E1B缺陷型腺病毒dl1520联合化疗药物DDP对鼻咽癌细胞体外杀伤及诱导凋亡的影响

E1B缺陷型腺病毒dl1520联合化疗药物DDP对鼻咽癌细胞体外杀伤及诱导凋亡的影响

一、E1B缺陷腺病毒dl1520联合化疗药物DDP体外对鼻咽癌细胞杀伤及诱导凋亡作用(论文文献综述)

李敏[1](2021)在《双特异性溶瘤腺病毒Ad-VT对荧光素酶标记人黑素瘤的抑制作用及机制研究》文中指出

崔英丽[2](2021)在《双特异性溶瘤腺病毒Ad-VT对卵巢癌抑制作用研究》文中研究说明癌症是人类死亡的主要原因之一。2020年全球癌症确诊患者1930万例,1000万人因癌症死亡。其中卵巢癌发病率和死亡率均居女性癌症发病率和死亡率的第八位。卵巢位于盆腔深部,早期病变不易被发现,一经发现,多为晚期,目前针对卵巢癌的治疗以手术与化疗相结合的方式为主,但化疗副作用大,易产生耐药。因此,仍然需要继续寻找更有效地治疗手段。当前随着分子生物学、细胞生物学和病毒学的快速进步和不断发展,基因治疗已经逐渐发展成为一种新型治疗卵巢癌的治疗手段,其中新型溶瘤腺病毒已充分显示表现出了一种不可替代治疗优势,发挥了病毒治疗和基因治疗的双重重要作用及其功能,有望尽快使其发展成为一种治疗卵巢癌的有效治疗手段。Apoptin是一种源自于鸡贫血病毒(CAV)的凋亡诱导蛋白,在正常细胞中没有细胞毒性,而在肿瘤细胞中能够特异性诱导肿瘤细胞发生凋亡。人端粒酶逆转录酶(h TERT)的长度和生存能力与细胞衰老和永生化有关。由于端粒酶逆转录酶(h TERT)基因的限速和催化成分的紧密转录抑制作用,大多数正常人体细胞缺乏端粒酶活性。然而,在高达90%的人类恶性肿瘤中观察到h TERT表达和端粒酶激活,使其具有无限的增殖能力。本课题组前期已构建了含有凋亡素(apoptin)蛋白和h TERTp启动子的人五型腺病毒Ad-Apoptin-h TERTp-E1a(Ad-VT),该病毒具有只在肿瘤细胞中复制并特异性杀伤多种肿瘤细胞的能力。本研究利用本课题组自行构建的双特异性溶瘤腺病毒Ad-VT以及其对照病毒Ad-T、Ad-VP3和Ad-MOCK进行了对人卵巢癌A2780和SKOV3细胞的体内外抑制作用研究。研究目的:通过体内外多种实验分析Ad-VT对人卵巢癌A2780和SKOV3细胞的抑制作用。研究方法:1.利用pGL4.51转染卵巢癌A2780和SKOV3细胞,并用G418加压筛选稳定表达荧光素酶基因的人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞,并进行生物学特性分析检测。2.通过结晶紫染色和WST-1检测等方法分析Ad-VT对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞的杀伤作用。3.通过Hoechst染色、Annexin V流式分析、caspase酶活性检测、活性氧检测以及JC-1染色等方法分析Ad-VT杀伤人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞的主要方式。4.通过细胞划痕、Transwell小室侵袭等方法分析Ad-VT对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞迁移和侵袭能力的影响。5.用人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞分别建立裸鼠荷瘤模型,并每周观测肿瘤发光强度、肿瘤大小以及小鼠生存情况来分析Ad-VT在体内对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞的抑制作用。研究结果:1.构建成功了表达荧光素酶基因的人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞,并筛选出稳定表达的细胞系,且所构建的细胞与原始细胞没有明显的生物学差异。2.通过结晶紫染色和WST-1实验,显示了Ad-VT对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞具有杀伤作用,且杀伤作用具有剂量效应和时间效应关系。3.通过Hochest染色、Annexin V流式分析、caspase酶活性检测、活性氧检测以及JC-1染色等方法表明,Ad-VT主要通过内源性凋亡途径杀伤人卵巢癌A2780-LUC和人卵巢癌SKOV3-LUC细胞。4.细胞划痕实验、Transwell小室侵袭实验等方法表明,Ad-VT对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞的迁移和侵袭具有明显的抑制作用。5.通过构建表达荧光素酶的人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞的裸鼠肿瘤模型,Ad-VT也可以在体内显着抑制人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC,并延长裸鼠生存期。研究结论:本研究成功构建了人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞,并通过多种体内外实验证实了Ad-VT对人卵巢癌A2780-LUC和SKOV3-LUC细胞具有显着的细胞杀伤作用,表明,Ad-VT具有成为卵巢癌治疗药物的潜力。

王京[3](2020)在《乳腺癌可视化模型的建立及双特异性重组腺病毒与紫杉醇协同抑制作用的研究》文中进行了进一步梳理目前,临床上使用的抗癌药物包含许多种,其中治疗乳腺癌的化疗药物主要有紫杉醇和环磷酰胺等。在临床治疗中,化疗药物的应用获得了较好的疗效,但化疗药物同时也是一把双刃剑,同时也给病人带来较大副作用,例如引起了人体的免疫系统、消化道、造血系统、皮肤和粘膜、神经系统、肝功能、心脏、肺毒性、肾功能及其他等伤害,有时还可出现并发症,常见的有感染、出血、穿孔、尿酸结晶等。如何能够在维持甚至提高患者疗效的同时,降低给患者带来的一系列副作用,一直在困扰着临床医生。虽然,已经有乳腺超声、钼靶、核磁等方法被应用于乳腺癌临床中。但是,依然不能满足临床的需求。人们还是应用注射亚甲蓝染料、纳米碳、核素等追踪前哨淋巴结方法去开展一些研究与探讨。萤火虫荧光素酶标记癌细胞在体内成像的方法,可构建稳定表达荧光素酶的细胞系和可视化动物模型。与其它方法相比,此种方法生物学特性稳定,毒性较小,克服了检测时高强的背景噪音,其波长的优势使所发出的光更容易透过组织,萤光信号强,可在短时间内表现出更强的应答等优点。但是,还需要探讨该方法在增加灵敏度的同时,是否会干扰药物抗癌作用等问题进行更深入的研究。作为肿瘤基因治疗,溶瘤病毒疗法已成为治疗癌症的重要手段之一。本课题组在先前的研究中构建了双重特异性抗肿瘤重组腺病毒,将其命名为Ad-apoptin-hTERTp-E1a(Ad-VT)。即,在原有腺病毒中插入肿瘤特异性启动子(hTERTp,人端粒酶逆转录酶)和特异性抑癌基因(apoptin),由肿瘤特异性启动子(hTERTp,人端粒酶逆转录酶)启动E1A基因(病毒复制必需基因)、巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)启动子启动凋亡素基因(Apoptin),因此,Ad-VT是一种具有同时在肿瘤细胞中特异性复制和特异性抑制的对正常细胞毒副作用小的溶瘤腺病毒。现如今乳腺癌患者患病率位居女性癌症首位,而且临床综合治疗给女性患者的身心带来很大伤害。各种有效的副作用小的治疗方法不断出现,将给癌症治疗带来曙光。因此,本研究旨在探讨乳腺癌可视化模型构建及重组腺病毒Ad-apoptin-hTERTp-E1a(Ad-VT)与紫杉醇(PTX)联合应用对乳腺癌协同抑制作用,力争为乳腺癌患者带来新的获益。新的治疗方法也有望成为临床中尚未解决难题的希望。方法:1、用pGL4.51质粒转染MDA-MB-231细胞,以构建稳定表达荧光素酶(MDA-MB-231-LUC)的肿瘤细胞,使Ad-VT与紫杉醇(PTX)联合治疗乳腺癌可视化。2、使用Calcusyn软件分析Ad-VT与紫杉醇(PTX)的协同作用,并确定最终的药物浓度。3、结晶紫染色和WST-1实验用于分析Ad-VT和紫杉醇联合对MCF-7,MDA-MB-231和MCF-10A细胞的抑制作用。4、使用Hoechst,Annexin V,JC-1染色和ROS检测,分析Ad-VT和紫杉醇联合诱导的MCF-7和MDA-MB-231细胞凋亡。5、使用caspase酶活性检测和caspase3、PARP以及细胞色素c蛋白水平检测,分析Ad-VT和紫杉醇联合诱导的MCF-7和MDA-MB-231细胞凋亡。6、使用划痕、Transwell迁移和侵袭实验分析检测了Ad-VT和紫杉醇联合后对MCF-7和MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭的抑制作用。7、使用MMP2、MMP9、E-cadherin、Vimentin和Snail蛋白水平检测,分析了Ad-VT和紫杉醇联合后对MCF-7和MDA-MB-231细胞转移的抑制作用。8、通过建立荷瘤裸鼠模型和转移瘤模型来证实Ad-VT和紫杉醇的组合对体内肿瘤的抑制作用。结果:1、不同毒价Ad-VT与不同浓度化疗药物交叉联合,在WST-1实验中所得到的抑制率结果数据引入calcusyn软件,可以得出结论:部分范围数据的CI指数小于1。2、结晶紫染色结果提示Ad-VT可以在MCF-7和MDA-MB-231细胞中引起明显的细胞毒性,但对MCF-10A细胞基本无毒。紫杉醇对MCF-10A细胞具有一定的细胞毒性作用,当Ad-VT和紫杉醇联合使用时,在提高对乳腺癌细胞杀伤作用的同时会降低对正常细胞的毒性。在WST-1实验结果中,我们还发现Ad-VT对两种乳腺癌细胞都有明显的抑制作用,抑制率可以达到40%左右,并且对正常的乳腺上皮细胞没有毒性作用,而紫杉醇具有明显的细胞毒性。在正常的乳腺上皮细胞上(P<0.01)。当Ad-VT和紫杉醇联合使用时,对正常细胞的杀伤显着低于对癌细胞的杀伤作用(P<0.05),并且联合治疗后对乳腺癌细胞的抑制作用也明显高于单独使用Ad-VT或紫杉醇的抑制作用(P<0.05),联合时抑制率高于65%。3、在Hoechst染色结果中,Ad-VT和紫杉醇联合使用后,细胞凋亡比例明显高于Ad-VT组和紫杉醇组;在Annexin V结果中,我们还发现Ad-VT和紫杉醇联合使用后,两种类型的乳腺癌细胞的凋亡水平显着增加,达到约75%(p<0.05)。通过JC-1染色发现,Ad-VT联合紫杉醇组对两种乳腺癌细胞的线粒体膜电位变化更为显着。在红绿荧光比值结果中,我们还发现,Ad-VT组的线粒体膜电位明显低于对照组和紫杉醇治疗组(p<0.01),合并后这种现象更为明显。ROS检测结果表明,Ad-VT在乳腺癌细胞中会使活性氧水平升高,与紫杉醇联合使用后效果更加显着。4、Caspase活性检测和凋亡相关蛋白检测中发现,Ad-VT会使凋亡蛋白水平显着提升,与紫杉醇联合使用后这种现象更为明显。5、在划痕和Transwell迁移试验中,发现Ad-VT,紫杉醇和联合疗法可以抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞的迁移能力。Ad-VT的疗效显着高于紫杉醇,联合治疗后的疗效显着高于Ad-VT组和紫杉醇组(p<0.01)。在侵袭检测中也观察到了相似的结果。6、MMP2、MMP9、E-cadherin、Vimentin和Snail蛋白水平检测后发现,Ad-VT和Ad-VT与紫杉醇联合使用后均能使MMP2、MMP9、Vimentin和Snail蛋白水平降低,并提高E-cadherin蛋白水平。7、使用活体成像系统观察肿瘤的生物发光强度变化,并连续观察6周。在4-6周时,1×109 PFU/100μl Ad-VT+20 mg/kg紫杉醇治疗组和1×109 PFU/100μl Ad-VT+10 mg/kg紫杉醇治疗组的平均生物发光强度为显着低于对照组(P<0.05)。Ad-VT联合紫杉醇的抑制作用明显高于单独的病毒或药物。在小鼠存活率结果显示,联合后,小鼠的存活率显着延长,平均存活时间为1×109PFU/100μl Ad-VT+20mg/kg紫杉醇治疗组和1×109 PFU/100μl Ad-VT+10mg/kg紫杉醇治疗组,分别为40.2d和39.6d。42天时,两只治疗组小鼠的存活率分别为80%和70%。8、使用活体成像系统观察转移瘤模型后发现,除了1×109 PFU/100μl Ad-VT+20 mg/kg紫杉醇治疗组和1×109 PFU/100μl Ad-VT+10 mg/kg紫杉醇治疗组以外,在其余治疗组和对照组的肺部中可以明显的看出肿瘤转移的现象。结论:1.成功构建了表达荧光素酶的人乳腺癌细胞MDA-MB-231-LUC,使双特异性重组溶瘤腺病毒Ad-VT与紫杉醇联合在乳腺癌裸鼠体内治疗中疗效可视化。2.使用Calcusyn软件分析Ad-VT与紫杉醇(PTX)联合应用具有协同作用,并确定最终的药物浓度为50 MOI Ad-VT+4 nmol紫杉醇。对正常乳腺上皮细胞的毒副作用较小。3.Ad-VT和紫杉醇联合应用可以显着增加对乳腺癌细胞迁移和侵袭的抑制。通过线粒体途径诱导MCF-7和MDA-MB-231细胞凋亡。4.Ad-VT和紫杉醇联合应用可抑制体内肿瘤生长和转移。而应用荧光素酶标记人乳腺癌细胞MDA-MB-231-LUC在体内抑制实验中,未见明显的毒副作用。综上所述,重组腺病毒Ad-VT具有特异性复制和特异性抑癌的特性,可以抑制乳腺癌细胞的生长并促进其凋亡。同时,与紫杉醇联合使用具有协同作用,并起到减毒增效的作用。并且对三阴性乳腺癌细胞的杀伤与激素依赖型乳腺癌细胞抑制作用基本一致。这将为乳腺癌患者在增高疗效的同时减少毒副作用,为乳腺癌的综合治疗提供了新的线索。

王子璇[4](2020)在《TRAIL修饰溶瘤腺病毒靶向治疗急性髓系白血病的研究》文中认为急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是一种异质性的血液系统恶性肿瘤,对人类的健康构成了严重的威胁。目前,AML的临床治疗仍旧是以放化疗、骨髓移植为主。尽管治疗手段在逐渐进步,但AML患者的整体存活率仍旧很低。对于一线化疗药物产生耐药反应是导致治疗失败的最主要原因,因此继续寻求新的治疗方式是当前AML治疗的首要任务。随着生命科学和医学研究的深入发展,溶瘤病毒(Oncolytic virus)成为目前治疗恶性肿瘤的一个重要发展方向。然而,由于靶向性较弱和感染效率不足,利用溶瘤病毒治疗白血病等血液系统恶性肿瘤目前仍然受到限制。溶瘤腺病毒是恶性肿瘤溶瘤病毒疗法研究中应用最为广泛的病毒类型之一。然而,受给药方式(目前主要通过瘤内给药)的限制,溶瘤腺病毒治疗血液恶性肿瘤的研究较少。在课题组的前期研究中,我们利用亮氨酸拉链异二聚体系统,通过对腺病毒衣壳蛋白进行结构改造修饰,成功构建了一种靶向型溶瘤腺病毒载体(rAd5pz-zTRAIL-RFP-SΔ24E1a,A4)。该载体可以通过静脉给药对乳腺癌小鼠模型产生较好的治疗效果。因此,本论文希望通过对载体进行优化,进一步考察其应用于AML治疗的潜力。溶瘤腺病毒A4可以表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL),且能够利用亮氨酸拉链(zipper)连接于病毒表面,从而靶向肿瘤细胞并增强肿瘤杀伤能力。因此,论文首先检测了AML细胞系和原代细胞表面腺病毒受体和TRAIL受体的表达水平。结果显示:在永生型AML细胞系THP-1和MV4-11均表达较高水平的死亡受体DR4、DR5,但假死亡受体(DcR1和DcR2)表达水平较低,并且两株细胞均表达较低水平的腺病毒受体(CAR,整合素αvβ3和整合素αvβ5)。而在所检测的19例AML患者来源的原代细胞中,有50%以上的样本表达中等水平的DR4、DR5。这一结果对经过我们改造的重组溶瘤腺病毒载体的应用奠定了基础。前期研究发现,尽管A4病毒的衣壳表面通过zipper修饰有TRAIL,但病毒衣壳修饰的TRAIL量小于理论值。所以,为了进一步提升A4的肿瘤靶向能力,我们首先构建了C端融合亮氨酸拉链zipper E·E34单链的截短型TRAIL的融合蛋白z-sTRAIL的原核表达质粒pET-28a-z-sTRAIL,并在大肠杆菌内成功表达并纯化出z-sTRAIL蛋白。在验证了z-sTRAIL的基本生物学活性后,将z-sTRAIL蛋白与腺病毒衣壳pIX修饰有zipper R·R34单链的病毒进行体外共孵育,经过CsCl密度梯度离心的方法对其进行纯化。通过对其进行dot blot和ELISA检测后证实,经过体外优化可以得到比A4病毒衣壳TRAIL修饰量多出一倍的重组溶瘤腺病毒载体,优化后的载体命名为zA4。通过对THP-1和MV4-11细胞进行感染分析,我们发现zA4对AML细胞的感染能力明显优于A4和衣壳未经修饰的A3病毒。并且通过THP-1与病毒的结合与内在化实验进一步证明了病毒载体表面修饰的TRAIL蛋白越多,越有利于增强病毒载体对THP-1细胞的结合能力。随后通过体外的抑瘤效果评价我们可以发现,以不同MOI病毒(A3、A4和zA4)分别感染THP-1和MV4-11细胞,三种溶瘤腺病毒均可以诱导剂量依赖的AML细胞毒性。并且对人正常淋巴T细胞H9无明显杀伤。并且以相同方法对19例AML患者的原代细胞样本进行相同的细胞毒性分析,结果表明三种溶瘤腺病毒均可以对原代AML细胞造成明显杀伤,并且杀伤能力随着病毒衣壳TRAIL蛋白修饰量的增加而增强。之后,使用THP-1细胞在Balb/c裸鼠中进行了体内抑瘤效果评价。我们成功建立了皮下荷瘤模型和静脉荷瘤模型两种AML模型。在两种模型中,三种病毒均有较明显的肿瘤靶向效果和抑制肿瘤效果,并且zA4显示出最佳的肿瘤靶向能力和效果最明显肿瘤细胞杀伤能力。由于发现溶瘤病毒在部分TRAIL受体表达较低的原代AML细胞中活性并不理想,因此为了进一步提升重组溶瘤腺病毒zA4在TRAIL死亡受体相对低表达的肿瘤细胞系中的杀伤能力,我们针对TRAIL活性进行了化药筛选。研究结果表明,人参皂苷Rh2能够提升肿瘤细胞的死亡受体表达,从而增强TRAIL引起的细胞凋亡活性。并且发现在同时应用低剂量的Rh2与低剂量的sTRAIL联合后,可以降低sTRAIL的半数抑制浓度IC50,二者之间存在着较强的协同作用。之后我们分别使用永生化AML细胞系THP-1与原代AML细胞分别进行了Rh2联合zA4的体外抑瘤效果评价,发现Rh2在这两类AML细胞中均能够显着增强zA4的肿瘤杀伤能力。最后,我们利用静脉荷瘤模型对这种联合疗法进行了体内评价验证。实验结果表明,这种联合治疗的方式可以有效地抑制肿瘤细胞的增殖及肝浸润现象,并且有效地延长了小鼠的生存期。综上所述,在本论文的研究中,我们通过对前期获得的靶向型溶瘤腺病毒进行优化,获得了具有更多TRAIL蛋白修饰的溶瘤腺病毒载体zA4。然后利用AML细胞系和原代AML细胞在体外细胞水平验证了zA4具有较好的抗肿瘤活性,并在裸鼠荷瘤模型中通过静脉注射的方式进行治疗性评价,证实优化后的zA4具有更强的肿瘤靶向能力及更强的抑瘤效果。此外,Rh2与zA4的联合应用增强了zA4对原代AML细胞和移植型AML裸鼠模型的靶向治疗效果。本研究提供了将溶瘤腺病毒载体应用于治疗包括AML在内的血液系统恶性肿瘤中的可行性。

胡箫[5](2020)在《溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒对小鼠结肠癌模型免疫状态及肿瘤微环境影响的研究》文中研究表明背景作为肿瘤生物治疗的前沿领域,近年来,溶瘤病毒疗法显示出了巨大的应用潜力,并为肿瘤的免疫治疗提供了新的方向。溶瘤病毒疗法可通过直接于瘤内注射溶瘤病毒来触发局部和全身的免疫反应,以达到溶解肿瘤细胞,然后释放肿瘤相关抗原,随后激活肿瘤特异性效应T细胞的目的。多种溶瘤病毒在临床前和临床试验中显示出了良好的安全性、靶向性以及令人兴奋的治疗效果。一种基于Ⅰ型单纯疱疹病毒的溶瘤病毒talimogene laherparepvec(T-VEC)已经完成了Ⅲ期临床试验,并已获得美国食品和药物管理局(FDA)的批准上市,用于治疗初次手术后复发的不可切除的黑色素瘤。了解溶瘤病毒治疗肿瘤所引起的机体免疫系统的改变及其对肿瘤微环境的影响,有利于为今后更好地应用溶瘤病毒进行免疫治疗提供有利依据。因此,本研究中我们应用一种基于Ⅱ型单纯疱疹病毒的溶瘤病毒oHSV2,探讨其在免疫完全和免疫缺陷荷瘤小鼠(小鼠结直肠癌CT26细胞系)模型中的直接溶瘤作用及其引起的抗肿瘤免疫应答。目的本研究的主要目的是明确oHSV2在荷瘤小鼠(小鼠结直肠癌CT26细胞系)模型中的直接溶瘤作用及其引起的抗肿瘤免疫应答。通过建立免疫完全和免疫缺陷小鼠双侧荷瘤模型,检测脾脏中淋巴细胞的表型和对肿瘤细胞的杀伤作用,以及分析双侧肿瘤微环境中的病理学特征和免疫基因的表达情况,为溶瘤病毒oHSV2激发机体特异性抗肿瘤免疫应答,改变肿瘤微环境的免疫状态提供依据。方法(1)应用CCK-8增殖实验检测oHSV2对小鼠结肠癌CT26细胞系的体外溶瘤活性。(2)通过皮下接种方式建立BALB/c小鼠单侧和双侧荷瘤(小鼠结直肠癌CT26细胞系)模型,探讨oHSV2的体内治疗作用及其引起的抗肿瘤免疫应答。(3)采用二次打击和免疫学杀伤实验,探讨oHSV2引起的特异性免疫应答。(4)通过皮下接种方式建立免疫缺陷小鼠双侧荷瘤(小鼠结直肠癌CT26细胞系)模型,探讨先天性免疫应答在oHSV2治疗肿瘤过程中发挥的作用。(5)应用流式细胞术检测各治疗组小鼠脾脏淋巴细胞的表型状态,同时分析双侧肿瘤病理学特征及免疫相关基因表达谱特征,探讨oHSV2治疗后机体整体免疫状态和局部肿瘤微环境的变化情况。结果(1)溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒oHSV2对小鼠结肠癌CT26细胞系具有显着的溶瘤作用,其效果呈时间和剂量依赖性。(2)在单侧和双侧小鼠结肠癌荷瘤模型上观察oHSV2的体内抗肿瘤作用。oHSV2治疗能有效抑制单侧和双侧肿瘤生长,延长小鼠存活时间,并且无明显副作用。(3)oHSV2治疗能够有效阻止相同肿瘤再次接种后成瘤。对于双侧荷瘤模型,单个病灶内的oHSV2治疗可同时有效抑制双侧肿瘤的生长。(4)NK细胞引起的非特异性免疫反应,即对靶细胞(被病毒感染的肿瘤细胞)的非特异性识别杀伤作用,在oHSV2治疗肿瘤的过程中同样起到了一定的抑制肿瘤生长的作用。(5)oHSV2的应用能够有效降低外周免疫中免疫抑制性细胞(如Tregs和MDSCs)的水平,有利于打破免疫耐受;同时提高了外周免疫中正向免疫细胞(如NK细胞、DCs、CD8+T细胞的)的水平,有利于加强非特异性和特异性抗肿瘤免疫反应;紧随特异性免疫应答后机体形成了免疫记忆,有利于有效防止肿瘤的转移和复发。(6)oHSV2治疗改变了肿瘤微环境的免疫状态。这种作用并非只局限于接受治疗的局部组织,而是同时会对其他部位的同种肿瘤微环境引起相似的改变。结论溶瘤病毒oHSV2发挥的第一重抗肿瘤作用即相对直接的使肿瘤细胞发生裂解而死亡,在第一重作用的基础上,肿瘤相关抗原(TAAs)伴随着肿瘤细胞的裂解而被释放,从而展现oHSV2治疗带来的第二重作用,即引起机体先天性免疫应答和特异性免疫应答。紧随特异性免疫应答后机体形成了免疫记忆,可有效防止肿瘤的转移和复发。溶瘤病毒oHSV2的应用可以重构小鼠脾脏和肿瘤微环境的免疫状态(包括未经病毒直接治疗的肿瘤),提示oHSV2的局部治疗模式可以转变为一种全身性的治疗模式。因此,溶瘤病毒oHSV2具有很好的临床应用潜力。

杨春华[6](2019)在《双调控并荷载SPAG9基因shRNA的溶瘤腺病毒联合多西他赛治疗前列腺癌的实验研究》文中指出第一部分构建双调控并荷载SPAG9基因shRNA的溶瘤腺病毒目的:构建双调控并荷载精子相关抗原9(sperm associated antigen 9,SPAG9)短发卡RNA(Short hairpin RNA,shRNA)的溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9并验证调控SPAG9蛋白表达的效果。方法:1.将包含DD3基因启动子和SPAG9基因shRNA的载体质粒p DD3-ZD55-SPAG9shRNA与骨架质粒p BHGE3(含有腺病毒右臂序列)通过Lipofectamine TM2000共转染至HEK-293细胞内,包装成溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9。2.琼脂糖电泳验证正确后大量扩增病毒,通过Cs Cl密度梯度离心法纯化,半数组织细胞感染剂量(Tissue culture infective dose,TCID50)法测定滴度。3.通过Western Blot检测DD3-ZD55-SPAG9对PC-3和DU145细胞SPAG9基因的沉默效果。结果:1.成功构建溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9,经扩增纯化后,DD3-ZD55-SPAG9的病毒滴度为9.46×10^8 pfu/ml。2.Western Blot结果显示DD3-ZD55-SPAG9可以有效沉默PC-3和DU145细胞内SPAG9蛋白的表达,与对照组相比,差异存在统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9,并可以有效沉默PC-3和DU145细胞内SPAG9基因的表达第二部分溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9联合多西他赛体外治疗去势抵抗性前列腺癌目的:观察溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9联合多西他赛(Docetaxel,DTX)在体外对去势抵抗性前列腺癌的治疗效果。方法:1.结晶紫染色和CCK-8观察各组对前列腺癌PC-3和DU145与正常前列腺细胞WPMY-1细胞的毒性作用和增殖抑制效果。2.划痕实验和Transwell侵袭实验检测各组对PC-3和DU145细胞迁移侵袭能力的抑制。3.Hoechst-33258染色实验检测各组PC-3和DU145细胞的凋亡。4.Western Blot实验检测PC-3和DU145细胞内SPAG9,侵袭和凋亡相关蛋白的表达。结果:1.结晶紫染色结果:各病毒治疗组对PC-3和DU145细胞的细胞毒性呈时间和滴度依赖性,DTX对PC-3和DU145细胞呈浓度和时间依赖性,各组处理48小时后,高浓度的DTX(>4ng/ml),高滴度的ZD55-SPAG9(MOI>20)会对WPMY-1细胞产生毒性作用,而DD3-ZD55-SPAG9在MOI>50时才会对WPMY-1细胞产生毒性作用,提示DD3-ZD55-SPAG9较对照病毒具有更高的安全性。2.CCK-8结果:随病毒和药物作用时间的延长,对前列腺癌细胞的增殖抑制效果均逐渐增强,且随病毒滴度和药物浓度的升高,对细胞的增殖抑制效果也逐渐增强。感染48小时后,联合组对前列腺癌细胞的增殖抑制效果明显高于各单一治疗组。各处理组48小时后WPMY-1细胞增殖较对照组无明显差异。3.划痕实验结果:24小时后,在PC-3和DU145细胞内,各治疗组的划痕愈合面积百分比均低于PBS组,且联合组划痕愈合面积明显低于单一治疗组。4.Transwell实验结果:48小时后,在PC-3和DU145细胞内,各治疗组穿透小室膜的细胞数均低于PBS组,联合组穿透细胞数明显低于单一治疗组。5.Hoechst-33258染色结果:48小时后,各治疗组的细胞凋亡率均高于PBS组,且联合组细胞凋亡率明显高于单一组。6.Western Blot实验结果显示:各治疗组内SPAG9蛋白表达均低于PBS组,侵袭相关蛋白E-cadherin的表达均高于PBS组,Vimentin和MMP-2的表达均低于PBS组,凋亡相关蛋白caspase-3和caspase-8的表达均高于PBS组。联合组内SPAG9,Vimentin,MMP-2的表达量明显低于单治疗组,同时E-cadherin、caspase-3和caspase-8的表达量明显高于单治疗组。结论DD3-ZD55-SPAG9可以在体外有效抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移侵袭能力,并可以有效诱导PC-3和DU145凋亡,效果略低于ZD55-SPAG9,但对WPMY-1细胞具有更高的安全性。对前列腺癌细胞侵袭能力的抑制作用,其机制之一可能是沉默SPAG9基因表达后,通过调控与上皮细胞间质化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)进程相关蛋白,上调E-cadherin,下调Vimentin,MMP-2的表达有关。对前列腺癌细胞凋亡诱导机制可能是通过促进caspase8与caspase3介导的内源性凋亡实现,联合使用多西他赛可起协同作用,增强DD3-ZD55-SPAG9的抗肿瘤效果。第三部分溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9联合多西他赛治疗裸鼠移植瘤目的:观察溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9联合多西他赛对裸鼠移植瘤的治疗效果。方法:1.建立前列腺癌PC-3细胞荷瘤鼠模型。监测不同处理组对移植瘤的生长的影响。苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE)检测各组肿瘤的生长状况。2.原位末端缺口标记法(Td T-mediated d UTP nick end labeling,TUNEL)法检测各组移植瘤细胞的凋亡情况。3.免疫组化和Western Blot检测各组移植瘤细胞中的侵袭相关蛋白E-cadherin、Vimentin和MMP-2的表达情况。结果:1.成功构建裸鼠移植瘤,各治疗组肿瘤生长速度均低于对照组,HE结果显示各治疗组内均存在肿瘤细胞凋亡坏死,联合组更为明显。2.TUNEL结果显示各治疗组内均存在明显的肿瘤细胞凋亡,联合治疗组较单一治疗组凋亡现象更为明显。3.免疫组化和Western Blot结果显示各治疗组内SPAG9、Vimentin和MMP-2蛋白表达降低,E-cadherin蛋白表达增多,联合组对上述蛋白的表达调控更为显着。结论:DD3-ZD55-SPAG9可以有效抑制裸鼠移植瘤的生长,并促进移植瘤细胞凋亡,抑制SPAG9、Vimentin和MMP-2蛋白表达,促进E-cadherin蛋白表达。但效果略低于ZD55-SPAG9。联合使用多西他赛后可以获得较单一治疗更高的移植瘤治疗效果。

毛立军[7](2018)在《荷载SATB1基因shRNA的溶瘤腺病毒治疗前列腺癌》文中认为第一部分荷载SATB1基因sh RNA溶瘤腺病毒对前列腺癌的靶向治疗作用目的:观察荷载SATB1基因sh RNA溶瘤腺病毒(ZD55-SATB1)体内外对前列腺癌的靶向治疗作用。方法:结晶紫染色、CCK8法观察ZD55-SATB1对前列腺癌细胞的毒性作用和增殖抑制效果。RT-PCR评价ZD55-SATB1对前列腺癌细胞SATB1基因的m RNA表达的沉默作用;Western Blot检测ZD55-SATB1对前列腺癌细胞SATB1蛋白及E1A表达的影响;Transwell研究ZD55-SATB1对前列腺癌细胞侵袭的影响;构建荷载前列腺癌DU145细胞的裸鼠皮下移植瘤模型。随机分成4组,每组6只,分别用ZD55-SATB1、ZD55-EGFP、Ad-SATB1、PBS瘤内注射治疗,100μl病毒(5×108 pfu),隔天一次,共三次。每周测量肿瘤体积,绘制肿瘤时间-体积生长曲线。第49天,全部处死裸鼠,免疫组化检测各组SATB1表达水平;TUNEL评价肿瘤组织细胞的凋亡情况。取肝、肺脏组织HE染色观察肿瘤转移情况。结果1.结晶紫染色结果:病毒ZD55-SATB1、ZD55-EGFP、Ad-SATB1对前列腺癌细胞均有杀伤作用,且随着病毒浓度的增大毒性作用逐渐增强,其中ZD55-SATB1的杀伤作用最强;ZD55-SATB1的细胞病变效应(CPE)比ZD55-EGFP、Ad-SATB1显着,而在正常细胞PZ-HPV-7中,在100MOI时ZD55-SATB1才出现CPE,提示ZD55-SATB1介导的细胞毒性具有肿瘤靶向性。2.CCK-8结果:随着病毒感染时间延长,前列腺癌细胞的存活率均逐渐下降。ZD55-SATB1对前列腺癌细胞杀伤作用,强于ZD55-EGFP、Ad-SATB1;感染96h后,ZD55-SATB1组DU145、LNCa P细胞存活率分别为(31.6±3.31%,36.6±3.63%),ZD55-EGFP组为(61.7±2.42%,65.4±2.324%),Ad-SATB1组为(82.4±3.54%,86.4±4.18%),ZD55-SATB1细胞存活率明显降低,与其他两组比较差异有统计学意义(P<0.05),而正常细胞PZ-HPV-7细胞感染病毒后,存活率却未出现明显变化。3.RT-PCR结果:ZD55-SATB1和Ad-SATB1均能特异沉默DU145、LNCa P细胞SATB1基因,分别为(36.5±3.1%、43.1±4.2%)和(51.9±3.2%、64.3±4.1%),与ZD55-EGFP和PBS对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01),表明ZD55-SATB1特异性沉默SATB1基因的表达,且比Ad-SATB1沉默效果进一步提高。4.Western Blot结果显示:ZD55-SATB1和Ad-SATB1组DU145细胞中SATB1蛋白相对表达量分别为PBS组的(40.1±3.7%,61.9±3.4%),LNCa P细胞中两组分别为对照组的(45.9±3.2%,67.1±3.7%),差异有统计学意义(P<0.05),而ZD55-EGFP对SATB1蛋白表达水平基本无影响,证实ZD55-SATB1可以有效地沉默前列腺癌细胞中SATB1基因蛋白的表达。ZD55-SATB1、ZD55-EGFP组E1A蛋白表达水平在前列腺癌细胞DU145和LNCa P中显着高于Ad-SATB1,表明ZD55-SATB1、ZD55-EGFP可在前列腺癌细胞中高效复制。另外,ZD55-SATB1、ZD55-EGFP在人正常前列腺上皮细胞PZ-HPV-7几乎不表达E1A,进一步说明ZD55-SATB1具有肿瘤靶向性。5.Transwell细胞侵袭实验结果:ZD55-SATB1组DU145和LNCa P穿过的细胞数分别为(61.3±17.25和25.4±6.2),明显少于Ad-SATB1组(170.1±25.44和42.7±10.7)及ZD55-EGFP组(295.4±23.36和77.6±15.2),各组比较差异有统计学意义(P<0.05),表明ZD55-SATB1可有效抑制前列腺癌细胞的侵袭。6.移植瘤:ZD55-SATB1组肿瘤平均体积为(295.3±51.9)mm3,比ZD55-EGFP组(525.6±89.3)mm3、Ad-SATB1组(582.3±97.0)mm3和PBS组(777.1±139.8)mm3显着减小,ZD55-SATB1组与各组比较差异有统计学意义(P<0.05),提示ZD55-SATB1对前列腺移植瘤的生长抑制效果比ZD55-EGFP、Ad-SATB1组明显增强。7.肺组织HE染色结果显示:PBS组有8只裸鼠出现肿瘤肺转移,同时ZD55-EGFP组有2只出现转移,而ZD55-SATB1和Ad-SATB1组则没有出现转移,提示ZD55-SATB1可抑制前列腺癌的远处转移。8.TUNEL实验结果:ZD55-SATB1组凋亡阳性细胞率为(87.3±4.8)%,ZD55-EGFP组为(51.2±3.4)%,Ad-SATB1组为(41.3±3.2)%,PBS组为(20.1±1.9)%,ZD55-SATB1组凋亡率显着增高,差异有统计学意义(P<0.05),说明ZD55-SATB1可促进移植瘤细胞的凋亡。结论:成功构建了新型溶瘤腺病毒ZD55-SATB1,通过体外实验证实ZD55-SATB1可以在前列腺癌细胞中特异性增殖,干扰SATB1基因的表达;ZD55-SATB1在体外对前列腺癌细胞具有较好杀伤、增殖抑制作用及抑制前列腺癌细胞侵袭作用;ZD55-SATB1可以有效抑制人前列腺癌裸鼠移植瘤的生长和转移、促进其凋亡,为前列腺癌的生物与基因治疗奠定了基础。第二部分荷载SATB1基因sh RNA溶瘤腺病毒联合内分泌、化疗治疗激素敏感性前列腺癌目的:观察荷载SATB1基因sh RNA溶瘤腺病毒(ZD55-SATB1)联合内分泌、化疗对激素敏感性前列腺癌的治疗作用。方法:1.CCK8法观察对激素敏感性前列腺癌LNCa P细胞的毒性作用和增殖抑制效果。2.Hoechst-33258染色、TUNEL检测前列腺癌LNCa P细胞凋亡情况。3.Migration检测前列腺癌LNCa P细胞的迁移。4.Invasion检测前列腺癌LNCa P细胞的侵袭。5.Western blot检测SATB1及凋亡相关蛋白Bcl-2,caspase-3和caspase-8的表达。6.构建裸鼠前列腺癌LNCa P细胞皮下移植瘤模型,随机分成8组:空白对照组(PBS组)、内分泌治疗组(ET组:手术去势)、药物治疗组(DTX组)、病毒治疗组(ZD55-SATB1组)、内分泌治疗联合化疗组(ET+DTX组)、病毒联合内分泌治疗组(ZD55-SATB1+ET组)、病毒联合化疗组(ZD55-SATB1+DTX组)、病毒联合化疗及内分泌治疗组(ET+DTX+ZD55-SATB1组)。7.测量肿瘤体积,绘制肿瘤时间-体积生长曲线。8.H&E染色观察肿瘤细胞的生长。9.免疫组化检测肿瘤组织中caspase-3、caspase-8、Bcl-2和CD31蛋白的表达。结果:1.CCK-8结果:5.0MOI的病毒ZD55-SATB1联合1ng/ml的DTX、10MOI的ZD55-SATB1、10MOI的ZD55-EGFP、2ng/ml的DTX、100ng/ml的Sitelong和PBS分别作用LNCa P细胞,48h后的存活率分别为(37.61±2.17)%、(65.32±5.06)%、(72.25±3.40)%、(55.94±3.97)%、(89.67±4.62)%、(81.17±2.19)%。ZD55-SATB1联合DTX组分别与单用ZD55-SATB1组、ZD55-EGFP组、DTX组、Sitelong组和PBS组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。ZD55-SATB1联合DTX组与Sitelong组比较,对LNCa P细胞增殖的抑制作用更明显,差异有统计学意义(P<0.05),说明ZD55-SATB1联合DTX及去除十一酸睾酮的联合,对细胞增殖抑制作用较仅病毒联合化疗进一步增强。2.Hoechst33258结果:5.0MOI的病毒ZD55-SATB1联合1ng/ml的DTX、10MOI的ZD55-SATB1、10MOI的ZD55-EGFP、2ng/ml的DTX、100ng/ml的Sitelong和PBS组凋亡率(%)分别为:64.00±6.52、52.67±8.14、33.33±3.59、36.52±7.84、5.71±2.26和6.01±4.64,联合组与单一治疗组比较,差异有统计学意义(P<0.05),说明联合治疗具有较强的促凋亡作用。3.Migration实验结果:5.0MOI的病毒ZD55-SATB1联合1ng/ml的DTX、10MOI的ZD55-SATB1、10MOI的ZD55-EGFP、2ng/ml的DTX、100ng/ml的Sitelong和PBS分别作用LNCa P细胞,培养24h后,穿膜细胞数分别为27.23±7.14、35.10±2.38、40.31±2.59、68.46±3.58、118.01±5.64和106.24±10.35,联合组与单一治疗组比较,迁移细胞明显减少,差异具有统计学有意义(P<0.01)。4.Invasion实验结果:5.0MOI的病毒ZD55-SATB1联合1ng/ml的DTX、10MOI的ZD55-SATB1、10MOI的ZD55-EGFP、2ng/ml的DTX、100ng/ml的Sitelong和PBS分别作用LNCa P细胞,培养24h后计算穿膜细胞数分别为12.31±0.41、21.93±2.11、26.12±2.13、25.06±1.89、76.82±4.31和68.62±4.22,联合组与其它各组比较,差异具有统计学有意义(P<0.01)5.TUNEL实验结果:5.0MOI的病毒ZD55-SATB1联合1ng/ml的DTX、10MOI的ZD55-SATB1、10MOI的ZD55-EGFP、2ng/ml的DTX、100ng/ml的Sitelong和PBS处理48h后,各组的凋亡率分别为(31.13±6.88)%、(14.70±3.84)%、(12.29±5.26)%、(13.802±4.74)%、(4.36±2.23)%、(9.48±3.19)%。联合组多于单一治疗组,与PBS组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05)。6.Western blot实验结果:5.0MOI的ZD55-SATB1联合1.0ng/m L的DTX、10.0MOI的ZD55-SATB1、10.0 MOI的ZD55-EGFP、2.0ng/m L的DTX、100.0 ng/m L的Sitelong组、PBS组SATB1蛋白的相对表达量分别为5.35±1.49、12.73±7.80、29.02±3.54、45.37±3.76、80.03±4.02、和91.72±4.45,联合组SATB1蛋白的表达量较其它各组明显减低(P<0.05),说明腺病毒ZD55-SATB1联合DTX可明显抑制SATB1蛋白的表达且DTX不影响ZD55-SATB1的沉默效果。ZD55-SATB1组与其它单一治疗组比较,SATB1蛋白的表达量差异亦有统计学意义(P<0.05),表明ZD55-SATB1可有效沉默SATB1基因,抑制SATB1蛋白的表达。各治疗组Bcl-2的表达量显着降低,caspase-3和caspase-8的表达量均增多,与单药物治疗组相比,联合组对凋亡蛋白的影响更为显着(P<0.05),7.移植瘤体积:病毒联合化疗及内分泌治疗组、病毒联合化疗组、内分泌治疗联合化疗组、病毒联合内分泌治疗组、病毒治疗组、化疗组、内分泌治疗组和空白对照组移植瘤终体积分别为264.92±28.88、555.64±254.89、555.64±254.89、1589.47±300.91、787.52±221.15、1127.25±271.93、1679.58±258.82、2287.41±254.89和2602.13±325.74。病毒联合化疗及内分泌治疗组疗效最强,显着小于空白对照组以及单药治疗组,差异有统计学意义(P<0.05)。8.H&E染色:内分泌治疗组、化疗组、病毒治疗组、病毒联合内分泌治疗组、内分泌治疗联合化疗组、病毒联合化疗组、病毒联合化疗及内分泌治疗组的肿瘤组织中均可见较多的死细胞,细胞裂解成碎片,细胞核固缩碎裂,其正常的组织结构消失,但联合组的肿瘤细胞坏死更明显。9.免疫组化法检测肿瘤组织中caspase-3、caspase-8、Bcl-2和CD31蛋白的表达:联合组与单用药物或病毒组相比,caspase-3、caspase-8蛋白表达量增多,Bcl-2蛋白表达量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。另一方面,与单用药物或病毒组相比,联合组移植瘤组织中CD31蛋白的表达量显着降低,说明联合组能够有效促进促凋亡蛋白的表达,降低抑凋亡蛋白的表达,且能在一定程度上抑制肿瘤组织血管的生成。结论:1.体外实验表明:溶瘤腺病毒和多西他赛对前列腺癌LNCa P细胞均有杀伤作用,体外给予Sitelong可促进LNCa P细胞的增殖。同时,溶瘤腺病毒联合多西他赛及去雄激素治疗可协同发挥抗肿瘤效果。2.体内实验表明:溶瘤腺病毒、多西他赛和手术去势均抑制前列腺癌LNCa P细胞皮下移植瘤的生长,且联合效果优于单一用药,其可能的机制包括抑制肿瘤细胞生长、诱导凋亡、抑制血管生成。

孙婷,何向蕾[8](2018)在《靶向肿瘤的溶瘤腺病毒制备策略的研究进展》文中进行了进一步梳理溶瘤腺病毒是指经过基因工程改造的腺病毒,其能够选择性地在肿瘤细胞中复制和表达,从而溶解肿瘤细胞;其可经过基因和衣壳蛋白层面的改造,特异性地结合和杀伤肿瘤细胞。自1996年世界上第一例溶瘤腺病毒ONXY-015开展临床研究以来,腺病毒在国内外广泛地应用于科学研究及转化应用,已有多个国家批准其在临床肿瘤治疗中使用,使用范围涉及到多种实体瘤。溶瘤腺病毒的改造方式多种多样,本文对溶瘤腺病毒治疗肿瘤的改造方法,如腺病毒的包膜蛋白进行修饰、腺病毒的结构基因进行改造、插入肿瘤特异性启动子、携带治疗基因与携带短发夹RNA和包括溶瘤病毒的多措施联合等研究进展作一综述。

陈智飞[9](2015)在《溶瘤腺病毒Ad-Apoptin-hTERTp-E1A对肺癌细胞抑制作用研究》文中研究表明近些年来,肺癌的发病率在全球范围内呈持续上升的趋势,甚至已经成为第一高发恶性肿瘤。面对传统肺癌的治疗方法,手术、放疗和化疗,已经不能有效的控制全球肺癌蔓延的趋势。随着分子生物学、细胞生物学和病毒学的发展,基因治疗已成为癌症治疗的另一有利武器,其中腺病毒载体癌症治疗表现出了巨大的优势,且腺病毒载体联合化疗在癌症临床上受到了广泛关注。目前,全世界仅有两种肿瘤基因治疗药物,一种为上海三维生物技术有限公司生产的重组人5型腺病毒(安柯瑞),其删除抗凋亡基因E1B和促进病毒粒子释放的基因E3,而发挥抗肿瘤作用;另一种为深圳市赛百诺基因技术有限公司生产的重组人p53腺病毒(今又生),是以5型腺病毒为载体,携带p53抑癌基因发挥抗肿瘤作用。腺病毒载体对基因转导是一种有效的工具,因此成为最常用的腺病毒载体。但安全性和有效性是评价溶瘤腺病毒的重要指标。第一代腺病毒载体由于病毒衣壳蛋白影响而会诱发机体明显的免疫反应,以及删除复制必需基因E1A,而影响病毒复制,这样便不利于腺病毒的持续作用。本课题组基于RAPAD.I系统,由巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)启动子驱动特异性抑癌基因Apoptin,人端粒末端转移酶(hTERT)启动子驱动腺病毒复制必需基因E1A,从而构建了同时具有肿瘤特异性复制和肿瘤特异性杀伤能力的双特异性溶瘤腺病毒Ad-Apoptin-hTERTp-E1A(ATV),并构建了对照病毒Ad-ΔE1B55K-ΔE3(rAd5)、Ad-p53和Ad-CMV-EGFP(Ad-EGFP)。MTS法用于检测重组腺病毒单独使用或联合顺铂对A549细胞生长抑制作用,结果表明ATV单独或联合顺铂对A549细胞杀伤抑制作用均具有一定的剂效关系和时效关系,ATV抑制率明显高于rAd5和Ad-p53,ATV联合组显着强于rAd5联合组和Ad-p53联合组,且顺铂可增强ATV对A549细胞的抑制作用;AO/EB染色、DAPI染色和Annexin V检测用于探讨重组腺病毒对A549细胞的抑制方式,结果表明ATV和Ad-p53主要是通过诱导A549细胞凋亡而达到抑制目的,而rAd5则主要是通过细胞溶胀作用致使细胞死亡;Transwell迁移实验和Transwell侵袭实验用于探讨A549细胞因ATV或ATV联合顺铂的抑制作用而对其迁移和侵袭能力的影响,结果表明ATV感染的A549细胞的迁移与侵袭能力受到显着影响,并具有一定的剂效和时效关系,ATV对A549细胞的影响要大于其他对照病毒,且ATV联合组要优于ATV单独组。建立A549皮下移植瘤裸鼠模型,通过测定肿瘤生长趋势和平均生存期指标,旨在探讨溶瘤腺病毒ATV及其联合顺铂对肺癌的体内抑制效果,结果表明,相比ATV单独治疗,ATV联合低剂量顺铂可以有效抑制移植瘤的生长及延长裸鼠平均生存期。各项实验结果揭示溶瘤腺病毒ATV及ATV联合顺铂在治疗肺癌方面具有潜在研究价值,及为临床治疗提供一定的理论基础。

许琨[10](2012)在《新型溶肿瘤腺病毒Ad-TD-RFP对人鼻咽癌的治疗作用》文中认为背景鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我国常见的恶性肿瘤。我国的发病总人数占全世界的80%,尤其在广东、广西、福建、江西和湖南等省发病率最高。鼻咽癌以放射治疗为主,早期鼻咽癌放疗5年生存率可达90%~95%。然而,由于鼻咽癌发病隐匿、局部侵蚀力强、淋巴结转移率高,初诊病例70%以上均为Ⅲ、Ⅳ期患者,加之常规放疗毒副反应大,从而导致多数患者五年生存率仅为20%~30%。因此,无论在理论上和临床的实践上不仅急需创新性的治疗方法弥补现有的不足,而且还需要对肿瘤细胞有着更好的选择性和更加明确的作用机制,同时又不与现在常用的治疗药物产生拮抗。复制选择性溶肿瘤病毒(Replication-selective oncolytic Adenovirus, RSOA)是一种新兴的肿瘤治疗方法。这类新的溶肿瘤病毒能选择性在肿瘤细胞中大量复制,从而溶解、杀伤瘤细胞,而对正常细胞没有明显影响。第一代具有复制能力的溶肿瘤腺病毒dl1520,是E1B-55KDa删除的人5型腺病毒,相似病毒在中国称H101,于2005年已被国家食品药品监督管理局(SFDA)正式批准为用于头颈部肿瘤的基因工程药物。 dl1520已被用于局部晚期原发性胰腺癌患者。dl1520治疗肿瘤的耐受性良好但治疗效果非常有限。基于我们以前的研究成果,我们最近构建了删除E1A-CR2、 E1B19K和E3gp-19K三个基因,同时保留E3B基因和E1B-55k基因的新一代溶肿瘤腺病毒,命名为Ad-TD-RFP。目的探讨腺病毒dl1520和新型溶肿瘤腺病毒Ad-TD-RFP在体外以及在裸鼠体内对人鼻咽癌细胞C666-1的治疗作用。方法采用MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulp hophenyl)-2H-tetrazolium)法检测新型溶肿瘤腺病毒Ad-TD-RFP和对照腺病毒dl1520对鼻咽癌细胞株C666-1的杀伤作用;采用TCID50(Tissue culture infectivedose50%)法检测新型溶肿瘤腺病毒Ad-TD-RFP和对照腺病毒dl1520在鼻咽癌细胞株C666-1中的复制能力;人鼻咽癌细胞株C666-1BALB/C裸鼠皮下成瘤,检测新型溶肿瘤腺病毒Ad-TD-RFP和对照病毒dl1520的治疗效果。结果新型溶肿瘤腺病毒Ad-TD-RFP和对照病毒dl1520对鼻咽癌细胞C666-1的EC50值分别为(107.6±3.2)pt/cell和(174.1±4.0)pt/cell,差异有统计学意义(P<0.001)。在鼻咽癌细胞C666-1中在不同时间点(24小时、48小时、72小时、96小时)新型溶肿瘤腺病毒Ad-TD-RFP是对照病毒dl1520复制能力的数倍,且差异有统计学意义(P<0.001)。裸鼠皮下C666-1移植瘤的治疗效果显示:新型溶肿瘤腺病毒Ad-TD-RFP治疗组肿瘤体积显着小于对照病毒dl1520治疗组(P<0.05)。结论新型溶肿瘤腺病毒Ad-TD-RFP在体内和体外对鼻咽癌细胞株C666-1均有很好的治疗效果,这项研究表明新型溶肿瘤腺病毒Ad-TD-RFP是一种治疗鼻咽癌的有效方法。

二、E1B缺陷腺病毒dl1520联合化疗药物DDP体外对鼻咽癌细胞杀伤及诱导凋亡作用(论文开题报告)

(1)论文研究背景及目的

此处内容要求:

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例:

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

(2)本文研究方法

调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、E1B缺陷腺病毒dl1520联合化疗药物DDP体外对鼻咽癌细胞杀伤及诱导凋亡作用(论文提纲范文)

(2)双特异性溶瘤腺病毒Ad-VT对卵巢癌抑制作用研究(论文提纲范文)

中文摘要
abstract
英文缩略词
绪论
第一篇 文献综述
    1.卵巢癌概述
    2.溶瘤腺病毒
        2.1 腺病毒的细胞进入、复制和免疫原性
        2.2 肿瘤选择性复制腺病毒的研究现状
        2.3 溶瘤腺病毒的临床发展
        2.4 改造溶瘤腺病毒
    3 凋亡素
        3.1 凋亡素的序列和结构
        3.2 凋亡素的IDP性质允许与细胞蛋白进行广泛的相互作用
        3.3 凋亡素与DNA的相互作用
        3.4 几种激酶介导凋亡素的细胞毒活性
        3.5 通过细胞周期检查点感知细胞增殖状态
        3.6 细胞是如何死亡的
        3.7 凋亡素的传递方式
第二篇 研究内容
    第1章 荧光素酶标记的人卵巢癌细胞的构建与鉴定
        1.1 材料和方法
        1.2 结果
        1.3 讨论
        1.4 小结
    第2章 重组腺病毒Ad-VT对 A2780-LUC和 SKOV3-LUC细胞的抑制作用和抑制途径的研究
        2.1 材料和方法
        2.2 结果
        2.3 讨论
        2.4 小结
    第3章 重组腺病毒Ad-VT对 A2780-LUC和 SKOV3-LUC细胞的体内抑制研究
        3.1 材料和方法
        3.2 结果
        3.3 讨论
        3.4 小结
结论
参考文献
导师简介
作者简介
攻读学位期间所取得的科研成果
致谢

(3)乳腺癌可视化模型的建立及双特异性重组腺病毒与紫杉醇协同抑制作用的研究(论文提纲范文)

中文摘要
abstract
中英文缩略词
前言
第1章 文献综述
    1.1 溶瘤腺病毒的研究现状
    1.2 乳腺癌与治疗
第2章 实验部分
    第一部分 荧光素酶标记人乳腺癌MDA-MB-231-LUC细胞的构建、鉴定以及裸鼠体内荷瘤模型的构建
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 实验方法
        2.1.3 结果
        2.1.4 小结
    第二部分 Ad-VT与紫杉醇(PTX)协同作用研究
        2.2.1 实验材料
        2.2.2 实验方法
        2.2.3 结果
        2.2.4 小结
    第三部分 双特异性溶瘤腺病毒和紫杉醇联合对乳腺癌细胞的体外抑制方式研究
        2.3.1 实验材料
        2.3.2 实验方法
        2.3.3 结果
        2.3.4 小结
    第四部分 双特异性溶瘤腺病毒和紫杉醇联合应用对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力影响的研究
        2.4.1 实验材料
        2.4.2 实验方法
        2.4.3 结果
        2.4.4 小结
    第五部分 双特异性溶瘤腺病毒和紫杉醇联合应用对荧光素酶标记人乳腺癌MDA-MB-231 细胞的体内抑制作用研究
        2.5.1 实验材料
        2.5.2 实验方法
        2.5.3 结果
        2.5.4 小结
第3章 讨论
第4章 结论
参考文献
作者简介及在学期间所取得的科研成果
致谢

(4)TRAIL修饰溶瘤腺病毒靶向治疗急性髓系白血病的研究(论文提纲范文)

中文摘要
Abstract
缩略词表
第一章 前言
    1.1 急性髓系白血病治疗研究进展
        1.1.1 急性髓系白血病
        1.1.2 AML治疗现状
        1.1.3 AML的新型疗法
    1.2 溶瘤腺病毒与AML治疗
        1.2.1 溶瘤病毒
        1.2.2 溶瘤腺病毒
        1.2.3 溶瘤腺病毒治疗AML的限制
    1.3 溶瘤腺病毒的改造策略
        1.3.1 溶瘤腺病毒的肿瘤靶向策略
        1.3.2 基于pIX的靶向性改造
        1.3.3 TRAIL修饰溶瘤腺病毒
    1.4 立题依据与论文设计
        1.4.1 立题依据
        1.4.2 设计思路
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料、仪器设备与常用试剂
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 实验试剂
        2.1.3 常用试剂及缓冲液配置
    2.2 实验方法
        2.2.1 质粒构建
        2.2.2 蛋白表达及纯化
        2.2.3 SDS-PAGE
        2.2.4 Western Blot
        2.2.5 酶联免疫吸附试验(ELISA)
        2.2.6 MTT法检测腺病毒诱导的细胞死亡
        2.2.7 流式细胞术检测细胞凋亡
        2.2.8 重组腺病毒扩增
        2.2.9 重组腺病毒纯化
        2.2.10 腺病毒的体内注射后肿瘤靶向检测
        2.2.11 溶瘤腺病毒体内抗肿瘤活性检测
第三章 结果与讨论
    3.1 急性髓系白血病细胞系及样本受体表达分析
        3.1.1 不同急性髓系白血病细胞株相关受体表达
        3.1.2 急性髓系白血病样本相关受体表达检测
        3.1.3 小结
    3.2 sTRAIL与zipper融合表达质粒的构建及蛋白表达纯化
        3.2.1 sTRAIL与zipper融合表达质粒的构建
        3.2.2 重组z-sTRAIL蛋白的表达纯化
        3.2.3 小结
    3.3 重组溶瘤腺病毒的优化
        3.3.1 重组溶瘤腺病毒的体外优化
        3.3.2 优化后重组溶瘤腺病毒zA4性质评价
        3.3.3 重组溶瘤腺病毒的抗肿瘤活性分析
        3.3.4 小结
    3.4 重组溶瘤腺病毒体外抗AML检测
        3.4.1 重组溶瘤腺病毒对AML细胞系感染性差异分析
        3.4.2 重组溶瘤腺病毒体外抗AML活性
        3.4.3 小结
    3.5 重组溶瘤腺病毒体内抗AML评价
        3.5.1 重组溶瘤腺病毒体内靶向效果评价
        3.5.2 重组溶瘤腺病毒皮下荷瘤模型抗AML活性
        3.5.3 重组溶瘤腺病毒体内肝肾毒性检测
        3.5.4 重组溶瘤腺病毒静脉荷瘤模型抗AML活性
        3.5.5 小结
    3.6 Rh2 联合重组溶瘤腺病毒体外抗肿瘤效果评价
        3.6.1 MTT法检测Rh2联合sTRAIL对THP-1细胞体外杀伤评价
        3.6.2 Rh2联合sTRAIL诱导细胞凋亡
        3.6.3 MTT法检测Rh2联合zA4对THP-1细胞体外杀伤评价
        3.6.4 MTT法检测Rh2联合zA4对原代AML细胞体外杀伤评价
        3.6.5 小结
    3.7 Rh2联合重组溶瘤腺病毒体内抗肿瘤效果评价
        3.7.1 Rh2联合重组溶瘤腺病毒体内抗肿瘤效果评价
        3.7.2 Rh2联合重组溶瘤腺病毒对AML细胞组织浸润能力的影响
    3.8 小结
讨论
参考文献
作者简历及攻读博士学位期间发表论文
致谢

(5)溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒对小鼠结肠癌模型免疫状态及肿瘤微环境影响的研究(论文提纲范文)

中英文缩略词
中文摘要
英文摘要
前言
材料与方法
一、实验材料
    1. 实验所用细胞系
    2. 实验动物及饲养条件
    3. 实验所用病毒株
    4. 实验所用药物
    5. 实验所用主要试剂
    6. 实验用试剂和溶液配制
    7. 主要耗材和仪器设备
二、实验方法
    1. 细胞培养相关实验
    2. CCK-8细胞增殖检测实验
    3. 动物模型的建立和治疗流程
    4. 检测oHSV2治疗引起的特异性杀伤作用(CFSE-PI法检测细胞毒)
    5. 对小鼠脾脏淋巴细胞表型进行流式检测分析
    6. 病理组织学切片的制备
    7. 肿瘤组织RNA的提取与完整性鉴定
    8. 转录组测序(RNA-Seq)
    9. 生物信息学分析
    10. 统计学分析
实验结果
    1. 溶瘤病毒oHSV2和化疗药物顺铂(DDP)均能有效降低CT26细胞的活力
    2. 溶瘤病毒oHSV2对单侧荷瘤模型治疗效果的初步评价
    3. 溶瘤病毒oHSV2治疗引起系统性的长期的抗肿瘤特异性免疫应答
    4. 适应性免疫(特异性免疫)在溶瘤病毒OHSV2发挥作用的过程中起到重要作用
    5. 溶瘤病毒oHSV2的应用可以增强小鼠脾脏的正向免疫
    6. 溶瘤病毒oHSV2的应用可以有效改善肿瘤微环境的免疫状态
    7. 溶瘤病毒oHSV2治疗可以引起肿瘤微环境中免疫相关基因的差异性表达
讨论
小结
参考文献
基金资助
博士学位期间发表论文
文献综述 溶瘤病毒抗肿瘤免疫机制及其对肿瘤微环境的影响
    参考文献
致谢
个人简历

(6)双调控并荷载SPAG9基因shRNA的溶瘤腺病毒联合多西他赛治疗前列腺癌的实验研究(论文提纲范文)

中文摘要
Abstract
前言
    参考文献
第一部分 构建双调控并荷载SPAG9 基因shRNA的溶瘤腺病毒
    材料和方法
        1.材料
        1.1 细胞、质粒、培养基
        1.2 主要试剂、材料
        1.3 抗体
        1.4 主要仪器
        1.5 试剂的配制
        2.方法
    结果
        1.成功构建溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9
        2.DD3-ZD55-SPAG9 的扩增、纯化与滴度测定
        3.DD3-ZD55-SPAG9 抑制前列腺癌细胞内SPAG9 蛋白表达
    讨论
    结论
    参考文献
第二部分 溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9 联合多西他赛体外治疗去势抵抗性前列腺癌
    材料和方法
        1.材料
        1.1 细胞、培养基
        1.2 主要试剂、材料
        1.3 抗体
        1.4 主要仪器
        1.5 试剂的配制
        2.方法
    结果
        1.结晶紫染色检测DD3-ZD55-SPAG9+DTX对细胞的毒性作用
        2.溶瘤腺病毒ZD55-SPAG9 及多西他赛抑制前列腺癌细胞的生长
        3.DD3-ZD55-SPAG9 联合DTX抑制前列腺癌细胞迁移能力
        4.DD3-ZD55-SPAG9 联合DTX抑制前列腺癌细胞侵袭能力
        5.DD3-ZD55-SPAG9 联合DTX促进前列腺癌细胞凋亡
        6.DD3-ZD55-SPAG9 联合DTX下调SPAG9、Vimentin、MMP-2 蛋白,上调E-cadherin、caspase-8、casepase-3 蛋白的表达
    讨论
    结论
    参考文献
第三部分 溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9 联合多西他赛治疗裸鼠移植瘤
    材料和方法
        1.材料
        2. 方法
    结果
        1.DD3-ZD55-SPAG9 联合DTX抑制裸鼠移植瘤生长
        2. HE 染色
        3.TUNEL凋亡试剂盒检测肿瘤凋亡
        4.免疫组化法检测肿瘤组织中SPAG9 蛋白与EMT相关蛋白
        5.Western Blot检测肿瘤组织内SPAG9和EMT相关蛋白表达情况
    讨论
    结论
    参考文献
研究创新
存在的问题和改进方法
参考文献
综述(一) 溶瘤腺病毒介导的抗肿瘤治疗研究进展
    参考文献
综述(二) 嵌合抗原受体 T 细胞免疫治疗前列腺癌现状及进展
    参考文献
缩略词表 Abbreviation
攻读学位期间参与发表的学术成果
致谢

(7)荷载SATB1基因shRNA的溶瘤腺病毒治疗前列腺癌(论文提纲范文)

中文摘要
abstract
前言
    参考文献
第一部分 荷载SATB1基因shRNA溶瘤腺病毒对前列腺癌的靶向治疗作用
    材料与方法
    结果
    讨论
    结论
    参考文献
第二部分 荷载SATB1基因sHRNA溶瘤腺病毒联合内分泌、化疗治疗激素敏感性前列腺癌
    材料与方法
    结果
    讨论
    结论
    参考文献
研究创新
存在的问题和改进方法
    参考文献
综述(一)
    参考文献
综述(二)
    参考文献
缩略词表 Abbreviation
攻读学位期间学术成果(第一作者或通讯作者)
致谢

(8)靶向肿瘤的溶瘤腺病毒制备策略的研究进展(论文提纲范文)

1 溶瘤腺病毒的制备策略
    1.1 对腺病毒的包膜蛋白进行修饰
    1.2 对腺病毒的结构基因进行改造
    1.3 插入肿瘤特异性启动子
    1.4 携带治疗基因
        1.4.1 细胞因子
        1.4.2 凋亡相关基因
    1.5 携带短发夹RNA
2 溶瘤病毒的多种联合策略
3 结语

(9)溶瘤腺病毒Ad-Apoptin-hTERTp-E1A对肺癌细胞抑制作用研究(论文提纲范文)

中文摘要
Abstract
英文缩略词
绪论
第一篇 文献综述
    1 溶瘤腺病毒及化疗的研究进展
        1.1 腺病毒载体概述
        1.2 溶瘤腺病毒当前情况
        1.3 溶瘤腺病毒在临床中的限制性
        1.4 提高癌症细胞感染有效性的方法
        1.5 提高溶瘤腺病毒复制特异性的策略
    2 溶瘤腺病毒与化疗联合在抗肿瘤领域的应用
        2.1 化疗概述
        2.2 溶瘤腺病毒与标准化疗药联合
        2.3 溶瘤腺病毒与靶向化疗药联合
        2.4 展望
第二篇 研究内容
    第一章 重组腺病毒对肺癌细胞 A549 的体外抑制研究
        1.1 材料与方法
        1.2 结果
        1.3 讨论
        1.4 小结
    第二章 重组腺病毒对肺癌细胞 A549 抑制而对迁移和侵袭能力的影响
        2.1 材料与方法
        2.2 结果
        2.3 讨论
        2.4 小结
    第三章 重组腺病毒对肺癌细胞 A549 的体内抑制研究
        3.1 材料与方法
        3.2 结果
        3.3 讨论
        3.4 小结
结论
参考文献
导师与作者介绍
攻读学位期间所取得的科研成果
致谢

(10)新型溶肿瘤腺病毒Ad-TD-RFP对人鼻咽癌的治疗作用(论文提纲范文)

摘要
Abstract
图和附表清单
英文缩略词
前言
材料与方法
结果
讨论
结论
参考文献
综述 腺病毒治疗头颈部肿瘤的研究进展
    参考文献
个人简历及攻读学位期间发表的论文
致谢

四、E1B缺陷腺病毒dl1520联合化疗药物DDP体外对鼻咽癌细胞杀伤及诱导凋亡作用(论文参考文献)

  • [1]双特异性溶瘤腺病毒Ad-VT对荧光素酶标记人黑素瘤的抑制作用及机制研究[D]. 李敏. 吉林大学, 2021
  • [2]双特异性溶瘤腺病毒Ad-VT对卵巢癌抑制作用研究[D]. 崔英丽. 吉林大学, 2021(01)
  • [3]乳腺癌可视化模型的建立及双特异性重组腺病毒与紫杉醇协同抑制作用的研究[D]. 王京. 吉林大学, 2020(08)
  • [4]TRAIL修饰溶瘤腺病毒靶向治疗急性髓系白血病的研究[D]. 王子璇. 吉林大学, 2020(08)
  • [5]溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒对小鼠结肠癌模型免疫状态及肿瘤微环境影响的研究[D]. 胡箫. 北京协和医学院, 2020
  • [6]双调控并荷载SPAG9基因shRNA的溶瘤腺病毒联合多西他赛治疗前列腺癌的实验研究[D]. 杨春华. 苏州大学, 2019(06)
  • [7]荷载SATB1基因shRNA的溶瘤腺病毒治疗前列腺癌[D]. 毛立军. 苏州大学, 2018(01)
  • [8]靶向肿瘤的溶瘤腺病毒制备策略的研究进展[J]. 孙婷,何向蕾. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2018(02)
  • [9]溶瘤腺病毒Ad-Apoptin-hTERTp-E1A对肺癌细胞抑制作用研究[D]. 陈智飞. 吉林大学, 2015(09)
  • [10]新型溶肿瘤腺病毒Ad-TD-RFP对人鼻咽癌的治疗作用[D]. 许琨. 郑州大学, 2012(10)

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E1B缺陷型腺病毒dl1520联合化疗药物DDP对鼻咽癌细胞体外杀伤及诱导凋亡的影响
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