一、人端粒及端粒重复序列结合因子的研究现状（论文文献综述）
张芮源[1]（2021）在《动态响应型DNA四面体探针设计及其用于活细胞内端粒酶原位分析研究》文中研究说明端粒酶是一种核糖核蛋白酶复合体,其催化核心包括端粒酶逆转录酶（TERT）和端粒酶RNA（TER）,能够催化端粒酶重复序列（TAAGGG）n添加到端粒末端。端粒酶的RNA和蛋白质组分中的不同结构可调节端粒酶的持续合成能力,而端粒酶持续合成能力在维持端粒稳态和端粒长度中起关键作用。端粒酶的功能是细胞增殖和分化的基础,并与癌症、遗传病等许多疾病直接相关。因此,端粒酶的准确和灵敏检测对于疾病早期诊断和药物治疗效果评估具有重要价值。DNA纳米结构因其可编辑性和生物相容性而在分析检测中引起研究者的浓厚兴趣。其中,DNA四面体纳米材料可通过简单的自组装法合成,具有较强的稳定性、较低的细胞毒性、结构位点易于修饰、纳米尺寸易于被细胞内吞等优点。近年来,DNA四面体作为载体,已广泛用于生物医学领域,以进行原位成像,生物传感和基因治疗。基于以上分析,本文构建了动态响应型DNA四面体探针,实现了对端粒酶的灵敏、准确检测并将其用于细胞成像。本文共分为三章:第一章为绪论,主要概述了端粒及端粒酶反应机理、端粒酶研究意义以及目前国内外报道的端粒酶传统和新型检测方法,并介绍了本文主要解决的科学问题和研究内容。第二章构建了顺次点亮型DNA四面体探针（SLMN）,用于分析活细胞中的端粒酶活性。SLMN由DNA四面体,一条长链DNA（LD）和三种类型的MB（分别称为MB1,MB2和MB3）组成。MB分别用不同发射波长的荧光基团FAM、Cy5、HEX标记。LD链包含端粒酶底物（TS）结构域,在端粒酶的作用下,TS延伸添加端粒重复序列。由于产物长度的限制和序列的互补性,当添加重复单元时,它只能与最近的分子信标杂交。延长的端粒重复序列与固定的分子信标顺序杂交,并伴有顺序点亮的荧光。通过解析信号可以揭示特定长度产物的贡献,而不是获得对整个产物的混合信号。这个设计不仅可以检测细胞内端粒酶活性,还可以实现对端粒酶在底物上作用的实时监测以及产物长度分布的原位表征。第三章构建了一个组件分离对接型DNA四面体探针（DTDA）,以精确地在肿瘤细胞中成像检测端粒酶活性。DTDA在其两个顶点上带有一对双分子DNA三链体,并在酸性条件下通过Watson-Crick和Hoogsteen相互作用得以稳定。DTDA在肿瘤细胞的细胞外酸性pH中保持结构完整性,但在非癌细胞的细胞外碱性pH中,三链体释放出含有同嘧啶及端粒酶底物的单链DNA（HTS）。一旦内化到肿瘤细胞中,由于细胞内相对较高的pH值,HTS就会从DTDA解离到细胞质。然后,它被细胞内端粒酶催化延伸,并通过立足点介导的链置换与其他两个顶点对接,分离后返回DTDA,并伴有荧光增强。对于非癌细胞,HTS不会进入细胞,不会导致随后的细胞内对接事件。DTDA可以精确区分肿瘤细胞和表达端粒酶的非癌细胞。该策略可以为研究靶细胞中的生物标志物提供新的范例。
唐铃丰[2]（2021）在《人端粒酶逆转录酶hTERT鉴别乳腺良恶性肿瘤的Meta分析》文中认为目的系统评估人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）基因检测鉴别诊断乳腺良恶性肿瘤的临床价值。方法检索CNKI、CBM、维普、Wan Fang Data、Pub Med、The Cochrane Library（2020年10期）、Web of Science、EMbase数据库中与hTERT基因检测鉴别乳腺良恶性肿瘤相关的文章,检索时间均由建库时间至2020年10月9日。提取纳入文献基本资料并通过QUADAS标准评价研究质量。使用Stata 15.0和Meta-Disc 1.4软件对数据进行统计分析。首先通过ROC曲线和Spearman相关系数来检验有无阈值效应,若有阈值效应,则拟合ROC曲线并计算AUC及Q*指数;若无阈值效应,则采用卡方检验分析异质性,并结合I2定量判断异质性的大小。然后使用meta回归分析探寻异质性来源,进行亚组分析。最后通过漏斗图分析发表偏倚。结果本研究一共纳入了17篇文献,共1436例患者（乳腺恶性肿瘤852例,乳腺良性肿瘤584例）。结果显示,hTERT诊断乳腺恶性肿瘤的合并敏感度(Sen合并)为0.81[95%CI（0.79,0.84）],合并特异度(Spe合并)为0.83[95%CI（0.79,0.86）],合并阳性似然比(+LR合并)为4.75[95%CI（3.35,6.74）],合并阴性似然比(-LR合并)为0.21[95%CI（0.15,0.30）]以及合并诊断优势比(DOR合并)为26.93[95%CI（15.02,48.28）]。所有结局指标I2均大于50%,因此采用随机效应模型进行Meta分析。对全部因素进行meta回归分析,结果显示异质性主要来源为作者国家,剔除两篇国外文献后行亚组分析,采用固定效应模型计算合并DOR为35.89,AUC=0.9242,Q*=0.8582。结论hTERT基因检测鉴别诊断乳腺良恶性肿瘤有较好的灵敏度及特异度,诊断试验的判别效果较好,其有助于临床上乳腺良恶性肿瘤的鉴别。
刘欢[3]（2021）在《端粒长度及其关联基因多态性对精液质量的影响》文中认为背景近年来,不孕不育在适龄夫妻中的比例越来越高,其中由男性因素导致的不育约占4060%,目前临床上评估男性生殖健康缺乏更为敏感的生物标志物。精子发生过程中精子端粒长度保持不变来维持精子染色体的稳定性,端粒长度的变化与男性精液质量间存在相关性。端粒长度改变可能成为新的和易于衡量的生物标志物,用以检测男性生殖损伤。目的了解目前河南省濮阳市育龄男性精液质量的水平,分析相对端粒长度与男性精液质量的关系,评估其作为男性生殖损伤生物标志物的可能性,研究相关遗传因素与相对端粒长度之间的关联性。方法研究对象来源于濮阳市妇幼保健院生殖健康中心就诊和体检的男性,采用计算机辅助精子分析技术、聚合酶链反应、实时荧光定量PCR方法和限制性片段长度多态性方法,分析了其相对端粒长度及其关联基因多态性对精液质量的影响。结果1.精液质量相关结果随着年龄增大精液量、精子总数、前向运动精子百分率、总活力百分率、前向运动VSL大于35μm/s精子百分率基本呈下降趋势;随BMI增加鞭打频率总体呈下降趋势;饮酒组曲线速度、直线速度、平均路径速度、精子头侧摆幅度高于非饮酒组。2.GSTT1、GSTM1基因缺失与精液质量的分析经单因素Logistic回归分析,GSTM1基因是前向运动精子百分率（OR=1.68,95%CI:1.082.61）的保护因素,GSTT1基因是精子总活力百分率（OR=1.75,95%CI:1.082.83）的保护因素。3.相对端粒长度与精液质量的分析经Spearman相关分析,相对端粒长度与精子总数、精子浓度、前向运动精子百分率、直线速度存在正相关性,与精子畸形指数、颈部缺陷参数之间存在负相关性。经线性回归分析,端粒长度与精子总数（β=2.03（0.08,3.99）,P<0.05）间具有正相关关系。4.基因多态性与端粒长度的分析经多重线性回归分析,POT1 rs1034794基因型AT（β=-7.81（-13.40,-2.21）,P<0.05）、TT（β=-9.51（-15.39,-3.63）,P<0.05）相对于AA端粒长度更短,TERT rs2735940基因型TT（β=4.92（0.04,9.79）,P<0.05）相对于CC端粒长度更长,TERC rs2293607基因型GG（β=-4.56（-8.86,-0.26）,P<0.05）相对于CC端粒长度更短。5.基因多态性与精液质量的分析经单因素Logistic回归分析,POT1 rs1034794基因型AT（OR=3.21,95%CI:1.109.37）、TT（OR=3.90,95%CI:1.3711.15）相对于AA和POT1 rs10250202基因型CC（OR=5.17,95%CI:1.4418.53）相对于AA与前向运动精子百分率的增加相关;POT1 rs10250202基因型CC（OR=5.05,95%CI:1.0823.53）相对于AA与总活力百分率的增加相关。6.辣椒饮食对精液质量的保护因素单因素二分类Logistics回归分析发现,在调整年龄、吸烟、饮酒和BMI后食物辣度、食辣时间、每周吃辣频率、每月吃辣频率是精液质量参数的保护因素。多因素Logistics回归分析发现,在调整年龄、吸烟、饮酒和BMI后食辣时间是精子总数和精子浓度的保护因素。结论1.随着年龄的升高男性精液基本参数下降,随BMI的增加精子鞭打频率下降。2.GSTM1基因是前向运动精子百分率的保护因素,GSTT1基因是精子总活力百分率的保护因素。3.基因多态性可能通过改变端粒长度从而导致精液质量的改变。4.食物辣度、食辣时间、每周吃辣频率、每月吃辣频率与男性精液基本参数和精子运动参数存在正相关性。
孟凡渝[4]（2020）在《基于新型无酶生物传感体系的端粒酶及miRNA检测成像技术的研究》文中研究表明端粒是位于线状染色体两端的DNA-蛋白质帽子结构,能够保证遗传信息以及染色体正常的生理功能。端粒酶作为一类具有逆转录作用的酶,能够决定端粒的长短和活性大小。端粒与端粒酶在细胞衰亡、肿瘤发生以及干细胞能力维持等生命活动中都至关重要,而表达和调控机制的紊乱很可能导致癌症相关疾病的发生。在大部分恶性肿瘤细胞中端粒酶都会过表达,阻止端粒长度缩短和缺失,使癌细胞永生化。由此端粒酶可作为重要的肿瘤标志物,为癌症早期诊断提供依据和相应的治疗靶点,它的检测分析具有广泛的应用价值。本论文依据端粒酶扩增的基本原理,设计相应的核酸纳米结构和分子识别探针,构建基于功能化纳米材料介导的信号放大体系,以电化学和荧光技术作为关键检测手段,开发超灵敏生物传感器,开展针对端粒酶活性相关的定量检测和细胞内成像研究,具体内容如下:1.我们首先利用纳米材料作为信号分子,设计了无PCR参与的基于电化学传感技术的端粒酶活性分析方法。在这项研究里,使用未修饰的金纳米材料（AuNPs）和电化学伏安法定量分析从HeLa细胞中提取的端粒酶的活性。在金电极上,端粒酶可以利用硫醇修饰的端粒酶底物（TS）引物和脱氧核糖核苷酸（dNTPs）的混合物,特异性地促进含有重复核苷酸序列（TTAGGG）n的单链DNA（ssDNA）的延长。在TS引物与阻断剂DNA杂交后,纳米金粒子被ssDNA延伸部分暴露的含氮碱基捕获,并且通过差分脉冲伏安法（DPV）来具体量化端粒酶活性。在分析电化学信号后,获得20到2000个细胞的线性检测范围。这种简单的分析机制的检测极限是20个细胞。此方法无需PCR参与,快速且简单,非常适合在体外灵敏的评估细胞提取物中的端粒酶活性。2.我们接着开发了一种更稳定精确的双信号比率型电化学传感器,设计核酸的发夹结构用于端粒酶活性的超灵敏分析。发夹结构的DNA探针在其5’末端用亚甲基蓝（MB）分子标记后首先被结合在金电极界面上。然后与二茂铁标记（Fc）的端粒酶底物引物（Fc）进行杂交。随着端粒酶的催化反应,重复产生（TTAGGG）n的序列,能够与发夹DNA其余部分结合,进而触发探针的构象转导,打开发夹结构。因此,MB信号从电极表面释放,检测到的氧化峰值电流（IMB）降低。同时,Fc信号不受构象变化影响,保持相对稳定,峰值电流（IFc）可以用作内部对照,提高信号输出的稳定性和准确性。这种智能结构设计可以实现可靠的目标识别,获得的结果表现出出色的分析性能,非常适合低浓度目标物的检测。实验结果发现IMB/IFc与端粒酶浓度对数线性相关,检测限度极低。这种基于核酸结构变化和比率型信号输出的方法,可以成为一种强有力的分析端粒酶活性的实用工具,也可以作为开发其他核酸分析的多功能工具。3.端粒酶催化端粒延伸反应并添加DNA重复序列,诱发癌症或其他疾病,除了体外检测,其细胞内成像分析也具有重大应用价值。因此,开发可靠和方便的端粒酶原位监测方法对于恶性肿瘤的临床诊断至关重要。然而,大多数用于细胞内端粒酶活性测定的电流探针都面临不可避免的假阳性干扰。在这项研究中,我们设计了一种核酸四面体结构,并利用荧光共振能量转移（FRET）效应,来高灵敏度的监测和分析细胞内基于端粒酶表达的自由扩增程序。其中,由DNA四面体作为结构基底和发光DNA作为有效识别序列,构建DNA纳米探针,以实现端粒酶的体外传感检测和细胞内成像,并且避免假阳性干扰的问题。端粒酶可以使其底物引物延伸产生重复序列,发生链置换反应并改变核酸探针的构型,两端标记荧光团的发光DNA被释放游离出来,信号分子之间的距离增加导致荧光的恢复。此方法基于显着的FRET效应建立了简单比率传感器,检测限度可以达到单细胞水平。这种检测系统可以在端粒酶抑制剂的筛选分析中得到应用,在抗癌药物发现中发挥作用。4.端粒酶和miRNA在肿瘤细胞中含量较高,已被公认为常见的肿瘤检测标志物。我们又设计了基于miRNA触发的DNA酶步行器,与纳米金（AuNPs）探针结构相结合,用于端粒酶活性的逻辑门传感分析。通过链置换反应,目标miRNA打开两个发卡结构,循环扩增形成双足DNA酶步行器。在AND逻辑门实验中（实验A）,端粒酶的存在使引物（Tp）被延长,与锁定链结合。双足DNA酶和Mn2+与底物链结合,发生催化剪切作用,被AuNPs抑制的羧基荧光素信号（FAM）释放到溶液中,荧光恢复。在两种目标物或任何一种目标物不存在时,检测体系的荧光皆无法恢复。在OR逻辑门实验中（实验B）,miRNA触发的双足DNA酶可以单独打开AuNPs探针上的发卡结构,在Mn2+作用下,将荧光分子释放出来。端粒酶产生的延伸产物,可以与AuNPs探针上含有FAM的锁定链结合形成双链,释放到溶液中产生荧光。单一目标物存在下,荧光信号皆可恢复,两种目标物存在下,荧光强度增加。除此之外,含有信号分子的AuNPs探针复合物、载有DNA酶和TP引物的二氧化锰（MnO2）纳米片,可被细胞自主摄取,传递到细胞中,用于细胞内成像分析。该方法使用生物逻辑门和DNA酶步行器,极大地提高了荧光探针检测的适用性和灵敏度,已成功应用于端粒酶和miRNA的体外检测和细胞内成像研究,对于临床诊断来说具有重要意义。5.在更进一步的研究中,我们策略性地制造了多功能纳米结构TDNs-Flare探针,来同时灵敏地检测端粒酶和miR-21这两种肿瘤标志物,以及进行相应的细胞内生物成像研究。TDNs-Flare探针主要是由金纳米颗粒（AuNPs）修饰的四面体DNA纳米结构（TDNs）作为基质,包含Flarel（Cy5）和Flare2（CDg）两种不同的反应性应答信号。在存在靶标的情况下,不完全互补的DNA链Flare会竞争性地从四面体框架中被置换下来,从而导致荧光信号的恢复。CDg荧光对应的miR-21线性检测范围从1 fmol到100 pmol,而Cy5荧光可以完成低至10个HeLa细胞的端粒酶浓度分析,动态分析范围从10到5000个HeLa细胞。此外,抗癌药物（Dox）在插入DNA双链后,会随目标物的识别和结合,而释放到细胞中发挥作用。这项研究表明TDNs-Flare探针是定量测定癌症生物标志物的很好的选择,并且已成功在研究中用于响应性生物成像。该纳米结构不仅克服了在细胞水平上同时检测多种生物标志物的障碍,而且在DNA装载抗癌药物的细胞内传递方面有着广阔的应用前景。
郑建波[5]（2020）在《肾细胞癌组织中hTERT启动子甲基化水平与其临床病理意义》文中研究指明研究背景:肾癌是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,全世界每年诊断出超过40万名新患者,其中约17万名患者死于肾癌。近些年来肾癌的发病率呈上升趋势,其发病机制仍未被明确。近来发现端粒及端粒酶的活性在肿瘤包括肾癌等疾病的发生发展中可能起到了重要作用。端粒是位于真核细胞染色体末端的DNA-蛋白质复合体,由重复排列的富含鸟嘌呤的六聚体DNA及特定的端粒结合蛋白组成。对维持基因组和染色体稳定起重要作用。端粒酶是一种核糖核蛋白聚合酶,是一种能够延长端粒重复序列的酶,通过在人类染色体末端添加5’-TTAGGG-3’重复序列来维持端粒末端的T-Loop结构。在出生后的体细胞中端粒酶的表达通常受到抑制,如果其失调可能与致癌性有关。虽然它在大多数正常人类细胞中被抑制,但在高达90%的人类恶性肿瘤中可检测到端粒酶活性。端粒酶主要有人端粒酶逆转录酶（hTERT）、人端粒酶RNA组分（hTR）及相关蛋白3个不同的亚基组成,hTERT是端粒酶全酶的催化亚基,是端粒酶活性的限速因子。已知人hTERT基因的表达和功能通过多种途径调节,包括转录因子,启动子甲基化/突变,染色质重塑,交替剪接,蛋白质修饰导等。在这些调节手段中,转录调节是最重要的。自从发现正常细胞上大多数癌基因启动子存在高甲基化后,甲基化的遗传修饰被引起广泛的兴趣。DNA甲基化,一般发生在CpG位点。hTERT启动子区域没有TATA和CAAT盒,但含有一个致密的富含CG的CpG岛,这表明DNA甲基化在hTERT表达调控中可能起潜在的作用。对重亚硫酸氢盐处理后的基因组组测序,Theodora等人研究了 37种细胞系中hTERT的启动子甲基化状态,包括正常细胞,干细胞和癌细胞。虽然他们研究没有发现特异性甲基化位点或区域与hTERT表达相关,却证实了在端粒酶阴性的SUSM-1细胞系中通过去甲基化处理诱导了 hTERT表达。目前一些研究表明hTERT启动子的CpG岛甲基化与体内较低的端粒酶活性有关,然而更多研究表明hTERT启动子区域的超甲基化与hTERT mRNA表达正相关,这与我们通常认为的基因上某个区域的甲基化升高导致该基因的表达降低相反,因此DNA甲基化在hTERT表达和端粒酶活性调节中的潜在作用仍然有待阐明。肾细胞癌（RCC）是肾脏恶性肿瘤中最常见的癌症病理类型,诊断时转移率为25-30%。据报道,hTERT基因表达可以通过各种反式作用元件和顺式作用元件调节,包括 c-Myc,Sp1,WT1,HIF-1α,P53,TGF-β,SMYD3,染色质重塑和启动子突变。然而很少有研究涉及RCC中hTERT启动子的DNA甲基化状态。为此,我们使用焦磷酸测序定量评估了 hTERT启动子区域中转录上游的筛选出的5个CpG位点的甲基化水平,进一步探讨hTERT启动子甲基化百分比和hTERT表达,端粒酶活性,临床分期和患者预后之间的相关性,并对hTERT启动子甲基化水平与其表达和端粒酶活性之间的关系进行了探讨,探索hTERT启动子甲基化在肾肿瘤发生发展中的潜在作用,筛选预测肾肿瘤预后的生物标志物。研究目的:通过收集103例肾细胞癌患者的年龄、性别、肿瘤类型、TNM分期、Fuhrman分级等临床病理特征并随访手术后预后情况,检测肾细胞癌及配对癌旁正常组织的hTERT启动子甲基化水平、hTERT mRNA相对表达丰度,端粒酶活性。分析hTERT启动子甲基化水平与hTERT mRNA相对表达丰度,端粒酶活性3者之间的相互关系及其与肾细胞癌患者年龄、性别、肿瘤类型、TNM分期、Fuhrman分级等特征之间的关系,对hTERT启动子甲基化水平在肾细胞癌中的潜在作用机制进行初步的研究。研究对象及方法:收集2009年至2014年期间,在山东大学齐鲁医院入院手术的103名患者中,通过根治性肾切除术（n=99）或肾单位保留手术（n=4）获得成对的肾肿瘤组织和与肿瘤相邻的正常组织（NAT）。所有标本均通过组织病理学检查确认诊断。将标本在-80℃冷冻直至随后的实验室分析。对这些患者进行随访研究,随访时间从2009年1月1日起,截止时间2016年11月30日。以手术时间作为观察起点,直至患者出现死亡,记录每个病例的年龄、性别、左右、病理类型、TNM分期、Fuhrman分级、生存时间等资料。按照DNeasy组织试剂盒（Qiagen Ltd,Venlo,Netherlands）说明书从冷冻组织标本中提取DNA。通过分光光度法测量DNA浓度并调节至50ng/ml。采用EpiTect Bisulfite试剂盒（Qiagen）,严格按照产品说明书进行基因组DNA的亚硫酸氢盐修饰。通过采用特异性的引物对亚硫酸氢盐转化的基因组DNA进行PCR,PCR结果确认DNA的亚硫酸氢盐转化成功。使用PyroMark PCR试剂盒（Qiagen）进行 PCR。使用 PyroMark Assay Design Software 2.0 设计引物。对于所有样品,用0.5μl亚硫酸氢盐转化的基因组DNA进行PCR反应。使用生物素标记的引物（反向引物）通过使用链霉抗生物素蛋白包被的Sepharose珠（GE Healthcare,UK）纯化PCR产物。将PCR产物与Sepharose珠结合,纯化,洗涤,用0.2M NaOH溶液变性,并再次洗涤。然后将0.3μM测序引物与纯化的单链PCR产物退火,并根据产品说明在PyroMark Q96（Qiagen）中进行焦磷酸测序。为了总亚硫酸氢盐转化的内部对照,焦磷酸测序的区域中的非CG胞嘧啶也被包括。使用TRizol试剂（Invitrogen）从组织样品中提取总细胞RNA。使用总共1μg的RNA用M-MLV逆转录酶（Thermo,Lithuania）进行逆转录。使用SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems,Foster City,CA）在 7000 实时 PCR系统（Applied Biosystems）中进行QPCR。β2-作为内参照物。根据阈值循环值,使用2-△△Ct方法计算标本中hTERT mRNA的相对水平。使用TeloTAGGG端粒酶PCR ELISA试剂盒（Roche Diagnostics）测定端粒酶活性。提取1.0μg蛋白质进行测定,并且在端粒酶-引物延伸反应后进行30个PCR循环。使用ELISA显色反应检测PCR产物。端粒酶活性水平表示为吸光度[测定在450nm上的OD值（参考波长690nm）]。对正态分布的采用t检验。不符合正态分布的未配对组采用Mann-Whitney U检验,配对组采用Wilcoxon秩和检验,3组样本之间比较采用多样本比较的秩和检验,Kruskal-Wallis法来进行整体分析及两两比较。对于指标与预后之间的关系,采用Kaplan-Meier分析,对Log-rank检验有意义的单因素纳入多因素Cox回归分析,报告的所有P值均为双尾检验,并且采用值小于0.05。SPSS 16.0软件统计结果提示P=0.000,做图时按P<0.001显示处理。研究结果:我们提取12个肾癌组织和相对应癌旁正常组织（NAT）的DNA,采用重亚硫酸盐转化后,设计了 3对PCR引物对hTERT启动子的三个区域的14个CpG位点进行焦磷酸测序。在所有14个检查的CpG位点中发现,与NAT相比,我们发现肾癌组织中的hTERT启动子区CpG甲基化百分比更高,按P小于0.05,2组之间均有显着统计学意义。同时在三个区域PCR过程中,我们发现包含位点1至5区域的PCR扩增信号最稳定。以这个区域为研究对象,我们扩大检测样本,使用焦磷酸测序检测了 103名肾癌患者配对样本中位点1至位点5的甲基化百分比。我们发现与NAT相比,肾癌组织中所有5个CpG位点都显着高甲基化。在所有103个肾肿瘤组织和配对NAT中,患者的年龄与MMP1-5（means of methylation percentage of CpG sitel to site2）之间均不存在线性相关性。肾癌组织中MMP 1-5和hTERT全长mRNA表达（R2=0.450）之间观察到较高的正相关。一致地,在MMP 1-5和端粒酶活性之间也发现了正相关（R2=0.446）。我们的数据表明hTERT启动子在肾癌组织中是高甲基化的,并且甲基化水平与hTERT mRNA表达和端粒酶活性密切相关。我们研究hTERT启动子甲基化水平与临床病理特征之间的关联,发现所有患者的甲基化与年龄和性别无关。同时我们发现较高水平的hTERT启动子甲基化水平与疾病阶段显着相关,但是我们的数据发现Fuhrman等级之间与hTERT甲基化水平没有统计学显着差异。同时,透明细胞RCC（ccRCC）和非ccRCC之间的hTERT启动子甲基化水平没有显着差异。肾肿瘤组织与NAT相比,全长hTERT mRNA表达及端粒酶活性有明显的统计学差异,hTERT表达与端粒酶活性之间存在直线相关性。经单因素的分析,患者的TNM分期,细胞Fuhrman分级,hTERT启动子甲基化水平,hTERT mRNA表达水平,端粒酶活性对肾癌术后生存率有影响,经多因素Cox回归分析发现AJCC分期、hTERT启动子甲基化水平是影响肾癌病人预后的独立因素。研究结论:综上所述,我们通过对人肾癌中hTERT启动子甲基化水平、hTERT表达及端粒酶活性与临床特征和预后之间的相关性研究,我们发现hTERT启动子甲基化与hTERT表达/端粒酶活性之间存在正相关,hTERT表达与端粒酶活性之间存在正相关。hTERT启动子甲基化此外,我们发现了 hTERT启动子甲基化、hTERT mRNA表达及端粒酶活性与临床结果之间的密切关联,是肾癌预后不良的危险因素。hTERT启动子CaAvg（按48.3%分层）,AJCC分层是影响肾癌患者手术之后预后的独立因素,hTERT启动子甲基化水平影响hTERT mRNA表达及端粒酶活性,影响肾癌预后,揭示这种表观遗传改变可以作为RCC诊断和预后的有价值的生物标志物。
赵兵[6]（2020）在《基于人胃黏膜端粒调控网络与衰老学说探讨固本通络汤治疗慢性萎缩性胃炎的机制》文中研究表明研究目的:端粒缩短是反应细胞衰老的生物学标志物,研究显示,慢性萎缩性胃炎（CAG）患者胃黏膜端粒长度较同龄正常人缩短,提示CAG或与胃黏膜衰老有关,然相关分子机制尚未阐明。既往临床研究证实,导师根据“胃天年”理论运用固本通络汤治疗CAG在临床上具有较好的疗效,然固本通络汤疗效发挥的机制尚不明确。本研究通过对CAG患者胃黏膜端粒长度与端粒结合蛋白TRF1、TRF2、POT1 mRNA及蛋白表达水平、细胞衰老通路关键因子p53mRNA表达水平的研究,从端粒调控网络与衰老角度探讨CAG的发病机制以及固本通络汤治疗CAG的机制。研究方法:（1）CAG患者胃黏膜端粒长度、TRF1、TRF2、POT1mRNA及蛋白表达与p53mRNA表达水平的病例-对照研究采用病例对照研究的实验设计,收取30例CAG患者及30例CNAG患者作为对照组,所有患者均于中国中医科学院广安门医院行胃镜检查及病理活检,明确诊断。通过填写调查问卷以确定两组患者疾病发生的危险因素,通过检测患者胃窦部黏膜端粒长度、TRF1、TRF2、POT1mRNA及蛋白表达以及细胞衰老通路关键因子p53mRNA表达,探讨人胃黏膜端粒调控网络及衰老与CAG的相关性,以进一步明确CAG发病的分子机制。（2）固本通络汤治疗CAG的机制研究采用自身前后对照的实验设计,回顾性的收取经固本通络汤治疗3个月后胃窦部黏膜病理至少改善一个等级的患者30例,对其治疗前后的胃窦部病理标本进行再切片,通过检测胃窦部黏膜端粒长度、TRF1、TRF2、POT1mRNA及蛋白表达以及细胞衰老通路关键因子p53mRNA表达,探讨固本通络汤对端粒调控网络及细胞衰老通路关键基因p53的影响,从而明确固本通络汤疗效发挥的机制。研究结果:（1）CAG患者胃黏膜端粒长度、TRF1、TRF2、POT1mRNA及蛋白表达与p53mRNA表达水平的病例-对照研究两组患者基线比较:性别、年龄组成无明显差异,基线一致,具有可比性。两组患者相关危险因素比较:与CNAG组相比,CAG患者中有Hp感染史者更多、病程更长,差异有统计学意义（P<0.05）;BMI、吸烟史、饮酒史、熬夜、暴饮暴食、喜食辛辣刺激、生冷及高盐饮食、胃癌家族史及现症感染Hp等危险因素差异均无统计学意义。两组患者病理情况比较:CAG组患者中,伴萎缩22例（占73.3%）、伴肠化29例（占96.7%）、伴异型增生1例（占3.3%）,两组患者胃黏膜病理积分有明显差异（t’=9.682,P<0.001）。两组患者胃黏膜端粒长度比较:两组患者胃黏膜相对端粒长度均不符合正态分布,CAG组相对端粒长度中位数为0.67,CNAG组相对端粒长度中位数为1.06,CAG组较CNAG组相对端粒长度短,差异有统计学意义（U=297.000,P=0.024）两组患者胃黏膜TRF1、TRF2、POT1mRNA及蛋白表达水平的比较:胃黏膜TRF1mRNA在CNAG组高表达,但差异无统计学意义（t=0.788,P=0.434）;TRF2mRNA在CAG组高表达,但差异无统计学意义（t=1.969,P=0.054）;POT1mRNA在CNAG组高表达,但差异无统计学意义（t’=-1.225,P=0.226）;TRF1、TRF2、POT1蛋白在CAG组均高表达,与CNAG组比较差异显着,有统计学意义（P<0.01）。两组患者胃黏膜p53mRNA表达水平的比较:p53mRNA在CAG组高表达,但差异无统计学意义（t=0.260,P=0.796）。胃黏膜端粒长度与年龄的相关性分析:CAG组及CNAG组胃黏膜端粒长度与年龄均无相关性（CAG 组:r=-0.303,P=0.131;CNAG 组:r=-0.195,P=0.302）胃黏膜端粒长度与 TRF1、TRF2、POT1、p53mRNA 及 TRF1、TRF2、POT1蛋白表达的相关性分析:CAG组p53mRNA表达水平与胃黏膜端粒长度存在轻度负相关（r=-0.396,P=0.031）,回归方程Y=-0.321X+1.099（F=3.438,P=0.074）,提示该回归方程无统计学意义,因而不能用p53mRNA表达水平预测CAG胃黏膜端粒长度,CNAG组胃黏膜端粒长度与TRF1、TRF2、POT1及p53mRNA水平均无相关性;CAG组TRF2、POT1蛋白表达量与胃黏膜端粒长度呈负相关,其中TRF2蛋白表达量与端粒长度的线性回归方程为Y=-0.041X+1.249（F=1.741,P=0.198）,提示该回归方程无统计学意义,不能用TRF2蛋白表达量预测CAG胃黏膜端粒长度,POT1蛋白表达量与端粒长度的线性回归方程为Y=-0.103X+1.272（R2=0.206,F=7.249,P=0.012）,CNAG 组胃黏膜端粒长度与 TRF1、TRF2、POT1蛋白表达量均无相关性。胃黏膜病理积分与胃黏膜相对端粒长度、TRF1、TRF2、POT1、p53mRNA表达水平及TRF1、TRF2、POT1蛋白表达水平的相关性:60例受试者胃黏膜病理积分与胃黏膜相对端粒长度呈负相关（r=-0.410,P=0.001）,线性回归方程为Y=-5.018X+11.54（R2=0.181,F=12.81,P<0.001）;胃黏膜病理积分与 TRF1mRNA表达水平无相关性（r=-0.054,P=0.682）,与TRF2mRNA表达水平呈正相关（r=0.339,P=0.008）,与 POT1mRNA 表达水平无相关性（r=0.052,P=0.695）,与p53mRNA表达水平亦无相关性（r=0.037,P=0.778）;胃黏膜病理积分与TRF1、TRF2、POT1蛋白表达量均呈正相关,与TRF1蛋白表达量回归方程为Y=1.974X+0.534（R2=0.437,F=45.04,P<0.001）,与 TRF2 蛋白表达量回归方程为Y=0.848X-1.457（R2=0.138,F=9.312,P=0.003）,与POT1蛋白表达量回归方程为 Y=1.743X+0.814（R2=0.294,F=24.15,P<0.001）。CAG发病的多因素Logistic回归分析:TRF1与POT1蛋白表达阳性为CAG的独立危险因素,TRF1蛋白表达阳性者发生CAG的风险是阴性者的16.54倍（95%CI:1.84-149.03）,POT1蛋白表达阳性者发生CAG的风险是阴性者的9.11倍（95%CI:1.64-50.54）。（2）固本通络汤治疗CAG的机制研究治疗前后病理资料比较:萎缩、肠化、慢性炎症治疗前后的构成比差异显着,具有统计学意义（P<0.01）;萎缩、肠化治疗前后积分及治疗前后总积分差异显着,具有统计学意义（P<0.001）;慢性炎症治疗前后积分无明显差异（P>0.05）;异型增生病例数仅为1例,因而治疗前后差异无统计学意义。治疗前后胃黏膜端粒长度的比较:治疗前胃黏膜相对端粒长度为0.30±0.16,治疗后为0.32±0.19,治疗前后差值为-0.02±0.20,差异无统计学意义（t=-0.549,P=0.587）,无法证明固本通络汤对治疗前后的胃黏膜端粒长度有影响。治疗前后胃黏膜TRF1、TRF2、POT1mRNA及蛋白表达水平比较:治疗前后TRF1表达水平较治疗前下降,差异有统计学意义（P<0.05）,治疗前后TRF2及POT1mRNA表达水平无差异,因此无法证明固本通络汤对TRF2及POT1mRNA表达有影响;治疗前后胃黏膜TRF1、TRF2及POT1蛋白表达量差异均无统计学意义（P>0.05）,无法证明固本通络汤对TRF1、TRF2及POT1蛋白表达有影响。治疗前后胃黏膜p53mRNA表达水平比较:治疗后p53mRNA的表达水平较治疗前下降,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:我们通过对CAG患者胃黏膜端粒长度、TRF1、TRF2、POT1mRNA及蛋白表达与p53mRNA表达水平的病例-对照研究发现:（1）CAG患者胃黏膜端粒长度较CNAG患者缩短,端粒的缩短与CAG的发生密切相关。（2）CAG患者胃黏膜TRF1、TRF2、POT1蛋白表达量显着高于CNAG患者;CAG患者胃黏膜TRF2、POT1蛋白表达量与胃黏膜端粒长度呈负相关,考虑CAG患者胃黏膜端粒缩短与TRF2、POT1蛋白的过表达有关。（3）CAG患者的p53mRNA表达水平与胃黏膜端粒长度存在轻度负相关,CAG患者中端粒长度缩短伴随着p53mRNA表达增高,初步考虑为p53通路的激活以介导细胞衰老,防止端粒过短被识别为DNA损伤,引起染色体不稳定而发生癌变,有待进一步研究证实。（4）本研究60例受试者胃黏膜病理积分与胃黏膜相对端粒长度呈负相关,与TRF2mRNA表达水平及TRF1、TRF2及POT1蛋白表达量均呈正相关,且有统计学意义,因此胃黏膜端粒长度、TRF2mRNA表达水平、TRF1、TRF2、POT1蛋白表达量均可以预测胃黏膜的病变程度。（5）TRF1和POT1蛋白表达阳性是CAG的独立危险因素,TRF1蛋白表达阳性者发生CAG的风险是阴性者的16.54倍,POT1蛋白表达阳性者发生CAG的风险是阴性者的9.11倍。临床上对胃黏膜TRF1及POT1蛋白的免疫组化检测可作为CAG诊断和预后的参考指标。通过对固本通络汤治疗后胃黏膜病理改善者的自身前后对照研究发现:（1）固本通络汤治疗前后胃黏膜相对端粒长度无明显差异,尚不能说明固本通络汤对胃黏膜端粒长度有影响。（2）固本通络汤可以下调TRF1mRNA的表达水平。（3）固本通络汤治疗前后TRF1、TRF2、POT1蛋白表达无明显差异,尚不能说明固本通络汤对TRF1、TRF2、POT1蛋白表达有影响。（4）固本通络汤可以下调p53mRNA表达水平,初步考虑固本通络汤可能是通过延缓端粒缩短的速度,为DNA损伤修复机制提供机会,阻断p53介导细胞衰老通路的激活,从而达到延缓胃衰老、逆转CAG的作用,然其机制尚有待于进行细胞体外和动物体内实验做进一步的验证。
陈文静[7]（2020）在《功能化纳米结构的设计及在肿瘤细胞检测、成像和药物递送中的应用》文中提出癌症,又称恶性肿瘤,是某些正常细胞在内源或外源致癌因子作用下发生转化,形成的具有分化和增殖异常、浸润性和转移性等生物学特征的非正常细胞,进而发展成为肿瘤组织的一种疾病。癌症患者死亡的主要原因之一是延迟诊断和治疗,因为症状通常要等到癌症晚期才出现。因此,癌症的早期、准确检测和精准诊断是治疗成功的前提和关键。常规的诊断方法存在特异性低和灵敏度低的问题,因此在肿瘤发生早期较难检测,而以肿瘤标志物为基础的癌症检测可显着改善早期诊断和后续治疗的效果。化疗作为常用的肿瘤治疗方法之一,存在非特异性给药的问题,即化疗药物对肿瘤细胞发挥杀伤作用的同时,对正常细胞也产生严重的副作用。此外,重复给药容易使肿瘤细胞对药物产生耐药性,降低治疗效果。因此迫切需要开发具有针对性功能的纳米结构,实现对癌症的早期、准确诊断和精准治疗。本论文致力于功能化纳米结构的设计及其在肿瘤细胞检测、成像和药物递送方面的应用。通过对目前报道的功能化纳米结构进行总结,发现随着功能化纳米结构的深入应用,逐渐暴露出一些不足和新的挑战:（1）针对肿瘤标志物,如何构建操作简便、便于携带、简单直观的可视化方法?（2）针对化疗产生的药物耐受性问题,如何在外排泵对药物外排的同时,降低肿瘤细胞的抗凋亡防御,恢复细胞对化疗药物的敏感性?（3）对于化疗产生的药物耐受性问题,通过纳米载体减少外排泵对药物的外排作用后,未能及时进入细胞核发挥作用的药物存在再次被外排的可能性,如何减少外排泵对药物的再次外排?本论文基于以上问题和挑战,开发了一系列功能化纳米结构,并将其用于肿瘤标志物端粒酶的可视化检测、肿瘤细胞膜蛋白的成像以及针对肿瘤细胞的药物递送和胞内的可控释放。论文主要分为以下五章内容:第一章为绪论部分,主要总结并概述了功能化纳米结构的设计原则及肿瘤细胞检测、成像和药物递送方面的应用,并在此基础上总结了现阶段功能化纳米结构存在的问题和新的挑战。第二章,构建了一种基于可转换的DNA末端的银纳米探针,用于端粒酶活性的灵敏、特异的比色检测。本设计是将端粒酶的作用下端粒酶结合底物的延伸特性和银纳米颗粒的等离子体效应相结合。在端粒酶的作用下,银纳米探针上的端粒酶结合底物延伸出端粒重复序列,刚性的DNA平末端转化为灵活的单链摇摆末端。摇摆末端增强了纳米探针的稳定性,并缓解了盐诱导的聚集,使得溶液呈黄色。当端粒酶失活时,平末端的纳米探针无法抵抗盐诱导的聚集,从而导致溶液呈灰色。基于端粒酶调节的DNA“平-摇摆”末端转换诱导的银纳米颗粒的分散性和颜色的变化,实现了基于银纳米颗粒的内源性端粒酶的比色检测。检测限相当于1 cell/μL的端粒酶活性,且通过颜色间的差异实现可视区分肿瘤细胞和正常细胞。这种策略将为生化研究和临床诊断提供一种可靠、方便定量端粒酶活性的新方法。第三章,构建了一种基于DNA-金纳米探针的横向流动生物传感器,用于端粒酶活性的快速、可视化检测。本设计是将端粒酶的作用下端粒酶结合底物的延伸特性、金纳米颗粒的等离子体效应和横向流动装置相结合,主要包括流动横向装置的制备与可视化检测研究。端粒酶结合底物在端粒酶的作用下发生链延伸,再将含有端粒酶延伸序列的样品滴加于样品垫上,在毛细作用下沿装置向后流动,端粒酶延伸产物可与水化结合垫上涂覆的金纳米颗粒表面修饰的DNA互补连接,再向后端流动,可与测试区的测试DNA结合,测试区出现红色,说明待测样品中的端粒酶具有活性。即样品滴加于该试纸条后,可自发在流动过程中发生DNA杂交、显色等系列反应,实现了端粒酶活性的快速、自动化检测。第四章,构建了一种pH响应型DNA纳米烟花,用于耐药型乳腺癌细胞的成像和化疗药物阿霉素在细胞内的pH响应式释放,一定程度上逆转肿瘤细胞的耐药并提高化疗的治疗效果。pH响应型DNA纳米烟花是以“可激活”式适体和i-motif结构为基本功能元件。纳米烟花的最外层Y型结构的外层序列设计为“可激活”MUC1适体,并在MUC1适体序列末端标记荧光基团Cy5和互补序列标记淬灭基团BHQ-2,实现了对耐药型乳腺癌细胞的特异性识别和成像。I-motif结构设计为pH响应型DNA纳米烟花层与层的交联点,在溶酶体内构象变化,实现了 pH响应型DNA纳米烟花的崩解和对Dox的快速释放,使胞内阿霉素浓度超过外排泵的泵出能力,从而更多的阿霉素进入细胞核发挥杀伤作用。结果表明设计的pH响应型纳米药物载体对肿瘤细胞的识别、成像和逆转耐药肿瘤细胞耐药性方面具有一定的应用潜力。第五章,构建了一种适体-DNA四面体纳米载体,用于耐药性乳腺癌细胞内靶向、协同的药物递送,逆转肿瘤细胞的耐药性并增强化疗效果。本设计是将MUC1适体的靶向性和化疗药物阿霉素与基因药物siRNA的协同作用相结合。MUC1适体可实现药物载体对MCF-7/ADR细胞的靶向递送。Bcl-2 siRNA作为抗凋亡基因抑制剂将Bcl-2mRNA的表达水平下调至24%,恢复肿瘤细胞对Dox的敏感性,从而提高Dox对肿瘤细胞的杀伤作用。与游离Dox相比,药物载体显示出加强的化疗效果。这些结果表明设计的药物载体在降低化疗药物副作用并逆转肿瘤细胞耐药性方面具有应用潜力。第六章为结论与展望部分,主要包括本论文的研究成果的总结和前景展望。
周化[8]（2019）在《新型端粒酶逆转录酶抑制剂的合成、活性评价及初步抗癌作用机制研究》文中认为在85%-90%的肿瘤细胞中端粒酶特异性表达以维持端粒的延伸。肿瘤细胞内端粒酶逆转录酶的水平增高,而在正常细胞中却难以检测到端粒酶的活性。目前端粒酶已成为高效、具有特异选择性的抗肿瘤药物开发的新靶标之一。基于化合物BIBR1532的结构特点及其与靶标可能的结合模式、国内外已报道的小分子端粒酶抑制剂的结构特征,本文共设计合成了三大类和其他具有不同结构特点的76个目标化合物。目标物的结构均经过核磁共振氢谱和高分辨质谱确认。所有目标物均未见端粒酶活性报道,其中60个尚未见文献报道。72个目标物其分子量在400以下。就其分子量而言,绝大多数目标物作为先导物仍然有较大的结构优化空间。本文测定了所有目标物对人黑色素瘤A375等四种癌细胞的抑制增殖活性。其中42个化合物在体外对人黑色素瘤A375等癌细胞的活性在中等和较强之间,其IC50值在1.87μM-88.60μM之间,弱于阳性对照药阿霉素,但强于BIBR1532。化合物2t对人黑色素瘤A375细胞的抑制活性较强,IC50值达到了1.87μM,约是阳性对照药阿霉素IC50值的2.4倍。基于化合物对癌细胞的抑制活性结果,本文明确了目标物抗癌活性的初步构效关系。丙烯酰胺类衍生物的初步构效关系如下:3-位取代苯环比萘环更有利,3-位苯环上有吸电子基团对活性提高是不利的;3-位氰基取代比环丙基取代更有利;酰胺的氢原子可被甲基或乙基取代,活性保持或提高。丁烯酮/肟类衍生物的初步构效关系如下:分子中羟肟取代比酮氧基取代对活性更有利,3-萘环取代比3-取代苯环和噻唑环更有利于活性的提高。与其他化合物相比,丙烯酰胺衍生物2a-2x、3a-3g和丁烯肟衍生物5a-5e对已测试的癌细胞具有更强的活性。我们选择了部分具有较强抗癌活性的目标物,研究其对人正常胃黏膜上皮GES-1细胞和人永生化正常肝L-02细胞的毒性,以判断其细胞选择性并为下一步的研究工作提供方向。本文发现2a-2x和3a-3g中部分化合物对GES-1和L-02细胞毒性较低。化合物5a和6a为富电子的二芳基不饱和化合物,其对正常细胞GES-1和L-02的毒性较大。本文选择了39个具有代表性的化合物进行体外端粒酶抑制活性的研究。其中27个化合物在体外具有良好的端粒酶抑制活性,其IC50值在0.62μM-25.50μM之间,21个化合物的活性优于阳性对照药星形孢菌素,但弱于BIBR1532。化合物2e在体外对端粒酶活性的IC50值达到了0.62μM,约为BIBR1532 IC50值的2倍。基于目标物对端粒酶的抑制活性结果,本文得到了端粒酶抑制活性的初步构效关系。丙烯酰胺衍生物的初步构效关系如下:3-位氰基取代比环丙基取代更有利;3-位苯环上具有位阻不大的供电子基团对活性提高是有利的;端粒酶的活性位点对具有一定空间位阻的基团如环丙基可能具有一定的容忍性;酰胺中的氢原子不是端粒酶抑制活性必需。丁烯酮/肟衍生物的初步构效关系如下:与丁烯酮衍生物相比,丁烯肟衍生物对端粒酶具有更强的抑制活性;该系列化合物3-位取代基为富电子的基团如萘基,对活性提高更有利。与其他化合物相比,丙烯酰胺衍生物2a-2x、3a-3g和丁烯肟衍生物5a-5e对端粒酶活性的抑制作用更强。本文以端粒酶与小分子BIBR1532的共晶结构为基础,将部分化合物与端粒酶的相互作用进行分子对接研究。对接结果显示上述化合物与BIBR1532在端粒酶中的结合方式基本一致。作者分别对化合物2e和2h抑制胃癌MGC-803和肝癌SMMC-7721细胞的机理进行初步研究,发现其均能阻滞癌细胞的细胞周期于G2/M期,并剂量依赖性地降低癌细胞端粒酶逆转录酶的表达水平从而抑制端粒酶的活性,进而诱导癌细胞的凋亡。基于以上结果,我们判断该类化合物为端粒酶逆转酶抑制剂,与预期靶标一致。综上,基于理性设计的方法,本文获得了在体外对部分癌细胞和端粒酶显示良好抑制活性、对正常细胞毒性较低、具有结构新颖性的丙烯酰胺类小分子抑制剂。上述结果与药物分子设计中实现BIBR1532类似物对实体瘤具有更强抗癌活性的目标相符。综合考虑目标物的活性、毒性和分子量大小等因素,丙烯酰胺衍生物2a-2x和3a-3g中活性较好的化合物如2t和3c可作为先导物进入下一轮化学修饰的结构优化和活性评价。
李静[9]（2019）在《TIN2基因突变对人胃黏膜上皮细胞GES-1端粒及染色体的影响》文中认为[目的]TIN2是一种端粒保护蛋白,在端粒蛋白复合体中起重要作用,目前已知的研究表明端粒保护蛋白复合体-Shelterin的结构改变,可以引起端粒功能的紊乱,导致一系列疾病的发生。本实验在建立稳定的TIN2基因突变真核载体和空载体的人胃黏膜上皮细胞GES-1基础上,来探讨TIN2基因突变对人胃粘膜上皮GES-1细胞的端粒及染色体影响。[方法]建立稳定的TIN2基因突变真核载体和空载体的人胃黏膜上皮细胞GES-1。通过免疫荧光/端粒肽核酸荧光原位杂交（PNA-Fish）实验检测TIN2基因突变是否能导致端粒DNA的损伤反应从而引发端粒功能障碍损伤灶（TIF）,通过染色体实验检测TIN2基因突变能否导致染色体畸变（环状染色体、染色体端-端融合）。Southern blot实验检测TIN2基因突变对端粒相对长度是否有影响。[结果]1、成功的构建了稳定的TIN2基因突变真核载体和空载体的人胃黏膜上皮细胞GES-1。2、PNA-Fish实验发现空载体组和空白组未出现明显损伤灶,TIN2基因突变真核载体的GES-1细胞组中出现了多于3个的端粒功能障碍损伤灶,其差异具有统计学意义（P<0.05）。3、染色体分析实验发现在TIN2基因突变真核载体的GES-1细胞组可观察到GES-1细胞染色体畸变,而在空载体组、空白组中没有观察到染色体畸变。差异具有统计学意义（P<0.05）。4、Southern blot实验结果证明,空载组、空白组中端粒的相对长度没有明显变化。TIN2基因突变真核载体的GES-1细胞组端粒的相对长度变短,差异具有统计学意义（P<0.05）。[结论]在人胃黏膜上皮GES-1细胞中,TIN2基因突变导致端粒功能障碍损伤灶和端粒平均长度缩短,以及染色体畸变。表明TIN2基因突变在胃癌的发生中可能起着一定的作用。
刘蕊[10]（2019）在《大黄素和端粒酶抑制剂联合应用引起端粒功能异常和细胞死亡》文中进行了进一步梳理目的:端粒对基因组的稳定性起着重要作用,端粒功能异常与疾病的发生息息相关。包括G四链体在内的高级结构,会引起端粒功能障碍,阻碍端粒酶识别并抑制端粒延长,导致端粒缩短。研究表明,一些小分子配体可以结合并稳定该结构,引起端粒DNA损伤并抑制端粒酶活性,进而抑制癌症的发生。然而,我们发现端粒酶可以修复这些端粒异常。在这里,我们试图回答G4稳定性配体和端粒酶抑制剂的联合应用是否可以诱导长期DNA损伤并抑制肿瘤生长。方法:（1）在天然化合物数据库中进行基于分子对接的虚拟筛选分析,以鉴定新型G4稳定性配体。通过圆二色光谱和紫外可见光谱的热变性实验进一步证明该配体（大黄素）对G4具有稳定作用。此外,采用IF-FISH的方法进一步证明大黄素对细胞内端粒G4的影响。（2）大黄素处理不同种类的细胞不同时间,采用IF-FISH和中期染色体FISH实验,检测大黄素对基因组DNA损伤和端粒功能的影响;采用TUNEL和SA-β-gal的方法检测大黄素对细胞凋亡和衰老的影响。（3）大黄素处理不同种类的细胞不同时间,采用TRAP和q-RT-PCR的方法检测大黄素对端粒酶活性的影响。（4）通过端粒酶抑制剂抑制端粒酶活性,再次检测大黄素对端粒酶阳性、端粒酶阴性和无端粒酶活性细胞的细胞增殖的影响以及对端粒功能异常现象的影响。（5）建立异种移植的乳腺癌小鼠模型,使用大黄素和端粒酶抑制剂联合处理小鼠,观察小鼠肿瘤的生长情况,明确联合处理对肿瘤发生的影响。结果:（1）利用基于分子对接的虚拟筛选、圆二色光谱和紫外可见光谱的热变性实验,根据能量值,大黄素被认为是最佳的候选配体之一,具有与G4结合并稳定G4的潜力。IF-FISH结果显示,大黄素可以稳定或诱导细胞内端粒G4的形成。（2）大黄素处理细胞48小时,IF-FISH和中期染色体FISH结果显示,大黄素引起端粒功能紊乱,包括端粒脆性位点、端粒丢失和端粒DNA损伤的增多;TUNEL和SA-β-gal结果显示,细胞凋亡和衰老的数量也明显增加。随着处理时间延长,IF-FISH和中期染色体FISH结果显示,大黄素引起的端粒功能紊乱以及细胞凋亡都得到了明显地恢复。（3）大黄素处理细胞48小时,TRAP和q-RT-PCR的结果显示,端粒酶活性和端粒酶逆转录酶mRNA的表达量明显升高。随着处理时间延长,q-RT-PCR结果显示,端粒酶逆转录酶mRNA的表达量下降。（4）大黄素和端粒酶抑制剂BIBR1532联合应用抑制端粒酶阳性细胞的增殖,但是对端粒酶阴性和无端粒酶活性的正常细胞没有抑制作用。此外,大黄素和端粒酶抑制剂联合应用长期处理细胞,观察到端粒功能异常无法恢复。（5）大黄素和端粒酶抑制剂BIBR1532联合应用处理异种移植的乳腺癌小鼠,观察到乳腺癌小鼠的肿瘤生长受到明显抑制。结论:我们首次发现大黄素诱导的端粒功能异常可以通过增强端粒酶活性,进而导致端粒功能障碍得到修复,削弱其抗癌作用。大黄素与端粒酶抑制剂联合使用可以协同诱导端粒功能障碍,抑制肿瘤的生长,进而为端粒酶阳性癌症的治疗提供新的治疗证据和策略。
二、人端粒及端粒重复序列结合因子的研究现状（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人端粒及端粒重复序列结合因子的研究现状（论文提纲范文）
（1）动态响应型DNA四面体探针设计及其用于活细胞内端粒酶原位分析研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 端粒及端粒酶概述 |
| 1.1.1 端粒 |
| 1.1.2 端粒酶 |
| 1.2 端粒酶研究意义 |
| 1.2.1 端粒酶与癌症的关系 |
| 1.2.2 端粒酶与组织衰竭疾病 |
| 1.2.3 端粒酶与皮肤病 |
| 1.3 端粒酶的检测方法 |
| 1.3.1 传统的检测方法 |
| 1.3.2 新型的生物传感检测方法 |
| 1.4 四面体DNA纳米结构及其应用 |
| 1.4.1 四面体DNA纳米结构 |
| 1.4.2 四面体DNA纳米结构的应用 |
| 1.5 本论文的研究目的和研究内容 |
| 1.5.1 研究目的 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 顺次点亮型DNA四面体探针用于分析活细胞中的端粒酶活性 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂和参数 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.3 实验步骤 |
| 2.3.1 顺次点亮型DNA四面体探针(SLMN)的制备 |
| 2.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳实验分析 |
| 2.3.3 细胞培养 |
| 2.3.4 细胞提取物中端粒酶活性的检测 |
| 2.3.5 细胞毒性分析 |
| 2.3.6 端粒酶活性的原位成像 |
| 2.3.7 测定细胞内端粒酶延长的产物长度分布 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 SLMN合成的表征 |
| 2.4.2 实验可行性研究 |
| 2.4.3 产物组成分析 |
| 2.4.4 灵敏性分析 |
| 2.4.5 特异性分析 |
| 2.4.6 细胞毒性分析 |
| 2.4.7 细胞成像 |
| 2.4.8 细胞内端粒酶延长的产物长度分布 |
| 2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 组件分离对接型DNA四面体探针用于成像肿瘤细胞中的端粒酶活性 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂和参数 |
| 3.2.2 仪器 |
| 3.3 实验步骤 |
| 3.3.1 DTDA的制备 |
| 3.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 3.3.3 细胞培养 |
| 3.3.4 细胞提取物中端粒酶活性的检测 |
| 3.3.5 细胞毒性分析 |
| 3.3.6 端粒酶活性的原位成像 |
| 3.3.7 流式细胞术实验 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 DTDA的序列优化及合成表征 |
| 3.4.2 DTDA的可行性研究 |
| 3.4.3 灵敏性分析 |
| 3.4.4 特异性分析 |
| 3.4.5 细胞毒性分析 |
| 3.4.6 细胞成像 |
| 3.4.7 流式细胞术分析 |
| 3.5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（2）人端粒酶逆转录酶hTERT鉴别乳腺良恶性肿瘤的Meta分析（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述:人端粒酶逆转录酶h TERT在乳腺肿瘤诊断治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的文章 |
（3）端粒长度及其关联基因多态性对精液质量的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 端粒及相关基因多态性与男性生殖健康 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）基于新型无酶生物传感体系的端粒酶及miRNA检测成像技术的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 端粒和端粒酶概述 |
| 1.1.1 端粒和端粒酶的发现 |
| 1.1.2 端粒和端粒酶的组成结构 |
| 1.1.3 端粒和端粒酶的功能 |
| 1.1.4 端粒和端粒酶的研究应用 |
| 1.1.5 端粒酶的测定 |
| 1.2 基于生物传感器的检测方法 |
| 1.2.1 生物传感器的检测原理 |
| 1.2.2 电化学生物传感器检测 |
| 1.2.3 荧光生物传感器检测 |
| 1.2.4 其他生物传感器检测 |
| 1.3 核酸纳米结构在检测中的应用 |
| 1.3.1 核酸纳米结构的可控组装 |
| 1.3.2 核酸纳米结构在体外生物传感中的应用 |
| 1.3.3 核酸纳米结构在细胞内成像中的应用 |
| 1.4 本课题的研究意义 |
| 第2章 基于金纳米粒子的端粒酶直接电化学生物传感 |
| 2.1 背景介绍 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 材料和化学品 |
| 2.2.2 细胞培养和端粒酶提取 |
| 2.2.3 凝胶电泳 |
| 2.2.4 AuNPs的制备和表征 |
| 2.2.5 工作电极预处理和实验条件优化 |
| 2.2.6 端粒酶延伸和AuNPs捕获 |
| 2.2.7 电化学测量 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 端粒酶活性测定的原理 |
| 2.3.2 AuNPs图像和实验优化 |
| 2.3.3 使用凝胶电泳检测端粒酶活性 |
| 2.3.4 生物传感器构建的表征 |
| 2.3.5 端粒酶活性的量化 |
| 2.3.6 传感器的评估 |
| 2.4 结论 |
| 第3章 基于比率型电化学传感策略的端粒酶活性超灵敏检测 |
| 3.1 背景介绍 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验材料和试剂 |
| 3.2.2 二硫键的还原反应 |
| 3.2.3 细胞培养和端粒酶提取 |
| 3.2.4 端粒酶活性检测过程 |
| 3.2.5 电化学测量 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 端粒酶检测的原理 |
| 3.3.2 电极修饰过程的表征 |
| 3.3.3 比率传感器的表征 |
| 3.3.4 端粒酶活性的检测 |
| 3.3.5 端粒酶抑制剂的分析 |
| 3.3.6 不同细胞系端粒酶活性分析 |
| 3.4 结论 |
| 第4章 基于荧光共振能量转移和DNA纳米探针的比率型传感器用于端粒酶活性分析 |
| 4.1 背景介绍 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 材料和化学品 |
| 4.2.2 DNA四面体的制备 |
| 4.2.3 细胞培养及端粒酶的提取 |
| 4.2.4 凝胶电泳实验 |
| 4.2.5 DNA探针的毒性检测 |
| 4.2.6 端粒酶活性的体外定量 |
| 4.2.7 原位成像 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 传感原理 |
| 4.3.2 检测体系的适用性 |
| 4.3.3 检测体系的荧光定性分析 |
| 4.3.4 DNA纳米探针的毒性分析 |
| 4.3.5 荧光信号的浓度优化 |
| 4.3.6 端粒酶活性的体外分析 |
| 4.3.7 特异性调查 |
| 4.3.8 细胞内成像 |
| 4.4 结论 |
| 第5章 基于miRNA触发的DNA酶步行器用于端粒酶活性的逻辑门传感检测 |
| 5.1 背景介绍 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 实验试剂和材料 |
| 5.2.2 AuNPs和MnO_2的合成 |
| 5.2.3 AuNPs探针和DNA酶的预处理 |
| 5.2.4 细胞培养和端粒酶提取 |
| 5.2.5 端粒酶和miRNA的体外检测和分析 |
| 5.2.6 检测体系的特异性和毒性测定 |
| 5.2.7 共聚焦荧光显微镜的细胞内成像 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 实验原理 |
| 5.3.2 检测体系的荧光表征 |
| 5.3.3 反应条件的优化 |
| 5.3.4 端粒酶和miRNA体外传感检测 |
| 5.3.5 检测体系的评估 |
| 5.3.6 细胞毒性实验 |
| 5.3.7 目标物的共聚焦成像 |
| 5.4 总结 |
| 第6章 基于核酸四面体和荧光探针介导的端粒酶与MiR-21的检测和细胞内成像 |
| 6.1 背景介绍 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 化学试剂和仪器 |
| 6.2.2 TDNs-Flare探针的制造 |
| 6.2.3 细胞培养和端粒酶提取 |
| 6.2.4 端粒酶和miR-21的体外评估 |
| 6.2.5 TDNs-Flare探针的细胞特异性和毒性测定 |
| 6.2.6 共聚焦荧光显微镜的细胞内成像 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 TDNs-Flare探针检测端粒酶和miR-21的原理 |
| 6.3.2 TDNs-Flare探针的结构和光学表征 |
| 6.3.3 端粒酶和miR-21的体外检测 |
| 6.3.4 检测方法的稳定性和细胞毒性 |
| 6.3.5 TDNs-Flare探针用于原位成像 |
| 6.4 结论 |
| 第7章 论文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与其他研究成果 |
（5）肾细胞癌组织中hTERT启动子甲基化水平与其临床病理意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 人TERT启动子甲基化水平及其与肾细胞癌病理特征的关系研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 人hTERT启动子甲基化水平等影响肾细胞癌预后的多因素分析 |
| 前言 |
| 对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 综述 肾癌DNA甲基化研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 附英文文章 |
（6）基于人胃黏膜端粒调控网络与衰老学说探讨固本通络汤治疗慢性萎缩性胃炎的机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词索引 |
| 前言 |
| 附: 技术路线图 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1. 慢性萎缩性胃炎现代医学研究进展 |
| 1.1 GA、GIM、Dys |
| 1.2 病因学 |
| 1.3 临床表现 |
| 1.4 诊断 |
| 1.5 治疗 |
| 1.6 结语与展望 |
| 参考文献 |
| 2. 慢性萎缩性胃炎的中医药研究进展 |
| 2.1 病名溯源 |
| 2.2 病因病机 |
| 2.3 中医药治疗 |
| 2.4 实验研究 |
| 2.5 结语与展望 |
| 参考文献 |
| 3. 端粒调控网络与衰老及慢性萎缩性胃炎相关研究现状 |
| 3.1 端粒概述 |
| 3.2 端粒调控网络与衰老 |
| 3.3 端粒与慢性萎缩性胃炎相关研究 |
| 3.4 结语与展望 |
| 参考文献 |
| 4. 周斌教授从“胃天年”论治慢性萎缩性胃炎经验述要 |
| 4.1 “胃天年”理论的创立及学术思想溯源 |
| 4.2 周斌教授基于“胃天年”理论治疗慢性萎缩性胃炎经验述要 |
| 4.3 结语与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 CAG患者胃黏膜端粒长度、TRF1、TRF2、POT1mRNA及蛋白表达与p53mRNA表达水平的病例-对照研究 |
| 1. 临床资料与方法 |
| 2. 研究结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 固本通络汤治疗CAG的机制探讨 |
| 1. 临床资料与方法 |
| 2. 研究结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 1. 全文结论 |
| 2. 创新点 |
| 3. 局限性与展望 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附录 |
（7）功能化纳米结构的设计及在肿瘤细胞检测、成像和药物递送中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号与缩写 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 癌症及其诊断与治疗 |
| 1.2 功能化纳米结构的设计 |
| 1.2.1 纳米材料 |
| 1.2.2 功能化纳米结构用于肿瘤细胞检测、成像和药物递送的设计 |
| 1.3 功能化纳米结构用于肿瘤细胞检测的研究 |
| 1.4 功能化纳米结构用于肿瘤细胞成像的研究 |
| 1.5 功能化纳米结构用于肿瘤细胞药物递送的研究 |
| 1.5.1 治疗单元 |
| 1.5.2 靶向单元 |
| 1.5.3 刺激响应单元 |
| 1.6 本论文解决的科学问题及研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 基于可转换的DNA末端的银纳米探针用于人端粒酶活性的比色检测 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂和仪器 |
| 2.2.2 纳米探针的合成 |
| 2.2.3 细胞培养和端粒酶的提取 |
| 2.2.4 端粒酶的比色检测 |
| 2.2.5 传感体系的透射电子显微镜表征 |
| 2.2.6 凝胶电泳实验 |
| 2.2.7 纳米探针表面DNA修饰量的表征 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 基于可转换的DNA末端的银纳米探针用于人端粒酶活性的比色检测的设计原理 |
| 2.3.2 可行性分析 |
| 2.3.3 检测原理的验证 |
| 2.3.4 纳米探针表面DNA修饰量的优化 |
| 2.3.5 银纳米探针分析性能的考察 |
| 2.3.6 端粒酶活性的可视化 |
| 2.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于DNA-金纳米探针的横向流动生物传感器用于人端粒酶活性的比色检测 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂和仪器 |
| 3.2.2 金纳米颗粒的合成 |
| 3.2.3 金纳米颗粒的透射电子显微镜表征 |
| 3.2.4 DNA修饰的金纳米探针的合成及浓度测定 |
| 3.2.5 金纳米探针的动态光散射表征 |
| 3.2.6 金纳米颗粒表面DNA修饰量的测定 |
| 3.2.7 细胞培养和端粒酶的提取 |
| 3.2.8 横向流动生物传感器的制备 |
| 3.2.9 端粒酶活性的检测 |
| 3.2.10 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 基于DNA-金纳米探针的横向流动生物传感器用于人端粒酶活性的比色检测的设计原理 |
| 3.3.2 金纳米颗粒的表征 |
| 3.3.3 DNA-金纳米探针的表征 |
| 3.3.4 DNA-金纳米探针表面DNA修饰量的表征 |
| 3.3.5 横向流动生物传感器的准备 |
| 3.3.6 横向流动生物传感器能否正常使用的验证 |
| 3.3.7 端粒酶结合底物在不同细胞裂解中的延伸 |
| 3.3.8 横向流动生物传感器的线性关系考察 |
| 3.3.9 横向流动生物传感器的特异性考察 |
| 3.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 pH响应型DNA纳米烟花用于耐药型乳腺癌细胞的成像和药物递送 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂和仪器 |
| 4.2.2 pH响应型DNA纳米烟花的合成 |
| 4.2.3 凝胶电泳实验 |
| 4.2.4 pH响应型DNA纳米烟花中阿霉素插入量的考察 |
| 4.2.5 细胞培养 |
| 4.2.6 体外释放实验 |
| 4.2.7 荧光显微镜成像 |
| 4.2.8 流式细胞术 |
| 4.2.9 细胞存活率实验 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 pH响应型DNA纳米烟花用于耐药型乳腺癌细胞的成像和药物递送的设计原理 |
| 4.3.2 pH响应型DNA纳米烟花的合成及表征 |
| 4.3.3 pH响应型DNA纳米烟花的特异性识别 |
| 4.3.4 pH响应型DNA纳米烟花中阿霉素插入量的考察 |
| 4.3.5 pH响应型DNA纳米烟花中阿霉素的体外释放研究 |
| 4.3.6 共定位考察pH响应型DNA纳米烟花在细胞内的分布 |
| 4.3.7 pH响应型DNA纳米烟花中阿霉素的细胞内释放研究 |
| 4.3.8 细胞存活率的考察 |
| 4.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 适体-DNA四面体纳米载体用于耐药型乳腺癌细胞的靶向、协同药物递送 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 试剂和仪器 |
| 5.2.2 siRNA@MUC1-Td和MUC1-Td的合成 |
| 5.2.3 siRNA@MUC1-Td在不同介质中时间稳定性的考察 |
| 5.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳实验 |
| 5.2.5 阿霉素插入量的考察 |
| 5.2.6 细胞培养 |
| 5.2.7 荧光显微镜成像和荧光共聚焦成像 |
| 5.2.8 实时荧光定量PCR |
| 5.2.9 细胞存活率实验 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 适体-DNA四面体纳米载体用于耐药型乳腺癌细胞的靶向、协同药物递送的设计原理 |
| 5.3.2 siRNA@MUC1-Td的合成及表征 |
| 5.3.3 siRNA@MUC1-Td在不同介质中时间稳定性的考察 |
| 5.3.4 阿霉素插入量的考察 |
| 5.3.5 siRNA@MUC1-Td靶向性的考察 |
| 5.3.6 细胞内Dox蓄积量的考察 |
| 5.3.7 共定位考察siRNA@MUC1-Td在细胞内的分布 |
| 5.3.8 Bcl-2 siRNA基因沉默效率的考察 |
| 5.3.9 细胞存活率的考察 |
| 5.3.10 细胞凋亡检测 |
| 5.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 致谢 |
| 博士期间发表论文 |
| 附件 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（8）新型端粒酶逆转录酶抑制剂的合成、活性评价及初步抗癌作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1.前言 |
| 1.1 端粒及端粒酶 |
| 1.2 端粒酶活性抑制剂的研究进展 |
| 1.2.1 逆转录酶抑制剂 |
| 1.2.2 G-四链体稳定剂 |
| 1.2.3 其他靶点的抑制剂 |
| 1.3 新型端粒酶逆转录酶抑制剂的理性设计 |
| 1.4 抗癌、细胞毒性及端粒酶活性评价思路 |
| 1.5 目标物的合成路线设计 |
| 1.5.1 丙烯酰胺衍生物 |
| 1.5.2 丁烯酮和丁烯肟衍生物 |
| 1.5.3 戊二烯酮衍生物 |
| 1.5.4 化合物W_1-W_6 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 化合物合成和结构表征的主要试剂和仪器 |
| 2.2 目标化合物的合成及结构表征 |
| 2.2.1 丙烯酰胺衍生物 |
| 2.2.2 丁烯酮/肟衍生物 |
| 2.2.3 戊二烯酮衍生物 |
| 2.2.4 化合物W_1-W_6 |
| 2.3 合成中遇到的问题 |
| 2.3.1 吸电子基团取代的1,3-二苯基-丁-2-烯酮 |
| 2.3.2 化合物W_X系列 |
| 2.4 活性及机制研究的实验材料和方法 |
| 2.4.1 实验材料 |
| 2.4.2 活性及机制研究实验方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 单晶结构解析 |
| 3.2 抗癌活性及正常细胞毒性评价 |
| 3.2.1 丙烯酰胺衍生物的活性 |
| 3.2.2 丁烯肟/酮衍生物的活性 |
| 3.2.3 戊二烯酮衍生物和其他化合物的活性 |
| 3.2.4 细胞毒性 |
| 3.3 端粒酶的抑制活性 |
| 3.3.1 部分丙烯酰胺衍生物的活性 |
| 3.3.2 部分丁烯酮/肟衍生物的活性 |
| 3.3.3 部分戊二烯酮衍生物和W2 的活性 |
| 3.4 细胞周期 |
| 3.5 细胞凋亡 |
| 3.6 蛋白免疫印迹 |
| 4.讨论 |
| 4.1 抗癌活性的初步构效关系 |
| 4.1.1 丙烯酰胺衍生物 |
| 4.1.2 丁烯肟/酮衍生物 |
| 4.1.3 戊二烯酮衍生物 |
| 4.1.4 部分化合物的细胞毒性 |
| 4.2 端粒酶活性的初步构效关系 |
| 4.2.1 丙烯酰胺衍生物 |
| 4.2.2 丁烯酮/肟衍生物 |
| 4.2.3 戊二烯酮衍生物 |
| 4.3 抗癌与端粒酶抑制活性相关性分析 |
| 4.4 分子对接 |
| 4.5 下一步研究计划 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（9）TIN2基因突变对人胃黏膜上皮细胞GES-1端粒及染色体的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.1.3 主要溶液的配置 |
| 2.1.4 主要溶液的配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 GES-1 细胞及其转染的细胞的培养 |
| 2.2.2 PLV-hTIN2P232S慢病毒突变载体的构建 |
| 2.2.3 稳定TIN2 基因突变真核载体和空载体GES-1 细胞系的建立 |
| 2.2.4 蛋白免疫印迹检测Flag蛋白的表达 |
| 2.2.5 PNA-Fish检测端粒功能损伤灶 |
| 2.2.6 制备染色体 |
| 2.2.7 测量平均端粒长度 |
| 2.2.8 端粒的相对长度的计算 |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 成功构建TIN2 突变载体 |
| 3.1.1 TIN2 突变载体DNA测序分析 |
| 3.2 成功构建TIN2 基因突变真核载体和空载体的GES-1 细胞 |
| 3.2.1 荧光显微镜观察结果 |
| 3.2.2 TIN2 基因突变真核载体和空载体的GES-1 细胞中突变TIN2 蛋白的表达 |
| 3.3 免疫荧光/端粒肽核酸荧光原位杂交(PNA-Fish)检测端粒功能障碍 |
| 3.4 染色体分析 |
| 3.5 测量端粒的相对长度 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 作者攻读学位期间的科研成果 |
| 本研究课题资助项目 |
| 致谢 |
（10）大黄素和端粒酶抑制剂联合应用引起端粒功能异常和细胞死亡（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、G4稳定性配体的筛选 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.1.4 主要溶液配制 |
| 1.1.5 实验方法 |
| 1.1.6 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 G4 稳定性配体的虚拟筛选 |
| 1.2.2 大黄素对细胞内端粒G4 的影响 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、大黄素对基因组DNA和端粒功能的影响 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要溶液配制 |
| 2.1.5 实验方法 |
| 2.1.6 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 大黄素对基因组DNA的短期影响 |
| 2.2.2 大黄素对端粒功能的短期影响 |
| 2.2.3 大黄素对端粒功能的长期影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、大黄素对端粒酶活性的影响 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 研究对象 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 主要溶液配制 |
| 3.1.5 实验方法 |
| 3.1.6 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 大黄素对端粒酶活性的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 四、大黄素和端粒酶抑制剂联合应用对细胞增殖和肿瘤的影响 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 研究对象 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.1.4 主要溶液配制 |
| 4.1.5 动物实验 |
| 4.1.6 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 大黄素和端粒酶抑制剂联合应用对细胞增殖及端粒的影响 |
| 4.2.2 大黄素和端粒酶抑制剂联合应用对肿瘤的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 G4结构稳定剂的应用进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、人端粒及端粒重复序列结合因子的研究现状（论文参考文献）
- [1]动态响应型DNA四面体探针设计及其用于活细胞内端粒酶原位分析研究[D]. 张芮源. 山东大学, 2021(12)
- [2]人端粒酶逆转录酶hTERT鉴别乳腺良恶性肿瘤的Meta分析[D]. 唐铃丰. 重庆医科大学, 2021(01)
- [3]端粒长度及其关联基因多态性对精液质量的影响[D]. 刘欢. 新乡医学院, 2021
- [4]基于新型无酶生物传感体系的端粒酶及miRNA检测成像技术的研究[D]. 孟凡渝. 中国科学技术大学, 2020(01)
- [5]肾细胞癌组织中hTERT启动子甲基化水平与其临床病理意义[D]. 郑建波. 山东大学, 2020(01)
- [6]基于人胃黏膜端粒调控网络与衰老学说探讨固本通络汤治疗慢性萎缩性胃炎的机制[D]. 赵兵. 中国中医科学院, 2020(01)
- [7]功能化纳米结构的设计及在肿瘤细胞检测、成像和药物递送中的应用[D]. 陈文静. 山东大学, 2020(12)
- [8]新型端粒酶逆转录酶抑制剂的合成、活性评价及初步抗癌作用机制研究[D]. 周化. 安徽医科大学, 2019(07)
- [9]TIN2基因突变对人胃黏膜上皮细胞GES-1端粒及染色体的影响[D]. 李静. 南华大学, 2019(01)
- [10]大黄素和端粒酶抑制剂联合应用引起端粒功能异常和细胞死亡[D]. 刘蕊. 天津医科大学, 2019(02)