胃癌NK细胞浸润与预后的关系

胃癌NK细胞浸润与预后的关系

一、胃癌NK细胞浸润与预后的关系(论文文献综述)

曾庆文[1](2021)在《LCP1的表达与胃癌临床病理相关性及肿瘤免疫细胞浸润的生物信息学分析》文中提出背景:LCP1是免疫细胞细胞间相互作用、粘附、迁移和趋化因子诱导极化的重要调节因子。此前的研究表明,LCP1被确定为多种癌症的诊断和预后标志物,如口腔鳞状细胞癌、结肠癌和肺癌。然而,LCP1在胃癌中的作用及其对肿瘤免疫浸润的影响尚不清楚。方法:在本研究项目中,首先,通过GEPIA数据库和TIMER数据库分析发现LCP1在胃癌组织中表达情况;同时免疫组化进行验证,进一步分析LCP1的表达与临床病理特征相关性。Kaplan-Meier Plotter数据库分析LCP1的表达与胃癌患者的总生存率、无进展生存率、进展后生存率的相关性,并且通过c Bio Portal数据库分析LCP1在胃癌患者中的遗传特征。此外,通过TIMER数据库、TISIDB数据库以及下载的TCGA数据库胃癌数据利用R语言分析LCP1的表达与胃癌微环境中免疫细胞浸润的相关性;同时通过GSEA软件对下载的TCGA数据库胃癌数据进行了GSEA功能通路分析。结果:在此研究中,本研究发现LCP1在胃癌组织中的表达显着高于胃粘膜组织,并且其表达与胃癌患者的肿瘤侵袭性和不良预后呈显着正相关。此外,LCP1的表达与肿瘤微环境中免疫浸润淋巴细胞相关,包括免疫抑制细胞(衰竭T细胞和调节性T细胞)和免疫支持细胞(CD4+T细胞和CD8+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞),并与肿瘤免疫细胞表面标志物密切相关。GSEA分析表明LCP1的表达在淋巴细胞形成和免疫反应的通路中起重要作用。结论:LCP1作为胃癌患者诊治潜在的生物靶点,并且在胃癌微环境中肿瘤免疫细胞浸润中发挥着重要双重作用。

原凌燕[2](2021)在《基于转录组数据挖掘分析免疫标志物与恶性黑色素瘤转移机制的研究》文中研究指明背景:恶性黑色素瘤(Malignant Melanoma,MM)是极具侵袭力的恶性肿瘤之一,具有发病隐匿,易转移,治疗反应差的特点,死亡病例占皮肤肿瘤总死亡病例的80%。多数患者确诊之前就已经发生远处转移,由于晚期有效的治疗方法和治疗药物有限,伴发转移患者总生存期仅为6-9个月,3年生存率不足15%。目前,即使包括最新获批用于转移性黑色素瘤的分子靶向治疗药物KRAS抑制剂和抗细胞毒性T淋巴细胞抗原(CTLA)-4抗体Ipilimumab在内的免疫治疗的受益群体也相当有限,而且几乎无法预测不同个体伴随治疗的严重副作用。因此,鉴定筛选与恶性黑色素瘤的预后高特异、高选择性相关的标志物,筛选出新治疗方法的获益群体,并据此预测预测筛选开发针对性的治疗方法,对改进MM的治疗至关重要,这也很可能有助于发现未来针对性研发MM新药的潜在靶点。目的:分析和筛选MM原发病例样本和转移病例样本中的差异表达基因,构建预后风险模型,并探索预后风险模型基因对肿瘤微环境的影响,分析基因标志物与MM恶性程度和免疫耐受复杂特性的关系,获取基因标志物影响黑色素瘤恶性表型相关的功能证据,为改善MM转移患者的临床治疗决策和相关新药研发提供参考依据。方法:(1)筛选基因标志物:1)以生物信息学方法,获取和清洗TCGA数据库的MM病例的基因组表达谱、生存数据,因为数据库中缺乏恶性黑色素瘤原发病例和转移病例的配对样本,所以根据数据库中恶性黑色素瘤病例的临床特征、治疗干预措施等,我们严格制定纳入和排除标准,保证原发病例样本和转移病例样本的一般资料具有可比性后,进行两组样本的差异表达基因分析;2)使用Imm Port(The Immunology Database and Analysis Portal)数据库的免疫相关基因数据集,取交集匹配出免疫相关基因标志物。3)为了保证预后时间的准确性,我们使用观察到的生存间隔时间(observed survival interval,OBS,即从TCGA采样到患者死亡或最后一次随访的时间间隔)代替总生存时间(overall survival,OS);为了排除病例临床表型和治疗干预措施等因素的影响,我们纳入了年龄、性别、AJCC分期、Clark评分、Breslow厚度值进行单变量和多变量逐步Cox风险比例回归分析以构建预后基因标志物的预测模型,并通过R软件的“survminer”软件包构建,根据ROC曲线下面积验证模型的有效性。4)通过CIBERSORTx反卷积方法重构MM样本的免疫浸润淋巴细胞的相对含量丰度,“Spearman”相关性分析确定预后模型基因与免疫浸润淋巴细胞的相关性;5)本研究还收集MM单细胞测序数据,通过单细胞组学数据对转移预后基因标志物与肿瘤微环境的浸润淋巴细胞亚组进行相关性分析并比较计算结果,进一步对反卷积计算的结果加以验证。(2)验证基因标志物:1)利用人类蛋白质图谱(The human protein atlas,HPA)数据库的人类肿瘤样本免疫组学数据验证基因标志物,包括目标蛋白在细胞内的定位、肿瘤组织中的表达水平及免疫组化的特征等;针对缺乏免疫组化数据的目标靶基因,使用TCGA泛癌数据验证该基因对多种肿瘤的预后作用;2)利用分子生物学方法,通过Cas9技术基于向导RNA(small guide RNA,sg RNA)敲除CXCR4,构建敲除目标基因的恶性黑色素瘤细胞系sg-A375细胞,通过划痕实验、Transwell实验、CCK-8实验获取CXCR4影响黑色素瘤细胞恶性生物学行为的功能证据,以实验研究验证CXCR4基因对A375细胞侵袭和转移的促进作用。结果:(1)通过一系列分析,构建了一个可以预测MM转移患者预后的由6个免疫相关基因(immune-related genes,IRGs)-SLPI,S100A7,LYZ,CCL19,CXCR4和CD79A-组成的基因标志物模型,该模型能够在训练集中区分转移MM患者的预后风险,(TCGA,n=226,log-rank test,P<0.001);且6-IRGs是MM独立的预后危险因素,不受性别、年龄和病理分期等临床特征的影响(HR=20.84,95%CI:5.00-86.93,P<0.001);在GEO独立数据集中的验证结果显示该模型对转移患者的预后也能做出有效预测(GSE19234,n=106,log-rank test P<0.001,GES53118,n=79,log-rank test,P<0.001),并通过ROC曲线验证模型的有效性;通过CIBERSORTx重构免疫浸润细胞的含量丰度,6个IRGs与免疫浸润细胞及免疫检查点基因(immune-checkpoint genes,ICGs)均具有一定的相关性。(2)通过GEO(GSE72056)单细胞测序数据集,运用单细胞分析软件及方法分析了MM转移病例样本中的细胞特征和聚类分型。结果显示,样本细胞注释后分为18类,与免疫微环境有关的肿瘤细胞亚群包括B细胞、DC细胞、成纤维细胞、粒细胞集落刺激因子、CD34造血干细胞、神经上皮细胞、神经元细胞、嗜中性粒细胞、NK细胞、前体CD34B细胞、晚期CD34B细胞、早幼粒细胞、T细胞和组织干细胞。与原发病例样本的肿瘤微环境比较,上述细胞(除NK细胞和T细胞)在淋巴结转移病例样本的含量丰度有显着差异(P<0.001);单细胞中检测到的3个基因标志物(CXCR4,LYZ和CD79A)与上述差异细胞具有显着的相关性(P<0.001)。其中,CXCR4和多种免疫浸润细胞具有较高的相关性,因此CXCR4作为后期的实验验证对象,进行生物实验验证其功能。(3)通过HPA数据库中102例MM样本的免疫组化数据验证分析了筛选出的5个IRGs(SLPI,S100A7,LYZ,CCL19和CD79A)的蛋白组化结果显示在恶性黑色素瘤中均可以看到5个基因的蛋白免疫组化的染色;CXCR4和免疫浸润细胞呈高度相关,但是CXCR4在HPA数据库缺少蛋白组化数据,因此,为深入探讨CXCR4在肿瘤中的功能,基于TCGA泛癌的数据,分析CXCR4出恶性黑色素瘤之外的多种肿瘤的预后风险比(hazard radio,HR),将CXCR4对不同肿瘤患者预后的HR进行Meta分析。结果显示,CXCR4对胃癌、骨肉瘤、卵巢癌、肺腺癌、肾透明细胞癌、头颈部癌、食管腺癌和宫颈癌的OS有预测作用(P<0.001),其中,在胃癌和肾透明细胞癌的预后是保护性因素(HR<1),在其余肿瘤的预后为危险性因素(HR>1)。CXCR4对于多种肿瘤患者的无复发生存时间(Relapse-Free Survival,RFS)预后HR的Meta分析结果显示,CXCR4的高表达对胃癌、卵巢癌、肺腺癌、肾透明细胞癌和膀胱癌具有预后预测作用(P<0.001),在胃癌、肺腺癌和肾透明细胞癌患者的RFS是保护性因素(HR>1),而在卵巢癌还和膀胱癌中是高风险因素(HR>1)。(4)通过生物实验验证CXCR4与MM的增殖、转移功能关联:使用Cas9技术,利用sg-RNA转染敲除CXCR4后构建MM的CXCR4基因敲除细胞系A375细胞(sg-A375),然后通过划痕实验和Transwell小室实验检测sg-A375细胞的迁移及穿透力,获取CXCR4与黑素瘤恶性行为相关功能的证据。与A375细胞比较,sg-A375细胞的划痕实验修复能力和迁移及侵袭能力显着下降。结果证实敲除CXCR4可抑制黑素瘤增殖、侵袭、迁移过程,表明MM中CXCR4高表达和患者预后不良相关。结论:(1)通过TCGA数据库筛选获得6个IRGs(SLPI,S100A7,LYZ,CCL19,CXCR4和CD79A)组成的可用于MM转移患者预后预测的免疫相关基因标志物(immune-related gene signature,IRGS),经GEO不同维度的独立数据集验证该6个IRGs组成的IRGS模型具有很好的适用性。(2)转移MM病例的单细胞分析结果说明:转移病例样本中的B细胞、粒细胞集落刺激因子、中性粒细胞和成纤维细胞的浸润,与MM患者预后相关,同时上述浸润细胞含量丰度和免疫预后基因表达呈显着正相关。(3)HPA数据库验证基因标志物的结果显示,除CXCR4外,其余SLPI,S100A7,LYZ,CCL19和CD79A5个基因蛋白可以在数据库验证;基于泛癌数据的meta分析结果显示,CXCR4对多种肿瘤患者的OS和RFS均具有较好的预测作用。对不同的肿瘤,CXCR4具有不同的预后判断价值。(4)CXCR4不仅促进A375细胞的增殖和克隆,还与细胞的迁移和侵袭行为密切相关,说明CXCR4可能通过影响免疫微环境而改变患者的预后。

沈仕俊[3](2021)在《胃癌D2根治术后复发及转移的影响因素分析》文中研究指明[目 的](1)探讨胃癌患者行开腹或腹腔镜下胃癌D2根治术后复发、转移的影响因素,为胃癌术后监测提供理论依据;(2)探讨外周血T细胞及细胞因子对胃癌D2根治术后复发、转移的影响。[方 法]收集2018年5月1日至2019年9月3日期间于胃镜下取材并经病理诊断及影像学检查明确为胃癌后在云南省肿瘤医院腹部外科行经开腹或腹腔镜下胃癌D2根治术,术后再次病理诊断并进行病理分期为胃癌的患者136例。回顾性分析胃癌患者行开腹或腹腔镜下D2根治术后的复发转移的总例数、转移的常见组织及器官、总体的生存情况。同时分析术前外周血中的T细胞亚群及细胞因子(CD4+/CD8+比值、NK细胞比率、CD4+T细胞比率、CD8+T细胞比率、CIK细胞比率、白介素-2、白介素-4、白介素-6、白介素-10、干扰素-γ、α肿瘤坏死因子)对D2根治术后的胃癌患者复发、转移的影响及与生存时间的长短有无关系。单因素分析用Kaplan-Meier生存分析,对有统计学意义的单因素用Cox风险比例回归模型进行多因素分析。[结 果](1)收集136例经开腹或腹腔镜下行胃癌D2根治术后的患者,观察到36例行胃癌D2根治术后的患者在术后随访中出现不同程度的复发或转移,总的复发转移率为26.5%,死亡的患者有30例,死亡率22.1%。18个月无病生存率(DFS)和18个月总生存率(OS)分别为77.2%和86.7%。腹腔淋巴结转移是胃癌患者经开腹或腹腔镜下行胃癌D2根治术后最常见的远处转移部位,约占8.8%(12/136);其余依次是腹膜转移7.4%(10/136)、肝转移5.8%(8/136)、肺转移2.2%(3/136)。(2)通过Log-rank检验对免疫功能状态指标、肿瘤标志物、错配修复基因、Ki-67、EBV感染、Hp感染、临床病理学特征等7个不同的维度进行单因素分析。发现血清中肿瘤标志物AFP、CA15-3、CA72-4、CEA值以及是否伴淋巴结转移、TNM分期、神经脉管有无侵犯、肿瘤直径的大小,血清中免疫功能状态指标CD3+T细胞比率及白介素-4值表达情况与胃癌患者经开腹或腹腔镜下行胃癌D2根治术后的DFS及OS相关(p<0.05)。将上述经单因素分析p<0.05的影响因素进一步纳入多因素Cox风险比例回归模型中进行分析,其分析表明:TNM分期为Ⅲ~Ⅳ期、CEA>3.4μg/L及癌栓侵犯神经或脉管、CD3+T细胞比率≤76.3%、白介素-4>30.85Pg/ml是影响胃癌患者D2根治术后DFS的独立危险因素(p<0.05),而CEA>3.4μg/L、癌栓侵犯神经或脉管、CD3+T细胞比率≤76.3%、白介素-4>30.85Pg/ml是影响胃癌患者D2根治术后OS的独立危险因素(p<0.05)。[结 论](1)腹腔淋巴结转移是胃癌患者经开腹或腹腔镜下行胃癌D2根治术后最常见的远处转移部位,其余分别是腹膜转移、肝转移、肺转移;(2)外周血清中的肿瘤标志物CEA、CA15-3、CA72-4、AFP值情况以及TNM分期、神经脉管有无侵犯、是否伴有淋巴结转移、肿瘤直径的大小,术前血清中免疫功能状态指标中的CD3+T淋巴细胞比率及白介素-4值情况与胃癌患者经开腹或腹腔镜下行胃癌D2根治术后的复发转移以及生存时间的长短相关;(3)TNM分期为Ⅲ~Ⅳ期、神经或脉管伴随有癌栓侵犯、CEA>3.4μg/L、CD3+T细胞比率≤76.3%、白介素-4>30.85Pg/ml是影响胃癌患者经开腹或腹腔镜下行胃癌D2根治术后复发及转移的独立危险因素。

黄晓炎[4](2021)在《POC1A可作为介导胃癌免疫浸润的临床预后标记物》文中提出背景:作为最常见的恶性肿瘤之一,胃癌在全球范围内具有较高的致死率。而其中,肿瘤微环境介导的免疫浸润对胃癌的预后存在深远影响。POC1中心蛋白A(POC1A)作为一种中心体上的关键蛋白,在调节细胞中心粒的过程中发挥重要作用,但POC1A在胃癌中并无相关研究。因此,探讨POC1A与胃癌免疫浸润及肿瘤预后的相关性,可在胃癌的早期诊断及治疗中发挥重要作用。目的:1.探索POC1A在胃癌中的表达情况并验证POC1A对胃癌患者生存预后的影响。2.验证POC1A与胃癌临床病理特征间的相关性。3.探究POC1A与胃癌中肿瘤微环境的关联。4.研究POC1A与胃癌中免疫细胞浸润之间的联系。5.研究POC1A与免疫细胞浸润对胃癌临床预后的影响。方法:1.通过TCGA及GEO等公共数据库预测POC1A在胃癌中的表达情况及其与胃癌临床预后的相关性。2.通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)及免疫组织化学技术(IHC)验证POC1A在胃癌及癌旁组织中的m RNA及蛋白表达情况。3.通过统计学方法分析POC1A的m RNA及蛋白表达量与包括临床分期、肿瘤部位及大小在内的临床特征之间是否存在显着性关联。4.通过ESTIMATE算法、单样本GSEA(ss GSEA)分析及CIBERSORT反卷积算法对公共数据库内的基因表达数据进行分析并结合TIMER数据库以预测POC1A与肿瘤微环境及免疫细胞浸润之间的关联。5.通过免疫组织化学技术(IHC)和统计学分析验证POC1A与M2型肿瘤相关巨噬细胞特异性标记物在胃癌组织中的表达情况、相关性及二者对胃癌生存预后的影响。结果:在本研究中,我们通过TCGA及GEO公共数据库预测POC1A在胃癌中发挥抑癌效应,并通过本中心组织样本及相应临床预后信息验证发现POC1A在胃癌组织中的m RNA及蛋白表达都显着低于癌旁组织(P<0.001),且KM生存分析显示POC1A高表达与胃癌不良预后呈显着负相关(P<0.05)。同时,POC1A不仅与临床病理因素中的N分期具有相关性(P<0.05),还可作为独立预后因素(HR:0.56,95%CI:0.33-0.96,P=0.034)发挥抑癌效应。因此,我们通过多种生物信息学分析方法联合多个公共数据库对POC1A与肿瘤微环境及免疫浸润的关系进行探讨,发现POC1A与肿瘤微环境及免疫浸润呈显着负相关(R<0,P<0.001)。同时,生物信息学分析及免疫组化结果都表明胃癌中M2型肿瘤相关巨噬细胞的高度免疫浸润可促进胃癌不良预后(P<0.001)且与POC1A高表达呈显着负相关(P<0.05)。此外,生存分析结果表明,综合考虑POC1A及M2型肿瘤相关巨噬细胞特异性标记物CD163的表达后,我们发现POC1A单阳性的胃癌患者预后较CD163单阳性的患者而言,具有更好的临床预后(P<0.001),且POC1A与CD163的综合表达情况可作为独立预后因素影响胃癌的总体生存率(P=0.034)。结论:在胃癌中,POC1A可作为独立预后因素介导胃癌患者的良好预后,且POC1A表达量与促癌因素M2型肿瘤相关巨噬细胞免疫浸润程度负相关。二者的综合表达情况可作为独立预后因素,与肿瘤大小一起影响胃癌的临床预后。因此我们认为POC1A可作为一个与M2型肿瘤相关巨噬细胞免疫浸润有关的新型胃癌临床预后标记物。

赵亚楠[5](2021)在《NLRP3炎症小体及γδT17/MDSCs在淋巴瘤免疫稳态失衡中的作用及机制研究》文中研究指明第一部分 NLRP3炎症小体介导的免疫抑制在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的作用和机制研究研究背景:弥漫性大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是最常见的侵袭性非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma,NHL),占所有NHL的30-35%。利妥昔单抗联合化疗作为一线治疗手段显着提高了疗效,但仍有三分之一以上的患者难治或复发。90%的难治/复发病例不能通过常规挽救化疗和自体干细胞移植得到缓解。免疫疗法近年来在肿瘤治疗领域取得重要进展,例如免疫检查点阻断剂(ICB)、CAR-T疗法等,已在多种实体瘤中取得一定的疗效,但在DLBCL患者中反应欠佳。因此,探索DLBCL发病过程中调节免疫稳态的相关机制,评估高危因素,对于提高DLBCL的治疗效果十分重要。炎症反应是肿瘤发生的关键因素之一。炎症小体可介导炎性细胞因子释放,产生炎症级联反应,促进形成适合肿瘤细胞生长的炎性微环境。NLRP3炎性小体是研究最广泛的炎症小体,外来病原体入侵或体内细胞的损伤和死亡,可招募、组装并激活NLRP3炎症小体,活化caspase-1,切割IL-1β和IL-18前体,产生有活性的IL-1β和IL-18,从而介导机体的免疫应答,促进机体清除病原体和内源性损伤。此外,NLRP3炎症小体在肿瘤的发生发展中起着重要的调节作用。既往研究表明,NLRP3炎症小体在乳腺癌、纤维肉瘤和胃癌等多种恶性肿瘤中发挥促癌作用,并且NLRP3及其效应细胞因子IL-1β和IL-18可促进免疫抑制性肿瘤微环境形成,参与肿瘤的免疫逃逸。因此,NLRP3炎症小体诱导的免疫抑制可能是肿瘤发生的机制之一。本课题组前期研究发现,初诊NHL患者血清中IL-18升高,治疗缓解后降低;且淋巴瘤细胞株中的NLRP3炎症小体可被活化,伴随NLRP3炎症小体相关基因的表达升高。然而,NLRP3炎症小体在DLBCL发病中的作用尚不清楚。肿瘤细胞可通过多种方式抑制机体的抗肿瘤免疫应答,逃逸宿主的免疫监视。免疫检查点是免疫细胞或肿瘤细胞上表达的调节免疫稳态的分子,对防止自身免疫反应过度激活起着重要作用。然而,肿瘤中过度表达的免疫检查点可使机体免疫功能受到抑制,导致肿瘤的免疫逃逸,例如肿瘤细胞表达的程序性细胞死亡配体1(PD-L1),与活化T细胞上表达的程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)结合并传递抑制性信号,诱导肿瘤免疫耐受。免疫抑制也是淋巴系统恶性肿瘤发生发展的重要因素之一。研究表明,恶性B淋巴细胞可通过高表达PD-L1逃避免疫监视。另外,肿瘤免疫微环境还存在髓系来源的抑制细胞(MDSCs)、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)及调节性T细胞(Tregs)等抑制免疫功能的细胞。研究证实,DLBCL中MDSCs可通过IL-10、S100A12及PD-L1介导T细胞功能抑制。近期研究报道,NLRP3炎症小体/IL-1β途径可促进头颈部鳞状细胞癌的肿瘤发生,阻断该途径延缓了肿瘤生长,并伴随着效应T细胞数量的增加和免疫抑制性细胞的减少。鉴于NLRP3炎症小体在肿瘤发生和免疫抑制中的重要作用,我们推测,DLBCL中NLRP3炎症小体异常活化通过介导肿瘤免疫逃逸促进淋巴瘤发生发展。目前,DLBCL中免疫抑制的调节机制尚不明确,对于DLBCL中NLRP3炎症小体的作用及免疫调节机制的深入认识,有助于识别新的生物标志物,逆转免疫抑制状态,并改善DLBCL患者免疫治疗反应。研究目的:本课题拟研究NLRP3炎症小体在DLBCL发病中的作用及其对肿瘤免疫应答的影响,分析其与临床特征和预后的相关性;体内验证NLRP3炎症小体对淋巴瘤小鼠发病的影响;探讨NLRP3炎症小体对T细胞表型和功能的影响及其参与淋巴瘤免疫抑制的作用及机制;探索NLRP3抑制剂对免疫检查点阻断疗法的影响。预期目标的实现,将揭示NLRP3炎症小体介导的免疫失衡在DLBCL发生发展中的作用及机制,为DLBCL提供新的预后标志物和治疗靶点。研究方法:1.收集35例初诊DLBCL肿瘤组织和35例正常淋巴组织(14例扁桃体组织,7例腋窝淋巴结,7例支气管淋巴结和7例胃周淋巴结),制备微阵列组织芯片。(1)免疫组化染色评估DLBCL肿瘤组织和正常组织中NLRP3炎症小体效应细胞因子(IL-1β、IL-18)的水平,分析NLRP3炎症小体活化与DLBCL临床特征的关系。(2)免疫组化染色检测PD-L1的水平,分析PD-L1的表达与临床特征的关系。(3)分析IL-1β或IL-18表达与PD-L1表达的关系。2.收集初诊、缓解和难治/复发阶段的DLBCL患者外周血标本,同时收集健康对照者及其他类型NHL患者外周血标本,分离外周血单个核细胞(PBMCs)。(1)检测DLBCL患者抗肿瘤免疫应答能力:流式细胞术检测外周血中T细胞和NK细胞比例,检测T细胞和NK细胞表面免疫检查点分子(TIM-3、PD-1、BTLA、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、CD160)的表达,检测T细胞分泌细胞因子能力(IFN-γ、TNF-α)及NK细胞脱颗粒能力(颗粒酶、穿孔素、CD107a),判断T细胞和NK细胞功能是否受损。分析外周血T细胞表达免疫检查点水平与DLBCL临床特征和预后的关系。(2)流式细胞术检测外周血中MDSCs及其亚群(PMN-MDSCs、M-MDSCs)和Tregs的比例,判断免疫抑制性细胞在DLBCL中是否扩增。(3)实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测NLRP3炎症小体相关基因(IL1B、IL18、NLRP3、ASC、CASP1、NFKB1)在PBMCs中的表达,比较DLBCL患者和健康对照中的表达差异。3.体外培养DLBCL细胞株(OCI-LY3、RC和DB),对细胞株进行不同处理:①对照组:PBS处理;②活化组:利用脂多糖(LPS)和三磷酸腺苷(ATP)活化NLRP3炎症小体;③抑制组:在加入LPS和ATP同时,利用NLRP3抑制剂MCC950抑制NLRP3炎症小体活化。(1)提取不同处理组细胞的总蛋白,Western Blot方法验证各组DLBCL细胞株NLRP3炎症小体活化状态。(2)将不同处理组的OCI-LY3和RC细胞株分别与健康志愿者的PBMCs进行间接共培养,分别共培养3、7、10天后,收集共培养体系的PBMCs,进行流式细胞术检测,分析T细胞的比例和表型。4.NLRP3炎症小体介导淋巴瘤免疫失衡的体内研究:(1)A20淋巴瘤小鼠模型构建:体外培养小鼠淋巴瘤细胞株A20细胞,接种于4周龄雌性BALB/c小鼠前肢背部皮下,设置:①对照组:腹腔注射无菌PBS;②NLRP3抑制组:腹腔注射MCC950阻断NLRP3炎症小体活化。比较两组小鼠淋巴瘤生长情况,分析阻断NLRP3炎症小体活化对小鼠淋巴瘤生长的影响。(2)ELISA检测淋巴瘤小鼠肿瘤匀浆和血浆中IL-1β和IL-18的水平,Western Blot检测小鼠肿瘤和脾脏中NLRP3炎症小体相关蛋白的表达,评估体内应用MCC950是否能抑制小鼠NLRP3炎症小体活化。(3)WesternBlot检测小鼠肿瘤组织PD-L1及相关信号通路分子的表达,分析抑制NLRP3炎症小体对PD-L1表达及相关信号通路的影响。(4)淋巴瘤小鼠抗肿瘤免疫应答检测:分离对照组和NLRP3抑制组小鼠PBMCs、脾细胞、腋窝/腹股沟淋巴结细胞和肿瘤细胞,流式细胞术检测不同部位T细胞表面PD-1和TIM-3的表达,T细胞比例及其产生IFN-γ、TNF-α和Granzyme B的能力,以及免疫抑制性细胞MDSCs、TAMs和Tregs的比例,分析阻断NLRP3炎症小体活化后荷瘤小鼠体内免疫应答的变化。(5)对A20淋巴瘤小鼠分别注射anti-IL-1β和anti-IL-18抗体,观察抑制IL-1β和IL-18活性对小鼠淋巴瘤生长的作用。流式检测小鼠外周血、脾脏、淋巴结和肿瘤等部位T细胞比例及其表面PD-1、TIM-3的表达,以及MDSCs、TAMs和Tregs的比例,分析阻断IL-1β和IL-18活性对淋巴瘤小鼠免疫应答的影响。Western Blot检测小鼠肿瘤组织PD-L1及相关信号通路分子的表达,分析阻断IL-1 β和IL-18活性对PD-L1表达的影响。(6)对A20淋巴瘤小鼠分别注射PD-L1抗体、NLRP3抑制剂MCC950,观测对小鼠淋巴瘤生长的抑制作用,分组如下:①PD-L1抗体组:腹腔注射抗小鼠PD-L1抗体;②NLRP3抑制组:腹腔注射MCC950;③联合组:腹腔注射MCC950和PD-L1抗体;④对照组:腹腔注射等量IgG。比较各组小鼠抗肿瘤免疫应答的差异:流式检测外周血、脾脏、淋巴结和肿瘤中T细胞的比例、表型和功能,以及免疫抑制性细胞的比例变化,分析NLRP3抑制剂和PD-L1抗体之间的相互作用。5.统计分析:使用SPSS 21和GraphPad Prism 7软件对数据进行分析。数据表示为平均值±标准差或中位数±数据范围或四分位数间距。所用数据为三次独立重复实验的结果。利用Student t检验和Mann-Whitney U检验评估P值,用Pearson相关系数检验相关性,P值小于0.05表示差异具有统计学意义。研究结果:1.IL-18在DLBCL肿瘤组织中显着升高且与PD-L1表达呈正相关。(1)组织芯片染色结果显示,DLBCL肿瘤组织IL-18表达水平明显升高,且与生发中心型DLBCL(GCB-DLBCL)相比,非GCB型(non-GCB)DLBCL具有更高水平的IL-18。进一步亚组分析发现,IL-18和IL-1β在CD10(-)和MUM1(+)的患者中表达水平更高。(2)组织芯片染色结果显示,DLBCL肿瘤组织PD-L1表达水平较正常淋巴组织明显上调,且PD-L1表达与DLBCL生存不良的独立预测因子Ki-67表达成正相关。而且,肿瘤微环境中PD-L1与IL-18的表达水平成正相关。(3)RT-qPCR结果显示,与健康对照相比,DLBCL患者PBMCs中的IL1B和IL18基因表达明显上调。2.流式细胞术检测发现,DLBCL患者抗肿瘤免疫应答受到抑制。(1)流式检测T细胞和NK细胞产生细胞因子水平,发现:与健康对照相比,DLBCL初诊患者外周血CD3+T细胞分泌TNF-α和IFN-γ的水平明显减少,NK细胞(CD3-CD56+)比例显着降低,NK细胞产生穿孔素和颗粒酶的水平明显下降。(2)流式检测免疫检查点分子表达,发现:与健康对照相比,DLBCL初诊患者外周血中T细胞表面PD-1和TIM-3的阳性率明显上升,NK细胞表面TIM-3和BTLA的表达明显升高。进一步分析患者临床资料发现,PD-1+T细胞比例与血清乳酸脱氢酶(LDH)水平呈正相关。而且,T细胞表达PD-1和TIM-3水平与淋巴瘤Ann Arbor分期和国际预后指数(IPI)有关,Ann Arbor Ⅲ/Ⅳ期的DLBCL患者较Ⅰ/Ⅱ期的患者外周血中PD-1+T细胞和TIM-3+T细胞比例明显升高,IPI≥3分的患者较IPI0-2分的患者PD-1+T细胞和TIM-3+T细胞比例明显升高,提示DLBCL患者T细胞表面PD-1和TIM-3表达的增多与不良预后相关。(3)流式检测免疫抑制性细胞比例,发现:与健康对照相比,DLBCL初诊患者外周血中MDSCs和Tregs细胞的比例明显增高,而治疗后缓解的DLBCL患者Tregs比例较初诊患者明显下降,难治/复发DLBCL患者Tregs比例较缓解患者明显升高。3.体外实验证实,DLBCL细胞株的NLRP3炎症小体可被活化并影响PD-L1表达。(1)WesternBlot结果显示:与对照组相比,LPS和ATP处理后,OCI-LY3、RC和DB细胞的蛋白裂解产物中,IL-1β(p17)和PD-L1蛋白水平明显升高;MCC950处理后,OCI-LY3、RC和DB细胞的蛋白裂解产物中,IL-1β(p17)和PD-L1表达明显下调。(2)体外活化或抑制RC或OCI-LY3细胞的NLRP3炎症小体,并与PBMCs共培养,流式结果显示:共培养7天后,RC细胞和OCI-LY3细胞的共培养体系中,NLRP3炎症小体活化组的CD8+T细胞比例均较对照组显着降低,而NLRP3炎症小体抑制组的CD8+T细胞比例较活化组显着升高。4.体内实验证实,MCC950体内阻断NLRP3炎症小体活化可抑制淋巴瘤生长,降低PD-L1表达。(1)我们通过向BALB/c小鼠皮下注射同系A20淋巴瘤细胞株建立了小鼠淋巴瘤模型,接种后7天左右,小鼠右侧斜肋部皮下出现肉眼可见的肿瘤,接种后14天左右,小鼠肿瘤负荷明显增加。至观察终点处死小鼠,ELISA结果显示,肿瘤组织匀浆中IL-1β和IL-18水平明显升高。(2)Western Blot结果证实:腹腔注射MCC950使小鼠肿瘤和脾脏中NLRP3炎症小体效应产物IL-1β和IL-18水平显着降低,并且显着下调淋巴瘤小鼠模型肿瘤中的PD-L1和磷酸化STAT3(pSTAT3)的蛋白水平。(3)分析NLRP3炎症小体与小鼠淋巴瘤生长的关系,发现观察终点时,NLRP3抑制组淋巴瘤小鼠的肿瘤体积和肿瘤重量明显低于对照组。5.流式结果显示,MCC950体内阻断NLRP3炎症小体活化可提高淋巴瘤小鼠的T细胞比例及其产生TNF-α的水平,减少PD-1+或TIM-3+T细胞比例,降低免疫抑制性细胞的水平。(1)与对照组相比,NLRP3抑制组小鼠肿瘤浸润CD8+T细胞明显增多,脾脏CD3+、CD4+、CD8+T细胞比例明显升高,脾脏CD3+T细胞产生TNF-α的水平明显增加,而分泌IFN-γ的水平下降。(2)与对照组相比,NLRP3抑制组小鼠脾脏和淋巴结中CD3+T细胞表达PD-1和TIM-3的比例显着降低。(3)与对照组相比,NLRP3抑制组MDSCs和TAMs比例在小鼠肿瘤、外周血、脾脏中显着降低,Tregs细胞比例在肿瘤和脾脏中显着降低。6.体内中和IL-18可抑制淋巴瘤生长,降低免疫抑制性细胞比例。(1)将淋巴瘤小鼠分别注射IL-1β或IL-18中和抗体,发现观察终点时,anti-IL-1β组和anti-IL-18组小鼠淋巴瘤大小均显着低于对照组。(2)流式结果显示:与对照组相比,anti-IL-18组小鼠肿瘤、外周血和淋巴结中CD8+T细胞比例均显着增加;anti-IL-1β组小鼠淋巴结中CD8+T细胞比例增加,而外周血中CD8+T细胞比例降低。(3)流式检测T细胞表面PD-1和TIM-3的表达,结果显示:anti-IL-18组小鼠外周血和淋巴结中CD8+T细胞表达PD-1降低,肿瘤、外周血和脾脏中CD4+T细胞表达PD-1的比例降低,且肿瘤浸润T细胞表达TIM-3降低;而anti-IL-1β组小鼠T细胞表达PD-1百分比无明显变化,肿瘤T细胞表面TIM-3表达升高。(4)流式检测免疫抑制性细胞的比例,发现:anti-IL-18小鼠外周血MDSCs和TAMs比例均明显低于对照组,且anti-IL-18组小鼠肿瘤和脾脏的Tregs比例较对照鼠显着降低;anti-IL-1 β组小鼠外周血MDSCs和TAMs也明显低于对照组,而Tregs比例无明显改变。(5)Western Blot检测小鼠肿瘤组织PD-L1及相关信号通路分子的表达,发现anti-IL-18和anti-IL-1β组小鼠肿瘤组织中PD-L1和pSTAT3蛋白表达水平均较对照显着降低。7.NLRP3炎症小体抑制剂和PD-L1抗体对于抑制淋巴瘤生长具有拮抗作用。(1)在本研究中,我们分别用MCC950、anti-PD-L1抗体单一处理或MCC950联合anti-PD-L1抗体处理淋巴瘤小鼠模型,观察对小鼠淋巴瘤生长的影响,结果显示,单用MCC950或anti-PD-L1抗体均能减小淋巴瘤小鼠的肿瘤负荷,而联用MCC950和anti-PD-L 1抗体降低了肿瘤抑制效果。(2)流式分析发现,与对照相比,anti-PD-L1抗体能显着提高肿瘤浸润性CD8+T细胞和总T细胞的比例,并增加脾脏CD8+T细胞IFN-γ和TNF-α产生;而联合MCC950后,肿瘤CD8+T细胞比例及脾脏CD8+T细胞产生IFN-γ和TNF-α的水平明显低于单用anti-PD-L1组。以上结果说明,NLRP3抑制剂会破坏由PD-L1抗体提高的CD8+T细胞比例和产生细胞因子能力。(3)流式分析发现,anti-PD-L1组小鼠脾脏和淋巴结中PD-1+T细胞比例明显高于对照组和MCC950组,而联合组小鼠的脾脏和淋巴结中PD-1+T细胞的百分比也明显高于单用MCC950组。此外,与MCC950组相比,anti-PD-L1组肿瘤浸润的MDSCs和TAMs的百分比均显着提高,而且联合用药组小鼠肿瘤中的MDSCs和TAMs比例也明显高于单用MCC950组。可见,PD-L1抗体在一定程度上破坏了由NLRP3抑制剂降低的免疫抑制因素。结论:1.DLBCL患者中NLRP3炎症小体异常活化,肿瘤组织中效应细胞因子IL-18表达上调,且与共抑制配体PD-L1表达成正相关。2.DLBCL患者体内抗肿瘤免疫应答受到抑制,肿瘤微环境中PD-L1表达增加,外周免疫抑制性细胞群体MDSCs、TAMs和Tregs明显扩增,T细胞表达PD-1和TIM-3增加,与DLBCL不良预后相关。3.阻断NLRP3炎症小体活化可显着抑制小鼠淋巴瘤进展,增强抗肿瘤免疫应答,降低免疫抑制性细胞数量。而且,NLRP3炎症小体主要通过效应因子IL-18介导淋巴瘤中免疫应答的调节。4.A20淋巴瘤小鼠模型体内阻断NLRP3炎症小体活化可拮抗PD-L1抗体对肿瘤的抑制作用。第二部分 γδT17和MDSCs在胃MALT淋巴瘤微环境免疫稳态失衡中的作用及机制研究研究背景胃粘膜相关淋巴组织(Mucosa-associated lymphoid tissue,MALT)淋巴瘤的发生发展与幽门螺杆菌(Helicobacter Pylori,HP)感染导致的胃粘膜区域免疫稳态失衡密切相关。胃MALT淋巴瘤是慢性炎症转化为肿瘤的典型疾病类型。胃粘膜局部微环境中大量免疫细胞浸润、细胞因子产生等导致的免疫稳态失衡,在胃MALT淋巴瘤的发生发展中起重要作用,因此探究其潜在的免疫调节机制对于明确炎症-肿瘤转化的机制意义重大。髓系来源的抑制细胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)由处于早期分化阶段的髓系细胞组成。生理状态下MDSCs处于静息状态,缺乏免疫抑制活性。在各种病理状态下,MDSCs被募集到淋巴器官或肿瘤组织中,通过细胞间接触或可溶性细胞因子的作用,产生广泛的免疫抑制作用。MDSCs主要通过抑制T细胞、NK细胞功能介导肿瘤免疫耐受。研究发现,MDSCs中高活性的精氨酸酶1(Arginase 1,Arg-1)消耗TCR合成的原料L-精氨酸,并抑制细胞周期相关蛋白Cyclin D3、CDK4的表达,导致T细胞增殖阻滞。MDSCs通过诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)产生一氧化氮,诱导T细胞凋亡。除此之外,MDSCs还能通过促进调节性T细胞(Tregs)聚集发挥免疫抑制作用。由此可见,MDSCs在肿瘤免疫耐受中扮演重要角色。胃粘膜免疫是机体整个免疫网络的重要组成部分,具有独特的结构和功能,其中γδT细胞的富集是胃粘膜区域免疫的重要特性。γδT细胞在胃肠道粘膜中含量丰富,对于维持胃粘膜微环境稳态、抵御外来微生物入侵及调节获得性免疫应答起重要作用。yδT细胞可分泌多种细胞因子,按功能不同可划分为分泌IFN-y的γδT1和分泌IL-17的γδT17,其中的T17的作用日益受到重视。γδT17在纤维肉瘤、皮肤癌、结肠癌、卵巢癌等多种肿瘤的微环境中大量浸润,通过促进血管生成、肿瘤侵袭以及诱导免疫耐受等发挥促癌作用。研究表明,HP感染相关的慢性胃炎可引起γδT细胞大量活化18,而且在胃MALT淋巴瘤微环境中存在IL-17的高表达19,20。然而,关于γδT17在胃MALT淋巴瘤中的作用尚不清楚,有待于进一步研究。近年研究显示,γδT17可通过募集和激活MDSCs来介导结直肠癌和肝细胞癌肿瘤微环境中的免疫耐受。在结肠癌微环境中,IL-23诱导γδT17细胞极化,分泌IL-17、IL-8、TNF-α和GM-CSF等细胞因子,招募并激活MDSCs。在肝癌微环境中,活化的γδT17产生大量IL-17,可促使肿瘤细胞分泌CXCL5,进而招募MDSCs;同时,MDSCs通过分泌IL-23和IL-1β促进γδT17极化,形成正反馈环路,进一步介导肿瘤免疫耐受。由此我们推测,HP感染引起胃粘膜局部慢性炎症,微环境免疫稳态失衡,γδT17被激活,通过分泌IL-17等细胞因子,募集MDSCs,介导肿瘤细胞免疫逃逸,参与胃MALT淋巴瘤发生发展。研究目的本项目拟以胃MALT淋巴瘤区域免疫微环境为切入点,研究γδT17、MDSCs及相关细胞因子在胃MALT淋巴瘤免疫失衡中的关键作用,探索胃MALT淋巴瘤从炎症向肿瘤转化过程中的免疫调节机制。研究方法1.利用H.felis给BALB/c小鼠灌胃,构建小鼠胃MALT淋巴瘤模型,利用快速尿素酶实验和PCR方法检测细菌定植情况,利用H&E染色和免疫组化鉴定小鼠胃粘膜病理特征,动态监测小鼠胃组织成瘤情况。2.H.felis感染后不同时间点(8、11、14、19月)分离小鼠的外周血、脾脏及胃组织,流式细胞术检测MDSCs在胃MALT淋巴瘤小鼠模型和对照鼠中的比例。制备小鼠胃组织的石蜡切片,利用免疫荧光和免疫组化检测胃局部MDSCs(Gr-1+CD 11 b+)的数量及其产生Arg-1和iNOS的水平。3.在胃MALT淋巴瘤小鼠模型发病过程中,利用ELISA和RT-qPCR检测胃组织IL-17蛋白水平和Il17a基因表达的变化,通过流式细胞术分析产生IL-17的三种主要细胞γδT17(TCRγδ+IL-17+)、Th17(CD4+IL-17+)和Tc17(CD8+IL-17+)的比例变化,比较γδT17细胞水平在胃MALT淋巴瘤小鼠模型和对照鼠之间的差异,以及随H.felis感染时间延长的变化趋势。4.比较胃MALT淋巴瘤小鼠模型和对照鼠胃局部细胞因子和趋化因子的差异:RT-qPCR检测Toll样受体(Toll-likereceptor,TLR)、细胞因子及趋化因子的表达,ELISA检测IL-1β、IL-23等细胞因子的表达和水平,Western Blot检测NLRP3炎症小体是否在H.felis感染鼠胃组织活化,分析差异表达的细胞因子或趋化因子在胃MALT淋巴瘤小鼠发病中的作用。5.收集胃MALT淋巴瘤初诊患者和健康对照者的外周血标本,并制备胃MALT淋巴瘤组织和正常胃组织的石蜡组织切片。流式细胞术检测外周血中MDSCs(CD45+Lin-CD33+HLA-DR-CD11b+)、Tregs(CD4+CD25+Foxp3+)、γδT17(TCRγδ+IL-17+)、Th17(CD4+IL-17+)和Tc17(CD8+IL-17+)的比例,比较胃MALT淋巴瘤患者和健康志愿者之间的差异。免疫荧光检测MD S C s(CD33+CD11b+)和γδT17(TCRγδ+IL-17+)在胃MALT淋巴瘤肿瘤组织中的浸润,免疫组化检测Arg-1、iNOS、IL-1β和IL-23的表达。6.统计分析:本研究数据以平均数±标准差或中位数±四分位数间距表示,用Student t检验或Mann-Whitney检验评估,使用 SPSS 21 和GraphPad Prism 7对数据进行分析。P值小于0.05差异具有统计学意义。结果1.胃MALT淋巴瘤小鼠模型鉴定:H&E染色结果显示,从灌胃后8个月开始,H.felis感染鼠胃黏膜出现以淋巴细胞聚集为主的淋巴滤泡,且随感染时间延长,H.felis感染鼠胃黏膜的病理损害逐渐加剧;感染后14个月,淋巴细胞明显破坏粘膜肌层,甚至粘膜全层,形成淋巴上皮损害(LEL),这是胃MALT淋巴瘤的典型特征。免疫组化证实,H.felis感染鼠胃黏膜聚集的淋巴组织主要由CD20+的B淋巴细胞组成。以上结果证实,长期的H.felis感染会导致BALB/c小鼠胃黏膜病理损害,先后出现炎症、淋巴组织增生、淋巴滤泡形成和LEL,此病程演变与人的胃MALT淋巴瘤的形成过程高度一致。2.胃MALT淋巴瘤小鼠胃粘膜区域免疫微环境中MDSCs浸润增多。流式结果显示,H.felis感染早期胃部病变较轻时,感染鼠外周血中MDSCs的比例较对照鼠无明显变化;H.felis感染中后期,胃MALT淋巴瘤小鼠模型的外周血中MDSCs的比例较对照鼠明显升高。免疫荧光和免疫组化证实,与对照鼠相比,Gr-1+CD11b+的MDSCs在胃MALT淋巴瘤小鼠模型的胃组织浸润显着增多,而且胃组织局部的Arg-1分泌明显增多。3.胃MALT淋巴瘤小鼠胃粘膜区域免疫微环境中γδT17大量聚集。RT-qRCR和ELISA结果显示,H.felis感染鼠胃组织IL-17在mRNA和蛋白水平均显着高于对照鼠。同时,免疫组化也证实了 IL-17在胃MALT淋巴瘤小鼠模型淋巴滤泡形成部位的高表达。流式数据显示:与对照鼠相比,H.felis感染后8个月小鼠脾脏γδT细胞的比例明显升高,而CD4+T和CD8+T细胞比例无明显差异;而且,胃MALT淋巴瘤小鼠的脾脏中γδT17在产生IL-17的T淋巴细胞中的比例显着升高,而Th17和Tc17比例在两组小鼠之间无明显变化,提示γδT17是胃MALT淋巴瘤发展过程中调节免疫稳态的主要细胞群体。进一步研究发现,γδT17的比例随着H.felis感染时间的延长逐渐升高,提示的T17与疾病进展的相关性。4.胃MALT淋巴瘤小鼠胃粘膜病变部位参与γδT17极化和募集的细胞因子和趋化因子表达增加。RT-qPCR结果显示,与对照鼠相比,Tlr2、Tlr7和Tlr9基因在H.felis感染后的小鼠胃组织中表达明显升高。Western Blot结果显示,NLRP3炎症小体的活化产物cleaved caspase-1的蛋白水平在H.felis感染后的小鼠胃组织明显增加。ELISA评估小鼠胃组织匀浆中细胞因子的水平,发现与对照鼠相比,IL-1β和IL-23在胃MALT淋巴瘤小鼠模型的胃组织中显着升高。同时RT-qPCR检测发现,Ccr6和Ccl20在胃MALT淋巴瘤小鼠模型胃组织的表达显着高于对照鼠。5.胃MALT淋巴瘤临床标本检测结果:流式检测发现,与健康志愿者相比,胃MALT淋巴瘤患者外周血中MDSCs和Tregs的比例显着升高。免疫荧光和免疫组化证明,胃MALT淋巴瘤患者肿瘤组织中MDSCs和γδT17细胞水平较正常胃组织显着升高,且Arg-1和iNOS在肿瘤微环境中的表达显着上调,同时细胞因子IL-1β和IL-23的表达明显上调。结论1.持续性的H.felis感染可导致小鼠胃组织从胃炎进展到胃MALT淋巴瘤,病理发病过程与人胃MALT淋巴瘤的发生发展高度相似。2.MDSCs在H.felis感染小鼠胃部病变组织和胃MALT淋巴瘤患者肿瘤组织中大量浸润,参与炎症向淋巴瘤的转化。3.胃MALT淋巴瘤小鼠模型胃部病变和胃MALT淋巴瘤患者肿瘤组织中,IL-17分泌增多,γδT17大量聚集,IL-1β、IL-23的激活和CCL20-CCR6的趋化作用可能参与γδT17在病变部位的浸润。γδT17随感染时间延长逐渐增多,可能通过募集MDSCs参与胃MALT淋巴瘤的进展。总之,胃局部免疫稳态失衡是胃MALT淋巴瘤发生发展的重要因素。

冀寿健[6](2021)在《免疫检查点抑制剂治疗消化系统肿瘤潜在预测标志物的探索研究》文中研究指明背景:以免疫检查点抑制剂(ICIs)为代表的免疫疗法带来了肿瘤治疗的全新模式,已在泛癌种患者中展现了持久的生存优势。而消化系统肿瘤作为高发病率与高死亡率的瘤种之一,接受ICIs治疗也同样显示了良好的临床获益。但遗憾的是仅有一小部分患者治疗有效,大部分患者仍然无法从ICIs治疗中获益。而且特异性的免疫相关不良事件和肿瘤超进展现象同样限制了其应用。因此亟需开发ICIs治疗疗效和预后的预测性生物标志物以筛选获益人群,提高有效率并且减少不良反应的发生。T细胞受体(TCR)与细胞因子都是抗肿瘤免疫循环中非常重要的组成部分,直接影响ICIs的抗肿瘤效果。两者与接受ICIs治疗的消化系统肿瘤患者临床结果的相关性值得深入探索。本研究拟基于消化系统肿瘤患者队列,探索外周血TCR组库与细胞因子水平在ICIs治疗中的预测作用。方法:本研究分为两部分内容。第一部分是探索TCR组库在接受ICIs治疗的消化系统肿瘤患者中的预测价值。纳入了接受抗程序性死亡受体-1(PD-1)抗体治疗的食管癌、胃癌、肝细胞癌、结直肠癌等消化系统肿瘤患者队列,采集其治疗前基线和治疗后首次评效时的外周血样本行TCR组库测序。同时收集部分健康人群的外周血样本以作为对照。另外,收集患者治疗前基线的肿瘤组织以用于PD-L1表达水平的检测。Shannon指数用以表示TCR组库的多样性。Morisita’s重叠指数用来表示治疗前后TCR组库的相似程度。Logistic多因素回归分析用来确定变量是否是疾病进展的危险因素。Cox多因素回归分析用来确定变量是否是预后的独立预测因素。第二部分是探索细胞因子在接受ICIs治疗的消化系统肿瘤患者中的预测价值。我们纳入了两个队列,其中发现队列是接受抗PD-1/PD-L1抗体治疗的食管癌患者,采集其治疗前基线的外周血样本,使用多重免疫测定试剂盒检测了59种细胞因子,以探索其与临床获益之间的相关性。R语言(3.6.2)计算一致性指数、净重新分类指数和整体鉴别指数用于评估外周血细胞因子水平的预测能力。验证队列是除食管癌之外的泛癌种患者,用于验证候选的生物标志物。此外,采集组织样本行多重免疫组织化学(mIHC)分析肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的图谱,旨在确定外周血免疫因子和肿瘤局部免疫微环境之间的关联。结果:第一部分纳入了137例患者,中位年龄为54岁(范围21-70岁)。其中76例接受抗PD-1抗体单药治疗,61例接受抗PD-1抗体联合治疗。肿瘤患者TCR多样性显着低于健康对照人群(P<0.0001),而在不同肿瘤类型之间的分布无显着差异。TCR多样性与年龄呈显着负相关(r=-0.306,P=0.0003)。在单药治疗队列中,基线TCR多样性较高的患者表现出显着更高的疾病控制率(77.8%vs.47.2%;HR,3.92;95%CI,1.14-13.48;P=0.030)、更长的无进展生存期(PFS)(6.47个月vs.2.77个月;HR,2.10;95%CI,1.16-3.79;P=0.014)和总生存期(OS)(NA vs.8.97个月;HR,3.53;95%CI,1.49-8.38;P=0.004)。此外,即使在基线多样性较低的患者中,治疗前后维持较高的TCR组库相似程度的患者依然能够从抗PD-1抗体治疗中获益。而治疗前后TCR组库相似程度低的患者难以获益。然而在抗PD-1抗体联合治疗队列中,两种生物标志物均未显示出预测价值。有趣的是,TCR多样性和PD-L1表达水平的联合指标可以更好的将患者分层。第二部分发现队列纳入了21例食管鳞状细胞癌患者,验证队列纳入了61例以消化系统肿瘤为主的泛癌种患者。在发现队列中,治疗前趋化因子(C-C基元)配体-5/调节活化正常T细胞表达与分泌的趋化因子(CCL5/RANTES)与可溶性PD-L1(sPDL1)水平在PD、SD、PR三个亚组中分布均呈上升趋势。进一步的研究证明治疗前基线CCL5/RANTES、sPD-L1水平及两因子联合指标与疗效及预后的相关性。与低细胞因子水平相比,高细胞因子水平的患者表现出更高的疾病控制率和延长的生存期。更重要的是,在验证队列中证实了细胞因子水平与ICIs治疗之间的相关性。值得注意的是,肿瘤微环境组成的进一步定量分析表明两因子的联合指标和自然杀伤细胞的浸润相关。结论:1.外周血TCR组库和细胞因子水平均可作为消化系统肿瘤接受ICIs单药治疗临床结果的预测性生物标志物。2.TCR多样性有望成为组织PD-L1检测的补充指标。3.细胞因子的联合应用可更好的提高预测能力。4.ICIs联合治疗的预测标志物仍需进一步探索。

黄伽乐[7](2021)在《胃肠肿瘤免疫因子治疗与预后价值的探索研究》文中研究指明目的:胃癌和结肠癌是人类最常见的消化道恶性肿瘤。根据全球癌症(GLOBOCAN)2018统计报告显示,2018年世界新增胃癌103万例,结肠癌109万例。随着诊断技术和治疗水平的提高,胃肠肿瘤患者的总生存期得到了一定程度的延长,但由于胃肠肿瘤起病隐匿,进展迅速,大部分患者初诊时即存在广泛的浸润和转移。此外,晚期胃肠肿瘤仍缺乏有效的治疗方法,个体间临床治疗获益差异很大,预后较差。因此,迫切需要寻找新的治疗靶点和预后生物标志物。恶性肿瘤的发生发展与机体的免疫系统息息相关。近年来,抗肿瘤免疫治疗迅速发展,如溶瘤病毒、嵌合抗原受体T细胞(CAR-Ts)和免疫检查点抑制剂等,在胃肠肿瘤的治疗中也取得了一定的成果。此外,肿瘤患者的免疫状态和肿瘤浸润免疫细胞是机体抗肿瘤免疫的重要影响因素,具有预后意义。因此,免疫因子在胃肠肿瘤中的治疗和预后价值具有重要的研究意义。研究方法:1.第一部分:探索胃癌中免疫治疗靶点B7家族的ceRNA调控网络(1)在TCGA胃癌数据集中分析B7家族各成员在胃癌及癌旁组织中的表达特点,同时在GEPIA在线数据库网站进行癌与癌旁差异表达验证;(2)应用生物信息学分析方法筛选B7家族在胃癌中的上游调控micro RNA和lncRNA,构建ceRNA调控网络;(3)应用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)验证所预测的ceRNA调控网络;2.第二部分:探索外周血免疫细胞亚群在转移性结肠癌中的预后价值(1)收集2015年至2019年于肿瘤内科住院治疗的转移性结肠癌患者信息;(2)应用卡方检验分析基线外周血淋巴细胞亚群与临床病理特征的关系;(3)应用Kaplan-Meier法和Log-rank检验法分析临床病理特征和基线外周血免疫细胞亚群对结肠癌预后的影响;(4)应用COX单因素/多因素分析基线外周血免疫细胞亚群与临床病理特征对结肠癌预后的影响;结果:第一部分:1.在胃癌组织中B7-H3与B7-H5表达水平最高;与正常组织相比,B7-2、B7-H2、B7-H3、B7-H6、B7-H7在胃癌中表达上调;2.通过生物信息学分析的方法筛选得到lncRNA XIST和COX10-AS1作为ceRNA通过调节miR-302家族和miR-520家族作用于B7家族;3.在HGC-27和SNU-216胃癌细胞系中敲除lncRNA COX10-AS1和XIST后,miR-302家族和miR-520d的表达上调,除B7-1外其他B7家族成员表达下调。第二部分:1.卡方检验结果显示BRAF野生型的转移性结肠癌患者基线外周血CD4+T细胞、CD3+T细胞、NK细胞和B细胞高于BRAF突变型患者;KRAS野生型的转移性结肠癌患者基线外周血CD8+T细胞高于KRAS突变患者;基线CEA正常值的患者基线外周血B细胞高于血清CEA高于正常范围患者;2.生存分析结果显示外周血CA19-9、KRAS、BRAF是预后不良因素,外周血ALB、CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞是转移性结肠癌的保护性预后因素。特别是在肝转移患者中,CD4+T细胞和NK细胞水平正常预示着更长的OS。3.基线外周血ALB、NK细胞和KRAS基因突变是转移性结肠癌的独立预后因素。结论:1.lncRNA XIST和COX10-AS1可能作为ceRNA通过调节miR-302家族和miR-520家族作用于B7家族。2.CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞是转移性结肠癌的保护性预后因素,其中NK细胞是独立预后因素。

孟佳林[8](2021)在《前列腺癌肿瘤免疫微环境对患者免疫分型、预后及恩杂鲁胺治疗敏感性的机制研究》文中指出研究背景及目的:前列腺癌(prostate cancer,PCa)是导致男性死亡的排名第二的恶性肿瘤,并在所有的肿瘤特异性死亡中排在第五,每年由PCa引起的死亡超过三十万,占男性癌症特异性死亡率的6.6%。去势治疗是晚期PCa常用的治疗方式,但也很容易产生治疗抗性,去势抵抗前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)患者的5年生存率仅有25.4%。恩杂鲁胺是治疗CRPC的新药,其主要作用是抑制雄激素受体(androgen receptor,AR)入核,然而基因突变、AR剪切体的产生以及肿瘤微环境(Tumor microenvironment,TME)的改变,都是导致恩杂鲁胺治疗失败的潜在原因。在肿瘤的起始发生和不断地进展中,TME发挥了重要的推动作用,一系列的科学研究都关注了TME以及免疫细胞的作用机制。因此,研究PCa的免疫表型分型,及免疫细胞对恩杂鲁胺治疗敏感性的相关机制至关重要,并可以指导PCa患者的临床治疗。方法:本研究获取了1557名前列腺癌患者的基因表达谱及临床预后信息。其中69例患者来自本单位,部分患者的病理组织切片被用来做免疫组织化学染色,验证相关结果。非负矩阵分解(non-negative matrix factorization,NMF)算法和最近模板预测nearest template prediction,NTP)被用来区分不同的免疫亚型分组,从已经发表的文献中收集了能够代表各种免疫细胞类型或宿主抗肿瘤免疫力的基因签名,并通过单样本基因集富集分析来表征化不同免疫亚型的特征。THP-1细胞通过100ng/ml的PMA溶液诱导贴壁,并通过进一步的与前列腺癌细胞共培养后,收获条件培养基。去除杂质碎片后的培养基在120000转超速离心70分钟后获取外泌体,通过透射电子显微镜对收集到的外泌体进行形态观察和拍摄。MTT,Ed U实验被用来测定不同处理组中,前列腺癌细胞对恩杂鲁胺治疗的敏感性。sh ATP1B1敲低慢病毒及mi RNA-320b inhibitor被用来抑制ATP1B1和mi RNA-320b的表达。实时定量PCR用来检测m RNA和mi RNA的表达,Ago2实验用来验证mi RNA和m RNA的相互作用。结果:大约14.9%至24.3%的患者属于免疫激活亚型,与预后良好的无复发生存期相关,免疫治疗在免疫激活亚型患者中更有效。免疫激活亚型和免疫抑制亚型中,巨噬细胞特征都比较高,进一步分析显示,高丰度的M2型巨噬细胞浸润与比较差的临床预后相关,同时,M2型巨噬细胞的浸润越多,ARSI治疗有效时间就越短。我们在C4-2、C4-2B细胞系中,验证了在M2型巨噬细胞共培养的状态下,前列腺癌细胞产生对恩杂鲁胺的耐药性。下游关键基因ATP1B1的表达升高受到了AR的调控,这种调控是来源于M2型巨噬细胞的外泌体中的mi R-320b抑制AR表达导致的。进一步探究发现M2型巨噬细胞的条件培养基处理后,PI3K/AKT通路的表达及活性均升高,敲低ATP1B1或是加入AKT抑制剂之后,肿瘤细胞重新对恩杂鲁胺治疗敏感。在体内实验中,每组小鼠均接收恩杂鲁胺治疗,M2型巨噬细胞+前列腺癌细胞组有着最大的肿瘤尺寸,而加入mi R-320b inhibitor后,恩杂鲁胺的治疗可以有效减小肿瘤大小。结论:本研究确定了一种与临床预后密切相关的新型免疫分子分类器,可以用来筛选适用于抗PD-1/PD-L1治疗的前列腺癌患者。M2型巨噬细胞免疫浸润与恩杂鲁胺耐药性的产生相关,M2型巨噬细胞通过外泌体转运mi R-320b,并影响前列腺癌细胞内AR/ATP1B1/PI3K/AKT通路。抑制mi R-320b或ATP1B1的是治疗前列腺癌恩杂鲁胺耐药的新靶点。

王泽洋[9](2021)在《EBV相关性胃癌多维度表型特征识别及其关联蛋白GBP5的作用机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景:胃癌(Gastric Cancer,GC)是全球范围内第五大高发肿瘤疾病,居肿瘤死亡原因第二位。胃癌病因包括遗传因素、理化因素及感染因素等。在感染因素中,幽门螺杆菌与胃癌有关已达成研究者共识。除此之外,近年来EB病毒(epstein barr virus,EBV)也已引起研究者高度重视。EBV是1964年Epstein和Barr从非洲儿童Burkitt’s淋巴瘤培养细胞中发现的病毒,属人类疱疹病毒4型,即γ-型疱疹病毒,特异性人类嗜淋巴细胞性病毒。目前已知,EBV感染与多种人类恶性肿瘤如Burkitt’s淋巴瘤、鼻咽癌、传染性单核细胞增多症、霍奇金病及非霍奇金淋巴瘤等密切相关。1993年,Tokunaga等通过原位杂交技术证实胃癌细胞内存在EBV编码的小RNA,将之定义为EBV相关性胃癌(EBV-associated gastric carcinoma,EBVaGC)。2014年癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)根据分子水平的差异将胃癌分为四种分子病理亚型,包括EB病毒感染型、基因组稳定型、染色体不稳定型及微卫星不稳定型。其中,EBVaGC以其区别于其他类型胃癌的多种特质引起了广泛关注。据统计,EBVaGC约占全世界胃癌发病率的10%,且在不同地域间存在差异([6])。全面认识EBVaGC对胃癌发生机制研究及临床诊治有重要指导意义。表型特征是生物体从宏观到微观(即分子组成)、从胚胎发育到出生、成长、衰老乃至死亡过程中,形态特征、功能、行为、分子组成规律等所有生物、物理和化学特征的集合。全景解析人类表型特征,建立宏观表型与微观表型间多维度关联,是解析生命科技的重要线索。目前,对EBVaGC分子表型及临床表型特征等已有所了解,比如,EBVaGC中显示出PIK3CA的反复突变、DNA甲基化以及JAK2,PD-L1和PDL2过表达扩增等。然而,EBVaGC的分子模式非常复杂,包含多种遗传学和表观遗传学变异、转录组学及蛋白组学变异等,对此,我们的认知还十分有限,尚需深入探索,EBVaGC主要临床表型特征及具体发病机制也需要进一步深入研究。全面阐释EBVaGC表型特征可提供潜在的新型胃癌治疗靶标和路线图,可为制定胃癌精准诊治策略提供参考。EBVaGC致癌原因与EB病毒感染有关。病原微生物感染的基因组学和蛋白质组学研究旨在找出在病原体感染和宿主防御整个过程中影响重要生物学活动的关键蛋白以及这些蛋白的功能机制。对重要微生物的基因组学和蛋白质组学差异的鉴定不仅有助于深入了解其发病机制,还可为相关疾病的治疗提供新靶点。然而对于EBV感染导致的胃癌,目前几乎所有基因和蛋白水平的研究均聚焦于单一因素或基于生物信息学数据库的大样本数据集,仍缺乏通过独立采集质谱技术检测蛋白质组学变化建立的对EBVaGC基因和蛋白表达谱的综合研究。血清学检测,作为一种方便、非侵入性和成本效益高的检测手段,在人群流行病学调查、疾病过程的动态监测和风险预测方面显示出显着的优势。到目前为止,EBV血清学检测已经广泛应用于Burkitt淋巴瘤,鼻咽癌,霍奇金或非霍奇金淋巴瘤,睾丸癌等疾病的风险预测及早期诊断。然而,很少有研究集中于EBV血清学与胃癌风险的关系。此外,目前尚不清楚EBV血清学检测是否具有GC预测和预后的潜能。综上,本研究试图从基因变异、蛋白表达、病理组织学形态、血清抗体表达等不同层面,多维度探讨EBVaGC表型特征并筛选鉴定EBVaGC关联蛋白。对于已鉴定出的EBVaGC关联蛋白,我们进一步探究了其在EBV相关性胃癌中的分子调控机制。本研究为进一步探讨EBVaGC关联蛋白的作用机制奠定基础。研究目的:1.明确EBVaGC的表型特征。2.EBVaGC关联蛋白的筛选鉴定。3.明确EBVaGC关联蛋白GBP5的作用机制。研究方法:第一部分:EBV相关性胃癌多维度表型特征识别(一)EBVaGC差异表达基因分析利用公共数据资源GEO数据库检索包含EBV相关性胃癌信息的基因表达谱芯片,确定GSE51575作为分析芯片。该芯片包含12例EBV-阳性和14例EBV阴性胃癌样本基因表达信息。采用GEO2R分析出该表达谱芯片的差异表达基因,|FC|>2.0,P<0.05为具有统计学意义。(二)EBVaGC差异表达蛋白筛选验证a)收集中国医科大学附属第一医院自2012年9月至2019年10月的胃癌手术患者癌组织共计132例。b)应用EBV编码RNA(EBER)原位杂交(ISH)技术对胃癌样本进行EBV原位检测。c)利用EBV阳性与阴性胃癌组织进行DIA-相对定量蛋白质组学分析,筛选具有差异表达水平的蛋白。(三)EBVaGC病理组织学特征分析1.收集中国医科大学附属第一医院自2012年9月至2019年10月的胃癌手术患者癌组织及其癌旁正常组织标本共计132例。通过患者病历收集性别、年龄、饮酒、吸烟、Lauren分型、浸润深度、癌周淋巴细胞浸润、脉管癌栓、淋巴结转移、周围神经侵犯、淋巴结外肿瘤种植等临床病理信息。2.通过原位杂交检测EBV原位感染情况,进行分析。(四)EBVaGC血清EBV抗体表达分析1.收集中国医科大学附属第一医院自2012年11月至2020年6月的胃癌手术患者以及庄河胃癌高发现场患者血样本,其中包括浅表性胃炎、萎缩性胃炎以及胃癌病例共计1790例。在患者病历中收集性别、年龄、饮酒、吸烟、Lauren分型、浸润深度、癌周淋巴细胞浸润、脉管癌栓、淋巴结转移、周围神经侵犯、节外种植等临床病理信息。本研究获得中国医科大学第一附属医院研究所医学伦理委员会的批准,所有受检者均提供书面知情同意书。2.利用血清定量检测不同EBV-VCA IgG抗体滴度,分析其表达水平与EBV相关性胃癌发病风险、预后及临床病理参数的相关性。第二部分:EBV相关性胃癌关联蛋白GBP5的作用机制研究(一)GBP5原位表达与胃癌发病风险、临床病理参数及预后关系利用免疫组化技术对255对胃癌组织以及癌旁正常对照组织进行免疫组化染色,分析其与胃癌之间的关系。(二)GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞活性的影响1.GBP5过表达和沉默质粒的构建:分别选取GV146和GV102为GBP5的过表达以及沉默质粒载体,并经过酶切确认。化学合成GBP5基因序列,用Kpn I/Bam HI酶切含有目的基因的质粒,将酶切产物连接入线性化表达载体,经PCR鉴定。2.根据文献报道,选取EBV阳性SNU719胃癌细胞系以及EBV阴性AGS胃癌细胞系,并经过Real-time PCR确认EBV的表达,进行后续实验。3.采用CCK-8进行细胞增殖效应的检测。(三)GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞免疫相关基因表达的影响1.EBVaGC差异表达免疫相关基因的确定本研究经查阅文献后共总结出47个免疫相关基因,进一步将GSE51575中差异表达基因与47个基因取交集后筛选出差异表达的免疫相关基因。P<0.05被认为具有统计学意义。2.确定EBVaGC与GBP5相关的免疫基因采用斯皮尔曼相关分析方法分析GBP5与EBVaGC差异表达相关的免疫相关基因的相关情况。|r|>0,P<0.05具有统计学意义。3.验证EBVaGC免疫相关基因差异表达本研究收集GBP5过表达和沉默的SNU719和AGS细胞系培养液上清进行酶联免疫吸附实验对预测的GBP5相关的免疫基因进行验证。利用SPSS Statistics 24和Graph Pad Prism 8进行统计分析。P<0.05为具有统计学意义。(四)GBP5表达调控网络分析1.EBV相关性胃癌中GBP5蛋白互作网络构建本研究利用STRING在线工具(v11.0,https://string-db.org)预测GBP5蛋白互作网络。将GSE51575中差异表达基因与预测出的GBP5互作蛋白取交集,筛选出差异表达的GBP5互作蛋白,P<0.05被认为具有统计学意义。2.EBVaGC中GBP5与互作蛋白间的关联分析本研究利用斯皮尔曼相关分析计算GSE51575数据集中GBP5与其差异表达互作蛋白间的相关性。|r|>0,P<0.05被认为具有统计学意义。3.EBVaGC中GBP5与互作蛋白的通路分析对GBP5及其具有显着相关性的互作蛋白进行GO(包括生物学过程、分子功能和细胞组成)和KEGG富集分析,P<0.05具有统计学意义。研究结果:第一部分:EBV相关性胃癌多维度表型特征识别1.EBVaGC关联基因表达特征(EBV+胃癌vs EBV-胃癌差异表达基因)对包含12例EBV-阳性和14例EBV阴性胃癌样本的基因表达谱芯片GSE51575进行差异分析,结果显示在EBVaGC中共有1088个基因上调,879个基因下调表达(|FC|>2.0,P<0.05),其中排位前者包括CXCL17、GBP5、DMBT1、SLC6A8等。将EBVaGC表达的关联基因进行通路富集分析,结果表明统计学差异最显着的前10条通路均与机体免疫功能相关,例如抗原加工和呈递;辅助性T细胞1、辅助性T细胞2以及辅助性T细胞17分化、移植物抗宿主反应等。2.EBVaGC关联蛋白表达特征(EBV+胃癌vs EBV—胃癌差异表达蛋白)2.1基于EBV检测的金标准EBER-ISH,EBV感染细胞在遵照试剂盒说明书处理过后细胞核可以被显着棕染。结果显示132例胃癌样本中共有7例组织标本具有阳性EBER信号。2.2 EBVaGC的蛋白质组学研究采用上述7例EBV+胃癌样本及与之年龄性别临床病理参数匹配的7例EBV—胃癌样本进行DIA-相对定量蛋白质组学分析。结果显示与EBV-阴性胃癌组相比,在EBV-阳性胃癌组中共鉴定出137个差异表达蛋白。其中,GBP5、C5AR1、THRAP3、P3H3和MDK为47个上调蛋白中差异前五的蛋白。2.3本研究将GSE51575中差异表达的基因分别与鉴定出的差异表达蛋白取交集。结果发现共有25个基因在两组数据中均差异表达,其中GBP5在25个差异表达蛋白中差异表达倍数最高,其在EBV-阳性胃癌中相较EBV-阴性胃癌同样显着上调(P=1.19E-03,log2FC=3.21),提示GBP5可能是一种与EBVaGC高度相关的蛋白。3.EBVaGC临床病理参数分析我们进一步对EBVaGC的组织病理学特征进行了分析。首先利用EBV原位杂交实验检测132例胃癌组织,结果显示7例具有阳性信号,EBVaGC检出率为5.3%。全部EBV+胃癌病例为中老年男性。其基本病理学特征为:全部病例为中晚期胃癌,多发于胃体部位(4/7,57.14%);大体分型以溃疡/溃疡浸润型为主(6/7,85.71%);组织学分型以中分化及低分化腺癌为主(6/7,85.71%);绝大多数呈浸润性性生长(6/7,85.71%);淋巴结转移多见(5/7,71.43%);所有病例均存在癌周淋巴细胞浸润。免疫组化染色结果显示,Ki67指数较高,多伴有P53阳性表达(5/7,71.43%)以及EGFR与VEGF表达(4/7,57.14%)。EBV-阳性胃癌与EBV-阴性胃癌相比,临床病理参数未见显着差异(P>0.05)。4.EBV血清抗体表达与胃癌风险/预后的相关性在发病风险方面,分析1790例EBV-VCA IgG感染状态与不同胃疾病的组间比较发现,萎缩性胃炎组和胃癌组的EBV-VCA IgG阳性率均显着高于对照组(AG:40.0%vs.30.5%;GC:38.6%vs.30.5%)。经年龄和性别校正后,研究发现EBV-VCA IgG感染者罹患萎缩性胃炎和胃癌的风险分别提高到1.55倍和1.36倍(分别为P=0.001,95%CI=1.21-1.99;P=0.011,95%CI=1.07-1.72)。在胃癌预后方面,对临床病理资料齐全的234例胃癌患者进行了随访。结果发现,在肠型胃癌亚组,EBV-VCA IgG感染状态与总生存期有关,EBV-VCA IgG阳性者的预后较EBV-VCA IgG阴性者更差(Mean survival month:49.2 vs.61.3,P=0.009,HR=3.50,95%CI=1.37-8.94)。第二部分:EBV相关性胃癌关联蛋白GBP5的作用机制研究1.GBP5原位表达与胃癌病理参数/预后的相关性我们首先探讨了GBP5蛋白表达与胃癌组织病理学特征的关系,结果提示GBP5蛋白表达水平与浸润深度、脉管癌栓、淋巴结外肿瘤种植存在显着相关,在其他病理学参数的分组中未发现GBP5蛋白存在差异表达(P>0.05)。我们还分析了GBP5蛋白表达对胃癌预后的影响,单因素与多因素COX回归分析均未发现GBP5蛋白表达与胃癌预后具有相关性(P>0.05)。2.GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞活性的影响EBV+SNU719和EBV—AGS细胞系中转染GBP5过表达质粒和对照质粒以及沉默和沉默对照质粒,分别观察两组细胞在24h、48h、72h的细胞活性。结果发现SNU719细胞系中,GBP5过表达组72h时的细胞活性较阴性对照组升高(P=0.001),GBP5沉默组细胞活性较沉默对照组降低(P<0.001)。3.GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞免疫相关基因表达的影响采用GSE51575芯片数据,利用GEO2R分析GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞免疫基因表达的影响,结果显示共有1088个基因上调,879个基因下调表达(|FC|>2.0,P<0.05)。进一步将47个免疫相关基因与GSE51575中差异表达基因取交集后发现23个基因在该芯片中存在差异表达,且均为上调表达,例如CXCL17等。4.GBP5表达与EBV相关性胃癌调控网络的关联分析本研究采用Sanger Box预测GBP5互作蛋白并确定其在EBVaGC中的差异表达情况,结果显示FCGR1B、TRIM22、GBP2、IRF1、OAS2和OASL可能为GBP5互作蛋白,且其在EBVaGC中均为上调表达,与GBP5存在显着的正相关关系。富集分析表明GBP5及其潜在的互作蛋白(OAS2、GBP2)可参与寡聚化核苷酸结合结构域样受体信号通路,提示EBVaGC中差异表达的GBP5、OAS2和GBP2可能通过影响此通路活性从而促进EBV相关性胃癌进展。研究结论:1.EBVaGC关联基因表达差异显着者有GBP5、CXCL17等,功能分析显示均与机体免疫功能相关。2.EBVaGC关联蛋白表达差异显着者有GBP5、C5AR1等,功能分析显示可能与乙醇降解Ⅱ类蛋白具有富集效应。3.EBV-阳性胃癌多见于中老年男性;胃体部位多发;溃疡/溃疡浸润型多见;中低分化腺癌多见,淋巴结转移多见。4.携带血清EBV-VCA IgG抗体者罹患胃癌发病风险升高;在肠型胃癌亚组中,EBV-VCA IgG阳性者的预后较EBV-VCA IgG阴性者更差。5.GBP5原位表达与胃癌不良临床病理参数正相关,尤其是与浸润深度、脉管癌栓以及结外肿瘤种植显着相关。6.GBP5可促进EBV阳性胃癌细胞增殖活性。7.在EBVaGC中,GBP5与23个免疫相关基因存在显着的相关性,其中CXCL17、IL-17、1L-8已经血清学表达实验证实。8.在EBVaGC中,GBP5表达调控通路生信分析结果提示,GBP5可与FCGR1B、TRIM22、GBP2、IRF1、OAS2、OASL互作。GBP5可能通过影响寡聚化域样受体信号通路活性从而促进肿瘤进展。

邓日林[10](2020)在《ISG12a通过抑制经典Wnt/β-catenin信号通路促进肿瘤免疫机制》文中进行了进一步梳理肿瘤严重危害人类健康。通过增强效应T细胞为主的适应性免疫抗肿瘤作用,PD-1等免疫检查点的抑制剂广泛用于肿瘤的治疗。然而,肿瘤的异质性导致只有少数患者在免疫治疗中有持续性效果。经典Wnt/β-catenin信号通路的活化可致肿瘤发生发展、耐药和治疗耐受、肿瘤干细胞特性(CSC)和上皮间质转换(EMT),还可能抑制免疫监管。先天免疫是肿瘤放疗、化疗和免疫治疗的基础,不仅可以介导对肿瘤细胞的识别、诱导和扩大免疫应答,而且可以发挥抗肿瘤效应、缓解肿瘤微环境中的免疫抑制。干扰素(IFN)通过激活JAK-STAT信号通路,诱导IFN刺激基因(ISGs)的表达,发挥抗肿瘤作用。然而,目前只发现RIG-I等极少数ISGs的抗肿瘤作用,大多数ISGs的功能未明。我们前期研究发现,IFN刺激基因ISG12a可逆转肿瘤细胞耐药、促进病毒诱导的先天免疫应答,是一个先天免疫效应分子。我们推断ISG12a可能调控肿瘤发生发展和肿瘤免疫,为此开展了如下研究:第2章发现ISG12a在肿瘤细胞和癌组织中呈低水平表达。为研究ISG12a的抗肿瘤效应,我们以肝细胞癌(HCC)和胃癌(GC)为研究对象。利用蛋白免疫印迹、实时荧光定量PCR(q RT-PCR)、免疫组织化学(IHC)染色等方法,确定ISG12a响应IFN刺激,ISG12a在肝癌细胞和胃癌细胞以及HCC和GC的癌组织中呈低水平表达,提示ISG12a可能抑制肿瘤的发生发展。第3章确定ISG12a的抗肿瘤作用。我们以沉默ISG12a的肝癌细胞和胃癌细胞进行了如下研究:通过检测细胞生长曲线、开展结晶紫染色和琼脂糖集落形成实验,发现ISG12a抑制肿瘤细胞增殖;借助于划痕和Transwell实验明确ISG12a阻碍肿瘤细胞迁移;粘附实验鉴定ISG12a降低肿瘤细胞的粘附能力;通过裸鼠皮下和尾静脉注射肿瘤细胞的方法,发现ISG12a抑制肿瘤发生、生长和转移;采用肿瘤干细胞球培养实验,发现ISG12a可降低CSC表型;检测EMT相关标志物和F-actin细胞骨架的表达变化确定ISG12a对EMT的负调控作用。基于以上发现,我们认为ISG12a是一个抑癌基因。第4章阐述ISG12a抑制经典Wnt/β-catenin信号通路的机制。结合肿瘤细胞内EMT标志物β-catenin的表达变化和RNA测序,我们推断ISG12a调控Wnt/β-catenin信号通路;借助蛋白免疫印迹、免疫荧光染色、q RT-PCR和双荧光素酶报告基因等技术方法,我们发现ISG12a对Wnt/β-catenin信号通路活化的抑制作用;利用蛋白的泛素化降解和免疫共沉淀实验结合生物信息学分析,阐明ISG12a通过阻断Axin蛋白的泛素化降解而促进β-catenin蛋白的泛素化降解,进而抑制Wnt/β-catenin信号通路的机制。第5章揭示ISG12a促进肿瘤免疫的作用和机制。我们利用IHC染色排除了ISG12a对肿瘤免疫浸润的调控作用,而利用流式细胞术等方法确定了ISG12a促进NK细胞介导的抗肿瘤免疫。非常有趣的是,我们通过流式细胞术等方法发现ISG12a抑制肿瘤细胞表面免疫检查点PD-L1的表达,并利用染色质免疫沉淀、双荧光素酶报告基因等技术方法,发现β-catenin是PD-L1新的转录因子。结合NK细胞杀伤和受体-配体封闭实验,揭示了ISG12a通过逆转PD-1/PD-L1信号轴,促进NK细胞介导的抗肿瘤免疫。因此,我们认为ISG12a通过抑制肿瘤细胞内Wnt/β-catenin信号通路,阻断PD-1/PD-L1信号轴而抑制免疫逃逸,进而促进NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。第6章明确ISG12a研究的临床意义。首先分析了临床肿瘤组织中ISG12a和Axin蛋白的表达,明确ISG12a对体内Wnt/β-catenin信号通路的特异性调控作用;然后探讨了肿瘤组织的ISG12a表达水平与临床预后的关系,发现癌组织内低表达ISG12a易致预后不良;最后解析了ISG12a表达水平与临床病理的关系,确定癌组织内低表达ISG12a可致肿瘤恶性进展。本研究的创新性和意义主要体现在三个方面:(1)确定ISG12a抑制肿瘤细胞增殖、迁移、转移、CSC和EMT等恶性表型,是一个新的抑癌基因,与HCC和GC的临床预后、恶性进展有重要联系;(2)首次发现SKP2是降解β-catenin蛋白复合物中支架蛋白Axin的E3泛素连接酶;(3)首次发现β-Catenin是免疫检查点PD-L1的转录因子,肿瘤细胞通过Wnt/β-Catenin信号通路上调PD-L1的表达而实现其免疫逃逸。总之,先天免疫效应分子ISG12a通过抑制肿瘤细胞内经典Wnt/β-Catenin信号通路逆转PD-1/PD-L1信号轴,促进NK细胞介导的抗肿瘤免疫。ISG12a的抗肿瘤作用及机理的研究强调IFN和先天免疫促进免疫治疗的关键作用。ISG12a等ISGs可能是肿瘤诊断和治疗的靶标,在肿瘤防治中将发挥重要作用。本研究确定的先天免疫、Wnt/β-catenin信号通路和肿瘤免疫之间的关系将为提高免疫治疗提供新的策略。

二、胃癌NK细胞浸润与预后的关系(论文开题报告)

(1)论文研究背景及目的

此处内容要求:

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例:

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

(2)本文研究方法

调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、胃癌NK细胞浸润与预后的关系(论文提纲范文)

(1)LCP1的表达与胃癌临床病理相关性及肿瘤免疫细胞浸润的生物信息学分析(论文提纲范文)

摘要
abstract
第1章 引言
第2章 材料方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 组织材料
        2.1.2 实验仪器
        2.1.3 实验试剂
        2.1.4 免疫组化实验试剂配置方法
    2.2 实验方法及生物信息学分析
        2.2.1 蜡块及载玻片的制作
        2.2.2 免疫组化及染色(Immunohistochemistry,IHC)
        2.2.2.1 免疫组化染色步骤
        2.2.2.2 染色结果评估
        2.2.3 生物信息学分析
    2.3 统计学分析
第3章 结果
    3.1 生物信息学发现LCP1 在各种肿瘤中的表达情况
    3.2 免疫组化验证LCP1在胃癌中的表达情况
    3.3 LCP1 的表达与胃癌患者预后的相关性
    3.4 LCP1 在胃癌中的遗传变异特征分析
    3.5 肿瘤免疫细胞在胃癌微环境中的浸润情况
    3.6 在胃癌微环境中LCP1 表达与免疫细胞浸润相关性
    3.7 LCP1 与免疫细胞表面标志物的相关性
    3.8 LCP1调控胃癌微环境中免疫相关通路
第4章 讨论
第5章 结论
致谢
参考文献
附录
攻读学位期间的研究成果
论文综述 胃癌的免疫治疗研究进展
    参考文献

(2)基于转录组数据挖掘分析免疫标志物与恶性黑色素瘤转移机制的研究(论文提纲范文)

中文摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 研究背景
        1.1.1 恶性黑色素瘤的流行病学特点及治疗现状
        1.1.2 恶性黑色素瘤分子缺陷的研究进展
        1.1.3 恶性黑色素瘤生物标志物的研究进展
        1.1.4 肿瘤微环境的研究进展
    1.2 研究目的
    1.3 研究内容
    1.4 研究方法
        1.4.1 生物信息学方法
        1.4.2 计算结果的独立数据集验证
        1.4.3 分子生物学实验功能验证
    1.5 技术路线图
    参考文献
第二章 恶性黑色素瘤Bulk转录组测序数据分析
    2.1 研究背景
        2.1.1 生物信息学与肿瘤治疗研究
        2.1.2 技术路线图
    2.2 材料与方法
        2.2.1 数据来源和分类
        2.2.2 数据预处理和数据质量标准化
        2.2.3 差异基因分析
        2.2.4 基因标志物的Cox风险比例回归分析
        2.2.5 构建基因标志物预后风险模型
        2.2.6 基因标志物通路和功能分析
        2.2.7 反卷积网络重构恶性黑色素瘤的免疫微环境
        2.2.8 预后基因标志物与肿瘤免疫浸润细胞的相关性分析
        2.2.9 恶性黑色素瘤中突变基因分布统计
        2.2.10 肿瘤突变负荷分数的计算和预后分析
    2.3 结果
        2.3.1 患者人口统计学和临床因素
        2.3.2 差异基因与免疫相关基因的识别
        2.3.3 建立免疫相关基因的风险模型
        2.3.4 评估预后模型的预测效果
        2.3.5 基因本体分析与KEGG通路分析
        2.3.6 原发和转移病例样本中肿瘤浸润免疫细胞的差异
        2.3.7 基因标志物与肿瘤免疫微环境的相关性分析
        2.3.8 GEO队列独立数据集验证模型的预后
        2.3.9 GEO队列中恶性黑色素瘤验证集的免疫分析
        2.3.10 评估低危和高危人群之间的免疫情况
        2.3.11 评估基于CD274/PDCD1 转移亚组肿瘤微环境的差异
        2.3.12 MM中的突变图谱
        2.3.13 TMB对恶性黑色素瘤预后的影响
    2.4 讨论
    2.5 结论
    参考文献
第三章 恶性黑色素瘤单细胞转录组测序数据验证
    3.1 研究背景
    3.2 材料与方法
        3.2.1 数据来源
        3.2.2 关键软件及数据库资源
        3.2.3 质控:细胞的选择和过滤
        3.2.4 数据标准化
        3.2.5 识别高变异基因
        3.2.6 中心化(Scaling)分析
        3.2.7 主成分(PCA)分析
        3.2.8 非线性降维(t-SNE)
        3.2.9 寻找差异表达的特征(聚类生物标志物)
        3.2.10 注释cluster中细胞类型
    3.3 结果
        3.3.1 质控和细胞群分类
        3.3.2 数据标准化
        3.3.3 质控和细胞群分类
        3.3.4 PCA降维并提取主成分分析
        3.3.5 T-SNE聚类分析和marker基因
        3.3.6 寻找差异表达的特征
        3.3.7 细胞类型鉴定
        3.3.8 基因标志物与肿瘤浸润免疫细胞的相关性
    3.4 讨论
    3.5 结论
    参考文献
第四章 HPA数据库基因标志物的免疫组化分析
    4.1 研究背景
        4.1.1 人类蛋白质图谱网站数据对基因标志物的验证
    4.2 材料和方法
        4.2.1 数据来源与下载
    4.3 结果
        4.3.1 蛋白SLPI的免疫组化特征
        4.3.2 蛋白LYZ的免疫组化特征
        4.3.3 蛋白CD79A的免疫组化特征
        4.3.4 蛋白CCL19 的免疫组化特征
        4.3.5 蛋白S100A7 的免疫组化特征
        4.3.6 蛋白CXCR4 对泛癌的预后的meta分析
    4.4 讨论
    4.5 结论
    参考文献
第五章 CXCR4促进 A375细胞的侵袭和转移的实验研究
    5.1 研究背景
    5.2 材料和方法
        5.2.1 实验试剂与实验仪器
        5.2.2 仪器和设备
        5.2.3 细胞株选择
    5.3 实验方法
        5.3.1 细胞培养
        5.3.2 Cas9敲除实验
    5.4 结果
        5.4.1 构建CXCR4 敲除细胞系模型
        5.4.2 实时荧光定量PCR检测A375细胞CXCR4 mRNA表达
        5.4.3 CXCR4 能够促进A375 细胞克隆集落形成
        5.4.4 CXCR4对A375细胞划痕实验的影响
        5.4.5 CXCR4增强A375细胞转移和侵袭能力
    5.5 讨论
    5.6 结论
    参考文献
第六章 结论与展望
附录一 CIBERSORTx计算结果(TCGA)
附录二 CIBERSORTx计算结果(GSE19234,GSE53118)
附录三 28 个差异基因的筛选结果
附录四 相关性分析结果(Primary Samples)
附录五 相关性分析结果(Metastasis Samples)
附录六 相关性分析结果(GSE19234)
附录七 相关性分析结果(GSE72056)
附录八 缩略语表(Abbreviation)
在学期间的研究成果
致谢

(3)胃癌D2根治术后复发及转移的影响因素分析(论文提纲范文)

缩略词表
中文摘要
英文摘要
前言
材料与方法
结果
讨论
结论
参考文献
综述 T淋巴细胞亚群及细胞因子应用于胃癌患者的预后评估
    参考文献
攻读学位期间获得的学术成果
致谢

(4)POC1A可作为介导胃癌免疫浸润的临床预后标记物(论文提纲范文)

附录一 英文缩略词表
附录二 试剂配方
附录三 主要仪器设备
中文摘要
Abstract
前言
2 材料与方法
3 结果
4 讨论
5 结论
参考文献
综述 POC1A及免疫细胞浸润在恶性肿瘤中的研究
    参考文献
攻读学位期间获得的学术成果
致谢

(5)NLRP3炎症小体及γδT17/MDSCs在淋巴瘤免疫稳态失衡中的作用及机制研究(论文提纲范文)

中文摘要
ABSTRACT
符号说明
第一部分 NLRP3炎症小体介导的免疫抑制在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的作用和机制研究
    前言
    材料与方法
    结果
    讨论
    结论
    附图
    附表
    参考文献
第二部分 γδT17和MDSCs在胃MALT淋巴瘤微环境免疫稳态失衡中的作用及机制研究
    前言
    材料与方法
    结果
    讨论
    结论
    附图
    附表
    参考文献
第三部分 文献综述 炎症、肿瘤和免疫: 微环境中的密切交流
    一、肿瘤中炎症的类型
    二、炎症与肿瘤的发生发展
    三、炎症反应的关键信号通路与肿瘤
    四、炎症和肿瘤免疫
    五、靶向炎症反应和肿瘤治疗
    六、总结和展望
    参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文
学位论文评阅及答辩情况表
英文论着

(6)免疫检查点抑制剂治疗消化系统肿瘤潜在预测标志物的探索研究(论文提纲范文)

缩略语表
摘要
Abstract
前言
第一部分 外周血T细胞受体组库作为抗PD-1抗体治疗消化系统肿瘤临床结果的预测标志物
    研究背景
    实验材料与方法
        一、研究对象
        1.病例来源
        2.纳入标准
        3.排除标准
        4.人口学信息及临床数据资料
        5.疗效评价标准
        6.审批及知情
        二、实验材料
        1.实验试剂
        2.实验耗材
        3.实验设备
        三、实验方法
        1.外周血TCR组库检测
        2.组织PD-L1表达检测
        四、统计方法
    结果
        一、患者基本人口学及临床特征
        二、TCR组库与临床特征
        三、基线TCR多样性与临床结果的相关性
        四、治疗前后TCR组库的动态变化
        五、高频克隆的Morisita's重叠指数与临床结果的相关性
        六、基线TCR多样性和治疗前后Morisita's重叠指数可能协同将接受抗PD-1抗体单药治疗的患者分层
        七、基线TCR多样性与PD-L1 表达之间的相关性
    讨论
第二部分 外周血细胞因子水平作为免疫检查点抑制剂治疗疗效的预测生物标志物
    研究背景
    实验材料与方法
        一、研究对象
        1.病例来源
        2.纳入标准
        3.排除标准
        4.人口学信息及临床数据资料
        5.疗效评价标准
        6.审批及知情
        二、实验材料
        1.实验试剂
        2.实验耗材
        3.实验设备
        三、实验方法
        1.外周血细胞因子检测
        2.组织mIHC检测
        四、统计分析
    结果
        一、患者基本人口学及临床特征
        二、鉴定抗PD-1/PD-L1抗体治疗ESCC患者潜在的预测生物标志物
        三、外周血免疫因子特征与临床获益之间的相关性
        四、候选免疫因子在泛癌种队列中的验证
        五、外周血免疫因子与肿瘤浸润淋巴细胞的相关性
    讨论
结论与展望
    一、结论
    二、展望
参考文献
附录A 实体瘤疗效评价标准RECIST(1.1 版)
附录B 59种免疫因子检测图谱
附录C 本研究涉及的临床试验项目简介
作者在学期间取得的学术成果
文献综述 免疫检查点抑制剂治疗预测标志物的研究进展
    参考文献
主要简历
致谢

(7)胃肠肿瘤免疫因子治疗与预后价值的探索研究(论文提纲范文)

摘要
abstract
英文缩略语
第一部分:胃癌免疫治疗靶点B7 超家族成员调控因子的筛选与鉴定
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 数据分析
        2.2 主要试剂和仪器
    3 结果
        3.1 B7 家族成员在胃癌中的表达
        3.2 B7 家族上游调控micro RNA的筛选
        3.3 lncRNA COX10-AS1 and XIST作为ceRNA调节miR-302和miR-520 家族
        3.4 lncRNA COX10-AS1 和 XIST抑制miR-302 家族和 miR-520d的表达,促进B7 家族成员表达
    4 讨论
    5 结论
第二部分:外周血免疫细胞亚群在转移性结肠癌中的预后价值
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 研究对象
        2.2 研究方法
        2.3 统计方法
    3 结果
        3.1 转移性结肠癌患者外周血免疫细胞亚群与临床特征间的关系
        3.2 临床及病理特征与转移性结肠癌预后
        3.3 外周血淋巴细胞亚群与转移性结肠癌预后
        3.4 .转移性结肠癌COX多因素生存分析
    4 讨论
    5 结论
参考文献
综述 B7家族在肿瘤研究中的进展
    参考文献
致谢
个人简历

(8)前列腺癌肿瘤免疫微环境对患者免疫分型、预后及恩杂鲁胺治疗敏感性的机制研究(论文提纲范文)

中英文缩略词对照
中文摘要
英文摘要
第一部分 基于非负矩阵分解方法确立前列腺癌患者免疫分类系统并应用于指导临床抗PD-1/PD-L1 治疗
    1. 引言
    2. 材料和方法
    3. 结果
    4. 讨论
    5. 结论
    参考文献
第二部分 M2型巨噬细胞外泌体来源的 miR-320b,通过AR/ATP1B1/PI3K/AKT 通路,调节前列腺癌细胞对恩杂鲁胺治疗的敏感性
    1. 引言
    2. 材料和方法
    3. 结果
    4.讨论
    5. 结论
    参考文献
附录 个人简历
致谢
免疫细胞在前列腺癌发生发展及临床治疗中的研究进展
    参考文献

(9)EBV相关性胃癌多维度表型特征识别及其关联蛋白GBP5的作用机制研究(论文提纲范文)

摘要
Abstract
英文缩略语
第一部分:EBV相关性胃癌多维度表型特征识别
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 EBV相关性胃癌差异表达基因分析
        2.2 EBV相关性胃癌差异表达蛋白筛选分析
        2.2.1 样品准备
        2.2.2 胃癌组织EBV原位杂交检测
        2.2.3 EBVaGC定量蛋白质组学检测
        2.2.4 蛋白组学数据分析
        2.2.5 免疫组化检测蛋白表达
        2.3 EBV相关性胃癌临床病理参数分析
        2.4 胃癌及癌前疾病血清EBV抗体表达分析
        2.4.1 血清EBV抗体的筛选
        2.4.2 胃癌及癌前疾病血清EBV-VCA IgG抗体表达分析
        2.5 统计学分析
    3 结果
        3.1 EBV相关性胃癌关联基因表达特征
        3.2 EBV相关性胃癌关联蛋白表达特征
        3.2.1 EBVaGC研究对象的确定
        3.2.2 EBVaGC蛋白质谱特征
        3.2.3 EBVaGC中转录组和蛋白组交集蛋白的筛选验证
        3.3 EBV相关性胃癌临床病理特征
        3.4 血清EBV抗体表达与胃癌风险/预后的相关性
        3.4.1 研究对象的基本信息
        3.4.2 血清EBV-VCA IgG抗体人群分布特征
        3.4.3 血清EBV-VCA IgG与胃癌及萎缩性胃炎发病风险的关系
        3.4.4 血清 EBV-VCA IgG与血清 HP-IgG的关系
        3.4.5 血清EBV-VCA IgG与胃癌临床病理参数的关系
        3.4.6 血清EBV-VCA IgG与胃癌预后的关系
    4 讨论
        4.1 EBVaGC关联基因表达特征及功能分析
        4.2 EBVaGC关联蛋白表达特征及功能分析
        4.3 EBVaGC临床病理特征
        4.4 血清EBV-VCA IgG抗体与胃癌发病风险与预后的关系
        4.4.1 血清EBV-VCA IgG抗体人群分布特征
        4.4.2 血清EBV-VCA IgG与胃癌及萎缩性胃炎发病风险的关系
        4.4.3 血清 EBV-VCA IgG与血清 HP-IgG的关系
        4.4.4 血清EBV-VCA IgG与胃癌临床病理参数及预后的关系
    5 结论
第二部分:EBV相关性胃癌关联蛋白GBP5的作用机制研究
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 材料和设备
        2.1.1 材料
        2.1.2 试剂
        2.2 GBP5原位表达与胃癌风险/病理参数/预后的相关性研究
        2.2.1 免疫组化检测
        2.3 GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞生物学行为的影响研究
        2.3.1 质粒构建
        2.3.2 摇菌和质粒提取
        2.3.3 细胞培养
        2.3.4 瞬时转染
        2.3.5 细胞总RNA提取及反转录cDNA
        2.3.6 实时荧光定量PCR(Real-time PCR)
        2.3.7 细胞增殖活性检测
        2.4 GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞免疫相关基因表达的影响研究
        2.4.1 EBVaGC关联免疫相关基因的确定
        2.4.2 EBVaGC与GBP5表达相关的免疫基因的确定
        2.4.3 验证EBVaGC免疫相关基因差异表达
        2.5 GBP5表达与EBVaGC调控网络的关联分析
        2.5.1 EBVaGC中GBP5蛋白互作网络构建
        2.5.2 EBVaGC中GBP5与互作蛋白的关联分析
        2.5.3 EBVaGC中GBP5与互作蛋白的通路分析
    3 结果
        3.1 GBP5原位表达与胃癌病理参数/预后的相关性
        3.2 GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞生物学行为的影响
        3.2.1 GBP5在胃癌细胞中的过表达和沉默效率
        3.2.2 GBP5表达对EBVaGC细胞增殖活性的影响
        3.3 GBP5影响不同EBV感染状态胃癌细胞免疫相关基因的表达
        3.3.1 确定EBVaGC中差异表达免疫相关基因
        3.3.2 EBVaGC中GBP5与免疫相关基因表达的相关性
        3.3.3 EBVaGC中GBP5与免疫相关基因相关性验证
        3.4 GBP5表达与EBVaGC调控网络的关联分析
        3.4.1 EBVaGC中GBP5蛋白互作网络
        3.4.2 EBVaGC中GBP5与互作蛋白的关联
        3.4.3 EBVaGC中GBP5与互作蛋白的富集分析
    4 讨论
    5 结论
本研究创新性自我评价
参考文献
综述 EBV感染与肿瘤
    参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简历

(10)ISG12a通过抑制经典Wnt/β-catenin信号通路促进肿瘤免疫机制(论文提纲范文)

摘要
Abstract
英文缩写
第1章 绪论
    1.1 肿瘤的现状和生物学特征
        1.1.1 肿瘤的基本概况
        1.1.2 肝细胞癌和胃癌
        1.1.3 肿瘤的基本特征
        1.1.4 经典Wnt/β-catenin等肿瘤信号通路
    1.2 先天免疫与肿瘤的发生发展
        1.2.1 先天免疫细胞与肿瘤
        1.2.2 NK细胞与肿瘤
        1.2.3 损伤相关分子模式
        1.2.4 RNA和DNA诱导产生干扰素
    1.3 干扰素和干扰素刺激基因
        1.3.1 干扰素与干扰素信号通路
        1.3.2 干扰素刺激基因(Interferon stimulated-genes,ISGs)
        1.3.3 干扰素刺激基因ISG12a
    1.4 肿瘤免疫
        1.4.1 肿瘤免疫治疗的现状
        1.4.2 肿瘤免疫逃逸
        1.4.3 先天免疫在肿瘤免疫治疗中的作用
        1.4.4 经典Wnt/β-catenin信号通路与肿瘤免疫
    1.5 本论文的设计思路
第2章 ISG12a在肿瘤细胞和癌组织中呈低水平表达
    2.1 前言
    2.2 实验材料
        2.2.1 实验细胞
        2.2.2 临床组织样本
        2.2.3 试剂和耗材
        2.2.4 仪器设备
    2.3 实验方法
        2.3.1 细胞培养
        2.3.2 IFN诱导ISGs实验
        2.3.3 人肝细胞的分离
        2.3.4 蛋白免疫印迹
        2.3.5 qRT-PCR
        2.3.6 IHC染色
        2.3.7 数据的统计分析
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 IFN诱导肝癌细胞和胃癌细胞内ISG12a的高表达
        2.4.2 ISG12a蛋白在肝癌细胞和胃癌细胞内呈低水平表达
        2.4.3 ISG12a表达水平在肝癌组织和胃癌组织中降低
    2.5 小结
第3章 ISG12a抑制肿瘤细胞的恶性表型
    3.1 前言
    3.2 实验材料
        3.2.1 实验细胞
        3.2.2 实验动物
        3.2.3 材料与试剂
        3.2.4 仪器设备
    3.3 实验方法
        3.3.1 干扰质粒的构建
        3.3.2 过表达质粒的构建
        3.3.3 细胞培养和转染
        3.3.4 慢病毒包装与感染
        3.3.5 蛋白免疫印迹
        3.3.6 细胞生长曲线
        3.3.7 结晶紫染色
        3.3.8 软琼脂集落形成
        3.3.9 粘附实验
        3.3.10 划痕实验
        3.3.11 Transwell实验
        3.3.12 裸鼠皮下成瘤
        3.3.13 裸鼠尾静脉注射
        3.3.14 H&E染色
        3.3.15 肿瘤干细胞球的培养
        3.3.16 Phalloidin染色
        3.3.17 数据的统计分析
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 稳定沉默ISG12a肿瘤细胞系的构建
        3.4.2 ISG12a抑制肿瘤细胞增殖
        3.4.3 ISG12a抑制肿瘤细胞迁移和对基质的粘附
        3.4.4 ISG12a抑制体内肿瘤的发生
        3.4.5 ISG12a抑制体内肿瘤的生长和转移
        3.4.6 ISG12a抑制肿瘤干细胞特性(CSC)
        3.4.7 ISG12a抑制肿瘤细胞的上皮间质转换(EMT)
    3.5 小结
第4章 ISG12a抑制经典Wnt/β-catenin信号通路及其机理
    4.1 前言
    4.2 实验材料
        4.2.1 实验细胞
        4.2.2 材料与试剂
        4.2.3 仪器设备
    4.3 实验方法
        4.3.1 细胞培养
        4.3.2 质粒构建
        4.3.3 qRT-PCR
        4.3.4 蛋白免疫印迹
        4.3.5 RNA测序
        4.3.6 双荧光素酶报告基因
        4.3.7 细胞质和细胞核蛋白的分离提取
        4.3.8 免疫荧光染色
        4.3.9 蛋白免疫共沉淀(Co-IP)
        4.3.10 生物信息学分析
        4.3.11 数据的统计分析
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 ISG12a对肿瘤细胞信号通路的影响
        4.4.2 ISG12a抑制经典Wnt/β-catenin信号通路的活化
        4.4.3 ISG12a促进β-catenin蛋白的泛素化降解
        4.4.4 ISG12a维持β-catenin蛋白降解复合物的稳定
        4.4.5 ISG12a抑制Axin蛋白的泛素化降解
        4.4.6 SKP2是降解Axin的E3泛素连接酶
        4.4.7 SKP2和Axin蛋白相互作用的功能区段分析
    4.5 小结
第5章 ISG12a通过抑制Wnt/β-catenin信号通路活化所致的PD-L1表达而促进肿瘤免疫
    5.1 前言
    5.2 实验材料
        5.2.1 实验细胞
        5.2.2 临床组织样本
        5.2.3 试剂和耗材
        5.2.4 仪器设备
    5.3 实验方法
        5.3.1 细胞培养
        5.3.2 干扰质粒的构建
        5.3.3 启动子质粒的构建
        5.3.4 蛋白免疫印迹
        5.3.5 免疫荧光染色
        5.3.6 qRT-PCR
        5.3.7 IHC染色
        5.3.8 RNA测序
        5.3.9 ChIP
        5.3.10 双荧光素酶报告基因
        5.3.11 外周血PBMC的分离
        5.3.12 NK细胞的分选
        5.3.13 人肝细胞的分离
        5.3.14 流式细胞术检测细胞表面蛋白
        5.3.15 流式细胞术检测细胞凋亡
        5.3.16 数据的统计分析
    5.4 结果与讨论
        5.4.1 ISG12a不影响肿瘤内免疫细胞浸润
        5.4.2 ISG12a促进NK细胞介导的抗肿瘤免疫
        5.4.3 ISG12a对NK细胞配体和HLA相关分子的表达没有影响
        5.4.4 ISG12a抑制肿瘤细胞免疫检查点PD-L1的表达
        5.4.5 IL-2和IL-18 促进NK细胞PD-1的表达
        5.4.6 ISG12a通过抑制PD-1/PD-L1信号轴而促进NK细胞介导的抗肿瘤免疫
        5.4.7 β-catenin是PD-L1新的转录因子
    5.5 小结
第6章 ISG12a在肿瘤研究中的临床意义
    6.1 前言
    6.2 实验材料
        6.2.1 临床组织样本
        6.2.2 试剂与材料
        6.2.3 仪器设备
    6.3 实验方法
        6.3.1 蛋白免疫印迹
        6.3.2 qRT-PCR
        6.3.3 数据的统计分析
    6.4 结果与讨论
        6.4.1 临床肿瘤组织中ISG12a与Axin的表达存在相关性
        6.4.2 癌组织内低表达ISG12a导致临床预后不良
        6.4.3 低表达ISG12a预示肿瘤的恶性进展
    6.5 小结
结论与展望
参考文献
附录A 攻读学位期间的主要研究成果
附录B 用于蛋白免疫印迹immunoblots和qRT-PCR的肝细胞癌和胃癌组织样本的相关临床信息
致谢

四、胃癌NK细胞浸润与预后的关系(论文参考文献)

  • [1]LCP1的表达与胃癌临床病理相关性及肿瘤免疫细胞浸润的生物信息学分析[D]. 曾庆文. 南昌大学, 2021(01)
  • [2]基于转录组数据挖掘分析免疫标志物与恶性黑色素瘤转移机制的研究[D]. 原凌燕. 兰州大学, 2021(09)
  • [3]胃癌D2根治术后复发及转移的影响因素分析[D]. 沈仕俊. 昆明医科大学, 2021(01)
  • [4]POC1A可作为介导胃癌免疫浸润的临床预后标记物[D]. 黄晓炎. 福建医科大学, 2021(02)
  • [5]NLRP3炎症小体及γδT17/MDSCs在淋巴瘤免疫稳态失衡中的作用及机制研究[D]. 赵亚楠. 山东大学, 2021(11)
  • [6]免疫检查点抑制剂治疗消化系统肿瘤潜在预测标志物的探索研究[D]. 冀寿健. 军事科学院, 2021(02)
  • [7]胃肠肿瘤免疫因子治疗与预后价值的探索研究[D]. 黄伽乐. 中国医科大学, 2021(02)
  • [8]前列腺癌肿瘤免疫微环境对患者免疫分型、预后及恩杂鲁胺治疗敏感性的机制研究[D]. 孟佳林. 安徽医科大学, 2021(01)
  • [9]EBV相关性胃癌多维度表型特征识别及其关联蛋白GBP5的作用机制研究[D]. 王泽洋. 中国医科大学, 2021(02)
  • [10]ISG12a通过抑制经典Wnt/β-catenin信号通路促进肿瘤免疫机制[D]. 邓日林. 湖南大学, 2020(02)

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胃癌NK细胞浸润与预后的关系
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