平,同时采用RT-PCT检测Bax、Bcl-2mRNA表达水平。五、补肾促卵方调控Nrf2/ARE信号通路抑制卵巢氧化损伤的作用机制在上述实验基础上,研究发现雷公藤多苷可通过诱导原始卵泡过度激活,并使进入生长卵泡池的颗粒细胞发生过度凋亡,促使卵泡异常闭锁,从而造成DOR。基于氧化应激是启动细胞凋亡程序的重要调控因素,为了进一步探索雷公藤多苷诱导卵泡颗粒细胞凋亡的作用机制以及补肾促卵方对其保护作用,本实验对卵巢组织8-OHdG、MDA、CAT、GSH-Px、SOD的水平进行了测定,同时采用Western blot和RT-PCT对卵巢组织Nrf2/ARE信号通路关键蛋白和基因Bach 1、Nrf2、Keap 1、HO-1的表达水平进行了检测。研究结果一、补肾促卵方急毒实验预实验结果提示补肾促卵方测不出LD50,故正式急毒实验采用最大耐受量实验的方法进行研究,结果显示补肾促卵方灌胃给药后,所有动物均未见死亡并且存活至实验结束。除给药组小鼠在灌胃后2h内出现静伏、活动减少、D0粪便色黑以及D1摄食量减少外,各组小鼠在其他时间点的一般状况良好。实验过程中两组小鼠日均饲料消耗量无明显差异,小鼠体重呈稳定上升趋势。两组小鼠主要脏器大体解剖均未见异常现象,主要脏器指数也无明显差异。二、补肾促卵方浓度筛选实验各组小鼠在实验期间进食、活动和大小便均无明显异常,补肾促卵方干预后小鼠体毛致密有光泽:除空白组外,各组小鼠予雷公藤多苷灌胃后,体重先呈下降趋势,随后逐渐增加至正常水平,至实验结束,各组小鼠体重无明显差异。补肾促卵方中、高剂量组能有效地改善小鼠动情周期,升高子宫和卵巢指数（P<0.05）,下调血清FSH、LH水平（P<0.01）,并增加原始卵泡、窦状卵泡和黄体计数（P<0.01）,减少闭锁卵泡计数（P<0.01）。三、补肾促卵方调控PI3K/AKT/mTOR信号通路保护原始卵泡池的作用机制各组小鼠一般情况、体重及动情周期变化趋势与实验二结果一致。补肾促卵方干预后小鼠卵巢指数升高（P<0.01）,血清AMH和INHB水平上升（P<0.01）,FSH、FSH/LH值下降（P<0.01,P<0.05）;补肾促卵方能增加卵巢原始卵泡、窦状卵泡和黄体计数（P<0.01,P<0.05,P<0.01）,减少次级卵泡和闭锁卵泡数目（P<0.01）,同时下调早期生长卵泡与原始卵泡比值（P<0.01）。补肾促卵方能增加小鼠子宫内膜厚度并使子宫内膜腺体数目增多。进一步研究发现补肾促卵方能下调卵巢组织 P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT、P-mTOR/mTOR 值（P<0.01）,同时减少 AKT和mTOR mRNA表达水平（P<0.01）,并使PI3K mRNA表达呈下降趋势。四、补肾促卵方调控Bax/Cyt C/Caspase-3信号通路保护生长卵泡的作用机制卵巢组织TUNEL荧光染色主要出现在各级生长卵泡周围的颗粒细胞中,而位于皮质区的原始卵泡未见明显荧光着色,补肾促卵方干预后卵巢荧光面积和数量明显减少。免疫组化结果显示Cyt C和Caspase-3蛋白也主要表达于各级生长卵泡周围的颗粒细胞中,而原始卵泡表达较少,补肾促卵方能减少卵巢组织Cyt C和Caspase-3阳性表达面积比（P<0.01）。Western blot结果显示补肾促卵方能减少卵巢组织Cyt C、Caspase-3和Bax蛋白表达水平（P<0.05）,增加Bcl-2和Bcl-2/Bax值（P<0.05,P<0.01）,同时补肾促卵方能使Bax mRNA表达水平呈下调趋势,增加Bcl-2mRNA和Bcl-2/Bax值（P<0.01）。五、补肾促卵方调控Nrf2/ARE信号通路抑制卵巢氧化损伤的作用机制补肾促卵方能减少卵巢8-OHdG、MDA含量（P<0.05,P<0.01）,增加CAT、GSH-Px和SOD活力（P<0.01）。Western blot结果显示,补肾促卵方能下调Bach 1核蛋白和Keap1蛋白表达水平（P<0.01,P<0.05）,上调Nrf2核蛋白和HO-1蛋白表达水平（P<0.05）,同时补肾促卵方能下调Bach 1核易位率并上调Nrf2核易位率（P<0.01）。RT-PCT结果显示,模型组和补肾促卵方组Bach 1和Nrf2 mRNA水平均升高（P<0.01）,但补肾促卵方能下调Keap 1 mRNA并上调HO-1 mRNA表达水平（P<0.05,P<0.01）。研究结论1.补肾促卵方最大耐受量为660.00g生药/kg/d,相当于临床用药量的240倍,该方临床用量安全无毒。2.补肾促卵方中、高剂量能够有效地保护雷公藤多苷诱导DOR小鼠的卵巢储备功能,且两者疗效相当,故在后续实验中选择中剂量进行研究。3.补肾促卵方能通过抑制卵巢PI3K/AKT/mTOR信号通路,逆转雷公藤多苷诱导DOR小鼠原始卵泡过度激活,减少卵泡异常闭锁,从而起到保护卵巢储备功能的作用。4.补肾促卵方能通过抑制卵巢Bax/Cyt C/Caspases-3信号通路,上调Bcl-2表达,减少生长卵泡颗粒细胞过度凋亡,从而防止雷公藤多苷诱导DOR小鼠出现生长卵泡异常闭锁。5.补肾促卵方能通过调控卵巢Nrf2/ARE信号通路,抑制Keap1过表达,促进Nrf2核易位,激活下游抗氧化酶活性,从而减轻雷公藤多苷诱导DOR小鼠卵巢出现氧化应激,防止卵泡颗粒细胞过度凋亡。
王桦影[3]（2019）在《二至丸对结肠癌细胞侵袭转移的作用机理研究》文中进行了进一步梳理[目的]侵袭转移是结肠癌患者高死亡率的重要因素之一,本课题基于“阴虚致瘤”的假说探讨滋阴方二至丸对结肠癌细胞增殖、周期、凋亡及侵袭转移的作用机理,为二至丸抗结肠癌增殖及侵袭转移提供科学依据,对提高患者生存率具有重要意义。[方法]1.细胞增殖实验:采用噻唑兰（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT）比色法检测二至丸含药血清和奥沙利铂（Oxaliplatin,L-OHP）对结肠癌HCT116细胞增殖的作用。2.细胞周期、凋亡实验:（1）采用PI染色法检测药物对结肠癌HCT116细胞周期分布的影响;（2）采用Annexin V-FITC/PI染色法检测药物对结肠癌HCT116细胞凋亡的影响;（3）采用蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测药物对结肠癌HCT116细胞凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达变化。3.细胞侵袭转移实验:（1）采用划痕实验检测药物对结肠癌HCT116细胞迁移的影响;（2）采用Transwell小室检测药物对结肠癌HCT116细胞侵袭能力的影响;（3）采用Western blot检测结肠癌HCT116细胞p65、p-p65、VEGFR1、E-Cadherin蛋白表达的变化;（4）采用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）检测结肠癌HCT116细胞VEGFR1、CDH1基因表达变化。[结果]1.增殖实验结果显示:二至丸药物血清干预HCT116细胞12 h后,2.5%、10%浓度的药物血清对HCT116细胞的增殖具有显着的抑制作用（P<0.05）;48 h后2.5%、5%、10%、20%浓度的药物血清对细胞有显着抑制作用（P<0.05）;72 h后抑制作用减弱,只有10%药物血清对细胞有显着抑制作用（P<0.05）。2.细胞周期、凋亡实验:（1）周期实验结果显示:与空白对照组各期比较,L-OHP组和联用组将细胞阻滞在G1期（P<0.05）,二至丸含药血清中、高剂量组将细胞阻滞在S期（P<0.05）。（2）凋亡实验结果显示:与空白对照组比较,各用药组均显着促进了细胞的凋亡（P<0.05）,联用组细胞凋亡率最高（P<0.05）。（3）Western blot实验结果显示:与空白对照组比较,L-OHP组和联用组可以显着上调Bax蛋白表达（P<0.05）,并且联用组比L-OHP组Bax蛋白表达显着升高（P<0.05）。与空白对照组比较,各用药组均显着下调Bcl-2蛋白的表达（P<0.05）。3.侵袭转移实验:（1）划痕实验结果显示:12h、24h:与空白对照组比较各用药组细胞迁移率均显着降低（P<0.05）,并且联用组迁移率最低。36h、48 h:与空白组比较,除二至丸高剂量组,其余用药组细胞迁移率均显着降低（P<0.05）,联用组迁移率最低。（2）Transwell实验结果显示:与空白对照组比较各用药组穿模细胞数均显着减少（P<0.05）。（3）Western blot实验结果显示:与空白对照组比较,二至丸含药血清中、高剂量组显着下调了p-p65、VEGFR1蛋白的表达（P<0.05）,联用组比L-OHP组显着降低了p-p65、VEGFR1蛋白的表达（P<0.05）;与空白对照组比较,L-OHP组和联用组显着上调了E-cadherin蛋白的表达（P<0.05）,并且联用组比L-OHP组E-cadherin蛋白表达显着升高（P<0.05）。（4）qPCR实验结果显示:与空白对照组比较,二至丸含药血清中、高剂量组显着下调了VEGFR1mRNA的表达（P<0.05）,联用组比L-OHP组显着降低了VEGFR1 mRNA的表达（P<0.05）;与空白对照组比较,各用药组对CDH1 mRNA表达没有显着影响。[结论]1.二至丸含药血清能够抑制结肠癌HCT116细胞的增殖。2.二至丸含药血清通过将细胞阻滞在S期改变结肠癌HCT116细胞的细胞周期分布,促进细胞的凋亡,并能协同L-OHP增加凋亡率,其机制可能与抑制Bcl-2蛋白的表达,增加Bax蛋白的表达有关。3.二至丸含药血清能够抑制结肠癌HCT116细胞的迁移和侵袭,其机制可能与下调p-p65、VEGFR1蛋白和mRNA的表达,协同L-OHP增加E-cadherin蛋白的表达有关。
谢慧慧[4]（2019）在《二仙汤对去卵巢大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用及机制研究》文中研究指明目的:本研究利用UHPLC/Q-TOF-MS及HPLC技术对二仙汤水煎液化学成分进行定性与定量检测分析。通过去卵巢（Ovx）结合左冠状动脉前降支结扎再灌注（I/R）方法,复制去卵巢大鼠心肌缺血再灌注损伤（MIRI）模型,灌胃给予二仙汤（EXD）,探讨二仙汤对去卵巢大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用及机制。利用H2O2作用心肌细胞复制心肌细胞氧化应激模型,给予芒果苷作用,考察芒果苷对心肌细胞氧化应激损伤的作用及机制。方法:1、通过UHPLC/Q-TOF-MS及HPLC技术对二仙汤水煎液中有效成分进行定性定量检测分析,利用电喷雾（ESI）离子源正负离子模式检测采集数据,Peakview质谱分析软件提供的化学成分保留时间、精准相对分子量和二级质谱碎片离子信息结合chemicalbook、chemspider化学信息检索建立化学成分数据库进行数据分析。2、将SPF级雌性SD大鼠根据体重随机分组,除假手术组（Sham）外,其余各组均进行卵巢摘除,通过阴道涂片筛选造模成功大鼠分为去卵巢组（Ovx）、去卵巢+缺血再灌注组（Ovx+I/R）、戊酸雌二醇组(Estradiol Valerate,E2 V,0.8mg·kg-1)、二仙汤低剂量组(Er-xian Decoction Low,EXD/L,4g·kg-1)、二仙汤中剂量组(Er-xian Decoction Middle,EXD/M,8g·kg-1)、二仙汤高剂量组(Er-xian Decoction High,EXD/H,12g·kg-1),灌胃给药80天;除Sham组、Ovx组外,其余各组均进行左冠状动脉前降支（LAD）结扎再灌注。以结扎后心电图ST段上抬,左心室壁发绀、苍白,再灌注ST段回落,心室壁恢复红润为缺血再灌注损伤模型成功。3、二仙汤对去卵巢大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用:Ⅱ导联采集正常去卵巢大鼠及缺血再灌注损伤后大鼠心电图,比较二仙汤对各阶段大鼠心电图的影响;Evans Blue和TTC染色法检测大鼠心肌缺血区及梗死区面积;试剂盒和酶联免疫吸附法（Elisa）检测大鼠血清中谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶同功酶（CK-MB）、雌二醇（E2）及大鼠心肌组织中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的含量;对大鼠心肌组织及子宫进行病理切片HE染色;蛋白质免疫印迹法（Western Blot）法检测大鼠心肌组织中Bcl2、Bax及雌激素α受体（ERα）蛋白的表达。4、芒果苷对心肌细胞氧化应激损伤的作用:利用酶解法和差速贴壁法分离纯化心肌细胞,分为空白组（Control）,模型组（Model）,白藜芦醇组（Resveratrol,Res,1μM）,芒果苷（Mangiferin）低剂量组（75μM）、中剂量组（150μM）、高剂量组（300μM）,药物作用24h后,除空白组外,均加H2O2 400μM作用1h,复制心肌细胞氧化应激损伤模型。MTT法检测芒果苷对心肌细胞活性的影响,试剂盒检测心肌细胞上清液中乳酸脱氢酶（LDH）、谷草转氨酶（AST）和心肌细胞中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的含量;Fluo-3AM和DCFH-DA荧光探针检测心肌细胞内Ca2+和ROS的含量;AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测各组细胞凋亡情况;Western Blot检测心肌细胞的凋亡相关蛋白Bax和PTEN/AKT/Foxo1信号通路相关蛋白的表达。结果:1、通过数据分析,二仙汤水煎液中分析出72个化合物,包括黄酮类28个、皂苷类4个、蒽醌类6个、酚苷类11个、生物碱类3个、有机酸类5个和其他15个。2、大鼠心电图结果显示,与Sham组相比,Ovx组和Ovx+I/R组大鼠心电图P波、R波、T波幅度明显减小（P<0.01）,PR间期、QRS时程、QT间期不同程度的缩短;与Ovx+I/R组相比,EXD组和E2 V组大鼠心脏ECG的病理变化显着改善。缺血再灌注后大鼠心电图比较,Ovx组与Sham组各阶段的心率、ST段幅度均无明显变化;与Ovx组相比,Ovx+I/R组在LAD结扎与再灌注阶段大鼠心电图ST段显着上抬（P<0.01）;与Ovx+I/R组相比,EXD组与E2 V组结扎与再灌注ST段上抬幅度不同程度减小（P<0.05）。Evans Blue和TTC染色结果显示,大鼠心肌缺血区与梗死区面积,Sham组与Ovx组无明显变化;与Ovx组相比,Ovx+I/R组大鼠心肌缺血区与梗死区面积明显增加（P<0.01）;与Ovx+I/R组相比,EXD组、E2 V组心肌缺血区和梗死区面积显着减小（P<0.05,P<0.01）。试剂盒检测结果显示,大鼠血清中AST、LDH、CK-MB及大鼠心肌组织中SOD的含量,Sham组与Ovx组相比无明显变化;与Ovx组相比,Ovx+I/R组大鼠血清中AST、LDH、CK-MB明显升高（P<0.05,P<0.01）,大鼠心肌组织中MDA含量升高,SOD的含量降低（P<0.05）;与Ovx+I/R组相比,EXD组、E2 V组大鼠血清中AST、LDH、CK-MB及心肌组织中MDA不同程度的降低,SOD的含量明显升高（P<0.05,P<0.01）。Elisa检测结果显示,与Sham组相比,Ovx组与Ovx+I/R组大鼠血清E2水平明显下降（P<0.01）;与Ovx+I/R组相比,EXD/M和EXD/H组E2水平显着上调（P<0.01）。大鼠心肌组织病理切片显示,EXD组大鼠心肌组织病理变化改善明显,可使心肌纤维、心肌细胞排列规整,肌间隙明显减小,心肌纤维断裂少,但有部分呈波浪状。大鼠子宫图片、病理切片和Western Blot结果显示,与Sham组相比,Ovx组与Ovx+I/R组大鼠子宫明显干瘪,皱缩,HE染色子宫内膜层变薄,腺体数量明显减少且心肌组织中ERα蛋白表达明显下调（P<0.01）;与Ovx+I/R组相比,各剂量组的EXD和E2 V组能够显着逆转上述子宫的病理变化,上调大鼠心肌组织ERα蛋白表达。Western Blot结果显示,Sham组与Ovx组大鼠心肌组织Bcl2、Bax的蛋白表达无明显差异;与Ovx组相比,Ovx+I/R组大鼠心肌组织Bcl2蛋白表达明显上调（P<0.01）,Bax蛋白表达明显下调（P<0.01）;与Ovx+I/R组相比,EXD组、E2 V组Bcl2的蛋白表达显着上调（P<0.01）,Bax的蛋白表达显着下调（P<0.01）。3、芒果苷对心肌细胞氧化应激损伤的作用:MTT结果显示,与空白组相比,模型组心肌细胞活力显着降低（P<0.01）;与模型组相比,不同剂量组的芒果苷均能够不同程度改善H2O2对心肌细胞活性的抑制作用（P<0.05）。试剂盒检测结果显示,与空白组相比,模型组心肌细胞培养基上清液中AST、LDH及心肌细胞内MDA的含量明显增加（P<0.05,P<0.01）,细胞内SOD含量明显减少（P<0.01）;与模型组相比,芒果苷药物组心肌细胞培养基上清液中AST、LDH和心肌细胞内MDA含量不同程度减少（P<0.05,P<0.01）,心肌细胞内SOD（P<0.05,P<0.01）含量显着增加。Fluo-3AM和DCFH-DA荧光探针检测结果显示,与空白组相比,模型组细胞内钙离子和ROS的含量明显增加（P<0.01）;与模型组相比,芒果苷组心肌细胞内钙离子和ROS的含量不同程度减少（P<0.05,P<0.01）。流式细胞术检测结果显示,与空白组相比,模型组心肌细胞凋亡率显着升高（P<0.01）;与模型组相比,芒果苷给药组心肌细胞的凋亡显着减少（P<0.01）。Western Blot检测结果显示,与空白组相比,模型组大鼠心肌细胞中Bax、AKT、p-PTEN的蛋白表达明显上调（P<0.01）,p-AKT、p-Foxo1的蛋白表达不同程度的下调（P<0.01）;与模型组相比,芒果苷组Bax、AKT、p-PTEN的蛋白表达显着下调（P<0.05,P<0.01）,芒果苷组p-AKT、p-Foxo1的蛋白表达不同程度上调（P<0.05,P<0.01）,各组之间的PTEN、Foxo1总蛋白表达无明显差异。结论:1、二仙汤水煎液中化学成分含量较多,共72个化合物,主要分为黄酮类、皂苷类、蒽醌类、生物碱等,其中芒果苷、淫羊藿苷、阿魏酸和盐酸小檗碱的含量较高。2、二仙汤通过调节大鼠体内雌激素水平,逆转由雌激素水平降低引起的大鼠ECG病理变化,维持雌激素对心脏的保护作用。二仙汤具有抗氧化作用,通过增加抗氧化酶活性,减轻缺血再灌注引起的心肌损伤。3、芒果苷通过改善氧化应激产生的心肌细胞不良状态,减少心肌细胞损伤、凋亡,减少心肌细胞内氧自由基,增强心肌细胞内抗氧化酶活性,减轻钙超载,从而减轻心肌细胞氧化应激损伤。
沈铜铜[5]（2019）在《自噬对玉米赤霉烯酮诱导的仔猪肠上皮细胞IPEC-J2毒性的保护作用及机制研究》文中研究说明玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEA）是镰刀菌产生的一种真菌毒素,主要污染谷物、谷物类食品与谷物饲料等。ZEA的性质稳定、难以清除、可长期存在于食物链中,具有广泛毒性,给人类与动物健康带来极大威胁。当摄入ZEA污染的饲料后,ZEA会破坏动物肠道完整性,影响肠道营养吸收与代谢,损害肠道健康,给养殖业带来巨大经济损失。在动物中,猪对ZEA最为敏感。研究ZEA对猪的肠细胞毒性可为毒素防控和人类健康防御提供理论基础。研究表明在多数应激条件下,自噬可以减缓有毒化合物的毒性以维持细胞正常生长。目前,关于ZEA与自噬间的作用研究较少,且多为ZEA与生殖系统自噬的研究,对于ZEA与肠自噬间的关系尚不清楚。研究二者间的相互作用,有望为霉菌毒素毒性防御与药物研发提供理论依据。本文主要探讨ZEA对仔猪肠上皮细胞毒性作用及机制,并对自噬的调控以及自噬和ZEA的肠细胞毒性间的作用进行了研究。试验一、玉米赤霉烯酮对仔猪肠上皮细胞的毒性研究本试验的主要目的是探讨ZEA对仔猪肠上皮细胞的毒性作用及机制。本试验应用仔猪肠上皮IPEC-J2细胞为模型,通过MTT法测定ZEA处理IPEC-J2细胞24h的半数抑制浓度（IC50）,同时测定不同浓度ZEA作用不同时间对IPEC-J2细胞活力的影响。应用Real-time-PCR检测ZEA暴露后细胞的凋亡相关基因Bax与Bcl-2的mRNA水平;利用ANXA5-FITC/PI检测细胞死亡率。为了进一步研究caspase在ZEA诱导的肠细胞毒性中的作用,我们应用caspase抑制剂预处理3h,检测其对ZEA诱导的细胞凋亡相关基因以及细胞活力的影响。结果为,ZEA处理IPEC-J2细胞24h的IC50为15.151μg/mL,ZEA能显着降低IPEC-J2细胞活力且呈剂量-时间依赖性。同时发现ZEA作用后,可显着降低Bcl-2的mRNA水平,增加Bax的mRNA水平与Bax/Bcl-2比值,以及增加细胞死亡率。添加caspase抑制剂,可显着逆转ZEA诱导的肠毒性。由此得出结论,ZEA诱导仔猪肠上皮细胞发生caspase依赖性细胞死亡。试验二、ZEA对氧化应激和细胞色素P450的影响活性氧（ROS）是机体有氧代谢的副产物。而细胞色素P450（CYP450）参与的代谢是产生ROS的重要来源之一。研究表明CYP450主要参与甾体激素的合成与代谢以及大部分的外源性物质如毒素、药物等的代谢。目前关于三者CYP450、ROS与ZEA毒性间的作用研究尚少。本研究发现ZEA可促进ROS的产生,利用ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）可增加细胞活力,降低细胞死亡,说明ZEA通过氧化应激造成细胞死亡。为检测CYP450在ZEA处理的IPEC-J2细胞中的作用,我们检测了猪肠道九种常见的CYP450的转录水平,发现ZEA可显着增加CYPOR水平。同时,ZEA处理后CYPOR的蛋白水平亦显着增加。利用CYPOR抑制剂7-ER可显着增加细胞活力,降低Bax/Bc1-2比值与细胞死亡以及ROS的水平。由此得出结论,ZEA通过CYPOR诱导氧化应激导致IPEC-J2细胞死亡。试验三、ZEA对自噬的影响研究自噬是机体的一个降解过程,可保护机体减缓大多数应激带来的损伤。本研究通过检测LC3、ATG5、SQSTM1/p62的表达以及EGFP-LC3自噬斑形成情况,发现ZEA可诱导IPEC-J2细胞发生自噬。应用自噬抑制剂CQ或3-MA结合ZEA和pmCherry-EGFP-LC3B观察自噬流情况,发现ZEA可诱导完整的自噬过程。应用CQ与siATG5可显着降低细胞活力,促进细胞死亡。结果表明ZEA可诱导仔猪肠上皮细胞发生自噬,而自噬可保护细胞抵抗ZEA的毒性。试验四、MAPK通路对ZEA诱导自噬的影响研究先前研究表明MAPK信号通路可被多种外界刺激激活,活化的MAPK可以调控细胞的生长、凋亡和自噬等。前面试验表明ZEA能够诱导IPEC-J2细胞发生自噬,但ZEA诱导的自噬信号通路机制有待深入研究。因而本试验主要探究MAPK通路对ZEA诱导的肠细胞毒性的作用以及其对细胞自噬的影响。我们检测了 ZEA处理后MAPK三大亚家族成员（ERK、JNK与p38）的转录水平变化,发现ZEA可显着增加p38/MAPK水平。利用Western blot法可见ZEA处理后p-p38的蛋白水平亦显着增加。利用p38抑制剂SB203580可显着降低细胞活力,增加Bax/Bcl-2比值与细胞死亡,表明p38激活后减缓ZEA诱导的IPEC-J2细胞死亡。然后,利用SB203580观察其对自噬相关蛋白LC3及SQSTM1/p62以及EGFP-LC3B自噬斑的影响,发现SB203580可以削弱ZEA诱导的自噬。此外,与ZEA组相比,应用p38/MAPK抑制剂与干扰自噬基因可增加CYPOR的蛋白水平和ROS水平。由此得出结论,激活p38/MAPK可调控自噬减缓ZEA诱导的CYPOR-氧化应激依赖的IPEC-J2细胞死亡。有趣的是,利用ROS抑制剂以及CYPOR抑制剂观察其对p38/MAPK、自噬蛋白LC3及自噬斑的影响,发现ROS与CYPOR可激活p38/MAPK与自噬反应。综合以上试验可知,在仔猪肠上皮细胞中,ZEA通过CYPOR诱导氧化应激导致细胞死亡,从而产生肠细胞毒性。ROS可激活p38/MAPK通路,活化的p38/MAPK可以调控自噬抵抗ZEA的肠细胞毒性,从而起到保护细胞的作用。本研究提出了一种ZEA的毒性机制及一种机体的保护性机制,为霉菌毒素及类雌激素性物质的毒性研究与防控提供理论依据。
周敏[6]（2019）在《玉米赤霉烯酮对断奶仔猪子宫生长发育的影响》文中研究表明玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEA）是少数产毒霉菌中的一种具有雌激素活性且能发挥类雌激素作用的代谢产物。近年来,世界上许多温湿地区的农作物在贮藏、加工、运输等过程中均不同程度地受到ZEA的污染,甚至还通过食物链存在于农副产品中对人及动物的健康造成极大威胁。ZEA发挥作用的靶器官主要是雌性动物的生殖系统,ZEA能与雌激素受体竞争性结合扰乱激素代谢,诱发母畜雌激素过多症,进而引起生殖器官功能和形态的变化,引发母畜繁殖障碍,给畜牧生产业带来极大的损失,不利于生猪产业的进一步发展。为了探究不同水平ZEA污染饲粮对断奶仔猪子宫生长发育的影响,本研究主要采用HE染色法、免疫组织化学、qRT-PCR、Western Blot等试验方法比较断奶仔猪子宫内增殖凋亡相关因子及TGF-β1/Smad3信号通路关键基因的分布与表达差异。试验选取34-36日龄健康三元杂交（杜×长×大）断奶仔猪40头,平均体重为（14.01±0.86 kg）。将所有试验动物随机分为4个处理,每个处理10头猪,组间初始体重差异不显着（P>0.05）,小母猪单笼饲养。对照组饲喂基础饲粮,三个试验组分别在基础饲粮上添加0.5、1.0及1.5 mg/kg ZEA（ZEA的测定值分别为0.52±0.07、1.04±0.03和1.51±0.13 mg/kg）,预饲期10 d,正式期35 d。本试验结果如下:随着饲粮中ZEA水平的升高,断奶仔猪的子宫指数呈一次（P<0.01）和二次（P<0.01）线性升高;1.5 mg/kg ZEA处理组的子宫指数显着高于1.0 mg/kg处理组（P<0.05）,1.0 mg/kg处理显着高于0.5 mg/kg处理组和对照组（P<0.05）;并且子宫肌层和内膜厚度随着ZEA水平的升高呈一次（P<0.01）和二次（P<0.01）线性升高,子宫腺密度明显增大。免疫组织化学结果显示断奶仔猪子宫内生长激素受体（Growth hormone receptor,GHR）、增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen,PCNA）、B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2,BCL-2）、BCL-2相关X蛋白（Bcl-2-associated x protein,BAX）免疫阳性物质主要分布在子宫肌层平滑肌细胞、血管壁细胞、内膜上皮细胞、腔上皮细胞,而GHR、PCNA、BCL-2在基质细胞也有分布,且随着饲粮中ZEA的增加,免疫阳性反应明显增强,但免疫阳性物质的分布位置没有因ZEA水平而发生明显变化。子宫内GHR、PCNA和BCL-2的mRNA相对表达量均呈一次（P<0.01）和二次（P<0.01）线性升高;BAX、Smad3的mRNA相对表达量呈一次（P<0.05）线性升高;1.5 mg/kg ZEA和1.0 mg/kg处理组TGF-β1的mRNA相对表达量显着高于0.5 mg/kg（P<0.05）,且0.5 mg/kg ZEA组的显着高于对照组（P<0.05）。子宫内GHR、PCNA、BCL-2、BAX、TGF-β1、Smad3和p-Smad3的蛋白相对表达量均呈一次（P<0.05）和二次（P<0.01）线性升高。以上结果表明,（1）ZEA（0.5-1.5 mg/kg）能改变断奶仔猪子宫形态学结构,且子宫器官指数与ZEA水平呈剂量效应;（2）ZEA可能通过调控子宫内PCNA和GHR的高水平表达,引发性早熟、促进细胞增殖,进而诱导子宫肥大、异常发育;（3）ZEA可以激活子宫内经典的TGF-β1/Smad3信号通路,参与子宫生长发育等生殖活动。
马双[7]（2018）在《菟丝子黄酮等中药成分缓解双酚A致小鼠生殖毒性作用机制研究》文中提出双酚A（Bisphenol A,BPA）是一种普遍存在的环境内分泌干扰物（Environmental Endocrine Disrupters,EEDs）,可引起动物生殖激素紊乱,导致生殖细胞凋亡等,但其具体作用机理尚不很清楚。本试验旨在探讨孕鼠口服接触BPA后,导致子代小鼠生殖器官损伤及生殖相关基因表达异常以及不同中药成分对其保护作用。试验以小鼠为模型动物,给妊娠第8-14 d的孕鼠每日口服不同剂量的BPA,待仔鼠（雄鼠及雌鼠）性成熟后检测其性腺组织结构（睾丸或卵巢）的变化,血清中卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）以及睾酮（T）的水平,睾丸及卵巢内Bax和Bcl-2蛋白表达水平,以及胆固醇侧链裂解酶基因（CYP11α）,类固醇合成急速调节蛋白（StAR）,干细胞因子（Kitlg）以及抗苗勒管激素（AMH）mRNA的变化。于仔鼠断乳时检测母鼠体重,卵巢组织结构及仔鼠死亡率。在此基础上,研究了菟丝子黄酮、番茄红素或黄芩苷对BPA致子代小鼠生殖毒性的缓解作用。体外试验检测了BPA染毒睾丸间质细胞（TM3）以及菟丝子黄酮等保护处理后的T及StAR变化。1.BPA对仔鼠及孕鼠生殖毒性:根据国外参考文献使用的600 mg/kg BW和前期预试验结果,确定本研究BPA口服剂量为500 mg/kg BW。孕鼠口服BPA对子代雄鼠生殖毒性的结果为:与对照组相比,BPA组仔鼠血清T水平降低,睾丸组织损伤严重;睾丸间质细胞中促凋亡蛋白Bax表达量增多,抑制细胞凋亡蛋白Bcl-2表达量减少;睾丸间质细胞中StAR mRNA表达降低,CYP11αmRNA表达增高。孕鼠口服BPA对子代雌鼠生殖毒性的结果为:与对照组相比,BPA组仔鼠FSH,LH水平降低,E2水平较高,卵巢结构损伤严重;卵巢颗粒细胞中Bax表达升高,Bcl-2表达降低;升高卵巢组织AMH mRNA表达量,降低Kitlg mRNA表达量。与对照组相比,500 mg/kg BPA组孕鼠体重降低,孕鼠卵巢组织损伤严重,仔鼠死亡率升高（P<0.01）。2.菟丝子黄酮等中药成分对BPA致小鼠生殖损伤的保护作用:孕鼠在妊娠1-7d每天给予菟丝子黄酮等能够缓解BPA引起的仔鼠生殖毒性。雄性仔鼠结果显示:菟丝子黄酮、番茄红素或黄芩苷能够升高仔鼠血清T水平,缓解BPA引起的睾丸组织损伤。与BPA组相比,菟丝子黄酮能够升高睾丸间质细胞中StAR,CYP11α和Bcl-2蛋白表达,升高睾丸组织中StAR,CYP11α和Bcl-2 mRNA表达,降低Bax mRNA表达,减少睾丸组织中的凋亡细胞数量。番茄红素能够升高睾丸间质细胞中Bcl-2蛋白表达,降低Bax表达,升高睾丸组织中StAR,CYP11α及Bcl-2 mRNA表达;黄芩苷能够升高睾丸间质细胞中CYP11α,Bcl-2蛋白表达,降低Bax表达,升高睾丸组织中Bcl-2 mRNA表达。对雌性仔鼠结果显示:菟丝子黄酮、番茄红素或黄芩苷能够缓解卵巢组织病变。与BPA组相比,菟丝子黄酮升高血清中FSH及LH水平,降低仔鼠E2水平,降低卵巢颗粒细胞中AMH,Bax蛋白表达,升高Bcl-2表达,降低凋亡细胞数量,能够升高卵巢组织中Kitlg,Bcl-2 mRNA表达,降低AMH,Bax mRNA表达,减少卵巢凋亡细胞;番茄红素升高仔鼠血清LH水平,降低E2水平,降低卵巢颗粒细胞中AMH,Bax蛋白表达,升高Bcl-2蛋白表达,降低凋亡细胞。同时升高卵巢组织中Kitlg mRNA表达,降低AMH mRNA表达;黄芩苷降低仔鼠血清中E2水平,升高FSH及LH水平,降低卵巢颗粒细胞中AMH蛋白表达,升高Bcl-2蛋白表达,降低卵巢组织中AMH mRNA表达。菟丝子黄酮等能够缓解BPA引起的孕鼠体重降低,仔鼠死亡率升高,缓解BPA致卵巢组织损伤。3.菟丝子黄酮等中药成分对BPA致TM3细胞生殖毒性保护作用研究:菟丝子黄酮、番茄红素或黄芩苷能够升高BPA引起的TM3细胞T分泌量减少,升高StAR蛋白表达,保护睾丸间质细胞免受BPA毒性。综上所述,孕鼠接触BPA引起子代小鼠生殖激素紊乱,诱发仔鼠睾丸间质细胞及卵巢颗粒细胞凋亡。主要机制是BPA干扰与激素合成相关基因及蛋白的表达,导致激素分泌合成细胞（睾丸间质细胞及卵巢颗粒细胞）发生凋亡,细胞减少,最终引起生殖激素水平异常,产生生殖毒性。不同中药成分如菟丝子黄酮和番茄红素对BPA引起的生殖毒性产生缓解作用,使性激素合成相关基因及蛋白表达稳定,抑制激素分泌合成细胞（睾丸间质细胞及卵巢颗粒细胞）凋亡,保护子代免受环境雌激素BPA对生殖器官功能的伤害。
冯晓庆[8]（2018）在《淫羊藿苷及17β-雌二醇对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用机制研究》文中研究指明帕金森病（Parkinson’s Disease,PD）是一种以黑质区域的致密带（substantia nigra par compacta,SNpc）多巴胺能神经元的进行性变性、缺失为主要病变的疾病。流行病学的统计结果表明,在PD患者中,男性多于女性,提示雌激素可能发挥着重要的作用。人体中,17β-雌二醇（17β-estradiol,E2）是最主要的雌激素,对神经细胞具有保护作用及防止神经退化的功能。目前有研究认为,雌激素可通过基因组途径和非基因组途径发挥其神经保护作用。基因组途径与胞内经典的雌激素核受体（estrogen receptor,ER）的激活有关,而非基因组途径是通过膜表面的G蛋白偶联雌激素受体（G protein-coupled estrogen receptor,GPER）来介导。另有研究表明,在中枢神经系统雌激素可通过雌激素受体与胰岛素样生长因子-1受体（insulin-like growth factor-1 receptor,IGF-1R）信号通路的交互对话,发挥神经保护作用。但流行病学资料显示长期使用雌激素可产生严重的副作用。因此,从传统中药中寻找具有类雌激素样作用,但副作用小的植物雌激素,系统研究其对神经元的保护作用和药理作用机制,将对中国传统中药的推广应用具有重要意义。淫羊藿苷（icariin,ICA）是淫羊藿的主要活性成分,具有类雌激素样作用。本课题组的前期工作证明ICA能够对抗神经毒素MPTP对多巴胺能神经元的损伤,但其神经元保护作用的靶点及机制,有待于进一步探讨。本实验在1-甲基-4-苯吡啶离子（1-methy-4-phenylpyridinium,MPP+）制备的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞损伤的模型上,采用MTT、免疫印迹技术的实验方法,应用GPER特异性激动剂G1,GPER特异性阻断剂G15、ER特异性阻断剂ICI182,780及IGF-1R特异性阻断剂JB1,研究淫羊藿苷和E2抗MPP+神经毒性的作用及其可能机制。实验结果如下:1.应用不同浓度MPP+（0.1 mM10 mM）处理SH-SY5Y细胞,随着MPP+浓度的增加,细胞的存活率逐渐降低。其中1 mM和10 mM MPP+组细胞存活率分别下降了26%和84%（P<0.01,P<0.001）。在后续实验中,我们选用1 mM MPP+。2.不同浓度的淫羊藿苷（0.001μM10μM）单独处理SH-SY5Y细胞,对细胞的存活率没有影响（P>0.05）。淫羊藿苷预处理SH-SY5Y细胞24 h,再与1 mmol/L MPP+共同作用细胞24 h,结果显示,0.01μM和10μM浓度的淫羊藿苷预处理组,细胞存活率较单用MPP+组明显升高（P<0.05;P<0.05）。在后续实验中,我们选用0.01μM的淫羊藿苷。3.单用E2（0.001μM、0.01μM）处理细胞,对SH-SY5Y细胞的存活率无影响（P>0.05）。应用E2预处理细胞24 h,再与MPP+共同作用24 h,0.001μM和0.01μM E2均能够明显降低MPP+的毒性作用（P<0.05）。在后续实验中,我们选用0.01μM E2。4.应用不同浓度的GPER特异性激动剂G1（0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM、2μM）预处理细胞24 h,再与MPP+共同作用24 h,可明显降低MPP+对细胞的毒性作用,其中0.01μM G1保护作用最为明显（P<0.05）。而1μM和2μM G1共处理组则对细胞存活率有不同程度的降低（P<0.05;P<0.001）。单用0.001μM0.1μM G1对SH-SY5Y细胞存活率没有影响,而1μM和2μM G1可明显抑制细胞的存活（P<0.05;P<0.001）。5.分别应用GPER特异性阻断剂G15（1μM）、IGF-1R特异性阻断剂JB1（1μg/m L）或ER特异性阻断剂ICI182,780（1μM）预处理细胞1 h,再应用淫羊藿苷或E2预保护细胞24 h,继而与MPP+共同作用24h。结果显示,JB1或ICI182,780共处理组,淫羊藿苷或E2的神经保护作用被阻断（P<0.05;P<0.001）,而G15预处理不能阻断淫羊藿苷或E2的神经保护作用（P>0.05）。单用阻断剂对细胞的存活率没有影响。6.为进一步明确G15的阻断效应,本研究应用G15预处理细胞,观察其对G1神经保护作用的阻断效应。结果显示G1对由MPP+诱导的神经元细胞损伤的保护作用能够被G15所阻断（P<0.01）。7.Western blotting结果显示,淫羊藿苷或E2预处理能够对抗MPP+诱导的Bcl-2蛋白表达的降低（P<0.001;P<0.01）和Bax蛋白表达的增加（P<0.01;P<0.001）。应用阻断剂JB1或ICI182,780,淫羊藿苷或E2的保护作用能够被阻断（P<0.01,P<0.001）。而G15预处理不能阻断淫羊藿苷或E2的上述作用（P>0.05）。单用阻断剂对Bcl-2和Bax蛋白的表达没有影响（P>0.05）。8.G1预保护亦能够对抗MPP+诱导的Bcl-2蛋白表达的降低（P<0.001）和Bax蛋白表达的增加（P<0.01）,G15预处理能够阻断G1的神经保护作用。上述结果表明:淫羊藿苷和E2可明显对抗MPP+对SH-SY5Y细胞的损伤,其机制可能是通过经典的雌激素核受体ER及IGF-1R介导的信号通路发挥其抗凋亡作用,雌激素膜受体GPER不是其主要的作用靶点。本研究结果为淫羊藿苷神经保护作用的靶点和可能机制提供了新的实验依据。
王丽娟[9]（2017）在《雌激素对Treg细胞凋亡和PD-1表达的影响及其与孕早期感染弓形虫致不良妊娠结局的关系》文中研究说明刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种人畜共患的细胞内寄生原虫,能够感染几乎所有温血动物的有核细胞。免疫力正常的人感染弓形虫后大多无明显的症状,但免疫缺陷病人感染后易导致严重的弓形虫病甚至死亡。孕妇在妊娠早期初次感染弓形虫会导致流产、胎盘细胞凋亡等;而孕晚期感染一般不引起流产,但发生垂直传播的概率达到80%。妊娠期胎儿对于母体来说相当于一种半同种异体的移植,胎儿能够成功躲避来自母亲的免疫攻击,这得益于妊娠期母亲免疫环境中耐受机制的形成,其中抑制性免疫细胞和分子发挥着重要的调节作用,这有助于母亲全身和局部免疫耐受的形成。调节性T细胞（Regulatory T cell,Treg）是CD4+T细胞中发挥负性调节作用的一群细胞,在维持正常妊娠中起着重要作用。以往研究表明,正常妊娠后小鼠的Treg细胞增多,流产小鼠的Treg细胞数目减少,将正常妊娠小鼠的Treg细胞过继转移给有流产倾向的小鼠,可有效降低流产率。本实验室前期研究发现,弓形虫排泄-分泌抗原（Excreted-Secreted Antigens,ESA）可诱导孕鼠体内CD4+CD25+调节性T细胞凋亡,减少了 Treg细胞数目,从而促进流产的发生。程序性死亡分子（Programmed death-1,PD-1）是主要表达在T、B淋巴细胞上的负性协同刺激分子,在维持正常妊娠中起着重要的作用。有研究表明,Treg细胞是通过表达免疫抑制分子PD-1和分泌细胞因子TGF-β、IL-10来发挥免疫抑制作用。此外,Treg细胞上PD-1表达增加会加强其抑制淋巴细胞活化的能力,从而起到保护胎儿的作用。封闭PD-1,Treg细胞的保护性作用消失,小鼠的流产率增高。有报道雌激素可以抗细胞凋亡并且促进Treg细胞上PD-1的表达,而PD-1+Treg具有更强的免疫负调控能力。雌激素受体敲除鼠体内PD-1的表达和Treg细胞的抑制功能都降低。在弓形虫致病中一个有趣的现象就是:弓形虫感染导致不良妊娠结局与母亲妊娠期间感染弓形虫的时间点有关,孕妇在妊娠早期初次感染弓形虫会导致流产等严重的不良妊娠结局;而孕晚期感染弓形虫一般不会引起流产。但是,其具体的机制尚未阐明。由于Treg细胞的数目和PD-1的表达在维持正常妊娠中具有重要作用,我们希望了解孕鼠在孕早期和孕晚期这两个不同的时间点感染弓形虫后,Treg细胞的数目和PD-1分子表达的变化,以及这种变化是否因为感染的时间点不同而存在差异,同时希望揭示造成这种差异的原因。本研究从体内和体外两方面分别设计实验,希望从Treg细胞的角度入手阐明孕早期、孕晚期感染弓形虫造成不同妊娠结局的原因。具体的实验结果如下:1.小鼠孕早期初次感染弓形虫易诱发流产分别于孕早期和孕晚期使小鼠感染相同数量的弓形虫速殖子,感染3天后剖杀,发现孕早期感染弓形虫的小鼠子宫胎儿吸收和出血现象明显,而孕晚期并没有观察到此现象。HE染色结果显示:孕早期感染弓形虫后母胎界面有明显的充血和炎症细胞浸润现象,而孕晚期感染组母胎界面则无明显变化。2.小鼠孕早期感染弓形虫后母胎界面上Foxp3的表达低于孕晚期分别于孕早期和孕晚期使小鼠感染相同数量的弓形虫速殖子,观察感染3天后其母胎界面上Foxp3的表达。我们观察到孕早期小鼠感染弓形虫后母胎界面上Foxp3的表达低于孕晚期感染小鼠。此外,感染组小鼠母胎界面上Foxp3的表达低于未感染组。3.小鼠孕早期感染弓形虫后CD4+CD25+调节性T细胞凋亡率比孕晚期高,Treg细胞上PD-1的表达前者低于后者分别于孕早期和孕晚期使小鼠感染相同数量的弓形虫速殖子,观察感染3天后其脾脏和腹股沟淋巴结CD4+CD25+调节性T细胞的凋亡率以及PD-1的表达。结果发现:孕早期和孕晚期感染弓形虫后,小鼠CD4+CD25+调节性T细胞的凋亡率均升高,但孕早期明显高于孕晚期。此外,在未感染和感染孕鼠中,孕晚期Treg细胞上PD-1的表达都高于孕早期。4.小鼠怀孕后其体内的雌激素水平逐渐增高正常小鼠经过配种、检栓后,在孕早期、孕中期和孕晚期分别摘眼球取血,检测血清中雌二醇的含量,发现随着妊娠的进程,小鼠的雌激素水平逐渐增高,到分娩前达到高峰。这与人在正常妊娠时雌激素的变化趋势一致。5.雌激素在体外具有拮抗CD4+CD25+调节性T细胞凋亡和诱导Treg上PD-1表达的作用用不同浓度的雌激素刺激小鼠脾脏组织单个核细胞,当雌激素浓度达到10-10 M时,CD4+CD25+调节性T细胞凋亡率下降,Treg细胞上PD-1表达上升。此外,当雌激素受体激动剂浓度达到10-6 M时,其抗ESA诱导的CD4+CD25+调节性T细胞凋亡作用最明显并且Treg细胞上PD-1的表达最高;而雌激素受体阻断剂能有效地封闭雌激素抗CD4+CD25+调节性T细胞凋亡和诱导Treg细胞上PD-1表达的作用。6.通过向非妊娠小鼠皮下连续注射雌激素,可有效抑制弓形虫感染后CD4+CD25+调节性T细胞的凋亡,同时上调PD-1+Treg的比例非妊娠小鼠经过两周雌激素注射后,其体内的雌激素水平达到了孕中期的水平。小鼠感染弓形虫后,脾脏和腹股沟淋巴结中的CD4+CD25+调节性T细胞凋亡率注射雌激素组比未注射雌激素组低,而PD-1+Treg 比例前者比后者高。此外,感染小鼠注射雌激素后脾脏中CD4+CD25+调节性T细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2比例增高,促凋亡蛋白Caspase-3比例降低。这些结果提示,雌激素具有抗CD4+CD25+调节性T细胞凋亡和促进PD-1在Treg细胞上表达的作用。综上所述,孕早期和孕晚期初次感染弓形虫会导致不同的妊娠结局,可能与不同孕期雌激素作用下调节性T细胞的数目和PD-1的表达差异有关。研究结果初步揭示了孕早期感染弓形虫更易发生流产的免疫学机制,即CD4+CD25+调节性T细胞凋亡率更高,调节性T细胞数目更少,具有免疫抑制功能的PD-1+Treg细胞比例更低。这有助于认识弓形虫感染导致流产的原因及机制,为临床预防和治疗弓形虫导致的不良妊娠结局提供一定的参考。
秦璐[10]（2017）在《LIF联合PPT延长MRL/lpr小鼠生存期及解毒袪瘀滋肾方的干预机制研究》文中进行了进一步梳理目的通过研究LIF联合PPT延长MRL/lpr小鼠生存期及解毒祛瘀滋肾方对该信号通路的干预,以进一步探索SLE发病的机制。方法①以293T细胞为培养对象,用双荧光素酶报告基因检测不同刺激条件下SIE相对荧光素酶活性;②Western-blot检测ERβ、STAT3蛋白表达水平及ERβ与STAT3的互相作用;③分离外周血中性粒细胞,通过流式细胞术检测LIF、β-E2和PPT致细胞凋亡情况;④以MRL/lpr小鼠为研究对象,将小鼠随机分为空白组、LIF组、PPT组、LIF+PPT组和空白组、LIF组、β-E2组、LIF+β-E2组等,每周注射一次,13周（或12周）后处死,统计小鼠生存曲线;取小鼠脾脏、胸腺称重;眼球取血检测血常规变化;⑤以HL-60细胞为培养对象,通过用LIF、PPT和解毒祛瘀滋肾方进行分组干预,用RT-PCR检测相关凋亡基因的mRNA的表达情况。结果双荧光素酶报告基因结果显示:LIF和PPT共刺激时STAT3协同ERβ的SIE相对荧光素酶活性显着升高;Western-blot结果显示:LIF刺激ERβ、STAT3的蛋白表达,LIF联合PPT共刺激时ERβ与STAT3产生显着的互相作用;流式细胞术结果显示:LIF延长中性粒细胞的体外存活时间,抑制中性粒细胞的凋亡,LIF联合PPT抑制中性粒细胞凋亡的作用更显着;统计小鼠生存曲线结果显示:与空白组相比,LIF联合PPT能够提高MRL/lpr狼疮小鼠的生存率;血常规指标显示,与空白相比,LIF+PPT组和LIF+β-E2组WBC数明显下降（P<0.05）,中性粒细胞比率明显升高（P<0.05）;RT-PCR结果显示:LIF联合PPT能够有效调节凋亡基因的表达,解毒祛瘀滋肾方协同调节凋亡基因的表达。结论第一,LIF联合PPT使STAT3与ERβ产生显着的互相作用,进而促进SIE元件的表达。第二,LIF能够抑制中性粒细胞的凋亡,延长中性粒细胞的存活时间。通过STAT3与ERβ相互作用激活SIE元件,促进下游基因的表达,参与中性粒细胞的生长和存活。并且LIF联合PPT时抑制中性粒细胞凋亡的作用更显着。第三,LIF联合PPT提高MRL/lpr狼疮小鼠的生存率和中性粒细胞比率,同时对粒细胞中凋亡基因的表达产生不同程度的影响,可能是其延长MRL/lpr小鼠的生存期的机制。第四,解毒祛瘀滋肾方对凋亡基因的表达起到一定的协同调节作用。
二、雌激素对脾脏中Bcl-2和Bax蛋白表达的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、雌激素对脾脏中Bcl-2和Bax蛋白表达的影响（论文提纲范文）
（1）雌激素对血管性痴呆大鼠认知功能及凋亡自噬相关蛋白和Wnt/β-catenin信号通路的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 去卵巢血管性痴呆大鼠模型的建立及雌激素对去卵巢血管性痴呆大鼠认知功能的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 雌激素对血管性痴呆大鼠海马组织形态学的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 雌激素对血管性痴呆大鼠海马神经元细胞凋亡和自噬相关蛋白表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 雌激素对血管性痴呆大鼠海马组织Wnt/β-catenin信号通路的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第五部分 雌激素替代治疗对手术绝经患者术后认知功能的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 雌激素对女性认知功能的影响 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）补肾促卵方调控PI3K和Nrf2信号通路保护卵巢储备功能低下的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 文献研究 |
| 综述一 原始卵泡激活与卵巢储备功能低下的研究进展 |
| 1 原始生殖细胞形成、迁移和增殖 |
| 2 性腺发育与性别决定 |
| 3 原始卵泡形成 |
| 4 原始卵泡激活 |
| 5 原始卵泡激活与卵巢储备功能低下 |
| 综述二 卵巢储备功能低下中医研究进展 |
| 1 病名的阐释 |
| 2 病因 |
| 3 病机 |
| 4 治疗 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 第二章 实验研究 |
| 前言 |
| 第一部分 补肾促卵方安全性评价的研究 |
| 实验一 补肾促卵方急毒实验 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 补肾促卵方保护雷公藤多普诱导DOR小鼠卵巢储备功能的机制研究 |
| 实验二 补肾促卵方浓度筛选实验 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 实验三 补肾促卵方调控PI3K/AKT/mTOR通路保护原始卵泡池的作用机制 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 实验四 补肾促卵方调控Bax/Cyt C/Caspase-3通路保护生长卵泡的作用机制 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 实验五 补肾促卵方调控Nrf2/ARE通路抑制卵巢氧化损伤的作用机制 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 创新点与展望 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附件 |
（3）二至丸对结肠癌细胞侵袭转移的作用机理研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 二至丸含药血清对人结肠癌细胞增殖的影响 |
| 1 实验材料和仪器 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 动物 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 主要试剂配置 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.2.1 细胞复苏 |
| 2.2.2 细胞传代 |
| 2.2.3 细胞冻存 |
| 2.3 二至丸含药血清制备 |
| 2.4 MTT比色实验 |
| 2.4.1 奥沙利铂对HCT116细胞增殖的作用 |
| 2.4.2 二至丸含药血清对HCT116细胞增殖的作用 |
| 2.4.3 奥沙利铂联用二至丸含药血清对HCT116细胞增殖的作用 |
| 2.5 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 奥沙利铂对HCT116细胞增殖的作用 |
| 3.2 二至丸含药血清对HCT116细胞增殖的作用 |
| 3.3 奥沙利铂联用二至丸含药血清前后对HCT116细胞增殖的作用 |
| 4 分析与讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 二至丸含药血清对人结肠癌HCT116细胞周期、凋亡的影响 |
| 1 实验材料和仪器 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 PI染色检测二至丸含药血清对HCT116细胞周期的影响 |
| 2.3 Annexin V-FITC/PI染色检测二至丸含药血清对HCT116细胞凋亡的影响 |
| 2.4 Western blot检测二至丸含药血清对HCT116细胞中Bcl-2、Bax蛋白表达变化 |
| 2.4.1 总蛋白提取 |
| 2.4.2 BCA法总蛋白定量 |
| 2.4.3 检测蛋白表达变化 |
| 2.5 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 二至丸含药血清对HCT116细胞周期的影响 |
| 3.2 二至丸含药血清对HCT116细胞凋亡的影响 |
| 3.3 二至丸含药血清对HCT116细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响 |
| 4 分析与讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 二至丸含药血清对结肠癌HCT116细胞侵袭转移的影响 |
| 1 实验材料和仪器 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 划痕实验检测二至丸含药血清对HCT116细胞迁移的作用 |
| 2.3 Transwell检测二至丸含药血清对HCT116细胞侵袭的作用 |
| 2.4 Western blot检测二至丸含药血清对HCT116细胞p65、p-p65、VEGFR1、E-Cadherin蛋白表达量 |
| 2.4.1 HCT116细胞总蛋白提取 |
| 2.4.2 BCA法总蛋白定量 |
| 2.4.3 检测蛋白表达变化 |
| 2.5 q PCR检测二至丸含药血清对HCT116细胞VEGFR1、CDH1 m RNA表达的变化 |
| 2.5.1 总RNA的提取 |
| 2.5.2 RNA浓度、纯度和完整性测定 |
| 2.5.3 RNA反转录为c DNA |
| 2.5.4 实时荧光定量PCR |
| 2.6 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 二至丸含药血清对HCT116细胞迁移能力的影响 |
| 3.2 二至丸含药血清对HCT116细胞侵袭能力的影响 |
| 3.3 二至丸含药血清对HCT116细胞p-p65、VEGFR1、E-Cadherin蛋白表达影响 |
| 3.4 二至丸含药血清对HCT116细胞VEGFR1、CDH1 m RNA表达影响 |
| 4 分析与讨论 |
| 5 小结 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 答辩委员会 |
（4）二仙汤对去卵巢大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 第一章 二仙汤化学成分定性与定量检测分析 |
| 第一节 基于液质联用技术对二仙汤化学成分定性检测分析 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 药物的制备 |
| 2.2 样品处理 |
| 2.3 液质联用色谱与质谱条件 |
| 2.4 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 QC样本总离子流图 |
| 4 讨论 |
| 第二节 基于高效液相法对二仙汤有效成分定量检测分析 |
| 1 材料与试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 药物的制备 |
| 2.2 样品的制备 |
| 2.3 高效液相色谱条件 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 第二章 二仙汤对去卵巢大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用及机制研究 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药材 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 药物的制备与给药 |
| 2.2 去卵巢模型制备及筛选 |
| 2.3 动物分组给药 |
| 2.4 大鼠心电图的采集与MIRI模型制备 |
| 2.5 大鼠心肌缺血区与梗死区面积的测定 |
| 2.6 大鼠血清心肌组织样本提取及保存 |
| 2.7 大鼠血清中LDH、AST、CK-MB、E2和心肌组织中SOD、MDA的含量测定 |
| 2.8 大鼠子宫和心肌组织病理学变化的观察 |
| 2.9 大鼠心肌组织中凋亡相关蛋白Bcl2、Bax、ERα受体蛋白表达的检测 |
| 2.10 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 去卵巢MIRI大鼠心电图的改变 |
| 3.2 二仙汤对去卵巢大鼠心电图参数的影响 |
| 3.3 二仙汤对去卵巢MIRI大鼠心电图参数的影响 |
| 3.4 二仙汤对大鼠心肌组织缺血区与梗死区面积的影响 |
| 3.5 二仙汤对大鼠血清中LDH、AST、CK-MB含量的影响 |
| 3.6 二仙汤对大鼠心肌组织中SOD、MDA含量的影响 |
| 3.7 二仙汤对大鼠心肌组织病理变化的影响 |
| 3.8 二仙汤对大鼠体重及雌激素水平的影响 |
| 3.9 二仙汤对大鼠子宫形态和病理变化的影响 |
| 3.10 二仙汤对大鼠心肌组织Bcl2、Bax、ERα受体蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 芒果苷对心肌细胞氧化应激损伤的作用及机制研究 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 主要药物与试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 原代心肌细胞的培养 |
| 2.2 原代心肌细胞的鉴定 |
| 2.3 芒果苷对心肌细胞毒性的检测 |
| 2.4 H_2O_2造模浓度与时间的筛选 |
| 2.5 芒果苷对H_2O_2刺激下心肌细胞活力的影响 |
| 2.6 心肌细胞内Ca~(2+)浓度的测定 |
| 2.7 心肌细胞内ROS浓度的测定 |
| 2.8 心肌细胞培养基上清液中的LDH、AST含量的测定 |
| 2.9 心肌细胞内SOD、MDA含量的测定 |
| 2.10 心肌细胞凋亡率的检测 |
| 2.11 心肌细胞相关蛋白表达的测定 |
| 2.12 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 原代心肌细胞形态 |
| 3.2 原代心肌细胞荧光鉴定 |
| 3.3 芒果苷与H_2O_2作用浓度及作用时间 |
| 3.4 芒果苷对H_2O_2刺激下心肌细胞活力的影响 |
| 3.5 芒果苷对H_2O_2刺激下心肌细胞内Ca~(2+)浓度和ROS含量的影响 |
| 3.6 芒果苷对H_2O_2刺激下心肌细胞培养基上清液LDH、AST含量的影响 |
| 3.7 芒果苷对H_2O_2刺激下心肌细胞SOD、MDA含量的影响 |
| 3.8 芒果苷对H_2O_2刺激下心肌细胞凋亡的影响 |
| 3.9 芒果苷对H_2O_2刺激下心肌细胞相关蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 答辩委员会名单 |
（5）自噬对玉米赤霉烯酮诱导的仔猪肠上皮细胞IPEC-J2毒性的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 玉米赤霉烯酮的研究现状 |
| 1 玉米赤霉烯酮概述 |
| 1.1 ZEA的理化性质 |
| 1.2 ZEA的污染现状 |
| 2 玉米赤霉烯酮的毒性作用 |
| 2.1 ZEA的生殖毒性 |
| 2.2 ZEA的免疫毒性 |
| 2.3 ZEA的肝肾毒性 |
| 2.4 ZEA的致癌性 |
| 2.5 ZEA的DNA毒性 |
| 2.6 ZEA对肠道结构及功能的影响 |
| 3 玉米赤霉烯酮的毒性机制 |
| 3.1 雌激素受体介导途径 |
| 3.2 ZEA与氧化应激途径 |
| 第二章 自噬的研究现状 |
| 1 自噬概述 |
| 2 自噬的调节机制 |
| 2.1 自噬的相关基因及分子 |
| 2.2 自噬的相关通路 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第一章 玉米赤霉烯酮对仔猪肠上皮细胞的毒性研究 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 主要器材 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 试验细胞 |
| 2.2 IPEC-J2细胞的培养 |
| 2.3 IPEC-J2细胞的处理 |
| 2.4 MTT法检测肠上皮细胞活力 |
| 2.5 实时荧光定量PCR |
| 2.6 流式细胞术检测IPEC-J2细胞死亡 |
| 2.7 数据统计与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 ZEA对IPEC-J2细胞活力的影响 |
| 3.2 ZEA对IPEC-J2细胞死亡的影响 |
| 3.3 阻断caspase检测ZEA对IPEC-J2细胞死亡影响 |
| 4 讨论 |
| 第二章 玉米赤霉烯酮对仔猪肠上皮细胞氧化应激及细胞色素P450的影响 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 主要器材 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 主要缓冲液及试剂配制 |
| 2.2 试验分组及处理 |
| 2.3 检测IPEC-J2细胞内ROS水平 |
| 2.4 实时荧光定量PCR |
| 2.5 Western blot |
| 2.6 数据统计与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 ZEA对IPEC-J2细胞ROS的影响 |
| 3.2 NAC对ZEA诱导的细胞死亡影响 |
| 3.3 ZEA对细胞色素P450的影响 |
| 3.4 CYPOR对ZEA诱导的细胞毒性的影响 |
| 3.5 CYPOR对ROS的影响 |
| 4 讨论 |
| 第三章 玉米赤霉烯酮对仔猪肠上皮细胞自噬的影响 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 主要器材 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 主要缓冲液及试剂配制 |
| 2.2 RT-PCR检测ZEA对细胞自噬相关基因的影响 |
| 2.2 Western blot检测ZEA诱导后细胞自噬蛋白变化 |
| 2.3 质粒转染 |
| 2.4 激光共聚焦观察ZEA对自噬斑及自噬流的影响 |
| 2.5 MTT检测CQ对ZEA诱导细胞活力的影响 |
| 2.6 RT-PCR检测CQ对ZEA诱导的凋亡相关基因的影响 |
| 2.7 ANXA5-FITC/PI检测CQ对ZEA诱导细胞死亡率的影响 |
| 2.8 siRNA转染 |
| 2.9 干扰ATG5对ZEA诱导的细胞活力的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 ZEA对细胞自噬相关基因与蛋白的影响 |
| 3.2 ZEA对自噬斑的影响 |
| 3.3 ZEA对自噬流的影响 |
| 3.4 CQ对ZEA诱导细胞毒性的影响 |
| 3.5 干扰ATG5对ZEA诱导的细胞毒性的影响 |
| 4 讨论 |
| 第四章 MAPK对玉米赤霉烯酮诱导的细胞自噬的影响 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 主要器材 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 试验分组及处理 |
| 2.2 RT-PCR检测ZEA对IPEC-J2细胞MAPK通路的影响 |
| 2.3 Western blot检测蛋白的变化 |
| 2.4 激光共聚焦观察自噬斑的变化 |
| 3 结果 |
| 3.1 ZEA对IPEC-J2细胞MAPK通路的影响 |
| 3.2 p38/MAPK在ZEA诱导的细胞毒性中的作用 |
| 3.3 p38/MAPK对自噬的影响 |
| 3.4 氧化应激及CYPOR对p38/MAPK与自噬的影响 |
| 3.5 p38/MAPK及自噬对CYPOR的影响 |
| 3.6 p38/MAPK及自噬对ROS的影响 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表论文 |
（6）玉米赤霉烯酮对断奶仔猪子宫生长发育的影响（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 玉米赤霉烯酮的概述 |
| 1.1.1 玉米赤霉烯酮的结构与理化性质 |
| 1.1.2 玉米赤霉烯酮的污染现状 |
| 1.1.3 玉米赤霉烯酮的吸收、代谢 |
| 1.1.4 玉米赤霉烯酮的生殖毒性 |
| 1.2 GHR的结构与功能 |
| 1.3 PCNA的结构与功能 |
| 1.4 BCL-2 家族简介 |
| 1.4.1 抑凋亡因子BCL-2 的结构与功能 |
| 1.4.2 促凋亡因子BAX的结构与功能 |
| 1.5 TGF-β1/Smad3 信号通路 |
| 1.5.1 TGF-β1/Smad3 信号通路对子宫发育的影响 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物与试验设计 |
| 2.1.2 试验动物饲养管理 |
| 2.1.3 试验饲粮的配制 |
| 2.1.4 饲粮常规养分含量和毒素的测定 |
| 2.1.5 主要试剂的配制及测定仪器 |
| 2.2 样品采集与指标测定 |
| 2.2.1 阴户面积的测定 |
| 2.2.2 子宫的采集 |
| 2.2.3 苏木精-伊红染色(HE染色) |
| 2.2.4 免疫组织化学法测定PCNA、BCL-2和BAX在子宫内的分布 |
| 2.2.4.1 免疫组织化学法步骤(超敏二步法) |
| 2.2.4.2 免疫组织化学法步骤(普通法) |
| 2.2.4.3 免疫组织化学法结果分析 |
| 2.2.5 qRT-PCR法检测子宫内相关基因mRNA相对表达量 |
| 2.2.5.1 子宫总RNA的提取 |
| 2.2.5.2 反转录反应 |
| 2.2.5.3 引物设计 |
| 2.2.5.4 qRT-PCR反应 |
| 2.2.6 Western Blot法检测相关基因蛋白相对表达量 |
| 2.2.6.1 子宫总蛋白的提取 |
| 2.2.6.2 总蛋白浓度的测定 |
| 2.2.6.3 Western Blot测定方法 |
| 2.3 数据统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 玉米赤霉烯酮对断奶仔猪子宫器官指数及形态学结构的影响 |
| 3.2 玉米赤霉烯酮对断奶仔猪子宫内GHR分布和表达的影响 |
| 3.2.1 玉米赤霉烯酮对断奶仔猪子宫内GHR分布的影响 |
| 3.2.2 玉米赤霉烯酮对断奶仔猪子宫内GHR免疫阳性IOD的影响 |
| 3.2.3 玉米赤霉烯酮对断奶仔猪子宫内GHR mRNA和蛋白相对表达量的影响 |
| 3.3 玉米赤霉烯酮对断奶仔猪子宫内增殖与凋亡相关基因分布和表达的影响 |
| 3.3.1 玉米赤霉烯酮对断奶仔猪子宫内PCNA分布的影响 |
| 3.3.2 玉米赤霉烯酮对断奶仔猪子宫内BCL-2 分布的影响 |
| 3.3.3 玉米赤霉烯酮对断奶仔猪子宫内BAX分布的影响 |
| 3.3.4 玉米赤霉烯酮对断奶仔猪子宫内PCNA、BCL-2和BAX免疫阳性IOD的影响 |
| 3.3.5 玉米赤霉烯酮对断奶仔猪子宫内PCNA、BCL-2和BAX mRNA相对表达量的影响 |
| 3.3.6 玉米赤霉烯酮对断奶仔猪子宫内PCNA、BCL-2和BAX蛋白相对表达量的影响 |
| 3.4 玉米赤霉烯酮对断奶仔猪子宫内TGF-β1/Smad3 信号通路的影响 |
| 3.4.1 玉米赤霉烯酮对断奶仔猪子宫内TGF-β1和Smad3 mRNA相对表达量的影响 |
| 3.4.2 玉米赤霉烯酮对断奶仔猪子宫内TGF-β1和Smad3 蛋白相对表达量的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 玉米赤霉烯酮对断奶仔猪子宫阴户面积及器官指数的影响 |
| 4.2 玉米赤霉烯酮对断奶仔猪子宫形态学的影响 |
| 4.3 玉米赤霉烯酮对断奶仔猪子宫内GHR表达的影响 |
| 4.4 玉米赤霉烯酮对断奶仔猪子宫内PCNA、BCL-2和BAX表达的影响 |
| 4.4.1 玉米赤霉烯酮对断奶仔猪子宫内PCNA表达的影响 |
| 4.4.2 玉米赤霉烯酮对断奶仔猪子宫内BCL-2和BAX表达的影响 |
| 4.5 玉米赤霉烯酮对断奶仔猪子宫内TGF-β1/Smad3 信号通路的影响 |
| 5 结论 |
| 6 后续研究及展望 |
| 7 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（7）菟丝子黄酮等中药成分缓解双酚A致小鼠生殖毒性作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 1 引言 |
| 1.1 雌激素对生殖的影响 |
| 1.1.1 雌激素受体在不同生殖器官中的表达 |
| 1.1.2 雌激素在生殖中的作用 |
| 1.1.3 环境内分泌干扰物的分类 |
| 1.2 环境雌激素的危害 |
| 1.2.1 环境雌激素对生殖功能的作用 |
| 1.2.2 环境雌激素对神经系统的作用 |
| 1.2.3 环境雌激素对免疫系统的作用 |
| 1.3 双酚A(BPA)对生殖的影响 |
| 1.3.1 胚胎期接触BPA对动物生殖的影响 |
| 1.3.2 新生动物接触BPA对生殖的作用 |
| 1.3.3 成年期接触BPA对动物生殖的作用 |
| 1.4 环境雌激素生殖毒性的机理 |
| 1.4.1 环境雌激素生殖毒性的途径 |
| 1.4.2 动物生殖毒性与细胞凋亡的关系 |
| 1.4.3 动物生殖障碍与激素之间的关系 |
| 1.4.4 生殖激素与细胞凋亡的关系 |
| 1.5 中药对生殖的影响 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 2 孕鼠口服双酚A对子代及孕鼠生殖毒性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 试验药品及仪器 |
| 2.1.3 动物处理 |
| 2.1.4 仔鼠生殖激素测定 |
| 2.1.5 HE染色检测组织结构的变化 |
| 2.1.6 免疫组化检测Bax,Bcl-2蛋白表达 |
| 2.1.7 RT-PCR检测睾丸St AR和CYP11α及卵巢Kitlg,AMH基因表达 |
| 2.1.8 统计分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 不同剂量BPA对子代雄鼠的生殖毒性 |
| 2.2.2 不同剂量BPA对子代雌鼠的生殖毒性 |
| 2.2.3 不同剂量BPA对孕鼠的生殖毒性 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 不同剂量BPA对子代雄鼠的生殖毒性 |
| 2.3.2 不同剂量BPA对子代雌鼠的生殖毒性 |
| 2.3.3 不同剂量BPA对孕鼠的生殖毒性 |
| 2.4 小结 |
| 3 菟丝子黄酮等缓解BPA致子代及孕鼠生殖毒性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 试验试剂 |
| 3.1.3 动物处理 |
| 3.1.4 生殖激素检测 |
| 3.1.5 HE观察睾丸和卵巢结构变化 |
| 3.1.6 免疫组织化学检测睾丸和卵巢相关蛋白变化 |
| 3.1.7 TUNEL检测凋亡细胞表达 |
| 3.1.8 Western Blot检测睾丸生殖相关蛋白及凋亡蛋白变化 |
| 3.1.9 RT-PCR检测生殖及凋亡相关基因表达变化 |
| 3.1.10 统计分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 菟丝子黄酮等对BPA致雄性仔鼠生殖毒性的缓解作用 |
| 3.2.2 菟丝子黄酮等对BPA致雌性仔鼠生殖毒性的缓解作用 |
| 3.2.3 菟丝子黄酮等对BPA致孕鼠生殖毒性的缓解作用 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 菟丝子黄酮等对BPA致雄性仔鼠生殖毒性的缓解作用 |
| 3.3.2 菟丝子黄酮等对BPA致雌性仔鼠生殖毒性的缓解作用 |
| 3.3.3 菟丝子黄酮等对BPA致孕鼠生殖毒性的缓解作用 |
| 3.4 小结 |
| 4 BPA对睾丸间质细胞的细胞毒性以及菟丝子黄酮等缓解作用研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验仪器 |
| 4.1.3 试验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 各药物对TM3细胞活性的影响 |
| 4.2.2 菟丝子黄酮等对TM3细胞分泌T的影响 |
| 4.2.3 菟丝子黄酮等缓解BPA抑制TM3 细胞分泌T的作用 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 中药成分安全浓度的测定 |
| 4.3.2 MTT原理与适用条件 |
| 4.3.3 BPA适宜浓度研究 |
| 4.3.4 菟丝子黄酮等对BPA致TM3细胞损伤的保护作用 |
| 4.3.5 菟丝子黄酮等对TM3细胞分泌T的影响 |
| 4.3.6 菟丝子黄酮等缓解BPA引起St AR蛋白表达降低的作用 |
| 4.4 小结 |
| 5 结论 |
| 6 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（8）淫羊藿苷及17β-雌二醇对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验材料准备 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 SH-SY5Y细胞的培养及处理 |
| 2.2 MTT法 |
| 2.2.1 MTT的配置 |
| 2.2.2 MTT实验原理 |
| 2.2.3 实验步骤 |
| 2.3 免疫印迹实验 |
| 2.3.1 常用液体的配制 |
| 2.3.2 蛋白提取 |
| 2.3.3 应用BCA法检测蛋白浓度 |
| 2.3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.3.5 湿式电泳转移 |
| 2.3.6 免疫印迹 |
| 3 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 不同浓度的MPP~+对SH-SY5Y细胞活力的影响 |
| 2 不同浓度的淫羊藿苷、E2对MPP~+诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用 |
| 2.1 不同浓度的淫羊藿苷对MPP~+诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用 |
| 2.2 不同浓度的E2对MPP~+诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用 |
| 3 不同浓度的G1对MPP~+诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用 |
| 4 G15、JB1、ICI182,780对淫羊藿苷、E2神经保护作用的阻断作用 |
| 5 G15对G1神经保护作用的阻断作用 |
| 6 单用G15、JB1、ICI182,780对细胞活力的影响 |
| 7 淫羊藿苷、E2对MPP~+诱导的细胞损伤模型中的Bcl-2、Bax蛋白表达的影响及G15、JB1、ICI182,780的阻断作用 |
| 7.1 淫羊藿苷对MPP~+诱导的细胞损伤模型中的Bcl-2、Bax蛋白表达的影响及G15、JB1、ICI182,780的阻断作用 |
| 7.2 E2对MPP~+诱导的细胞损伤模型中的Bcl-2、Bax蛋白表达的影响及G15、JB1、ICI182,780的阻断作用 |
| 8 G1对MPP~+诱导的细胞损伤模型中Bcl-2、Bax蛋白表达的影响及G15阻断作用 |
| 9 药物单用对SH-SY5Y细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（9）雌激素对Treg细胞凋亡和PD-1表达的影响及其与孕早期感染弓形虫致不良妊娠结局的关系（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 Treg和PD-1在弓形虫感染致不良妊娠结局中的作用 |
| 参考文献 |
| 附录 主要英文缩写词 |
| 硕士期间参与的课题及发表的文章 |
| 致谢 |
（10）LIF联合PPT延长MRL/lpr小鼠生存期及解毒袪瘀滋肾方的干预机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| (一) 实验材料 |
| 1. 实验动物 |
| 2. 实验药品 |
| 3. 细胞株 |
| 4. 实验仪器和设备 |
| 5. 实验试剂 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 主要试剂和溶液的配制方法 |
| 2. 解毒祛瘀滋肾方水煎剂制备 |
| 3. 解毒祛瘀滋肾方含药血清、空白血清制备 |
| 4. 细胞培养 |
| 5. 293T细胞转染 |
| 6. 免疫共沉淀 |
| 7. HL-60细胞分组与干预 |
| 8. 双荧光素酶报告基因分析实验 |
| 9. Western-blot实验 |
| 10. 外周血中性粒细胞分离 |
| 11. 流式细胞术 |
| 12. RT-PCR实验 |
| 13. 动物分组 |
| 14. 给药 |
| 15. 生存曲线数据采集 |
| 16. 血常规与脾脏胸腺指数测定 |
| 17. 统计学处理 |
| 二、结果 |
| (一) 双荧光素酶报告基因分析实验检测LIF刺激后SIE相对荧光素酶活性的表达 |
| (二) Western-blot检测LIF刺激下STAT3、ERβ的蛋白表达及互相作用 |
| (三) 双荧光素酶报告基因分析实验检测不同条件刺激SIE相对荧光素酶活性表达 |
| (四) Western-blot检测不同条件下STAT3和ERβ蛋白的互相作用 |
| (五) 流式细胞术检测不同条件刺激下中性粒细胞的凋亡情况 |
| (六) 不同分组下MRL/lpr小鼠生存曲线统计 |
| (七) LIF联合PPT或β-E2对处理的MRL/lpr小鼠脾脏指数和血常规指标的影响 |
| 1. LIF联合PPT对处理的MRL/lpr小鼠脾脏指数和血常规指标的影响 |
| 2. LIF联合β-E2对处理的MRL/lpr小鼠脾脏指数和血常规指标的影响 |
| (八) RT-PCR检测不同条件下HL-60细胞中凋亡基因的表达 |
| 三、分析与讨论 |
| (一) 中医对SLE的认识 |
| (二) STAT3与SLE |
| (三) 雌激素受体与SLE |
| (四) 中性粒细胞凋亡与SLE |
| (五) 解毒祛瘀滋肾方对SLE的疗效研究 |
| (六) 解毒祛瘀滋肾方对细胞凋亡的调节 |
| (七) 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 附：文献综述 系统性录杂研究脏 |
| 参考文献 |
四、雌激素对脾脏中Bcl-2和Bax蛋白表达的影响（论文参考文献）
- [1]雌激素对血管性痴呆大鼠认知功能及凋亡自噬相关蛋白和Wnt/β-catenin信号通路的影响[D]. 杨艳艳. 河北医科大学, 2021(02)
- [2]补肾促卵方调控PI3K和Nrf2信号通路保护卵巢储备功能低下的机制研究[D]. 陈燕霞. 中国中医科学院, 2020(01)
- [3]二至丸对结肠癌细胞侵袭转移的作用机理研究[D]. 王桦影. 江西中医药大学, 2019(02)
- [4]二仙汤对去卵巢大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用及机制研究[D]. 谢慧慧. 江西中医药大学, 2019(02)
- [5]自噬对玉米赤霉烯酮诱导的仔猪肠上皮细胞IPEC-J2毒性的保护作用及机制研究[D]. 沈铜铜. 南京农业大学, 2019(08)
- [6]玉米赤霉烯酮对断奶仔猪子宫生长发育的影响[D]. 周敏. 山东农业大学, 2019(01)
- [7]菟丝子黄酮等中药成分缓解双酚A致小鼠生殖毒性作用机制研究[D]. 马双. 河北农业大学, 2018(10)
- [8]淫羊藿苷及17β-雌二醇对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用机制研究[D]. 冯晓庆. 青岛大学, 2018(01)
- [9]雌激素对Treg细胞凋亡和PD-1表达的影响及其与孕早期感染弓形虫致不良妊娠结局的关系[D]. 王丽娟. 南京医科大学, 2017(05)
- [10]LIF联合PPT延长MRL/lpr小鼠生存期及解毒袪瘀滋肾方的干预机制研究[D]. 秦璐. 浙江中医药大学, 2017(05)