一、亚低温减少大鼠短暂性全脑缺血后皮质iNOS诱导的神经元凋亡（论文文献综述）
杜欣[1]（2021）在《牛黄及其有效成分对神经血管单元的保护作用研究》文中提出目的:观察牛黄及其有效成分对体外脑神经血管单元的保护作用,阐明牛黄及其有效成分治疗缺血性中风的内在生物学机制。方法:1.体外脑神经血管单元模型的建立以及缺氧/复氧模型的建立（1）利用体外原代细胞培养技术,提取大脑皮质神经元、星形胶质细胞和微血管内皮细胞,进行细胞鉴定;（2）利用transwell板将三种细胞共培养,构建体外脑神经血管单元的模型,利用TEER值,判定模型是否成功;（3）采用缺氧1h,复氧24h,构建OGD/R模型,利用TEER值、荧光素钠渗透系数判定模型是否成功。2.牛黄及其有效成分对三种细胞的毒性利用不同浓度的牛黄（Bezoar）、牛磺酸（Taurine）、牛黄熊去氧胆酸（TUDCA）和熊去氧胆酸（UDCA）,作用于神经元、星形胶质细胞和内皮细胞,分别干预24h和48 h,利用CCK8检测细胞活力,检测每种不同浓度的药物对细胞的毒性。3.牛黄及其有效成分对脑神经血管单元的保护作用（1）通过OGD/R模型,检测牛黄、牛磺酸、TUDCA和UDCA的不同剂量对细胞的作用,利用CCK8法检测细胞活力,确定每种药物的最佳剂量;（2）利用药物的最佳剂量进行干预,通过检测血脑屏障的通透性:TEER值、荧光素钠渗透系数和γ-GT;炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β;氧化应激指标SOD、NO、MDA以及神经元凋亡率。（3）牛黄对脑神经血管单元的保护机制研究加入抑制剂LY294002,检测牛黄对细胞的干预是通过PI3K/AKT通路实现的;检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3,金属蛋白酶MMP2、MMP9,紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5 以及 HIF-1α、VEGF、PI3K、AKT、p-AKT。4.不同配伍组分对脑神经血管单元的保护作用（1）利用OGD/R模型,筛选牛磺酸+牛磺熊去氧胆酸（T+T）,牛磺酸+熊去氧胆酸（T+U）的最佳剂量;（2）利用药物的最佳剂量进行干预,通过检测血脑屏障的通透性:TEER值、荧光素钠渗透系数和γ-GT;炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β;氧化应激指标SOD、NO、MDA以及神经元凋亡率。5.配伍组分牛磺酸和熊去氧胆酸对脑神经血管单元的作用机制利用T+U的最佳剂量,进行OGD/R的造模,检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3,金属蛋白酶 MMP2、MMP9,紧密连接蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5 以及 NF-κBp65,p-P65,IKBα,p-IKBα 蛋白表达。6.配伍组分牛磺酸和牛磺熊去氧胆酸对脑神经血管单元的作用机制利用T+T的最佳剂量,进行OGD/R的造模,检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3,金属蛋白酶MMP2、MMP9,紧密连接蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5,CA43、AQP4以及 P38MAPK,P-P38MAPK。结果1.获得了纯度较高的神经元、星形胶质细胞和内皮细胞（1）神经元培养7d后成熟,经MAP2免疫荧光鉴定,纯度大于95%;（2）星形胶质细胞培养7d后成熟,经GFAP免疫荧光鉴定,纯度大于95%;（3）内皮细胞培养7d后成熟,经Ⅷ因子免疫荧光鉴定,纯度大于95%。2.利用transwell,建立了脑神经血管单元的模型（1）该模型的电阻值在3-5天趋于平稳;（2）三细胞共培养,三种细胞的状态和单细胞相比,更佳。3.成功复制OGD/R模型利用缺氧1h,复氧24h,能够成功复制OGD/R模型,和正常组相比,模型组电阻值降低,荧光素钠渗透系数升高,能够进行下一步的实验研究。4.筛选药物毒性利用不用浓度的牛黄、牛磺酸、牛磺熊去氧胆酸和熊去氧胆酸分别干预24h和48h,筛选药物的毒性。5.筛选药物的保护剂量利用无毒性的各种药物浓度,通过OGD/R造模方法,检测细胞活力,筛选出保护作用的最佳剂量。6.牛黄及其有效成分对体外脑神经血管单元的保护作用（1）牛黄及其有效成分降低LDH,升高γ-GT,提高TEER值和降低荧光素钠渗透系数;（2）牛黄及其有效成分减少炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1 β的水平;（3）牛黄及其有效成分降低NO、MDA的水平,升高SOD的水平;（3）牛黄及其有效成分抑制神经元的凋亡;（4）牛黄降低MMP2、MMP9的蛋白表达;（5）牛黄能升高紧密连接蛋白的表达,提高ZO-1、Occludin、Claudin-5的蛋白表达;（6）牛黄通过HIF-α/VEGF,PI3K/AKT通路,发挥保护NVU的作用,牛黄降低HIF-1α、VEGF的蛋白表达水平,升高PI3K、AKT的蛋白表达水平。7.不同配伍组分对脑神经血管单元的保护作用（1）筛选了配伍组分的最佳剂量,T+T的最佳剂量1mM Taurine和1μM TUDCA,T+U的最佳剂量1mM Taurine和1μM UDCA;（2）T+T、T+U有效保护血脑屏障,降低TEER值,降低荧光素钠渗透系数,升高γ-GT;（3）T+T、T+U有效减轻细胞损伤,降低LDH的水平;（4）T+T、T+U有效减轻炎症反正,降低TNF-α、IL-6、IL-1β的值;（5）T+T、T+U有效抑制氧化反应,降低NO、MDA的水平,升高SOD的活力;（6）T+T、T+U抑制神经元的凋亡率。8.配伍组分牛磺酸和熊去氧胆酸对脑神经血管单元的作用机制（1）T+U抑制神经元的凋亡率;（2）T+U 提高 ZO-1、Occludin、Claudin-5 的蛋白表达;（3）T+U降低MMP2、MMP9的蛋白表达;（4）T+U降低Bax、Caspase-3蛋白表达,升高Bcl-2蛋白表达;（5）T+U降低MyD88、P-P65、P-IKB α的蛋白表达,通过MyD88/NF-κB信号通路发挥脑保护作用。9.配伍组分牛磺酸和牛黄熊去氧胆酸对脑神经血管单元的作用机制（1）T+T抑制神经元的凋亡率;（2）T+T 提高 ZO-1、Occludin、Claudin-5 的蛋白表达;（3）T+T降低MMP2、MMP9的蛋白表达;（4）T+T降低Bax、Caspase-3蛋白表达,升高Bcl-2蛋白表达;（5）T+U降低AQP4、P38MAPK,升高CX43的蛋白表达。结论（1）牛黄、牛磺酸、TUDCA和UDCA能够减轻炎症反应,降低氧化应激的水平,抑制神经元的凋亡发挥神经保护的作用;（2）牛黄通过HIF-1α/VEGF和PI3K/AKT通路发挥脑保护作用;（3）牛磺酸和牛磺熊去氧胆酸,牛磺酸和熊去氧胆酸配伍,发挥协同作用,比单独使用牛磺酸药效更好;（4）牛磺酸和熊去氧胆酸1000:1的配伍能够抑制炎症反应,降低氧化应激的水平,保护血脑屏障,抑制神经元的凋亡,能够抑制通路MyD88/NF-κB通路发挥脑保护作用（5）牛磺酸和牛磺熊去氧胆酸1000:1的配伍能够抑制炎症反应,降低氧化应激,保护血脑屏障,能够抑制P38MAPK通路,发挥脑保护作用;
张华朋[2]（2020）在《PI3K/Akt通道在七氟烷后处理脑缺血糖尿病大鼠神经保护作用的研究》文中研究说明研究背景脑卒中（cerebral stroke）是各种诱发因素导致脑内动脉闭塞、破裂而造成脑部血液循环障碍而引起脑组织损伤的一组疾病,分为缺血性、出血性两种。脑卒中作为世界上致死率最高的疾病之一,全球每年新发病例高达1030万,且近来有年轻化的趋势,给社会、家庭和患者带来极大的负担。更严重的是,许多其他疾病会直接或间接导致脑卒中的发生。例如糖尿病就是引起脑血管疾病的独立危险因素,据国外资料显示,有糖尿病史患者同时患脑血管疾病的概率达到了 30～40%,而且糖尿病合并脑卒中的患者已经达到非糖尿病患者的2倍以上。临床上糖尿病合并脑卒中的患者中缺血性脑卒中占到了 80%,糖尿病并发卒中的发病率快速上升。因此如何设计和开发安全有效的脑卒中治疗药物,尤其是糖尿病脑卒中是一个亟待解决的问题。众多研究资料表明,吸入性麻醉药预处理或后处理可以保护神经系统减轻缺血性损伤。有学者发现七氟烷预处理能够减少动脉阻塞导致的脑梗死体积和凋亡细胞。许多脑缺血再灌注损伤动物模型实验证明,七氟烷预处理可以有效减少神经细胞的凋亡、一定程度改善脑梗死体积、神经功能评分、炎性反应等方面从而保护脑神经。但我们并不清楚糖尿病是否会影响七氟烷后处理的神经保护作用,且七氟烷发挥作用的机制也有待研究。有学者发现糖尿病大鼠通过恢复海马突触功能和Na+,K+-ATP酶的活性提高学习和记忆能力,机制可能与PI3K/Akt信号通道有关;Yang和同事发现利拉鲁肽可以激活糖尿病大鼠PI3K/Akt信号通道,促进自噬,最终对慢性2型糖尿病相关的学习记忆障碍提供保护;另有研究已经证实糖尿病大鼠大脑皮层细胞中PI3K/Akt信号通道相关蛋白的表达量明显下降。因此,有必要进行七氟烷对糖尿病大鼠脑缺血后神经损伤影响的研究,以期发现七氟烷后处理对脑缺血再灌注糖尿病大鼠神经功能损害是否有效,以及PI3K/Akt信号通道在七氟烷后处理中的作用机制,为后期降低糖尿病人群脑缺血后神经功能损害及促进脑卒中后神经功能恢复提供理论依据。研究目的本文通过构建脑缺血合并糖尿病大鼠模型,评估七氟烷后处理对合并糖尿病的大鼠在脑缺血再灌注后,脑组织损伤程度及氧化应激和细胞凋亡的影响,以及PI3K/Akt信号通道在七氟烷后处理中的作用机制做初步探究。研究方法1.研究对象及分组:健康Wistar大鼠288只,体重（260±30）g。大鼠饲养于室温20±2℃,相对湿度50%～70%的清洁环境中,自由摄食、摄水,适应性饲养一周后,进行实验分组和脑缺血糖尿病模型制备。首先取其中240只大鼠随机分为6组（每组40只）,正常组（Control）:不做处理;糖尿病组（DM）:选取糖尿病造模成功后大鼠;脑缺血模型组（CI）:采用线栓法将健康大鼠大脑中动脉血流阻断2h后恢复灌注;糖尿病脑缺血模型组（DMCI）:阻断糖尿病大鼠大脑中动脉血流2h后恢复灌注;七氟烷后处理组（SCI）:健康大鼠缺血再灌注开始时立即给予大鼠2.6%的七氟烷吸入,持续30min;糖尿病七氟烷后处理组（SDMCI）:糖尿病大鼠缺血再灌注开始时立即给予大鼠2.6%的七氟烷吸入,持续30min。Control、DM、CI和DMCI组大鼠均在再灌注开始时给予100%氧气,持续30 min,大鼠再灌注24h后进行相应指标检测。2.建立糖尿病和脑缺血大鼠模型:大鼠高脂高糖饮食,喂养5周后,腹腔注射STZ（链脲佐菌素,Streptozotocin,溶解于柠檬酸缓冲液中,25mg/kg）每天一次,连续2d。72h后尾静脉采血测空腹血糖,以血糖≥16.7mmol/L,并出现多食、多尿、多饮为大鼠糖尿病模型成立。脑缺血大鼠模型构建方法:大鼠术前12h禁食。腹腔内注射10%水合氯醛麻醉大鼠,仰卧位固定,手术暴露右颈总动脉,在分叉处分离颈内动脉和颈外动脉,用4/0尼龙线阻断大脑中动脉,2h后抽出尼龙线,开放大脑中动脉,恢复缺血区灌注。模型成功建立的标志是:大鼠手术后清醒,左侧肢体出现偏瘫,以左上肢较为明显;提尾悬挂时左上肢呈现蜷缩屈曲;下地行走时向左侧转圈跌倒,不能正常直行。3.LY294002脑室内注射给药:为了研究七氟烷治疗脑缺血再灌注中PI3K/Akt通道的作用,用PI3K/Akt特异性抑制剂LY294002预处理七氟烷治疗组大鼠。取其余48只大鼠,将大鼠分为6组（每组8只）,分别构建正常脑缺血加生理盐水组（NS-CI）、糖尿病合并脑缺血加生理盐水组（NS-DMCI）,七氟烷后处理脑缺血加生理盐水组（NS-SCI）、七氟烷后处理糖尿病脑缺血加生理盐水组（NS-SDMCI）、七氟烷后处理脑缺血加抑制剂组（LY-SCI）、七氟烷后处理糖尿病脑缺血加抑制剂组（LY-SDMCI）大鼠模型。术前将LY294002溶于二甲基亚砜（DMSO）和乙醇中,终浓度为10mM。将大鼠用10%水合氯醛（350mg/kg,腹腔给药）麻醉。LY-SCI组和LY-SDMCI组在建立缺血模型术前30min,在缺血侧脑室注射10μl LY294002溶液,其他组大鼠麻醉后侧脑室注射10μl生理盐水作为对照。NS-SCI组、NS-SDMCI组、LY-SCI组、LY-SDMCI组缺血2h后恢复灌注时给予给予大鼠2.6%的七氟烷吸入,持续30min:NS-CI组、NS-DMCI组再灌注开始时给予100%氧气,持续30min。4.指标检测:对于神经功能评估,采用Longa的5级4分法,在动物麻醉清醒后24h进行评分并记录神经功能缺失症状;对于脑梗塞体积评估,采用TTC染色法并利用ImageJ软件进行计算;通过计算脑组织干/湿重比值评估大鼠脑水肿程度;对于大鼠大脑组织形态学变化,采用HE染色在光学显微镜下进行观察;对于大鼠神经学习能力的检测,采用Morris水迷宫实验进行测定;对于大鼠血清中的 S100B、Bcl-2、Bax、GSH-PX、Caspase-3 和 SOD 的含量,采用 ELISA试剂盒进行检测;对于大鼠血清中NOS活性和NO含量,采用比色法进行检测;western blot检测脑组织中PI3K/Akt通道相关蛋白的磷酸化水平。5.统计学方法分析:应用SPSS19.0统计学软件对各项检测数据进行数据分析,所有分析数据结果均以均数±标准差（mean±SD）表示,两组间数据分析采用t检验,多组间数据分析采用单因素方差分析（ANOVA）,事后分析采用LSD-t检验,两组间数据采用双变量Pearson进行相关性分析,以P<0.05表示差异具有统计学意义。研究结果1.七氟烷后处理可以减弱大鼠缺血性脑损伤。各脑缺血组大鼠与Control组相比脑梗死体积、Longa神经缺陷评分和脑含水量均增加（P<0.05）,且DMCI组大鼠的上述指标较CI和DM组大鼠有进一步增加（P<0.05）。七氟烷治疗降低了 SCI和SDMCI组的脑梗死体积、Longa分值和脑含水量（P<0.05）。结果表明七氟烷后处理减弱了 SCI和SDMCI组大鼠的缺血性脑损伤,对神经系统有保护作用。2.七氟烷后处理能改善脑缺血糖尿病大鼠的空间学习和记忆能力。利用Morris水迷宫来评估大鼠的空间学习和记忆功能,结果显示与Control组相比,其他脑缺血组别的大鼠逃避潜伏期时间明显延长,穿越平台次数显着降低（P<0.05）。而相比于CI和DMCI组,再灌注开始时吸入七氟烷的大鼠（SCI组和SDMCI组）逃避潜伏期时间明显减少,穿越平台次数显着增加（P<0.05）,并且可以在更短的时间内在导航测试中找到平台（P<0.05）。这些结果表明:七氟烷后处理改善了脑缺血糖尿病大鼠的空间学习和记忆能力。3.七氟烷后处理减轻了脑缺血糖尿病大鼠的脑组织形态学损伤。HE染色结果显示,对照组的大鼠脑组织由健康神经细胞组成,没有细胞肿胀、膜起泡、核浓缩、破碎溶解。与Control组和DM组相比,CI组的大鼠脑组织切片显示出坏死,神经元丢失,核固缩,神经元收缩和星形细胞肿胀。此外,与CI组相比,DMCI组显示出更严重的损伤。经过七氟烷后处理后,SCI组和SDMCI组的大鼠的组织损伤有明显的改善。4.七氟烷后处理减少脑缺血糖尿病大鼠的氧化应激反应。为了探究七氟烷的神经保护作用是否与其抗氧化特性有关,我们检测了内源性抗氧化酶SOD和GSH-PX的活性,以及NOS和NO的水平。与Control组相比,CI组的SOD和GSH-PX水平降低（P<0.05）,而DMCI组中二者表达水平进一步降低（P<0.05）。与CI和DMCI组相比,SCI和SDMCI组中SOD和GSH-PX含量明显增加（P<0.05）。七氟烷可以显着增加SCI和SDMCI组的大鼠的SOD和GSH-PX的表达。另一方面,NOS和NO的表达水平在CI组中有所增加（P<0.05）,并在DMCI组中进一步增加（P<0.05）,但经七氟烷后处理二者的表达水平显着降低（P<0.05）,这些结果表明七氟烷可以防御SCI和SDMCI组中大鼠的氧化损伤。5.七氟烷后处理可减弱脑缺血糖尿病大鼠脑组织的细胞凋亡。缺血再灌注后,血清中促凋亡因子Bax和Caspase-3在CI和DMCI组中的表达上调（P<0.05）,但在七氟烷治疗组中表达下调（P<0.05）。另一方面,抗凋亡因子Bcl-2的表达水平在CI组相比于Control组有所降低（P<0.05）,在DMCI组中Bcl-2的表达水平进一步降低（P<0.05）。与CI和DMCI组相比,七氟烷可以显着提高Bcl-2的表达（P<0.05）。这些结果表明:七氟烷通过在脑缺血大鼠脑组织中抑制细胞凋亡来减轻缺血性脑损伤。6.七氟烷后处理组大鼠的S100B蛋白水平显着降低。相比与对照组,各脑缺血组大鼠血清中S100B的浓度显着升高（P<0.05）,且DMCI组S100B的含量高于CI组和DM两组（P<0.05）,表明合并糖尿病可以加重大鼠缺血后再灌注造成的脑损伤。经七氟烷吸入治疗后,与CI和DMCI组相比,SCI和SDMCI组的S100B水平明显降低（P<0.05）。7.S100B蛋白水平与氧化损伤指标的相关性分析显示:S100B蛋白表达量与Longa神经功能缺陷评分、脑梗死体积、含水量、NOS、NO、Bax和Caspase-3呈正相关（P<0.01）,与SOD、GSH-PX和Bcl-2呈负相关（P<0.01）。说明血清S100B可以作为评价大鼠脑缺血损伤的可靠指标,提示七氟烷后处理可以减轻大鼠脑缺血引起的脑损伤程度。8.七氟烷后处理显着增加PI3K/Akt通道活性。Western blot实验结果显示脑缺血大鼠中PI3K和Akt蛋白的磷酸化水平与Control组相比明显降低（P<0.05）,DMCI组大鼠p-PI3K、p-Akt的含量低于CI组和DM组（P<0.05）。而与CI和DMCI组相比,用七氟烷后处理后,p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的比例明显增加（P<0.05）。表明七氟烷可能通过PI3K/Akt信号通道的激活来发挥作用。9.阻断PI3K/Akt信号通道可以减弱七氟烷对氧化应激和凋亡的保护作用。用PI3K/Akt通道抑制剂LY294002注射大鼠,检测血清中氧化应激和细胞凋亡相关因子水平的变化。七氟烷可以使脑缺血和糖尿病合并脑缺血的大鼠血清促凋亡因子Bax、Caspase-3水平降低（P<0.05）,并可以使凋亡抑制因子Bcl-2的蛋白含量升高（P<0.05）;当同时用LY294002处理大鼠后,七氟烷的作用变得不明显,血清Bax、Caspase-3、Bcl-2的含量与处理前变化不大（P<0.05）。类似地,脑缺血与糖尿病合并脑缺血的大鼠再灌注开始时吸入七氟烷可以改善缺血引起的抗氧化因子SOD和GSH-PX水平下降（P<0.05）,使它们的表达量大幅度升高;且代表氧化程度的NOS和NO水平与未经七氟烷处理的大鼠相比较也有所下降（P<0.05）。而LY294002的引入减弱了七氟烷的这种治疗效果,使血清SOD、GSH-PX、NOS和NO的含量均接近未吸入七氟烷治疗的缺血再灌注大鼠（P<0.05）。说明阻断PI3K/Akt信号通道可以抑制七氟烷的治疗效果,进一步验证了七氟烷是通过激活PI3K/Akt通道发挥保护作用。结论七氟烷后处理可显着改善糖尿病大鼠缺血再灌注时造成的脑损伤并很可能通过激活PI3K/Akt信号通道,抑制脑神经元细胞内的氧化应激反应和细胞凋亡从而发挥对大鼠脑缺血性神经损伤的保护作用。
谢坤[3]（2019）在《围手术期大鼠脑缺血再灌注损伤保护机制的研究》文中认为研究背景“脑卒中”（cerebral stroke）是一种中枢神经系统急性脑血流循环障碍性疾病,是世界公认的第三大致死性疾病,给患者带来了严重的心理和经济负担,极大地影响患者生活质量。其中缺血性脑血管病占比60%～80%,是脑血管病的主要类型。缺血性脑血管病（ischemic cerebralvascular disease,ICVD）引起的脑损伤包括缺血期原发性损伤和继发脑缺血再灌注损伤（Cerebral Ischemia Reperfusion Injury,CIRI）。在围手术期间,多种手术创伤可导致CIRI的发生,可能会导致远期学习、记忆及认知功能障碍,如体外循环、术中持续低血压导致脑血流灌注不足,神经外科手术损伤脑血管等多种情况。对于缺血期原发性损伤,临床上可在治疗时间窗内给予溶栓等措施对症处理,及时恢复血液供应,但对于继发的CIRI,目前临床治疗手段和疗效远未达到预期。因此,围术期脑CIRI的发病机制及防治措施的研究成为亟待解决的科学问题。CIRI的病理生理过程是一个复杂的级联反应,涉及多种损伤机制,如氧化应激、炎症损伤、能量代谢障碍、线粒体损伤、神经元自噬效应、细胞内钙超载等,这些损伤机制既可以单独作用,也可交替、循环作用,相互间产生前馈、正反馈和叠加作用,互为因果、共同作用,影响疾病的发生发展和转归。氧化应激、炎性损伤及神经元自噬效应在CIRI发生发展过程中的作用已经成为当前研究的热点。正常机体内存在抑制氧化应激的酶系统,如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等抗氧化酶,其中SOD是机体内主要的抗氧化酶、活性氧清除剂。在CIRI发生发展的过程中,大量活性氧（reactive oxygen species,ROS）产生、释放,造成细胞膜磷脂分子中的不饱和脂肪酸过氧化,产生脂质过氧化物,又经过氧化酶作用后生成大量毒性代谢产物,如丙二醛（Malondialdehyde,MDA）等,MDA可使细胞膜磷脂结构发生变化,细胞膜受损严重,引起神经细胞坏死、凋亡。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）是炎症反应活动中具有关键作用的细胞因子,被认为是全身炎性反应的始动介质,可直接导致血管内皮细胞功能减退、血管通透性增加、循环阻力降低,并诱导IL-1、IL-6、IL-8等细胞因子及黏附分子的“瀑布样”释放,构成炎性损伤的级联放大效应。转录因子NF-κB是脑缺血再灌注损伤时炎症反应的中心环节,许多研究已证实,NF-κB可通过调节凋亡相关基因的表达实现对细胞凋亡的干预,提高神经细胞的存活率。自噬是机体在缺血和缺氧下产生的压力反应,这个过程是通过囊泡将某些细胞组分转运到到溶酶体得以降解。在真核生物中,自噬不仅与生长发育、代谢和免疫等生理过程有关,还参与脑缺血、心肌缺血和肾缺血等病理过程的发生。近几年来研究表明,脑缺血再灌注过程中自噬被激活,不仅具有神经保护作用,而且参与神经细胞的死亡调节,因此,脑缺血再灌注可以激活自噬。在CIRI引起神经元损伤的不同机制中,不同种类基因蛋白酶的表达对细胞的凋亡或存活的转归有重要的作用:（1）B淋巴细胞瘤（B-cell lymphoma,Bc1）基因家族成员Bcl-2和Bax基因是目前研究比较明确的功能对立的凋亡调控基因;（2）半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）家族是另一大类细胞凋亡调控因子,Caspase-3是Caspase激活级联反应中下行最重要的凋亡执行蛋白酶,激活的Caspase-3通过裂解细胞骨架蛋白、DNA依赖性的蛋白激酶及其他Caspase相关底物蛋白等,改变细胞结构,最终导致细胞凋亡的发生;（3）自噬是细胞凋亡的一种方式,其激活主要与ULK复合物的活性有关,而ULK复合物活性主要由哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target ofrapamycin,mTOR）调控。（4）C-Jun氨基末端激酶（C-Jun N-terminal kinase,JNK）属于线粒体激活蛋白激酶超级家族。JNK信号通路可以通过细胞因子、生长因子、压力和其他因素被激活,并参与各种生理过程,如细胞增殖和分化、细胞凋亡和应激反应。此外,JNK信号通路与自噬的激活密切相关,在神经退行性疾病、缺血性再灌注损伤中也发挥重要作用。低温治疗目前是重症医学科对急危重症患者经常采取的治疗方式之一,围手术期重症患者也多有采用。在降低身体耗能的同时,通过低温抑制中枢细胞损伤、凋亡,起到脑保护作用,可能与以下机制有关:（1）使神经元Bcl-2表达升高,Bax表达降低,显着减少神经细胞凋亡;（2）抑制炎症因子（细胞色素C、ROS、NO）等对caspase-3的激活,使caspase-3表达下降,起到对脑神经细胞的保护作用;（3）促进P-ERK1/2表达,而对JNK表达仅有较小的上调作用,从而提高缺血再灌注神经元存活率;（4）促进P-Akt表达,抑制细胞凋亡。目前国际上通用的低温划分方式是将轻度低温（33～35℃）、中度低温（28～32℃）合称为亚低温（mild hypothcrmia,MH）。经过多年的动物实验研究和临床应用,亚低温技术已经逐渐成熟,广泛应用于心脏骤停、重度颅脑损伤以及脑卒中的治疗,收到了积极的临床疗效。丁苯酚（3-n-butylphthalide,NBP）又名芹菜甲素,是我国脑血管疾病治疗领域第一个拥有自主知识产权的一类新药。大量的国内外研究表明丁苯酚可以阻断缺血性再灌注损伤的多个环节,具有明确的治疗作用:（1）可改善线粒体中Na+/K+-ATPase和Ca2+-ATPase的活性,保护线粒体功能;（2）减少细胞色素C的释放,弱化凋亡蛋白酶的作用;（3）抑制细胞内钙超载;（4）减少兴奋性氨基酸的释放;（5）减轻血脑屏障的破坏程度;（6）改善缺血区微循环和能量代谢;（7）延长溶栓治疗时间窗。鉴于脑缺血再灌注损伤的病理生理机制和治疗研究成果、亚低温治疗的机制和NBP的生物学功能,我们可以合理地推测:相比单独使用MH或NBP治疗,NBP与MH联合使可能具有更强的改善脑缺血再灌注损伤、保护脑组织的效果。右美托咪定（Dexmedetomidine,Dex）作为一种新型具有高度选择性的α2肾上腺素受体激动剂,具有良好的镇静作用,是临床实践中常用于患者的镇静。研究发现,Dex可以通过减少氧化应激和降低炎症介质的释放来减轻大鼠的缺血再灌注损伤。然而,对于术后应用Dex是否对脑缺血再灌注损伤具有保护作用及作用机制尚未明确,本研究另一个重点是Dex后处理通过抑制炎症反应和神经元自噬减轻大鼠脑缺血再灌注损伤的的保护机制。综上所述,本研究对围术期脑缺血再灌注损伤的保护机制研究主要分为两个部分:（1）通过建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,应用MH与NBP联合治疗,检测脑组织中炎性因子的含量,观察神经元形态,检测凋亡相关蛋白的表达,验证NBP与MH联合使用对脑缺血再灌注损伤的保护作用。（2）通过建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,探讨Dex后处理对空间学习和记忆能力、脑梗死区、细胞凋亡的影响,这个过程中海马CA1区域神经元的病理变化,以及可能涉及的JNK信号通路分子机制。第一部分MH和NBP联合作用对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护机制目的本研究主要通过建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,应用MH与NBP联合治疗,通过检测氧化损伤和炎症相关因子的含量以及炎症相关蛋白的表达,研究MH和NBP联合应用对大鼠脑缺血再灌注损伤模型的神经保护作用。方法75只SPF级健康雄性SD大鼠（220-250g）由中国科学院上海实验动物中心提供。将大鼠随机分为假手术组、模型组、MH组、NBP组和MH+NBP组,每组15只。NBP组和MH+NBP组大鼠术前给予含NBP（80mg/kg）生理盐水灌胃7天（每天一次）,假手术组、模型组和MH组均给予等量生理盐水。药物治疗7天后,采用改良Pulsinelli四血管闭塞法构建大鼠脑缺血再灌注模型。应用0.9%氯化钠溶液（4-5℃）通过20G硅胶管泵入头部进行MH治疗,使海马温度降至（33.0±0.5）℃后,双侧颈总动脉与动脉夹结扎15min,在自然复温前保持低温1h。缺血再灌注8小时后,冰浴收集一部分脑组织,匀浆,取上清液,用MDA检测试剂盒,SOD检测试剂盒,NO检测试剂盒和NOS检测法测定MDA、SOD、NO和NOS含量。使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测脑组织中炎性因子IL-6和IL-1β的含量。一部分脑组织浸泡于10%福尔马林溶液中固定,进行石蜡包埋和常规切片。通过Nissl染色,在光学显微镜下观察脑组织神经元细胞的形态。采用免疫印迹测定Bcl-2、caspase-3、p-NF-κB、p-mTOR、mTOR等凋亡相关蛋白的表达量及磷酸化水平。结果1.脑组织中氧化应激因子含量变化采用试剂盒检测相应氧化应激因子,结果表明MH,NBP和MH+NBP治疗均能降低脑缺血再灌注损伤时的氧化应激因子MDA,NO,NOS的含量,增加SOD的含量,而且MH+NBP抑制脑缺血再灌注引起的氧化损伤的作用优于单独的MH和NBP治疗。2.脑组织中炎症因子含量变化ELISA检测结果显示,与模型组相比,MH组,NBP组及MH+NBP组IL-6和IL-1β含量均有不同程度的降低,MH+NBP组IL-6和IL-1β含量明显低于模型组。3.脑组织中神经元细胞结构变化尼氏染色结果显示,MH组和NBP组神经元数量较模型组明显增加,细胞排列规则,部分尼氏体丢失。与模型组比较,MH+NBP组神经元数量明显增加,且MH+NBP组与MH组、NBP组相比,神经元数量有所增加,神经元细胞结构完整,并且富含尼氏体。4.自噬相关信号m-TOR蛋白的活化Western Blot检测结果显示,采用MH和NBP联合治疗后p-mTOR蛋白表达水平显着降低。5.凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的变化Western Blot检测结果显示,采用MH和NBP治疗后较模型组Bcl-2蛋白表达水平增加,Bax蛋白表达显着降低。采用MH和NBP联合治疗后Bcl-2蛋白表达水平进一步增加,Bax蛋白表达降低。6.炎症相关信号NF-κB蛋白的活性Western Blot检测结果显示,与模型组相比,NH和NBP组p-NF-κB蛋白水平显着降低,NH+NBP组进一步降低p-NF-κB蛋白水平。结论1.MH和NBP联合治疗较单独使用MH和NBP治疗能更好地抑制脑缺血再灌注引起的氧化损伤和炎症反应。2.MH和NBP联合治疗可以减少脑缺血再灌注引起的大鼠脑神经细胞损伤,这种保护作用优于MH和NBP单独治疗。3.NH和NBP联合治疗可以通过抑制mTOR和NF-κB蛋白的磷酸化,促进Bcl-2表达和抑制Bax表达,对脑缺血再灌注损伤大鼠起到神经保护作用。第二部分右美托咪定后处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护机制目的本研究通过建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,探讨Dex后处理对大鼠空间学习和记忆能力、脑梗死区、细胞凋亡的影响,这个过程中海马CA1区域神经元的病理变化,以及JNK信号通路的蛋白表达,为术后减轻脑缺血再灌注损伤的治疗提供理论依据。方法180只雄性健康成年SD大鼠,随机分成6组（每个治疗组30只大鼠）,假手术（Sham）组,缺血再灌注损伤（I/R）组,右美托咪定后处理（Dex）组,JNK抑制剂（SP600125）组,右美托咪定后处理+JNK激动剂（Dex+Anisomycin）组,阳性药物尼莫地平对照（Nim）组。采用缝合闭塞法建立大鼠中脑动脉闭塞（MCAO）模型。脑缺血再灌注24小时后,进行莫里斯水迷宫试验以评价大鼠的空间学习能力和记忆能力。取每组6只大鼠脑组织,切片,利用TTC染色检测缺血脑区面积。取每组6只大鼠脑组织,浸泡于4%多聚甲醛固定,切片,进行TUNEL染色,检测脑组织中凋亡细胞的数量,通过HE染色观察CA1脑区的病理变化。取6组大鼠的血清,利用ELISA试剂盒测定血清中TNF-α,IL-6,IL-1β的含量。取每组6只大鼠脑组织,浸泡于2.5%戊二醛固定,通过透射电镜观察海马CA1区神经元的结构变化。提取每组6只大鼠脑组织的RNA,利用qRT-PCR检测自噬相关基因的表达。提取每组6只大鼠脑组织的总蛋白,利用免疫印迹技术检测自噬相关蛋白及JNK磷酸化水平。结果1.行为学测试利用莫里斯水迷宫测试对大鼠的空间学习和记忆能力进行评价。与Sham组相比,其他组逃逸潜伏期（EL）明显延长,而跨平台时间和停留原始平台时间减少。与I/R组相比,Dex组、SP600125组、Dex+Anisomycin组和Nim组EL明显缩短,而跨平台和平台时间显着增加。与Dex组相比,EL显着延长,而跨平台和平台象限时间在Dex+Anisomycin组中显着缩短。2.脑组织的梗死区域TTC染色测定脑组织梗死面积。在I/R组、Dex组、SP600125组、Dex+Anisomycin组和Nim组中观察到不同大小的白色梗死区域。大鼠脑组织的梗死区以梗死区/非梗死区域的百分比表示。与I/R组相比,Dex组、SP600125组、Dex+Anisomycin组和Nim组脑组织的梗死区域显着减少。与Dex组相比,Dex+Anisomycin组的白色梗死区域增加。3.大鼠海马CA1区神经元凋亡TUNEL测定用于检测大鼠大脑海马CA1区神经元凋亡。与Sham组相比,其他组显示阳性凋亡的神经元数量显着增加。与I/R组相比,Dex组、SP600125组、Dex+Anisomycin组和Nim组阳性凋亡的神经元数量有不同程度的明显下降。与Dex组相比,Dex+Anisomycin组神经元凋亡数量明显增加。4.大鼠海马CA1区域神经元的病理变化通过HE染色观察大鼠海马CA1区域神经元的病理变化。与Sham组相比,其他组神经元表现出不同程度的形态异常。与I/R组相比,Dex组、SP600125组、Dex+Anisomycin组和Nim组神经元病理变化程度降低,Dex组、Nim组和SP600125组之间无显着差异,而Dex+Anisomycin组神经元病理变化程度稍重。5.血清中炎症因子的变化ELISA测定大鼠血清中炎症因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的表达水平。与Sham组相比,其他组中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量显着增加。与I/R组相比,Dex组、SP600125组、Dex+Anisomycin组和Nim组中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量显着下降。与Dex组相比,Nim组与SP600125组的TNF-α、IL-6和IL-1β水平无显着差异,而Dex+Anisomycin组TNF-α、IL-6和IL-1 β的含量增加。6.海马CA1区域的自噬效应通过透射电镜观察海马CA1区域的自噬效应。电子镜下细胞中出现自噬小体或吞噬细胞被认为是自噬的形态特征。与I/R组相比,自噬程度有不同程度地降低,Dex组、SP600125组、Dex+Anisomycin组和Nim组水肿和空泡化程度降低。Dex组、Nim组和SP600125组之间没有显着差异,而Dex+Anisomycin组自噬程度稍重。7.大鼠脑组织Beclin-1,Caspase-3,LC3 mRNA和蛋白质的表达通过qRT-PCR检测大鼠脑组织自噬相关mRNA的表达。与Sham组相比,其他组Beclin-1、Caspase-3、LC3的mRNA表达显着增加。与I/R组相比,Sp600125组、Dex+Anisomycin组和Nim组中Beclin-1、Caspase-3、LC3的mRNA表达显着减少。Dex组、Sham组和SP600125组之间无显着差异,而Beclin-1、Caspase-3、LC3的mRNA表达在Dex+Anisomycin组略高。免疫印迹结果显示,与Sham组相比,Beclin-1、Caspase-3和LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白质表达在其他组（P<0.05）中明显升高,总体变化趋势变化与qRT-PCR结果一致。8.JNK信号通路活性的检测免疫印迹结果显示,与Sham组相比,其他组p-JNK1的蛋白表达明显上升,JNK1总含量无显着变化。与I/R组相比,Dex组、SP600125组、Dex+Anisomycin组和Nim组中p-JNK1的蛋白质表达显着减少。与Dex组相比,p-JNK1的蛋白质表达在Dex+Anisomycin组中略有上升。结论1.右美托咪定后处理和JNK通路抑制剂治疗可改善大鼠脑缺血性灌注损伤引起的学习和记忆功能障碍,减少脑组织梗死区域面积。2.右美托咪定后处理和JNK通路抑制剂治疗能减轻大鼠脑缺血性灌注损伤引起的海马CA1区域神经元的阳性凋亡和病理变化。3.右美托咪定后处理能够减少大鼠脑缺血性灌注损伤引起的炎症反应和自噬作用,可能与抑制JNK通路活化有关,并影响炎症因子和自噬相关蛋白质的表达。
周哲屹[4]（2019）在《瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠神经保护作用和机制研究》文中进行了进一步梳理目的:本实验主要分为三个部分,第一个实验主要探讨瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠神经保护的作用,观察MCAO术后,在6h、24h、72h、7d、14d较长时间段神经功能缺损的情况及瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠脑梗塞体积及脑组织细胞形态学的影响,同时与经典的艾灸治疗,以及NK-κ B抑制剂NAC及NAC联合神火灸做对比;第二部分观察瑶医神火灸对氧化应激、炎症、细胞凋亡相关指标的影响;第三部分探讨瑶医神火灸是否通过介导NF-κ B炎症通路起神经保护作用及相关机制研究。方法:对于整体的动物实验方案:（1）使用线栓法进行阻塞大脑中动脉（MCAO法）建立实验大鼠缺血再灌注损伤动物模型,缺血2h,再灌注24h,观察大鼠行为学,使用Zea-longa评分法观察大鼠神经功能缺损评分情况,评价造模是否成功。将实验大鼠采用随机数字法分为六组:假手术组、模型组、神火灸治疗组、艾灸治疗组、NAC组、神火灸+NAC组;治疗组采用神火灸、艾灸治疗,NAC采用脑室注入方法干预,（1）观察不同时段（6h、24h、72h、7d、14d）神经功能评分;（2）TTC法检测脑梗塞体积;（3）HE染色观察脑组织切片的形态学变化;（4）尼氏染色观察神经元损伤情况;（5）氧化应激相关生化指标的检测:于14d采集大鼠外周血,取血分离血清,ELISA法观察血清中MDA、SOD活性情况;（6）于14d采集大鼠外周血,取血分离血清,ELISA法观察血清炎症因子TNF-α、IL-1、IL-10的表达情况;（7）观察各组TUNNEL细胞凋亡情况;（8）采用免疫组化法、Western Blotting法、qPCR法测各组NF-κ B通路相关蛋白（Cox-2、iNOS、NF-κ B/p65、Bax、Bcl-2、Caspase-3）,确定瑶医神火灸治疗对相关通路蛋白和下游凋亡因子的影响。结果:1、瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠神经功能缺损的影响Sham（假手术组）大鼠行为、肢体功能无异常表现,评分:0分。而模型组出现向对侧转圈或者倾倒等神经功能缺失,和假手术组比较模型组神经功能缺损评分具有显着性差异。各治疗组在缺血再灌注6h、24h、72h时神经功能缺损评分无显着性差异（P>0.05）,在I/R后72h时,神火灸治疗组和艾灸治疗组与模型组相比,神经功能缺损并未出现显着改善（P>0.05）,而在治疗7d时,神火灸治疗组神经功能缺损较模型组有降低（P<0.05）,效果持续至14天更明显（P<0.01）。艾灸组与模型组比较对神经功能缺损的影响并不明显（P>0.05）。而NAC组作为一种抗氧化剂,在使用7d、14d明显起效,显着改善I/R大鼠神经功能缺陷,与模型组比较具有显着性差异（P<0.01）,与神火灸组疗效相当（P>0.05）;和模型组比较,NAC+神火灸在7d、14d出现神经功能缺损评分降低（P<0.01）。14d时,神火灸+NAC联用神经功能缺损评分数值下降,但和单用神火灸比较差异并不显着。2、瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠脑损伤体积的影响通过图像分析软件分析及计算,与假手术组比较,TTC染色后MCAO术后大鼠冠状脑组织切片可见明显脑梗塞病灶（P<0.01）,在治疗开始的24h时,梗塞体积未见明显差异,说明各治疗组在24h内均未对I/R大鼠脑梗死体积产生影响;14d时,艾灸组脑梗死体积与模型组比较具有统计学差异（P<0.05）;神火灸组、NAC组和NAC+神火灸治疗组与模型组比较,大鼠梗死体积下降明显,统计具有显着差异（P<0.01）,说明神火灸对脑梗死体积的神经保护作用较明显,NAC也具有神经保护的作用,其保护作用神火灸和NAC 比较对脑梗塞体积的影响未见明显差异,神火灸和NAC联用梗死体积数值下降,但和单用神火灸比较差异并不显着（P>0.05）。3、神火灸对动物大鼠的缺血再灌注损伤缺血脑组织相关病理学影响HE染色结果提示,假手术组（sham）大鼠脑组织细胞形态学基本正常,而模型组大鼠出现缺血中心神经细胞坏死,组织结构排列紊乱,细胞间隙增宽,细胞肿胀,核固缩,结构严重破坏;而神火灸治疗可改善神经元细胞死亡率,减轻缺血再灌注损伤,相对于模型组,其神经细胞异常相对较轻,核膜完整、染色质均匀一致、细胞器破坏较少;艾灸组其形态学改变和神火灸组基本一致;而NAC和NAC+神火灸治疗组大鼠缺血脑组织于镜下可见神经肿胀较轻,较模型组坏死细胞的数量显着减少,说明NAC作为抗氧化剂保护作用明确,和神火灸联用时炎症细胞浸润减少,细胞坏死、核固缩情况明显减轻。4、Nissl染色法观察缺血脑组织神经元数目Nissl染色结果显示,与模型组相比,神火灸和艾灸治疗组Nissl小体的数量增多,细胞形态较为正常,结构较为完整,提示灸治疗可减少I/R后神经元的损伤;而NAC组和NAC+神火灸治疗组Nissl小体的数量更多,大部分细胞形态正常,结构完整,说明NAC和NAC+神火灸治疗明显促进了脑缺血组织神经元存活。5、瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠MDA、SOD表达情况的影响本实验显示,脑缺血再灌注造模后,与假手术组比,模型组MDA水平明显上升（P<0.01）,SOD活化明显降低（P<0.01）,表明氧化应激损伤明显,SOD活性受到明显抑制,抗氧化能力减低。使用艾灸干预时,MDA水平下降,与模型组相比具有统计学差异（P<0.05）,SOD活性上升（P<0.05）;神火灸干预后,MDA水平明显下降（P<0.01）,SOD活性明显上升（P<0.01）,说明神火灸治疗能够显着提高SOD的活化能力,增强I/R损伤大鼠脑组织抗氧化应激的能力,减轻氧化应激相关损伤,并通过抗脂质过氧化相关反应对I/R损伤起保护作用。而在给予NAC侧脑室注射及NAC联合神火灸治疗时,缺血再灌注大鼠脑组织的SOD活力明显升高（P<0.01）,MDA含量明显降低（P<0.01）,其抗氧化效果优于单用神火灸（P<0.05）,提示NAC可调节缺血再灌注损伤引起的机体氧自由基释放、氧化还原应激失衡状态,减轻机体的氧化应激损伤,在与瑶医神火灸联合使用时,对SOD活性的激活和降低MDA含量方面明显优于单独使用神火灸（P<0.01）。6、瑶医神火灸对炎症因子表达情况的影响（TNF-α、IL-1、IL-10）研究结果显示,14d时,与Sham组比较,模型组TNF-α、IL-1 β、IL-10水平显着上升（P<0.01）;与模型组比较,神火灸组和艾灸治疗组干预后TNF-α、IL-10、IL-1 β水平下降具有显着性差异（P<0.01）;NAC组和NAC+神火灸治疗组TNF-α、IL-1 β、IL-10水平与神火灸治疗组具有相同变化趋势,与模型组比较水平下降明显（P<0.01）。而与神火灸组比较,NAC+神火灸联用TNF-α、IL-1 β水平明显下降（P<0.01）,IL-10也有所下降（P<0.05）,说明NAC和神火灸联用对炎症因子的降低作用更明显。7、瑶医神火灸对细胞凋亡的影响本实验显示,脑缺血再灌注造模后,与假手术组相比,模型组Tunel阳性细胞明显增加,表明细胞凋亡显着增加。使用艾灸和神火灸干预后,Tunel阳性细胞明显减少,与模型组相比,具有明显统计学差异（P<0.01）,说明神火灸治疗能够一定程度上减少缺血脑组织细胞的凋亡,对I/R损伤起保护作用。而在给予NAC侧脑室注射及NAC联合神火灸治疗时,缺血再灌注大鼠脑组织的细胞凋亡较模型组明显降低（P<0.01）,提示NAC可明显减轻缺血脑组织细胞凋亡。与神火灸组比较,NAC及NAC联合神火灸使用对细胞凋亡率的影响差异不显着（P>0.05）。8、瑶医神火灸对NF-κ B通路相关蛋白及下游凋亡因子的影响（Cox-2、iNOS、NF-κ B/p65、Bax、Bcl-2、Caspase-3）8.1脑组织中Cox-2、iNOS表达情况（免疫组化、WB检测、qPCR检测）研究结果提示,在缺血再灌注损伤后,和Sham组相比,免疫组化法显示模型组大鼠脑组织中Cox-2、iNOS阳性表达细胞增加（P<0.01）,脑组织中Cox-2和iNOS蛋白含量增加（P<0.01）,Cox-2 mRNA 和 iNOS mRNA 含量升高（P<0.01）,提示 Cox-2、iNOS参与了缺血再灌注损伤的过程;与模型组相比,艾灸组Cox-2免疫组化阳性细胞表达、Cox-2蛋白表达显着减少（P<0.01）,Cox-2mRNA含量减少（P<0.05）,iNOS 阳性细胞表达减少（P<0.05）,iNOS蛋白表达、iNOSmRNA含量显着减少（P<0.01）。与模型组比较,神火灸治疗可以明显降低Cox-2、iNOS阳性细胞表达,降低脑内Cox-2、iNOS蛋白的表达和脑内Cox-2、iNOSmRNA含量,结果具有显着统计学差异（P<0.01）,提示神火灸和艾灸一样,具有抑制Cox-2和iNOS保护脑组织的作用,并且与神火灸组相比,艾灸对iNOS 阳性细胞的表达明显升高（P<0.01）,iNOS蛋白表达增加（P<0.05）,提示神火灸抑制iNOS表达的作用优于艾灸组。而对于NAC组和NAC+瑶医神火灸治疗组,Cox-2、iNOS 阳性表达细胞减少,脑组织中Cox-2和iNOS蛋白含量减少,Cox-2 mRNA和iNOS mRNA含量减少较模型组更明显（P<0.01）,说明NF-κ B的抑制剂NAC可以明显减少Cox-2、iNOS的阳性表达,逆转脑组织缺血后的损伤,促进神经功能修复。与神火灸组比较,NAC+神火灸联用对Cox-2阳性细胞的表达、Cox-2、iNOS蛋白含量和Cox-2、iNOS mRNA的表达水平下降更为明显（P<0.01）,提示联合应用对Cox-2、iNOS的影响明显优于单独使用神火灸。8.2脑组织中NF-κ B/p65表达情况（免疫组化、WB检测、qPCR检测）本研究结果提示,在脑缺血再灌注14d后,免疫组化结果显示,与Sham组比较,模型组缺血脑组织NF-κ B p65阳性表达增多（P<0.01）,说明NF-κ B p65被激活,同时NF-κ B p65移位到胞核内的阳性细胞数增多,同时WB提示NF-κ B p65蛋白的表达增加（P<0.01）,qPCR 提示 NF-κ B p65 mRNA 上调（P<0.01）,说明 NF-κ B p65通路被激活。与模型组比较可以看出,艾灸治疗可以减少缺血脑组织NF-κ B/p65阳性细胞表达（P<0.05）、降低脑内NF-κ B/p65蛋白表达（P<0.05）,显着减少脑内NF-κB/p65mRNA表达（P<0.01）,而神火灸减少NF-κ B/p65阳性细胞表达、蛋白表达及脑内NF-κ B/p65mRNA表达更明显（P<0.01）,提示神火灸和艾灸治疗可能是通过抑制缺血脑组织NF-κ B/p65表达起到减轻MACO大鼠I/R脑损伤作用。而在降低脑内NF-κ B/p65蛋白表达方面,神火灸组优于艾灸组（P<0.05）。而NAC和NAC+神火灸可以显着减少NF-κ B/p65阳性细胞表达、蛋白表达及脑内NF-κ B/p65mRNA表达（P<0.01）,效果显着,并且NAC和神火灸联用对NF-κ B/p65的作用显着优于单一的神火灸治疗（P<0.01）。8.3脑组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3表达情况（免疫组化、WB检测、qPCR检测）本实验通过对I/R大鼠的免疫组化、Western blot及qPCR检测发现,与Sham组相比MCAO组Bax、caspase-3明显升高（P<0.01）,Bcl-2水平明显降低（P<0.01）。与模型组比较,艾灸治疗组Bax阳性细胞表达明显减少（PP<0.01）,Bcl-2阳性细胞增加、caspase-3 阳性细胞表达减少无统计学意义（P>0.05）,脑内Bax、caspase-3蛋白表达下降（P<0.01）,脑内Bax mRNA表达减少（P<0.05）、Caspase-3 mRNA表达显着减低（P<0.01）;脑内Bcl-2蛋白增加无显着意义（P>0.05）,Bcl-2 mRNA水平增加（P<0.05）;说明艾灸对于Bax、caspase-3、Bcl-2的调节具有一定作用,但是作用不稳定,各种检测结果存在差异。而与模型组相比,神火灸组Bax、caspase-3阳性细胞表达减少（P<0.01）,Bcl-2阳性细胞表达升高（P<0.05）;Bax、caspase-3蛋白表达下降（P<0.01）,Bcl-2 蛋白表达上升（P<0.01）,脑内 Bax mRNA、caspase-3 mRNA表达下降明显（P<0.01）,及脑内Bcl-2mRNA表达上升（P<0.01）,说明神火灸治疗可以通过影响细胞内Bcl-2、Bax、caspase-3等相关凋亡因子的水平从而影响细胞凋亡,并且和艾灸组比较,神火灸对降低Bax、Caspase-3蛋白表达的作用优于艾灸（P<0.01）。对于NAC组及神火灸+NAC组,caspase-3、Bax阳性细胞表达、脑内蛋白水平和mRNA水平下降更为明显（P<0.01）,Bcl-2阳性细胞表达、脑内蛋白水平和mRNA水平明显上升（P<0.01）,提示NAC具有影响相关凋亡因子抗凋亡的作用,联合神火灸使用对于细胞凋亡途径的影响作用更强,和神火灸单一治疗比较差异具有显着统计学意义（P<0.01）,联合治疗可以起到较强抗凋亡的神经保护作用。结论:1.神火灸改善了脑缺血再灌注大鼠神经功能缺损情况,减轻了缺血脑组织形态和病理学改变,对缺血再灌注大鼠具有神经保护的作用。2.瑶医神火灸对脑缺血再灌注大鼠损伤的神经保护作用与抗炎、抗氧化、抗凋亡的机制可能相关;3.瑶医神火灸对神经保护的作用机制可能是通过抑制NF-κ B炎症通路发挥抗炎、抗凋亡的作用。
叶宏[5]（2019）在《预适应联合后适应增强小鼠脑缺血再灌注损伤保护机制的研究》文中提出[目 的]观察自主跑轮预适应、缺血后适应以及两者联合应用对小鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用有无差异,结合氧化应激指标、细胞凋亡因子的检测,探寻可能的潜在调控机制。[方 法]实验由三个部分组成:第一部分实验动物小鼠分为5组:1.假手术组。2.脑缺血再灌注损伤模型组。3.缺血后适应组。4.自主跑轮预适应组。5.自主跑轮预适应联合后适应组。在第一部分实验结果的基础上设定第二部分实验分组:小鼠分为3组:1.假手术组。2.缺血后适应组。3.自主跑轮预适应联合后适应组。为验证第一、二部分的实验推论,将第三部分实验动物分为4组:1.缺血后适应组。2.自主跑轮预适应联合后适应组。3.自主跑轮预适应+后适应-PI3K抑制剂组。4.自主跑轮预适应+后适应-STAT3抑制剂组。实验采用神经功能缺损评分表,检测小鼠神经功能障碍评分;水迷宫检测认知功能;TTC实验检测脑梗死灶体积;分子生物学系列实验检测氧化应激生化指标以及神经元凋亡情况;细胞免疫的改变,采用Western blot检测凋亡、信号通路相关因子的蛋白表达。[结 果]第一部分实验:与脑缺血再灌注组比较,自主跑轮预适应改善小鼠脑缺血再灌注损伤后的神经功能、认知功能和减少脑梗死灶体积的作用不明显,后适应显着改善小鼠脑缺血再灌注损伤后的神经功能、认知功能和减少脑梗死灶体积,自主跑轮预适应联合后适应进一步增强改善小鼠脑缺血/再灌注损伤后的神经功能、认知功能和减少脑梗死灶体积的作用,明显强于单独的预适应或后适应。与脑缺血再灌注组比较,预适应略有升高超氧化物歧化酶（SOD）活性和降低丙二醛（MDA）含量的作用,后适应能显着升高脑组织中SOD活性和降低MDA含量,自主跑轮预适应联合后适应,升高脑组织SOD活性,降低MDA含量的作用进一步增强,明显强于单独的自主跑轮预适应或后适应。与模型组比较,自主跑轮预适应减少缺血区脑组织的神经细胞凋亡数量不明显,后适应明显减少神经细胞凋亡数量,自主跑轮预适应联合后适应减少神经元细胞凋亡的作用进一步增强,明显强于单独的自主跑轮预适应或后适应。Western blot检测凋亡相关因子的蛋白表达,与脑缺血再灌注组比较,其中促凋亡因子Bax、Caspase-3的蛋白表达,预适应联合后适应的表达减弱,自主跑轮预适应或缺血后适应的表达无明显统计学意义;抗凋亡因子Bcl-2的蛋白表达,预适应联合后适应的表达增强,自主跑轮预适应或缺血后适应的表达无明显统计学意义。第二部分实验:Western blot检测信号通路相关因子的蛋白表达,其中PI3K、STAT3的蛋白表达,缺血后适应升高PI3K、STAT3活性。自主跑轮预适应和后适应联合干预提升PI3K、STAT3通路活性强于单独的后适应。第三部分实验:分别使用PI3K抑制剂LY294002、STAT3抑制剂SH454后,自主跑轮预适应联合后适应的脑保护作用明显减弱,表现为:神经功能评分降低,认知功能减退,脑梗死体积增大,TUNEL检测的凋亡细胞数量增多,促凋亡因子线粒体内细胞色素C、Bax、Caspase-3的蛋白表达增强,抗凋亡因子胞质内细胞色素C、Bcl-2的蛋白表达减弱。[结 论]1.后适应对小鼠脑缺血/再灌注损伤有保护作用,自主跑轮预适应联合后适应能进一步增强上述作用。2.自主跑轮预适应联合后适应对小鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用的增强可能依赖于激活抗氧化、抗凋亡的PI3K和STAT3信号通路。3.分别使用PI3K、STAT3抑制剂后,自主跑轮预适应联合后适应的脑保护作用明显减弱。
张凯[6]（2019）在《基于PET分子影像的普鲁士蓝纳米酶治疗脑缺血的基础研究》文中进行了进一步梳理缺血性脑卒中是全球主要致死性疾病之一,占全球死亡病因的5.2%。缺血性脑卒中通常是由血栓或栓子阻断大脑动脉血流供应,引起短暂或永久的脑血流减低所致。短暂性脑血供减少或丧失会触发脑缺氧-再灌注损伤,诱发大量活性氧/氮（reactive oxygen and/or nitrogen species,ROS/RNS 或 RONS）的产生。大量产生的RONS被认为是介导脑缺血-再灌注后神经元损伤最主要的因子,靶向RONS的抗氧化剂也由此成为一种能保护神经元免受RONS损伤和改善缺血性脑卒中预后的理想药物。目前,以新型纳米材料为基础合成的抗氧化纳米酶,因具有稳定的酶样活性、较强的抗氧化性质、良好的生理稳定性和较低的合成成本等优势引起了广泛关注。普鲁士蓝是一种美国食品药品监督管理局批准的铯和铊中毒的解毒剂,具有良好的生物安全性。基于普鲁士蓝合成的纳米粒因具有磁/光性能、可控的理化性质以及多孔结构等优势,已被开发为多模态显像探针、药物载体和光热转换剂等,在生物医学研究领域受到广泛关注。此外,普鲁士蓝纳米粒因其具有过氧化氢酶、超氧阴离子歧化酶和过氧化物酶等多酶样活性,可作为有效的RONS清除剂。然而,其能否起到保护神经元、改善缺血性脑卒中等RONS相关疾病预后的作用,尚无研究报道。正电子发射计算机断层显像（positron emission tomography,PET）是一种无创的可在细胞和分子水平上在体显示机体生物活动的新型分子影像技术。18氟-脱氧葡萄糖（18F-fluorodeoxyglucose,18F-FDG）PET成像能够反映机体细胞水平的葡萄糖代谢情况和细胞的活性,已用于多种神经系统疾病的诊断和疗效评估。本研究旨在通过提出绿色安全、简单便捷的合成方法,合成新型空心普鲁士蓝纳米酶（hollow Prussian blue nanozymes,HPBZs）,并将其应用于缺血性脑卒中,从纳米技术、体外细胞和活体动物水平,探究其神经元保护作用及相关机制;同时,基于18F-FDG PET成像,活体评估HPBZs在缺血性脑卒中大鼠的神经保护作用和效果,为普鲁士蓝纳米粒的临床转化提供研究基础。第一部分HPBZs合成、表征以及性能检测本部分研究通过研发Bi3+介导的无模板空心纳米粒合成方法,成功制备了HPBZs。该方法合成路径简单,无需复杂的预处理和苛刻的合成条件。制备的HPBZs为直径约65 nm、大小均一、分散均匀的空心纳米粒,在生理环境下能够维持稳定的水合动力学直径,表现出良好的生物学稳定性。此外,HPBZs具有多酶样活性、可变的价态和较强的氧化还原性能,不仅能够将毒性ROS转化为无毒的水分子和氧气,而且能够有效地清除RNS。同时,空心结构赋予HPBZs更大的比表面积,增大HPBZs与RONS接触面积,从而提高HPBZs清除RONS的效能。本部分研究结果为HPBZs在缺血性脑卒中中清除大量产生的RONS从而发挥神经保护作用提供了实验依据。第二部分HPBZs发挥细胞保护作用的体外细胞实验研究该部分主要研究了 HPBZs在体外细胞水平的保护作用,并进一步探讨其发挥细胞保护作用的机制。首先,我们建立了体外细胞氧化应激模型,结果显示,HPBZs能够抵抗氧化应激损伤,保护神经元;随后构建了氯化钴诱导的体外细胞缺氧模型,结果显示HPBZs能够降低RONS水平,调控凋亡蛋白p53和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,从而保护缺氧受损的神经元;此外,我们还构建了体外炎症模型,结果表明HPBZs能够通过减少炎症介质环氧合酶-2和诱导型一氧化氮合酶的表达,抑制炎症因子IL-1β的释放,发挥体外细胞抗炎作用。综上所述,HPBZs可能通过减少RONS、抵抗细胞凋亡和抑制炎症反应,从而发挥细胞保护作用。第三部分HPBZs发挥神经保护作用的动物实验研究该部分主要研究了 HPBZs对缺血性脑卒中大鼠的神经元保护作用,并进一步探索其发挥神经元保护作用的机制。我们采用经典的致大鼠大脑中动脉梗阻线栓法构建了脑缺血-再灌注损伤大鼠模型,并于脑缺血-再灌注前2天、脑缺血-再灌注后1小时、4小时或8小时侧脑室注射HPBZs（40 μg/mL,10μL）,结果显示,脑缺血-再灌注前2天或缺血-再灌注后1小时侧脑室注射HPBZs可显着减少大鼠脑梗面积、改善大鼠脑缺血区葡萄糖代谢和促进大鼠神经行为学功能恢复;进一步分子生物学实验结果提示HPBZs可能通过降低脑内RONS水平、抑制神经胶质细胞增生和抵抗神经元凋亡,发挥神经元保护作用以拮抗缺血诱导的神经元损伤。同时,初步的活体生物安全性评估（包括18F-FDG PET成像、神经行为学测试以及2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色分析）结果显示,HPBZs具有良好的生物安全性。
高丽[7]（2013）在《血管紧张素-（1-7）在高血压及脑缺血损伤中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理血管紧张素-（1-7）在高血压及脑缺血损伤中的作用及机制研究缺血性脑卒中严重危害人类的健康，其发病率高，致死致残率高，给家庭和社会带来了沉重的经济负担。高血压作为脑卒中的独立危险因素，在卒中的发生发展过程中发挥关键的作用。研究表明，全世界约54%的卒中患者死因与高血压直接相关。在控制其它危险因素后，收缩压每升高10mmHg，卒中发病的相对危险增加49%；舒张压每升高5mmHg，卒中发病的相对危险增加46%。因此，加强高血压的防治，探索脑卒中的神经保护机制，具有重大的意义。肾素-血管紧张素系统（RAS）是机体重要的循环调节系统。经典的RAS通路是血管紧张素原（AGT）在肾素作用下生成血管紧张素I（Ang I），而Ang I在血管紧张素转化酶（ACE）作用下生成血管紧张素II（Ang II），与血管紧张素受体1（AT1R）结合构成ACE-Ang II-AT1R轴，在血压调节、水电解质的平衡中发挥重要作用。高血压患者长期存在RAS的过度激活，而Ang II的增加是促使患者发生致死及致残性临床转归终点事件的核心环节。研究表明，Ang II可通过多条交错复杂的途径诱导氧化应激，促使炎症反应，加速细胞凋亡，损伤血管内皮，刺激交感兴奋，最终导致卒中的发生。近年来，RAS的旁路途径逐步受到重视，血管紧张素-（1-7）[Ang-（1-7）]作为RAS新成员，主要由Ang II在ACE2作用下水解生成，通过与其特异性Mas受体结合组成ACE2-Ang-（1-7）-Mas途径，与经典途径ACE-Ang II-AT1R既相互抗衡又存在交互作用，共同维持机体内环境的稳定。Ang-（1-7）在多个方面发挥着与Ang II相反的功效，如舒张血管、降低血压、抑制平滑肌增生等，在心、脑、肾等系统的发育及功能修复中具有重要的作用。本课题组前期研究结果表明，Ang-（1-7）显着降低大鼠脑缺血再灌注后氧化应激水平，缩小梗死体积，改善神经功能评分，保护脑缺血再灌注损伤。然而，Ang-（1-7）对高血压脑损伤的病理生理改变有何影响及其在脑缺血损伤中发挥保护作用的机制目前尚不清楚。鉴于上述，本研究第一部分工作采用自发性高血压大鼠（SHRs）及与之匹配的正常Wistar-Kyoto大鼠（WKYs），通过微型渗透泵在大鼠侧脑室持续输注Ang-（1-7），研究不同剂量Ang-（1-7）对高血压大鼠脑内经典RAS通路代谢的影响，及其对脑内氧化应激、神经元凋亡及细胞自噬水平的影响及可能的机制，剖析Ang-（1-7）对高血压大鼠脑内一系列病理生理环节的作用。第二部分建立大鼠永久性脑缺血模型（pMCAO），探索Ang-（1-7）在脑缺血损伤中发挥保护作用尤其是对缺血后炎症反应的影响及可能的分子机制，深化我们对Ang-（1-7）保护脑缺血损伤的认识，为RAS在脑缺血发生发展过程中的作用提供直接的实验依据。目前，针对脑卒中的防治，控制高血压等危险因素已引起重视，及时有效的溶栓已经得到认可，神经保护剂的研制也在不断探索中。近年来，脑卒中的内源性保护作用受到越来越多的关注。缺血预适应（IPC）是指组织在遭受一次或多次短暂亚致死性缺血再灌注后，对随后更长时间的严重缺血再灌注损伤的抵抗能力提高。目前IPC是外科干预中研究最为广泛的一种方法，对器官的保护作用得到了大多学者的认可。然而由于缺血事件的不可预见性，限制了其在临床的应用。缺血后适应（IPOC）是组织在经历长时间缺血后，再灌注起始时给予短暂重复的缺血再灌注，可诱导器官的保护作用。IPOC发生在缺血后再灌注的起始阶段，如血管成形术或溶栓治疗时，此时多为临床医生所控制，具有较高的临床应用价值。目前IPOC在心肌缺血介入治疗领域已逐步得到应用，IPOC对脑缺血的保护作用在动物实验中也已得到验证，然而迄今为止，IPOC的机制仍未完全阐明。因此，本文第三部分建立大鼠大脑中动脉阻塞模型，从脑缺血内源性治疗学的角度，探索IPOC在脑缺血损伤中发挥保护作用的机制，为脑卒中的临床治疗学提供新的思路和策略。第一部分血管紧张素-（1-7）在自发高血压大鼠脑损伤的作用及机制研究目的：研究血管紧张素-（1-7）对自发高血压大鼠脑内病理生理改变的影响及机制。方法：通过微型渗透泵对16周龄的SHRs及WKYs侧脑室持续输注aCSF及低、中、高剂量的Ang-（1-7）。4周后，采用ELISA测定脑内Ang II的含量；Westernblotting测定ACE、AT1R、AT2R、iNOS、gp91phox、凋亡及自噬相关蛋白的表达；分光光度计法测定MDA的含量和SOD的活性；TUNEL检测大鼠皮层、海马CA1区和DG区的细胞凋亡数；免疫荧光观察大鼠皮层LC3的荧光表达；透射电镜观察神经元亚显微结构及自噬小体形成。结果：（1）相对于WKYs，SHRs脑内Ang II水平升高，ACE表达上调，AT1R的表达增加而AT2R表达减少。侧脑室持续输注中、高剂量的Ang-（1-7）显着降低脑内Ang II的水平及AT1R的表达，而对AT2R的表达及ACE的表达和活性无明显影响。（2） SHRs脑内MDA含量升高，SOD活性下降，iNOS及gp91phox的表达增多；中、高剂量的Ang-（1-7）可在不同程度上降低SHRs脑内MDA的含量，上调SOD的活性，减少iNOS及gp91phox的表达。（3） SHRs脑内Bcl-2表达升高，Bax表达降低，TUNEL阳性细胞数较WKYs明显增多；中、高剂量的Ang-（1-7）可显着上调SHRs脑内Bcl-2的表达，下调Bax的表达，减少TUNEL阳性细胞数。（4） SHRs脑内自噬相关蛋白LC3及Beclin1表达较WKYs明显升高，p62表达下降，LC3荧光细胞数增多。电镜结果显示，SHRs脑内细胞核膜破裂，染色质固缩，双层膜结构的自噬小体增多，细胞损伤较重；中、高剂量的Ang-（1-7）显着降低脑内LC3及Beclin1的表达，上调p62，减少LC3荧光细胞数，改善SHRs脑内神经元结构损伤，抑制自噬小体形成。（5）然而，Ang-（1-7）在SHRs脑内的上述效应可被Mas受体拮抗剂A-779取消。结论： SHRs脑内存在组织RAS的激活，同时氧化应激水平升高，神经元凋亡增多，细胞自噬激活；Ang-（1-7）通过作用于Mas受体在不同程度上减轻SHRs脑内氧化应激损伤，减少神经元凋亡，抑制细胞自噬激活，调节脑内局部RAS的代谢，参与高血压脑损伤病理生理的调节，为进一步阐明RAS在高血压靶器官损伤中的作用奠定了一定的学术基础。第二部分血管紧张素-（1-7）对大鼠脑缺血损伤后炎症反应的影响目的：探索血管紧张素-（1-7）对大鼠局灶性脑缺血后炎症反应的影响及可能的机制。方法：建立大鼠大脑中动脉永久性闭塞模型，术前48h通过微型渗透泵在不同分组大鼠侧脑室持续输注aCSF、Ang-（1-7）或A-779。缺血后24h行神经功能缺损评分及TTC染色检测脑损伤程度；分光光度计法测定MDA的含量和SOD的活性；Western blotting检测各组大鼠缺血侧皮层I-κB、NF-κB p65及COX-2蛋白的表达；免疫组织化学检测NF-κB p65空间分布以及阳性细胞数；ELISA测定脑组织中TNF-、IL-1β含量。结果：相对于永久性脑缺血大鼠，侧脑室内给予Ang-（1-7）可减小大鼠脑梗死体积，改善神经功能缺损评分，降低脑内MDA的含量，提高SOD的活性，抑制缺血侧皮层细胞NF-κB p65由胞浆向胞核移位，降低NF-κB p65阳性细胞数，并减少COX-2的表达及炎症因子TNF-、IL-1β的含量。Mas受体拮抗剂A-779可加剧大鼠脑缺血损伤，诱导氧化应激，上调NF-κB p65的表达，促进炎症反应，并且取消Ang-（1-7）对脑缺血损伤的保护作用。结论：Ang-（1-7）通过Mas受体显着改善脑缺血后神经功能障碍，减小脑梗死体积，减轻氧化应激损伤，抑制NF-κB介导的炎症反应，提示NF-κB介导的炎症途径是Ang-（1-7）抑制缺血后炎症反应发挥保护作用的重要靶点，这也为进一步研究RAS在脑缺血损伤中的作用提供了直接的实验证据。第三部分缺血后适应对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用及机制研究目的：研究缺血后适应对局灶性脑缺血大鼠脑保护作用及机制。方法：通过电凝法建立大鼠局灶性脑缺血后适应模型，自噬激动剂雷帕霉素、自噬抑制剂3-MA在不同分组大鼠侧脑室给药，缺血后24h行TTC染色及脑含水量检测脑损伤程度；Western blotting检测各组大鼠缺血侧皮层LC3、Beclin1、p62及Bcl-2蛋白的表达；免疫荧光检测LC3及Beclin1的荧光细胞数；透射电镜观察神经元亚显微结构及自噬小体形成。结果：（1） Western blotting结果提示，缺血后1h脑内LC3及Beclin1的表达开始上调，6h差异显着，24h达峰，缺血后48h表达开始下降；而p62的表达则在缺血后1h开始下降，24h最低，持续至缺血后48h。（2）以缺血后24h为观察时间点，IPOC显着减小大鼠脑梗死体积，减轻脑水肿程度，并降低LC3及Beclin1的表达，上调p62的表达，减少LC3和Beclin1的荧光细胞数；同时，电镜的结果显示大鼠脑缺血后皮层神经元出现坏死及凋亡的形态特征，胞浆内自噬小体增多，而IPOC大鼠脑内神经元核膜相对完整，细胞器结构损伤较轻，自噬小体形成减少。（3）然而，相对于IPOC，侧脑室给予雷帕霉素则显着增大了大鼠脑梗死体积，加重脑水肿，并上调LC3及Beclin1的表达，下调p62的表达，同时LC3和Beclin1的荧光细胞数也增加，神经元损伤加重。（4）与单纯缺血组相比，缺血后再灌前给予3-MA能显着减小大鼠脑梗死体积，减轻脑水肿，抑制自噬激活，同时上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，与IPOC发挥相似的保护作用。结论：大鼠局灶性脑缺血损伤后存在自噬的激活，且随着缺血时间的不同激活的程度不同。IPOC保护脑缺血损伤，抑制自噬激活，而雷帕霉素可能通过进一步诱导自噬激活阻断IPOC的保护作用。3-MA能够减轻大鼠脑缺血损伤，模拟IPOC的内源性保护作用，为进一步研究脑缺血内源性保护的临床治疗提供新的靶点。综上所述，本研究工作的主要创新之处在于：1.血管紧张素-（1-7）在高血压脑损伤的一系列病理生理环节中发挥多靶点保护作用Ang-（1-7）通过作用于Mas受体在不同程度上减轻SHRs脑内氧化应激损伤，减少神经元凋亡，抑制细胞自噬激活，影响脑组织经典RAS通路的代谢，参与高血压脑损伤病理生理的调节，进一步阐明了Ang-（1-7）在高血压发病机制中的重要作用，为靶向于RAS调节药物应用于高血压靶器官损伤的临床治疗提供了理论依据。2.血管紧张素-（1-7）参与缺血后炎症反应促进神经功能修复脑缺血损伤后存在炎症反应的级联放大效应，Ang-（1-7）通过作用于Mas受体抑制缺血后NF-κB介导的炎症反应，减轻氧化应激损伤，减小梗死体积，促进神经功能修复，诱导缺血后神经保护作用，深化了我们对Ang-（1-7）在脑缺血损伤中作用的认识，为RAS在脑缺血损伤发生发展中的作用提供直接的支持证据。3.缺血后适应抑制缺血再灌注损伤发挥内源性保护作用IPOC抑制神经元凋亡，抑制缺血后细胞自噬激活，改善神经功能障碍，减轻脑缺血再灌注损伤，启动内源性保护机制，为脑缺血神经保护临床治疗学提供新的思路和靶点。
刘荣[8]（2012）在《JAKs激酶在电针抗缺血性脑损伤中作用的研究》文中研究指明脑血管病（脑卒中）是危害人类健康的常见病,具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点,目前是世界第三大死因。在中低收入国家,脑卒中死亡率尤为严重（占全球死亡的85.5%）,因脑卒中所导致伤残而损失的调整寿命年（QALYs）是高收入国家的7倍,寻找有效的治疗手段并阐释其机理是目前脑科学领域的研究热点。研究证实,脑缺血损伤后缺血中心区的神经元死亡以坏死为主,而缺血周边半暗带区的神经元死亡与凋亡有关,如何挽救缺血半暗带区受损的神经细胞是一个值得关注的重要课题,因此研究引起细胞凋亡的信号转导机制可能为脑缺血提供新的前景。JAK-STAT系统是脑缺血后的炎性反应中重要的信号转导通路,也是决定病灶区细胞凋亡进程的重要因素。JAKs激酶作为JAK-STAT信号转导系统的重要组成部分,是许多细胞因子、生长因子的重要信号传感器。众所周知,针刺对脑缺血性疾病有着独特的疗效,具有多环节、多层次、多靶点的作用特点,而针刺对脑缺血后JAKs激酶作用机制研究尚未明确。因此,本文拟从JAKs激酶及其下游因子STATs与神经细胞凋亡间的关系及电针对其影响作用进行研究,以进一步揭示针刺治疗缺血性中风的作用机制,为临床治疗提供坚实的研究基础。本文分为文献研究、实验研究及小结三大部分。1.文献研究综观历代医学典籍,不乏有对中风病的精辟论述。在中风的病因病机认识上,经历了外风论、内风论以及非风论等阶段。归纳起来不外乎风、火、痰、气、虚、瘀六端,此六端常相互影响,相互作用,合而为病。为探讨古代针灸文献中针灸治疗中风病的选穴规律,本文选取晋代至清代具代表性的12部医着文献,通过确立中风检索词、建立数据库、频数分析及支持度对比的方法,总结出中风病总体腧穴运用频次,半身不遂、口眼歪斜、语言不利三大症状腧穴运用频次及经络腧穴相关性。现代文献研究方面,本文就缺血性中风的病理生理学机制、针灸作用机理、JAKs激酶及JAK-STAT信号转导通路与脑缺血发病机制的研究进展进行了综述,认为脑缺血能引起JAKs激酶的异常活化,但该信号途径的异常活化与缺血导致的神经元存亡之间的具体关系尚不十分清楚。因此进一步探讨JAKs激酶及JAK-STAT信号转导途经在缺血性脑损伤中的调控机制及针刺干预作用,将为防治缺血性脑损伤提供有益的线索。2.实验研究目的：观察电针对局灶性脑缺血大鼠缺血灶周围区不同时间段缺血侧皮质神经元病理形态学、神经元细胞凋亡、酪氨酸蛋白激酶JAKs及其下游因子STATs的影响,进一步揭示针刺治疗脑缺血疾病的可能作用机理。方法：SPF级雄性SD大鼠300只,按随机区组化法分为5组：假手术组、模型组、电针组、AG490组、电针+AG490组,各组又分为术后2h、1d、3d、7d、21d5个不同时段亚组。假手术组只暴露大鼠大脑中动脉,不予凝闭；模型组采用电凝闭大脑中动脉建立局灶性脑缺血模型；电针组手术凝闭大脑中动脉,予电针治疗；AG490组侧脑室注射AG49020min后,手术凝闭大脑中动脉；电针+AG490组侧脑室注射AG49020min后,手术凝闭大脑中动脉,续予电针治疗。观察指标如下：（1）各组大鼠神经功能缺损评分、HE染色及透射电镜观察局灶性脑缺血大鼠大脑皮质缺血灶周围区病理形态学改变。（2）TUNEL细胞凋亡染色法观察不同时段各组大鼠大脑皮质缺血灶周围区神经元细胞凋亡情况。（3）采用免疫荧光染色法、Western Blot、原位杂交法检测各组大鼠大脑皮质缺血灶周围区JAK1磷酸化蛋白及mRNA表达变化。（4）采用免疫荧光染色法、Western Blot、原位杂交法检测各组大鼠大脑皮质缺血灶周围区JAK2磷酸化蛋白及mRNA表达变化。（5）免疫荧光染色法和激光共聚焦显微镜观察各组大鼠大脑皮质缺血灶周围区JAK下游因子p-STAT3、p-STAT5表达情况。（6）运用双尾Pearson/Spearman相关检验分别进行2h、1d、3d、7d及21d五个时间段脑缺血模型组p-JAK、p-JAK2、p-STAT3、p-STAT5平均荧光强度值与神经细胞凋亡相关分析。结果：（1）缺血早期大鼠即出现神经功能缺损,神经功能缺损峰值出现在脑缺血后1d,随着缺血时间的延长,其神经行为学评分明显降低,以21d下降最为明显。除21d组,各时段干预组评分与同时段模型组相比,神经功能缺损评分具有所减少（P<0.05）。结合HE染色、电镜观察,其病理形态学改变与神经功能缺损的发展趋势基本一致,说明了电凝闭大脑中动脉致局灶性脑缺血大鼠模型的成功性,同时也说明电针治疗、AG490干预对脑缺血大鼠神经缺损体征具有明显改善作用,对脑缺血后大脑皮质神经元的恢复有一定促进作用。（2） TUNEL细胞凋亡检测结果显示：大鼠脑缺血2h后,在缺血侧大脑皮质可见较多的凋亡细胞,脑缺血1d后凋亡细胞的表达达到峰值,脑缺血3d细胞凋亡阳性反应物仍处较高的表达水平。随着缺血时间的延长,凋亡细胞数目逐渐下降,以脑缺血后21d减少最为明显。电针治疗方面,缺血后各时间段其细胞凋亡表达水平均低于模型组,以1d、3d、7d时间相点比尤为明显（P<0.01）。AG490组大鼠缺血侧脑组织细胞凋亡的变化趋势及其抗凋亡作用与电针组基本一致。电针治疗与AG490干预的协同作用方面,在脑缺血的超早期（2h）,两者的联合应用即可较好地抑制细胞凋亡（P<0.05）,但是在缺血后1d、3d、7d时间段,电针+AG490与单纯电针治疗或AG490干预相比差异不明显（P>0.05）。（3）采用免疫荧光染色法、western blot、原位杂交技术研究电针对局灶性脑缺血大鼠不同时间段p-JAK2蛋白及mRNA表达的影响。假手术组各相点的只检测到少量p-JAKl表达,脑缺血后2h大鼠缺血侧皮质即可检测到相当数量的JAK1磷酸化表达,缺血后1d达到高峰,模型3d组较前有所下降,随着缺血时间的延长,模型7d组p-JAK1的表达持续下降,直至缺血后21d尚有少量表达。电针组在1d、3d时间段JAK1磷酸化水平明显高于相应相点模型组的表达含量（P<0.01）。（4）假手术组大鼠的皮质中p-JAK2的表达量极少,说明正常生理状态下脑组织中JAK2是以非磷酸化形式存在。模型组2h大鼠缺血侧大脑皮质可检测到少量p-JAK2表达,脑缺血后1d到达峰值,M3d组开始下降,缺血后21d仍可检测到p-JAK2的少量表达。除缺血后2h、21d时间段,电针组JAK2磷酸化水平均少于同时间段模型组,1d、3d组尤为明显（P<0.01）。AG490组对JAK2磷酸化干预作用比电针组更明显,这种优势主要体现在脑缺血神经功能缺损的高峰期,即脑缺血后1d,A1d组与Zld组差异有显着性意义（P<0.05）。电针治疗与AG490干预协同作用方面,脑缺血后2h,两者的联合应用即可较好地抑制JAK2的磷酸化水平（P<0.05）,此外,E+A1d与Eld、E+A3d与E3d相比较均有统计学意义（P<0.05）,说明二者的共同作用在减少p-JAK2超量表达方面比单纯电针干预更有优势。（5）采用免疫荧光染色法观察电针对局灶性脑缺血大鼠不同时间段p-STAT3、 P-STAT5蛋白表达的影响。结果显示：①脑缺血后1d组的P-STAT3含量升高到达峰值,3d组开始下降,缺血后21d表达量明显减少。P-STAT3免疫阳性细胞的表达与脑缺血后p-JAK2、凋亡细胞的变化规律在时空分布及动态变化上呈一致性,都是在缺血后1d显着升高达到峰值,而其后又随着时间的推移逐渐下降。与模型组相比,脑缺血后1d、3d,电针治疗可明显减少STAT3的磷酸化表达水平。②缺血后2h,模型组即可检测到大量P-STAT5免疫荧光阳性细胞的表达,缺血后1d达到最高值,而缺血后3d,模型组P-STAT5水平开始下降,直到缺血后7d,21d, p-STAT5含量明显降低。在脑缺血1d,即P-STAT5表达的峰值期,电针治疗可促进STAT5的磷酸化；到缺血3d时,电针则明显提高P-STAT5的表达水平（P<0.01）；至脑缺血7d、21d时,电针组与模型组相比,差异虽无统计学意义,但在数据上具有一定优势。（6）脑缺血后JAK/STAT信号转导通路与神经细胞凋亡相关性分析：JAK1、JAK2、STAT3磷酸化表达与神经元细胞凋亡在脑缺血高峰期（即缺血后1d、3d时间段）密切相关,而在脑缺血慢性期关联性不甚明显。此外,p-JAK1蛋白表达与TUNEL细胞凋亡呈负相关性,P-JAK2、 p-STAT3蛋白表达与TUNEL细胞凋亡呈正相关性,P-STAT5蛋白表达与TUNEL细胞凋亡相关性不明显。结论：（1）缺血性脑损伤后,大鼠神经功能缺损、病理形态变化及神经细胞凋亡情况有向好的方向发展趋势,说明脑损伤后具有自我可塑性的调节机能。而电针可以改善受损的神经功能障碍,促进神经元的修复,抑制脑缺血后的神经元细胞凋亡。（2）电针治疗的介入能显着提高脑缺血早期缺血侧皮质JAK1的活性,激发机体自我保护机制,减轻脑缺血损伤,并且能促使这种保护性的效应维持一段较长的时间,参与受损组织的修复。（3）JAK2及其下游因子STAT3磷酸化的超量表达,JAK2-STAT3通路的异常激活与诱导细胞凋亡有关。电针治疗缺血性脑血管疾病的机制可能是通过针刺信号激发躯体神经系统的有关反应来启动相关信号转导通路来调节,即电针通过抑制JAK2-STAT3的异常活化,部分阻断或降低了炎性细胞因子的细胞内信号转导,以减少细胞凋亡的发生。（4）予JAK2阻滞剂AG490干预后,可明显抑制JAK2磷酸化表达和神经元细胞凋亡,且其与电针的协同作用更为明显,提示脑缺血后AG490对缺血灶大脑皮质神经元修复作用可通过作用于JAK/STAT信号转导系统而实现的。（5）电针能提高脑缺血缺血侧皮质STAT5磷酸化表达,作用机理可能是通过激活STAT5所诱导的相关细胞因子通路,以减轻脑缺血的损伤,提高修复受损神经元的能力。（6）结合本研究的实验结果,我们认为针刺启动JAK/STAT信号转导通路,促进神经自稳态调节是其治疗缺血性脑损伤的关键作用机制。
王恒[9]（2011）在《脑部亚低温预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用的研究》文中进行了进一步梳理目的：探讨脑部亚低温预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用的研究。方法：60只SD雄性大鼠随机分成实验组（SH，n=30）和对照组（CH,n=30），SH组采用头部亚低温（33-35℃）预处理10min,CH组常温条件下夹闭双侧颈内动脉3分钟制作大鼠脑缺血再灌注模型。大鼠脑缺血再灌注模型建立后均经全身低温（30-32℃）治疗2h，并分别于低温处理后3h,6h,12h,24h,48h,72h时间点（6个亚组，n=5）取大脑组织，HE染色观察、计数多形核白细胞，TUNEL法观察、计数凋亡细胞，TTC染色观察梗死体积，组织烘干法观察组织水分。结果：1、组凋亡细胞，多形核白细胞达峰时间，SH组比CH组滞后，峰值降低，组间比较有明显差异（p<0.05）。2、梗死体积百分比有明显差异（p<0.05）。3、脑组织水分百分比有明显差异（p<0.05）。结论：1、脑部亚低温预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤起到脑保护作用，2、脑部亚低温预处理能增强脑缺血再灌注后低温治疗的作用。
王海莲[10]（2010）在《七氟烷预处理对大鼠缺血性脑损伤保护作用及其机制研究》文中研究说明围术期缺血性脑损伤会产生术后神经功能的不可逆性损害,造成患者极大的痛苦及个人、家庭和社会的沉重经济负担,因此这是临床麻醉与复苏所关注的热点问题之一对围术期脑缺血高危患者（如脑外伤、颅内动脉瘤或接受心脏、大血管手术的患者等）应用包括吸入麻醉剂在内的药物进行干预,以达到减轻脑损伤、改善患者预后的神经保护效果,从而减轻个人与社会的疾病负担。近来的研究表明,吸入麻醉剂对脑的缺血再灌注损伤具有保护作用,目前对其机制的探索多集中于吸入麻醉剂对脑血流、脑代谢、兴奋性毒性、腺苷A1受体及某些离子通道的影响,而较少关注其对炎症因子及其上游信号转导通路、凋亡信号通路中关键分子的影响。目的：在成年雄性Sprague-Dawley大鼠制备的缺血性脑损伤动物模型上,研究七氟烷预处理对大鼠缺血性脑损伤的保护作用并探讨其可能的分子机制。方法：动物随机分为假手术Sham组、对照Vehicle组及0.5MAC和1MAC七氟烷预处理组,术前每天给予空气或不同浓度（0.5MAC和1MAC,载气为空气）七氟烷预处理30min,连续4d,在最后一次干预后24h进行MCAO,并观察再灌注72h的脑梗塞体积以及术后不同时程的神经功能评分；再灌注后0、3、6及24h取脑、提取蛋白进行western检测,再灌注后24h取脑并提取总RNA进行RT-PCR或制备冰冻切片进行免疫荧光检测。结果：缺血组脑梗塞体积较假手术组显着增高,而0.5MAC和1MAC七氟烷预处理组较Vehicle组的脑梗塞体积明显降低,但前两者之间无显着差异,神经功能评分也显示同样结果；七氟烷预处理降低了大鼠缺血性脑损伤后升高的炎症因子COX-2、iNOS、TNFα、IL-1α、IL-1β、IL-6的mRNA水平及COX-2. iNOS的蛋白水平,并且抑制了这些炎症因子上游信号分子NF-KB/p65、p38 MAPK的活化；七氟烷预处理抑制了大鼠缺血性脑损伤后小胶质细胞的活化；七氟烷预处理降低了大鼠侧脑室注射脂多糖后升高的炎症因子iNOS及其上游转录因子NF-κB/p65的水平；七氟烷预处理抑制了大鼠缺血性脑损伤后促凋亡因子caspase3及AIF的激活并使抗凋亡蛋白Bcl-2的水平增高。结论：我们的研究阐明了七氟烷预处理所诱导的延迟预处理效应对大鼠缺血性脑损伤具有明显保护作用,并且这种保护作用在大脑中动脉供血区域都较为明显；这种保护作用至少部分是由于七氟烷对炎症的抑制作用,使NF-κB入核减少,降低其转录调控的炎症因子——COX-2, iNOS, TNFa, IL-1α, IL-1β, IL-6;同时,七氟烷预处理具有抗凋亡作用,抑制促凋亡因子caspase3、AIF的激活,升高抗凋亡因子Bcl-2的水平。
二、亚低温减少大鼠短暂性全脑缺血后皮质iNOS诱导的神经元凋亡（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、亚低温减少大鼠短暂性全脑缺血后皮质iNOS诱导的神经元凋亡（论文提纲范文）
（1）牛黄及其有效成分对神经血管单元的保护作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 上篇文献综述 |
| 综述一 缺血性中风背景下的神经血管单元 |
| 1. 缺血性中风的研究现状 |
| 2. 神经血管单元的组成 |
| 3. 在正常和低氧条件下的生理学 |
| 4. 缺血性脑卒中的实验模型 |
| 5. 基于神经血管单元的治疗策略 |
| 6. 参考文献 |
| 综述二 中药抗缺血性脑卒中的研究进展 |
| 一. 植物药 |
| 1.1 人参 |
| 1.2 栀子 |
| 1.3 姜黄 |
| 1.4 丹参 |
| 1.5 黄芪 |
| 1.6 川芎 |
| 1.7 地黄 |
| 1.8 黄连 |
| 二. 动物药 |
| 2.1 牛黄 |
| 2.2 麝香 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 下篇 实验研究 |
| 实验一 “神经血管单元”体外模型的建立以及缺氧/复氧模型的建立 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 实验二 牛黄及其有效成分对单独培养的神经元、星形胶质细胞、内皮细胞的细胞毒性 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 牛黄及其有效成分对脑神经血管单元的保护作用 |
| 1. 实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验四 不同配伍组分对脑神经血管单元的保护作用 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 试验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验五 牛磺酸和熊去氧胆酸对神经血管单元的作用机制 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 试验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验六 牛磺酸和牛磺熊去氧胆酸对脑神经血管单元的作用机制 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 试验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）PI3K/Akt通道在七氟烷后处理脑缺血糖尿病大鼠神经保护作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表文章 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| English Paper One |
| English Paper Two |
（3）围手术期大鼠脑缺血再灌注损伤保护机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 MH和NBP联合作用对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 右美托咪定后处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述：脑缺血再灌注损伤 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
（4）瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠神经保护作用和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 瑶医源流及诊治法简述 |
| 1.1.1 瑶医药的形成和起源背景 |
| 1.1.2 瑶医药总体的特点 |
| 1.1.3 瑶医药的理论体系 |
| 1.1.4 瑶医诊治法简述 |
| 1.1.5 瑶医诊疗特色 |
| 1.1.6 瑶医药发展现状及存在问题 |
| 1.1.7 应对措施和建议 |
| 1.1.8 总结和展望 |
| 1.2 瑶医神火灸介绍及其临床应用 |
| 1.2.1 瑶医神火灸简介及作用原理 |
| 1.2.2 瑶医神火灸的作用及主治 |
| 1.2.3 神火灸的制备方法 |
| 1.2.4 瑶医神火灸药枝常用药物及功效[27] |
| 1.2.5 操作方法 |
| 1.2.6 神火灸与其他灸法的异同之处 |
| 1.2.7 临床应用举偶 |
| 1.2.8 瑶医神火灸治疗脑卒中及其并发症 |
| 1.2.9 总结 |
| 第二章 实验部分 |
| 实验一 瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠脑保护作用的研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 实验二 瑶医神火灸对脑缺血再灌注大鼠氧化应激、炎症因子及细胞凋亡的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 实验三 瑶医神火灸介导NF-κB通路对缺血再灌注大鼠保护作用的机制研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）预适应联合后适应增强小鼠脑缺血再灌注损伤保护机制的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 自主跑轮预适应联合后适应对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用 |
| 1. 实验动物及分组 |
| 2. 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 自主跑轮预适应联合后适应增强小鼠脑缺血再灌注损伤保护作用机制的研究 |
| 1. 实验动物及分组 |
| 2. 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 PI3K、STAT3信号通路介导了自主跑轮预适应联合后适应对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用 |
| 1. 实验动物及分组 |
| 2. 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 脑部缺血预适应的诱发因素、机制及应用前景 |
| 参考文献 |
| 综述二 运动与学习和记忆能力关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（6）基于PET分子影像的普鲁士蓝纳米酶治疗脑缺血的基础研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩写词表 |
| 第一部分 HPBZs合成、表征以及性能检测 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 HPBZs的合成 |
| 3.2 HPBZs的合成机制 |
| 3.3 HPBZs的表征 |
| 3.4 HPBZs多酶样活性和清除RONS性能 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 HPBZs发挥细胞保护作用的体外细胞实验研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 HPBZs细胞毒性检测 |
| 3.2 HPBZs保护体外氧化应激损伤细胞效应 |
| 3.3 HPBZs体外保护缺氧受损神经元效应 |
| 3.4 HPBZs体外抗细胞凋亡效应 |
| 3.5 HPBZs体外抗炎症效应 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 HPBZs发挥神经保护作用的动物实验研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 HPBZs在体神经保护作用 |
| 3.2 HPBZs体内抗细胞凋亡效应 |
| 3.3 HPBZs体内抗炎效应 |
| 3.4 HPBZs治疗时间窗 |
| 3.5 HPBZs体内生物安全性初步研究 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 总结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（7）血管紧张素-（1-7）在高血压及脑缺血损伤中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 血管紧张素-(1-7)在自发高血压大鼠脑损伤中的作用及机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 血管紧张素-(1-7)对大鼠脑缺血损伤后炎症反应的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 缺血后适应对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用及可能的机制 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（8）JAKs激酶在电针抗缺血性脑损伤中作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 中医学对中风的认识 |
| 1.1 中风病名溯源 |
| 1.2 中风的中医病因病机 |
| 1.3 针灸治疗中风选穴规律的古代文献研究 |
| 2 现代医学对缺血性中风的认识 |
| 2.1 缺血性中风的流行病学研究 |
| 2.2 缺血性中风脑损伤的病理生理学机制 |
| 3 针灸治疗缺血性中风的研究进展 |
| 3.1 针灸治疗缺血性中风的作用机理研究 |
| 3.2 针灸治疗缺血性中风的临床研究 |
| 4 JAKS家族酪氨酸激酶与JAK-STAT信号转导途径的研究进展 |
| 4.1 JAKS家族酪氨酸激酶与JAK-STAT信号转导系统概况 |
| 4.2 JAKS家族酪氨酸激酶在中枢神经系统的表达及其作用 |
| 4.3 JAKS家族酪氨酸激酶及JAK-STAT信号转导通路在缺血性脑损伤中的作用 |
| 4.4 信号转导阻滞剂AG490对脑缺血后JAK-STAT信号转导通路的影响 |
| 4.5 针刺对脑缺血后JAK-STAT信号转导通路的影响 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一电针对不同时段局灶性脑缺血模型大鼠神经运动功能及病理形态学的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验二电针对不同时段局灶性脑缺血模型大鼠缺血灶周围区神经元凋亡的影响. |
| 1 材料和方法 |
| 2 TUNEL细胞凋亡检测结果 |
| 3 讨论 |
| 实验三 电针对不同时段局灶性脑缺血模型大鼠缺血灶周围区P-JAK1的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验四 电针对不同时段局灶性脑缺血模型大鼠缺血灶周围区P-JAK2的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验五 JAKS下游因子STATS在局灶性脑缺血模型大鼠缺血灶周围区的表达及电针干预作用 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验六 脑缺血后JAK/STAT信号转导通路与神经细胞凋亡相关性分析 |
| 1 方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 小结 |
| 1 文献研究 |
| 1.1 中风病的中医学认识 |
| 1.2 缺血性中风的现代研究及针灸作用机理 |
| 1.3 JAKS激酶及JAK-STAT信号转导通路与脑缺血发病机制的研究 |
| 2 实验研究 |
| 2.1 研究设计思路 |
| 2.2 关于动物及动物模型的选择 |
| 2.3 电针参数的选择 |
| 2.4 选取督脉之“百会”、“大椎”治疗中风的理论依据 |
| 2.5 研究内容、方法和结果 |
| 2.6 结论 |
| 3 本研究创新之处 |
| 4 不足及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 博士在读期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（9）脑部亚低温预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附图 |
| 附录 |
| 附录 A 英中文术语缩略语对照表 |
| 附录 B 综述 |
| 参考文献 |
| 附录C 个人简介 |
（10）七氟烷预处理对大鼠缺血性脑损伤保护作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 1 中文摘要 |
| 2 英文摘要 |
| 3 前言 |
| 4 材料和方法 |
| 5 结果分析 |
| 5.1 大鼠局灶性脑缺血时程对脑损伤程度的影响 |
| 5.2 七氟烷预处理对大鼠缺血性脑损伤具有明显保护作用 |
| 5.3 生理指标及脑血流监测 |
| 5.4 七氟烷预处理对大鼠缺血性脑损伤保护作用机制研究 |
| 6 总结 |
| 7 讨论 |
| 8 参考文献 |
| 9 致谢 |
| 10 综述 |
| 参考文献 |
| 11 附录 |
四、亚低温减少大鼠短暂性全脑缺血后皮质iNOS诱导的神经元凋亡（论文参考文献）
- [1]牛黄及其有效成分对神经血管单元的保护作用研究[D]. 杜欣. 北京中医药大学, 2021(02)
- [2]PI3K/Akt通道在七氟烷后处理脑缺血糖尿病大鼠神经保护作用的研究[D]. 张华朋. 山东大学, 2020(10)
- [3]围手术期大鼠脑缺血再灌注损伤保护机制的研究[D]. 谢坤. 山东大学, 2019(02)
- [4]瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠神经保护作用和机制研究[D]. 周哲屹. 广州中医药大学, 2019(08)
- [5]预适应联合后适应增强小鼠脑缺血再灌注损伤保护机制的研究[D]. 叶宏. 昆明医科大学, 2019(05)
- [6]基于PET分子影像的普鲁士蓝纳米酶治疗脑缺血的基础研究[D]. 张凯. 浙江大学, 2019(03)
- [7]血管紧张素-（1-7）在高血压及脑缺血损伤中的作用及机制研究[D]. 高丽. 南京医科大学, 2013(10)
- [8]JAKs激酶在电针抗缺血性脑损伤中作用的研究[D]. 刘荣. 广州中医药大学, 2012(09)
- [9]脑部亚低温预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用的研究[D]. 王恒. 蚌埠医学院, 2011(03)
- [10]七氟烷预处理对大鼠缺血性脑损伤保护作用及其机制研究[D]. 王海莲. 复旦大学, 2010(01)