一、HPV58 E6基因的克隆及体外表达（论文文献综述）
杜阳阳[1]（2020）在《宫颈脱落细胞HPV58感染状况及其E6E7重组病毒的构建》文中研究说明目的1、了解宫颈脱落细胞人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）感染状况,探究高危型人乳头瘤病毒（high risk-HPV,HR-HPV）感染与宫颈细胞病理学特征之间的关系。2、利用人乳头瘤病毒58突变型E6E7（Mutant type E6E7,m E6E7）融合基因为靶点,以对人无致病性的巨细胞病毒株（Towne株）细菌人工染色体（SW102Towne bacterial artificial chromosome,SW102-T-BAC）为载体,构建携带HPV58m E6E7融合基因的重组病毒,鉴定HPV58m E6E7转化活性,为HPV58型治疗性疫苗研究奠定基础。方法1、收集体检普查女性宫颈脱落细胞,以所提DNA为模板,用HPV L1区通用引物MY09/11,进行PCR扩增,检测宫颈脱落细胞总感染率;利用HPV E6型特异性引物检测宫颈脱落细胞中具体感染型别;统计分析HPV感染与临床病理特征的关系。2、PCR扩增带有50bp Towne开放读码框（open reading frame,ORF）75左右同源臂的Galk、HPV58 E6E7融合基因,采用凝胶回收试剂盒对目的基因片段切胶、回收并纯化。将Galk片段电转至SW102-T-BAC感受态细胞内,使其发生同源重组,通过含有Galk及氯霉素抗性培养基筛选,获得带有Galk的SW102-T-ORF75-GalkBAC克隆,制备其感受态细胞;然后分别将纯化的m E6E7和w E6E7融合基因,电转到SW102-T-ORF75-Galk-BAC感受态细胞,通过脱Galk及氯霉素抗性培养基筛选,获得SW102-T-ORF75-HPV58-m E6E7-BAC及SW102-T-ORF75-HPV58-w E6E7-BAC克隆。提取所得克隆质粒DNA,转染到ARPE-19细胞,逆转录PCR及测序分析验证转染细胞HPV58-m E6E7及HPV58-w E6E7表达状况;观察重组病毒T-ORF75-HPV58-m E6E7及T-ORF75-HPV58-w E6E7对转染ARPE-19细胞的影响,通过软琼脂克隆分析HPV58-m E6E7及HPV58-w E6E7转化活性。结果1、经PCR扩增,检测到573例标本有HPV感染,HPV总感染率为56.85%。HPV16型的感染率为7.33%;HPV18型的感染率为2.62%;HPV58型的感染率为13.61%。依据年龄进行分组,各年龄段中41～50岁组HPV感染率较高为63.66%。对各年龄组HPV感染状况进行统计学分析显示,其差异具有统计学意义（P<0.05）。根据细胞病理学分期结果,HPV在HSIL组、LSIL组、ASC组、NILM组的阳性率分别是100%、80.15%、51.69%、51.55%,随着病变程度的降低HPV感染率呈现下降的趋势,统计分析其差异具有统计学意义（P<0.05）。且HPV58型在HSIL组的感染率较高为12.50%。2、获得了SW102-Towne-ORF75-m E6E7-BAC及SW102-Towne-ORF75-w E6E7-BAC的克隆。逆转录PCR及测序分析验证转染细胞中m E6E7及w E6E7的表达正确。转染SW102-T-ORF75-w E6E7-BAC的细胞生长失去接触抑制,因此出现重叠生长现象,其形态特征出现显着变化,由原来的梭形逐渐转变为圆形,肿胀,伴随着胞浆颗粒增多,并且在软琼脂中能够形成克隆;而转染SW102-TowneORF75-m E6E7-BAC及SW102-Towne-BAC及未转染细胞没有出现上述细胞的特点。结论1、所收集标本中HPV总感染率为56.85%,其中所检测型别中HPV58型感染率较高为13.61%。在体检普查41-50岁年龄组感染率较高为63.66%,并且随着宫颈病变严重程度的加重HPV总感染率呈现增高的趋势。因此有必要进行HPV治疗性疫苗的研究。2、获得了T-ORF75-HPV58-m E6E7和T-ORF75-HPV58-w E6E7重组病毒,并且T-ORF75-HPV58-m E6E7转化活性已经消除,为HPV58型治疗性疫苗的研究奠定了基础。图[14]幅;表[5]个;参[86]篇。
王雪恋[2]（2019）在《CRISPR-Cas9对HPV58阳性宫颈癌C33A细胞的基因编辑与治疗的实验研究》文中提出研究背景宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一。根据2018年全球癌症统计报告推算,2018年全球女性宫颈癌新发病例数为57万例,死亡病例数为31.1万例,发病病例和死亡比例在女性全身恶性肿瘤中均排在第四位。在中国,每年新增宫颈癌病例约14万例,死亡病例约3.7万例。目前公认的导致宫颈癌发生发展的主要危险因素是高危型人类乳头瘤病毒（Human Papillomavirus,HPV）的持续感染。从最初的HPV感染到宫颈癌的发生需要大约10-20年的时间,这意味着宫颈癌的发生是一个多因素相关的复杂过程。大多数宫颈癌是由HPV16和HPV18感染导致的。在我国,HPV58是继HPV16、18之后的导致宫颈癌的第三重要型别,且近年来感染率有升高趋势。近20年来,宫颈癌的5年生存率没有变化,所有目前的治疗策略（放疗、化疗、手术）在疗效上己经趋于平稳,这些治疗策略对正常细胞苛刻,对宫颈恶性组织的靶向性不够。有效预防HPV病毒感染的积极措施为接种HPV疫苗,但是当前的疫苗既不能预防所有类型的HPV感染,也不能治疗已经存在的病变。在研究HPV致病机制的基础上,如何有效清除HPV感染及控制HPV的致病能力,一直是宫颈癌防治的关键环节。当前亟需一种有效的治疗HPV感染发病的方法及一种新型的更有效的宫颈癌治疗方式。20世纪80年代末到90年代初,研究人员在细菌和古细菌基因组中观察到一种脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid,DNA）序列,被称为规律成簇的间隔短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat squences,CRISPR）。随着研究的进展,人们认识到CRISPR-CRISPR相关序列（CRISPR-Associated Squences,Cas）系统是细菌和古细菌中一种获得性免疫系统,通过引导RNA（guide RNA,gRNA）介导,Cas酶特异性的切割外源遗传物质,用以对抗入侵的病毒和质粒。基因的异常表达导致很多人类疾病的发生。CRISPR-Cas9系统可以对高等生物的细胞基因组DNA精准高效的编辑,因此在各种人类疾病的基因治疗方面已展现出广阔的应用前景。CRISPR-Cas9系统对于清除生物体内的病毒感染是一种非常有效的方法。到目前为止比如乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）与肝癌、EB 病毒（Epstein-Barr virus,EBV）与Burkitt淋巴瘤和鼻咽癌、人类疱疹病毒与卡波西肉瘤及HPV与宫颈癌等的研究。当前,CRISPR-Cas9基因编辑技术主要应用于HPV16、18相关宫颈癌基因治疗的研究,但尚未有应用于HPV58相关宫颈癌治疗的报道。本课题拟研究CRISPR-Cas9系统在HPV58阳性宫颈癌细胞及组织中的基因编辑及治疗,具体研究内容包括以下两部分:第一部分:CRISPR-Cas9系统在HPV58阳性宫颈癌细胞增殖与凋亡的影响及其机制的实验研究研究目的:研究CRISPR-Cas9系统在HPV58阳性宫颈癌C33A细胞（C33A/LV-HPV58E6E7）靶向失活E6、E7基因及抑制癌细胞增殖和促进凋亡的分子机制,并验证CRISPR-Cas9系统是否可被发展成为抑制HPV58感染及相关宫颈癌的新一代基因治疗技术。研究方法:1.利用双gRNA法（成对的gRNA/Cas9 D10A策略）,设计并合成了四对不同的gRNA序列,并将它们分别酶连入载体pAIO-mCherry的相应表达框中,从而构建出可分别针对HPV58 E6、E7两个基因的CRISPR-Cas9系统的表达质粒 pAIO-mCherry/gRNAI、和 pAIO-mCherry/gRNA2、pAIO-mCherry/gRNA3 和pAIO-mCherry/gRNA4,并分别进行Sanger测序验证。2.使用T7核酸内切酶I（T7 EI）酶切试验,验证CRISPR-Cas9系统在目标基因组上的切割效率。选出具有Cas9切割效率的靶点片段,测序并分析结果。3.将CRISPR-Cas9系统的表达质粒转染入稳定表达HPV58型E6E7融合基因的人C33A宫颈癌细胞系（C33A/LV-HPV58E6E7）中。4.分别利用Westem-Blot检测、CCK-8增殖实验、AnnexinV-FITC/PI染色及流式细胞术实验检测CRISPR-Cas9系统对C33A/LV-HPV58E6E7细胞系E6、E7、p53、pRb蛋白表达及细胞增殖和凋亡的影响。研究结果:1.T7核酸内切酶I（T7EI）测定CRISPR-Cas9/gRNA切割效率:通过T7核酸内切酶I（T7EI）酶切试验,结果表明我们构建的CRISPR-Cas9系统可以成功且高效地对细胞基因靶点片段进行切割和编辑,其中Cas/gRNA1的切割率为 41.5%,Cas/gRNA2 的切割率为 54.6%,Cas/gRNA3 的切割率为 62.4%,Cas/gRNA4的切割率为49.7%。2.CRISPR-Cas9 系统可引起 C33A/LV-HPV58E6E7 细胞中 E6、E7 表达抑制,相应的 p53、pRb 蛋白上调:经 Cas/gRNA1、Cas/gRNA2、Cas/gRNA3、Cas/gRNA4质粒分别转染48小时后的C33A和C33A/LV-HPV58 E6E7细胞。Western-Blot检测细胞中E6、E7、p53和pRb蛋白的表达结果显示Cas/gRNA1、Cas/gRNA2可抑制C33A/LV-HPV58E6E7细胞E6基因表达,对E7基因表达不影响,相应的引起p53蛋白的增加;Cas/gRNA3、Cas/gRNA4可抑制C33A/LV-HPV58E6E7细胞E7基因表达,对E6基因表达不影响,相应的引起pRb蛋白的增加。3.CRISPR-Cas9系统抑制C33A/LV-HPV58E6E7肿瘤细胞增殖生长:对转染了Cas/gRNA1、Cas/gRNA2、Cas/gRNA3、Cas/gRNA4 的 C33A/LV-HPV58E6E7细胞以及C33A/HPV58和C33A细胞进行CCK-8细胞增殖实验检测。结果显示,CRISPR-Cas9系统分别有效地减缓C33A/HPV58+gRNA1、C33A/HPV58+gRNA2、C33A/HPV58+gRNA3 和 C33A/HPV58+gRNA4 的细胞OD值增长,即CRISPR-Cas9系统可以抑制C33A/LV-HPV58E6E7细胞的增殖活力,并从监测第一天开始可以一直维持到第5天。而仅仅转染了空白质粒载体的C33A细胞的增殖速率却不受CRISPR-Cas9系统的影响。同时,结果也表明HPV58对C33A肿瘤细胞的生长起促进作用。4.CRISPR-Cas9系统促进C33A/LV-HPV58E6E7肿瘤细胞凋亡:分别用Cas9/gRNA1、Cas9/gRNA2、Cas9/gRNA3、Cas9/gRNA4 处理 C33A/LV-HPV58 E6E7肿瘤细胞和C33A肿瘤细胞。流式细胞术检测结果显示C33A/LV-HPV58E6E7细胞在Cas9/gRNA处理后均显示凋亡率急剧增加。Cas9gRNAl、Cas9gRNA2 导致 C33A/LV-HPV58E6E7 细胞凋亡率达 60%,Cas9gRNA3、Cas9gRNA4 导致 C33A/LV-HPV58E6E7 细胞凋亡率达 40-50%。而 Cas9/gRNA处理后对C33A细胞的细胞凋亡率与空白组基本一致,没有明显的变化。研究结论:1.双gRNA法构建的CRISPR-Cas9系统,可以对HPV58肿瘤细胞基因组精确及有效地进行切割,是一种高效便捷的基因敲除技术。2.CRISPR-Cas9 系统可引起 C33A/LV-HPV58E6E7 细胞中 E6、E7 表达抑制,p53、pRb蛋白上调,并抑制C33A/LV-HPV58E6E7细胞的增殖活力,促进C33A/LV-HPV58E6E7细胞凋亡。CR1SPR-Cas9系统未来可以被开发成为辅助治疗HPV58感染及相关宫颈癌的一种基因治疗技术。第二部分:PBAE和Micelle与CRISPR-Cas9质粒合成纳米药物用于治疗HPV58相关宫颈癌的实验研究研究目的:验证基于聚β-氨基酯（Polybeta amino ester,PBAE）纳米颗粒和F127/PPO-NMe3/pCas9纳米胶束（Micelle）与CRISPR-Cas9质粒合成的新型纳米药物,能否成为治疗HPV58感染及相关宫颈癌的一种新型小分子靶向基因药物。研究方法:1.分别合成PBAE及纳米颗粒和制备Micelle纳米胶束,对其表征进行鉴定。2.将PBAE纳米颗粒及Micelle纳米胶束分别与CRISPR-Cas9系统的表达质粒合成纳米药物。将纳米药物分别作用HPV58阳性新鲜宫颈癌组织及C33A/LV-HPV58E6E7 细胞系。3.利用Western-Blot检测HPV58阳性宫颈癌组织中E6、E7、p53、pRb蛋白的表达变化,利用CCK-8增殖实验检测对C33A/LV-HPV58E6E7细胞系增殖影响。研究结果:1.新型纳米药物作用C33A/LV-HPV58E6E7细胞系后,可抑制C33A/LV-HPV58E6E7细胞生长:使用PBAE和Micelle制成的纳米颗粒分别与 Cas9/gRNAl、Cas9/gRNA2、Cas9/gRNA3、Cas9/gRNA4 功能质粒结合并分别作用C33A/LV-HPV58E6E7细胞系后,CCK-8细胞增殖实验检测显示C33A/LV-HPV58E6E7细胞的增殖活力均受到明显抑制,这种趋势从监测第1天就已经比较明显并可以一直维持到第5天。而C33A细胞的增殖速率却不受CRISPR-Cas9系统的影响。2.新型纳米药物作用于HPV58阳性宫颈癌组织,可抑制细胞中E6、E7表达,相应的p53、pRb蛋白上调:使用PBAE和Micelle制成的纳米颗粒分别与 Cas9/gRNAl、Cas9/gRNA2、Cas9/gRNA3、Cas9/gRNA4 功能质粒结合并作用上述两例HPV58阳性宫颈癌组织,Western Blot检测显示gRNA1、gRNA2可抑制细胞E6基因表达,相应的引起p53蛋白的增加;gRNA3、gRNA4可抑制C33A/LV-HPV58E6E7细胞E7基因表达,相应的引起pRb蛋白的增加。研究结论:使用PBAE纳米颗粒和Micelle纳米胶束做为药物载体,可输送CRISPR-Cas9质粒至细胞内,通过抑制HPV58阳性宫颈癌细胞中E6、E7表达,上调p53、pRb蛋白,可抑制C33A/LV-HPV58E6E7细胞的增殖活力,有望成为治疗HPV58感染及相关宫颈癌的新型小分子靶向基因药物。
周茜[3]（2019）在《HPV16治疗性mRNA纳米疫苗的制备及免疫原性研究》文中研究表明本研究制备了一种针对16型人乳头瘤病毒（HPV,human papillomavirus）的治疗性 mRNA 纳米疫苗（mRNA nanovaccine）。首先将HPV16的致癌基因E6E7合成,将其插入真核表达载体PVAX1,构建PVAX1-E6E7重组质粒。将其转化至大肠杆菌TOP10中扩大培养,提取质粒,经XbaI单酶切制备线性化的DNA模板,体外转录成E6E7 mRNA。用同样的技术路线构建PVAX1-GFP重组质粒,制备GFP mRNA。其次,由于无处不在的RNA酶,本研究构建了一种阳离子脂质纳米颗粒（Lipid nanoparticles,LNPs）,旨在保护mRNA疫苗不被降解,顺利进入细胞,经过溶酶体逃逸后抵达核糖体翻译抗原蛋白。首先以GFP mRNA作为报告基因摸索mRNA-LNPs保护递送系统的条件。通过倒置荧光显微镜观察发现GFP mRNA-LNPs在293细胞中的荧光表达量相比化学转染法显着增加。随后将E6E7 mRNA与LNPs自组装成HPV mRNA-LNPs纳米疫苗。通过ELISA检测发现,HPV mRNA-LNPs纳米疫苗在体外293细胞中的抗原表达量相比化学转染HPV mRNA的抗原表达量增强了 1.8倍。本研究通过动态光散射、电位、包封率等对纳米疫苗进行了探讨,HPV mRNA-LNPs纳米疫苗的粒径约为97 nm左右,PDI为0.137,电位为21mV、包封率为95.9%。随后,将E6E7致癌基因通过两端的BamhI和XhoI酶切位点克隆到Pet-28a表达载体上,构建Pet28a-E6E7,将其转入BL21菌株进行诱导表达,分别用不同浓度IPTG诱导E6E7融合蛋白,确定最佳诱导条件为:16℃,120rpm,O.1mMIPTG诱导20h。将诱导得到的包涵体蛋白进行变性再复性获得E6E7可溶性蛋白,通过Western Blot鉴定目的条带以及结合活性。结果表明,本研究纯化的E6E7融合蛋白具有良好的结合活性,为后续动物实验检测奠定基础。最后,构建治疗小鼠模型,比较LNPs、HPV mRNA-LNPs、HPV DNA-LNPs的肿瘤生长曲线、小鼠血清抗原特异性IgG抗体滴度、Th1型细胞因子TNF-α、IFN-y、和Th2型细胞因子IL-4的表达情况以及各组小鼠脾细胞T细胞亚群变化。结果表明:相对LNPs对照组,HPV mRNA-LNPs纳米疫苗组小鼠的肿瘤大小得到显着抑制（p<0.05）,抗体滴度升高,细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-4表达量均显着提高（p<0.01）。HPV mRNA-LNPs纳米疫苗组小鼠脾细胞CD4+T细胞和CD8+T细胞相对LNPs对照组均显着提高（p<0.05）。综上所述,本研究构建的HPV mRNA-LNPs纳米疫苗在小鼠体内产生了显着的肿瘤治疗效果,诱发了强烈的体液免疫以及细胞免疫应答。
王致萍[4]（2019）在《人乳头瘤病毒18型致癌蛋白E7的性质鉴定和单克隆抗体的筛选》文中研究表明人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus,HPV）主要感染人体皮肤和粘膜组织,引起增生性病变甚至恶性肿瘤。高危型别的HPV的长期感染是引发宫颈癌、肛门癌、头颈癌、口咽癌等恶性肿瘤的主要诱因。全球每年约57万宫颈癌新发病例,死亡病例高达31.1万例。目前宫颈癌的治疗手段有限,手术切除对人体伤害较大且有复发的风险,因此,开展HPV治疗性疫苗的研究刻不容缓。癌蛋白HPV E6和E7在肿瘤发生发展进程中起关键作用,被认为是干预和治疗的关键靶分子,因此对癌蛋白E6和E7的结构和功能展开深入的研究具有十分重要的意义。本研究分别利用原核表达系统和真核表达系统等多途径对HPV E6和E7蛋白的上清可溶性表达进行了探索,最终在pTO-T7载体上取得突破,经过密码子优化、表达菌株、洗脱条件和储存缓冲液等条件的探索和优化,克服了癌蛋白E7在原核表达系统中易聚集沉淀的难题,建立了一套稳定的表达纯化体系,获得了纯度90%以上、均一性和稳定性均良好的HPV18 E7蛋白,并对其展开了单克隆抗体的筛选,共获得55株与HPV18 E7蛋白具有良好反应性的单抗细胞株。本研究进一步对其中26株反应性优良的单抗细胞株展开抗体纯化和性质鉴定工作,包括抗体亚型、抗原抗体反应性、线性及构象和型特异性等。建立了HPV18 E7单抗盘,并且获得了1株反应性良好的型特异性构象抗体9A5、6株反应性良好的型特异性线性抗体（2E8、14E5、17F2、17F3、8A7、5C5、18E7和3B5）、1株反应性较弱的型特异性构象抗体（18E6）、6株两型交叉抗体（1A12、4A10、8E6、17A3、14A6和11E8）和1F6这株六型交叉线性抗体。综上,本研究建立了HPV18致癌蛋白E7可溶性表达和纯化体系,获得了高纯度且性质稳定的HPV18 E7蛋白并建立了单抗盘,为后续开展HPV18 E7蛋白结构解析、功能研究和治疗性疫苗或药物开发奠定了坚实的基础。
覃露[5]（2019）在《AD-HPV16/18/58mE6E7三价重组腺病毒载体治疗性疫苗的免疫效果研究》文中研究表明目的:本研究旨在通过动物实验再次验证本课题组前期实验构建的AD-HPV16/18/58mE6E7三价重组腺病毒载体治疗性疫苗对表达HPV58型E6E7融合基因的荷瘤小鼠的细胞免疫效果,并且继续通过动物实验验证新型疫苗对表达HPV16、18型E6和（或）E7基因的荷瘤小鼠的免疫效果,为今后子宫颈癌前病变及恶性肿瘤的免疫治疗提供实验基础和候选疫苗。方法:1、查找并验证稳定表达HPV16型E6和E7蛋白的鼠源宫颈癌细胞系:通过细胞公司购买HPV16的E6、E7及ras基因共转化的C57BL/6（H-2b）小鼠子宫颈癌TC-1细胞株,并通过RT-PCR及Western Blot实验再次验证该细胞系HPV16E6、E7基因和蛋白的表达情况。2、表达HPV16型E6和E7基因的小鼠成瘤及验证:利用扩大培养并验证后的TC-1细胞系对C57BL/6小鼠进行右背部皮下成瘤实验,并通过RT-PCR、WB验证成瘤小鼠肿瘤组织内HPV16E6、E7基因和蛋白的表达情况。3、构建并验证稳定表达HPV18型E6E7融合蛋白的鼠源宫颈癌细胞系:本课题组结合前期成功构建稳定表达HPV58型E6E7融合蛋白的U14细胞系（小鼠来源宫颈癌细胞株,HPV阴性）的经验,将已构建成功的稳定表达HPV18E6E7融合基因的带绿色荧光的慢病毒系统转染小鼠子宫颈癌U14细胞。转染成功扩大培养后,利用RT-PCR及Western Blot实验验证新构建的稳定表达HPV18E6E7融合蛋白的鼠源U14细胞系（命名为:U14/LV-HPV18E6E7）。4、表达HPV18型E6E7融合基因的小鼠成瘤及验证:利用扩大培养并验证后的U14/LV-HPV18E6E7细胞系对C57BL/6小鼠进行右背部皮下成瘤实验,并通过RT-PCR、WB验证成瘤小鼠肿瘤组织内HPV18E6E7融合基因和蛋白的表达情况。5、新型疫苗免疫效果研究:分别以稳定表达HPV16 E6和E7基因、HPV18、58E6E7融合基因的小鼠成瘤细胞系构建荷瘤小鼠模型,用前期构建的AD-HPV16/18/58mE6E7三价重组腺病毒载体治疗性疫苗免疫小鼠,通过皮下移植瘤形态学、移植瘤生长情况、肿瘤抑制率以及小鼠生存情况的观察;血清抗体ELISA、ELISPOT、特异性CTL杀伤等体液免疫和细胞免疫的检测,评价新型疫苗对抗HPV16、18、58型肿瘤的效果。结果:1、通过RT-PCR和Western-Blot实验验证了鼠源子宫颈癌TC-1细胞在体外、体内均可稳定表达HPV16E6和HPV16E7基因。2、成功构建稳定表达HPV18E6E7融合基因的U14细胞系（U14/LV-HPV18E6E7）,且通过RT-PCR和WB实验证实该细胞系可在体内外稳定表达HPV18E6E7融合基因。3、通过动物实验验证了新型三价治疗性腺病毒载体疫苗的免疫效果:经疫苗免疫后的C57BL/6小鼠在一定程度上能分别抑制表达HPV58E6E7融合蛋白、HPV16E6和E7蛋白、HPV18E6E7融合蛋白的小鼠子宫颈癌细胞U14的生长,能产生有效的体液和细胞免疫,保护免疫小鼠免受移植瘤的攻击。（1）在抗移植瘤保护实验研究中:疫苗对抗HPV58型、HPV16型和HPV18型肿瘤细胞作用的基本相同,疫苗组小鼠皮下移植瘤成瘤潜伏期长于对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）;疫苗组小鼠肿瘤生长速度较对照组缓慢,肿瘤平均瘤重较对照组明显减低,生存期较对照组延长,差异具有显着性（P<0.05）。（2）体液免疫血清特异性抗体检测实验（ELISA实验）研究中:疫苗对抗HPV58型、HPV16型和HPV18型肿瘤细胞的体液免疫作用的基本相同,免疫小鼠可分别诱发针对HPV58型E6和E7、HPV16型E7、HPV18型E7抗原表位多肽的血清特异性抗体,抗体效价最高均达1:25600,与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）细胞免疫ELISPOT实验研究中:疫苗对抗HPV58型、HPV16型和HPV18型肿瘤细胞的细胞免疫作用的基本相同,通过该实验已分别检测到HPV58型E6和E7、HPV16型E7、HPV18型E7抗原表位多肽诱导的特异性分泌IFN-γ的效应T细胞,且所有疫苗组小鼠ELISPOT的斑点数均明显多于对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）。（4）细胞免疫细胞毒性T细胞杀伤实验研究中:疫苗对抗HPV58型、HPV16型和HPV18型肿瘤细胞的细胞免疫作用的基本相同,乳酸脱氢酶法（LDH）检测到AD-HPV16/18/58mE6E7腺病毒载体疫苗对杀伤U14/LV-HPV58E6E7细胞、TC-1细胞、U14/LV-HPV18E6E7细胞的CTL反应最高分别达33.050%、30.160%、30.890%。结论:本研究成功构建了稳定表达HPV18E6E7融合蛋白的鼠宫颈癌U14细胞系,并系统验证了新型三价治疗性腺病毒载体疫苗AD-HPV16/18/58mE6E7能分别在HPV16、18、58型肿瘤小鼠体内诱导产生有效的体液和细胞免疫,证实了该疫苗的免疫保护和免疫治疗作用,可以作为今后HPV16、18、58型相关子宫颈癌前病变及宫颈癌的免疫治疗候选疫苗。另外,通过免疫实验进一步验证前期本课题组筛选的HPV58型E6和E7 HLA-A2限制性CTL表位抗原多肽的免疫原性,推选HPV58E6肽作为后续实验研究的首选HPV58型表位抗原多肽。
贾超颖,马伟红,王鹤[6]（2017）在《稳定表达人乳头瘤病毒58型（HPV58）E6E7融合基因的人宫颈癌细胞株C33A的构建及验证》文中指出为构建稳定表达人乳头瘤病毒（HPV）58型E6E7融合基因的人宫颈癌C33A细胞系,将实验前期构建好并实现真核表达的重组慢病毒颗粒LV-HPV58E6E7转染入HPV（–）的人宫颈癌C33A细胞,经流式细胞仪分选出稳定转染的阳性克隆,利用四唑盐比色（MTT）法检测转染后细胞的生长情况以及流式细胞术检测细胞周期,并将稳定表达HPV58E6E7融合基因的C33A细胞LV-HPV58E6E7/C33A接种于裸鼠左腋下成瘤,用荧光定量PCR（q RT-PCR）、Western blot检测瘤组织中HPV58型E6E7融合基因的转录和表达。结果显示HPV58E6E7融合基因可促进C33A细胞的增殖;LV-HPV58E6E7/C33A细胞株能在裸鼠体内稳定转录及表达HPV58型E6E7融合基因。这表明我们成功建立了能稳定表达HPV58E6E7融合基因的人宫颈癌C33A细胞系LV-HPV58E6E7/C33A,为HPV58型治疗性疫苗的免疫效果检测提供了抗原细胞来源。
马伟红[7]（2017）在《HPV16/18/58三价治疗性腺病毒载体疫苗的构建及其抗HPV58肿瘤免疫效果的研究》文中认为目的:人乳头瘤病毒（humanpapillomavirus,HPV）已被证实是子宫颈癌及癌前病变发生的首要因素且为始动因素[1],通过疫苗的方法来治疗和预防宫颈癌是目前研究的主要方向。本研究通过将点突变失去转化活性的HPV16、18、58mE6E7融合基因片段插入腺病毒（Adenovirus,AdV）表达载体,构建表达HPV16、18、58mE6E7融合基因的腺病毒载体疫苗,同时将含HPV58E6E7融合基因的慢病毒（Lentivirus,LV）转染小鼠宫颈癌U14细胞,构建稳定表达HPV58E6E7融合基因的U14细胞系,最后在表达HPV58E6E7融合基因的荷瘤小鼠模型中初步检测AD-HPV16/18/58mE6E7腺病毒载体疫苗对HPV58型相关肿瘤的免疫效果,为宫颈癌及其癌前病变的免疫治疗提供候选疫苗。方法:1、点突变后HPV16型、18型、58型mE6E7融合基因片段的获得:通过GENEBANK网站,获得HPV16型、18型、58型的E6和E7基因序列,根据文献研究将E6和E7基因片段序列融合并去除终止码,同时将E6和E7基因通过关键碱基点突变失去转化活性改造成突变体mE6和mE7,使用双顺反子表达元件IRES连接,使其变成HPV16mE6E7-IRES-HPV18mE6E7-IRES-HPV58mE6E7（3480bp）融合基因片段,借助于公司对该片段进行全基因合成及测序,命名为pGH-HPV16/18/58mE6E7,并通过PCR及酶切实验验证目的片段。2、腺病毒载体疫苗AD-HPV16/18/58mE6E7的构建:将HPV16/18/58mE6E7基因片段连接入腺病毒表达载体,构建表达HPV16、18、58mE6E7融合基因腺病毒载体疫苗,通过RT-PCR、Western-Blot检测HPV16mE6E7、HPV18mE6E7、HPV58mE6E7融合基因在293A细胞中的转录翻译。3、稳定表达hpv58e6e7融合基因的小鼠子宫颈癌u14细胞系构建:将已构建成功的稳定表达hpv58e6e7融合基因的慢病毒转染小鼠子宫颈癌u14细胞,经流式细胞仪分选出稳定转染的阳性克隆,利用rt-pcr、western-blot分别检测hpv58e6e7融合基因在稳定转染的u14细胞株中的表达,并将稳定转染hpv58e6e7融合基因的u14细胞接种于c57bl/6小鼠右背部皮下成瘤,用rt-pcr、western-blot验证荷瘤小鼠模型瘤组织中hpv58e6e7融合基因的表达。4、疫苗免疫效果研究:用前期构建的ad-hpv16/18/58me6e7腺病毒载体疫苗免疫c57bl/6小鼠,进行预防及治疗hpv58e6e7（+）小鼠子宫颈癌细胞u14细胞移植瘤实验。通过对免疫后的u14/lv-hpv58e6e7荷瘤小鼠形态学、肿瘤生长情况、生存期等方面的观察以及血清抗体elisa、elispot、ctl杀伤等体液和细胞免疫方面的检测,初步评价该疫苗在抗hpv58型病毒及抗肿瘤方面的效果。结果:1、全基因合成了表达点突变后hpv16、18、58型me6e7的质粒pgh-hpv16/18/58me6e7,并通过基因测序、pcr及酶切实验鉴定目的基因片段;2、成功构建了腺病毒载体疫苗ad-hpv16/18/58me6e7,通过rt-pcr、western-blot验证其可以在293a细胞中转录翻译hpv16型、18型、58型me6e7融合基因;3、成功构建了稳定表达hpv58e6e7融合基因的小鼠子宫颈癌细胞u14细胞系,通过rt-pcr、western-blot验证其在体外、体内均可稳定表达hpv58e6e7基因。4、动物试验研究结果证实:经疫苗免疫后的小鼠能够产生有效的体液免疫和细胞免疫,在一定程度上抑制表达hpv58e6e7融合蛋白的小鼠子宫颈癌细胞u14细胞的生长,保护免疫小鼠免受移植瘤的攻击。1)在抗移植瘤保护实验中,疫苗组小鼠皮下的移植瘤成瘤潜伏期时间长于对照组,两组之间有统计学差异（p<0.05）。2)疫苗组小鼠肿瘤生长速度较对照组明显减慢,生存期较对照组延长,肿瘤平均瘤重明显低于对照组,抑瘤率明显高于对照组,实验组与对照组比较有统计学意义（p<0.05）。3)体液免疫血清特异性抗体检测elisa实验:经疫苗免疫的小鼠可诱发针对HPV58型E6、E7抗原表位肽蛋白的血清特异性抗体体液免疫,检测抗体滴度最高可达1:25600,与对照组比较,差异有显着性（P<0.05）。4)细胞免疫IFN-γ检测ELISPOT实验:可检测到通过HPV58型E6、E7抗原表位肽蛋白诱导的特异性、分泌IFN-γ的效应T细胞,疫苗组小鼠ELISPOT的斑点数明显多于对照组,实验组与对照组差异有统计学意义（P<0.05）。5)细胞毒性杀伤CTL实验:LDH法检测到AD-HPV16/18/58mE6E7腺病毒载体疫苗杀伤U14/LV-HPV58E6E7细胞的CTL反应最高达28%,说明其在一定程度上保护免疫小鼠免受U14/LV-HPV58E6E7细胞的攻击。结论:总之,成功构建并真核表达了AD-HPV16/18/58mE6E7重组腺病毒载体疫苗,并能在小鼠体内诱导产生有效的体液免疫和细胞免疫,一定程度抑制HPV58E6E7（+）移植瘤的生长,具有免疫保护和免疫治疗作用,可以作为HPV58相关宫颈癌及其癌前病变的免疫治疗的候选疫苗。
赵玉娇[8]（2016）在《登革热流行病学调查及重症登革热病理机制研究》文中指出本研究首先对中国的登革热流行病学进行系统描绘,并从GenBank数据库中筛查出所有分离自中国的登革基因序列共749条,进行进化发育分析。结果显示,自1978年至2014年间,我国共计报告登革热感染病例累计达735735例。1978年～1991年间疫情主要集中在广东省和海南省,自1991年后集中在广东、云南、浙江和福建四省,占全国感染病例的90%以上。死亡人数有507人,多数在1988年以前。感染人群的年龄分布呈扇形,集中在20～45岁之间。流行的登革毒株主要为Ⅰ型和Ⅱ型,呈交叉循环或共同感染模式。存在本地循环传播和各省跨时空循环传播交替出现的特点,也存在同一毒株的本地延续性传播。将2013年云南登革流行株全基因序列与Ⅲ型登革病毒标准株对比,确定共有62个氨基酸突变,与其亲缘关系最近的为2013年海南流行株及2002年孟加拉国流行株。2015年获得的17个登革全基因序列经内部比对,共找到217处碱基突变位点,其中非结构蛋白区域共有213处。将42个结构蛋白基因序列与Ⅱ型标准株进行比对,共发现36个氨基酸突变产生。进化分析显示,该流行株与2004年斯里兰卡流行株及2001年印度流行株属于同一进化分支。对375例登革热患者进行临床病理分析,发现患者普遍存在不同程度的炎症反应、血管渗漏和肝损伤。血清中病毒载量并不是导致重症登革热的唯一原因,NSl含量、补体的合成和消耗与重症登革热具有相关性。利用Ⅱ登革病毒及其同型别前膜蛋白prM抗体建立人全血ADE模型,发现ADE感染组病毒拷贝数高于普通感染组2.94倍,补体C3水平降低61.5%。两个登革感染组上清中均有大量C3a、C5a产生,补体C3bBb含量也明显升高,其中ADE组高于普通感染组2.6倍,而C1q含量变化不大,证明补体旁路途径过度激活是ADE感染过程中的效应机制之一。最后利用阴性分离的单核细胞建立抗体依赖增强感染体外模型。两个登革感染组上清中均有大量C3a、C5a产生,伴随IL-10的表达升高。经免疫共沉淀、质谱鉴定及Western Blot验证,证明膜辅助蛋白CD46与NS1具有相互作用。与单核细胞ADE模型共培养后免疫荧光染色检测HuVEC表面C5b-9的形成,伊红染色观察细胞骨架改变。结果ADE组HuVEC有明显的病理损伤,提示补体过度激活可能是导致血管内皮细胞损伤和血管渗漏的原因之一。综合上述研究结果,我们提出了“补体风暴”假说。即登革病毒NS1在细胞中大量复制并游离至血液中,循环迁移到全身各处。通过竞争结合补体调控因子CD46,使CD46散失或部分抑制对补体的调控作用,引起补体旁路途径过度活化,产生大量补体裂解片段,导致类似超敏反应的全身性临床症状。
陈丽来[9]（2016）在《HPV58型E6和E7抗原的HLA限制性CTL表位的预测、筛选及免疫反应性的鉴定》文中研究表明目的：人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）已被证实是诱发子宫颈癌的病因。其早期区基因E6和E7参与病毒自我复制、转录以及肿瘤形成,故已成为了治疗子宫颈癌的理想靶位目标。本研究通过计算机软件筛选出HPV58 E6和E7的HLA-A2限制性细胞毒性的T淋巴细胞（Cytotoxic lymphocyte, CTL）抗原表位,并进行合成以及免疫反应性的鉴定,为HPV58表位疫苗制备及其他包含HPV58 E6和E7基因疫苗检测提供了候选表位抗原。方法：1.表位抗原的预测及其体液免疫反应鉴定：通过国内外各文献中提供的检测表位抗原网站及软件,对HPV58 E6和E7的表位抗原多肽的预测及筛选,并借助于公司对该表位抗原进行合成及纯化,将筛选出来的5条HPV58 E6多肽（分组命名为P61-P65）、以及3条HPV58 E7多肽（分别命名为P71-P73）、阴性肽段组P0、单纯弗氏不完全佐剂组P1与空白PBS对照组P2均进行相应的分组,并分别于第1、8、15天注射1次,在小鼠尾静脉注射,进行小鼠免疫实验,然后以筛选出来的表位抗原分别包被酶联板,以免疫后小鼠的血清作为一抗,以羊抗鼠的IgG作为二抗,以四甲基联苯胺（Tetramethyl benzidine, TMB）作为反应底物,分别在酶标仪上450nm波长测其吸光度OD值,最后根据其抗体滴度间接定性地检测多肽的体液免疫性。2. ELISPOT酶联斑点试验：提取免疫后小鼠的脾脏,进行淋巴细胞的提取,利用酶联板上原已包被好的抗IFN-γ抗体捕获提取的淋巴细胞分泌的IFN-γ,并以酶联斑点显色方式将其表现出来,再通过公司进行斑点数目的读板,通过斑点的数目来间接反应被激发的特异性T淋巴细胞的数目。3.LDH法细胞毒T细胞杀伤实验：提取并培养免疫后小鼠的淋巴细胞,并将其作为效应细胞,以已标记的C33A/LV-HPV58E6E7细胞作为靶细胞,效应细胞攻击靶细胞,导致靶细胞损伤,并且释放出乳酸脱氢酶（1actic dehydrogenase,LDH）,最后实验组结果与靶细胞对照孔对比,用比色的方法来测定LDH活性的比较,以此方法来计算效应细胞对靶细胞的杀伤力,进而判断效应T细胞的CTL活性。结果：1.综合文献以及网站的分析,得出以下关于HPV E6基因的5条9肽表位抗原以及E7基因的3条多肽（分别命名为P61.P62.P63.P64. P65.P71.P72和P73） P61:HPV58 E611.19:TLHDLCQAL； P62:HPV58 E695-103:CLNEILIRC； P63:HPV58 E618-26:ALETSVHEI； P64:HPV58 E665-73:VCLRLLSKI；P65:HPV58 E699-107:ILIRCIICQ；P71:HPV58 E769-77: CINSTTTDV； P72:HPV58 E714-22:DLHPEPTDL； P73:HPV58 E772-80: STTTDVRTL:以上8条多肽均有可能成为HPV58 E6和E7的优势表位抗原；在小鼠末次免疫第7天,将E6的5条多肽组、E7的3条多肽组、阴性肽组、佐剂组与PBS组都分别包被酶联板,实验组小鼠E6组的P62-P65组和E7组的P71-P73的血清抗体滴度均呈现阳性结果,其血清的抗体效价均为1：1600（P<0.05）,末次免疫第21天,E6组的P61-P65组和E7组的P71-P73均出现阳性结果,P61血清抗体效价为1：1600,而P62-P65以及P71-P73血清抗体效价均为1：3200,两次血清ELISA显示阴性肽段组P0、单纯佐剂组P1以及PBS空白组PBS P2均呈现阴性结果（P<0.05）,实验组P61-P65、P71-P73与阴性组P0、两组对照组P1、P2比较均有显着性差异,具有统计学意义。2.ELISPOT斑点实验结果：将各组末次免疫第14天的小鼠进行提取淋巴细胞实验后分别进行斑点实验,结果显示P62、P63、P64和P73组的小鼠均可检测到特异性的T细胞免疫,IFN-γ分泌细胞形成的斑点数分别为3.2*107个脾细胞、3.05*107个脾细胞、1.26*107个脾细胞和2.66*107个脾细胞,而P61.P65.P71.P72.阴性组P0、单纯佐剂组P1以及PBS空白组P2均没有特异性斑点出现（P<0.05）,实验组P62、P63、P64和P73组与对照组的比较均有显着性的差异,具有统计学意义。3.LDH法细胞毒T细胞杀伤实验结果：实验组的小鼠末次免疫第14天,实验组只有3条多肽P62:HPV58 E695-103:CLNEILIRC; P63:HPV58 E618-26: ALETSVHEI; P64:HPV58 E665-73:VCLRLLSKI;能够激起小鼠的特异性CTL免疫反应,说明了P62、P63以及P64组的多肽为HPV 58 E6和E7蛋白的有效CTL表位。结论：HPV58 E695-103. HPV58 E618-26和HPV58 E665-73具有较强的免疫原性,能够有效的诱发免疫后小鼠产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答,可成为针对HPV58型感染的表位疫苗制备及其他包含HPV58 E6和E7基因的治疗性疫苗检测的候选多肽表位抗原。
邹健[10]（2016）在《人乳头瘤病毒致宫颈癌的型别特异性差异的研究》文中指出在世界范围内,宫颈癌是女性第二大常见的恶性肿瘤,每年有527,624个新发病例和265,653个死亡病例（www.hpvcentre.net in Oct 31th,2014）,其中85%的宫颈癌发生在发展中国家。宫颈癌病因明确,大量的研究表明高危型人乳头瘤病毒（HPV）持续感染是宫颈癌及癌前病变的主要致病因素。HPV分高危型和低危型,高危型包括：HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV51、HPV52、 HPV56、HPV58、HPV61等。研究表明,HR-HPV表达的病毒癌基因E6和E7,可分别结合降解宿主细胞P53和Rb,引起细胞周期、增殖、侵袭、转移等生物学行为改变,促进细胞的恶性转化,最终导致宫颈癌发生与进展。但对不同型别的病毒癌蛋白之间是否存在差异尚不清楚。流行病学证据显示,各种型别HPV在细胞学正常妇女和不同宫颈病变患者中的感染频率并不相同,反应了不同型别病毒感染力和致病力的不同,但是否与宿主对HPV型别特异的易感性有关所知甚少。本研究从不同型别HPV致宫颈癌能力差异和不同型别HPV感染宿主是否与宿主易感性有关两方面进行研究,首先通过设计两条HPV58 E6特异性多肽片断,将多肽交联至三种不同载体蛋白,免疫兔子,获得特异性HPV58 E6兔单克隆抗体。其次,通过构建pFLAG-CMV5.1-HPV58E6/E7和pFLAG-CMV5.1-HPV16 E6/E7真核生物表达质粒,转染293T和U20S细胞,观察HPV58E6/E7和HPV16 E6/E7基因对细胞的周期、凋亡、侵袭能力的差异及下游分子的表达差异,比较两者致癌能力的差异。最后,收集3299例宫颈脱落细胞样本,选出875例单纯HPV16,18,52,58阳性和HPV阴性,提取DNA,通过Illumina BeadXpress VeraCode platformSNP分型检测技术,对HPV感染相关受体基因（EGFR, PPIB, HSPG2, FGFR2, FURIN, ITGA6, TSPAN1和SDC2）上的96个tagSNP位点进行检测,分析目的基因SNP与型别特异HPV感染和官颈病变进展的相关性。本研究首次成功获得了HPV58E6单克隆抗体；在体外实验中验证了相比HPV58E6/E7, HPV16E6/E7具有更强的促细胞周期进程、抑制细胞凋亡、促进细胞侵袭的能力,进一步揭示了E6-P53和E7-pRB在HPV致癌过程中所起的关键作用；还发现了与HPV型别特异性感染及其致宫颈病变进展相关的差异宿主SNP位点,基因型及单倍型。本研究初步阐述了HPV在自然界的分布规律和不同病变中分布特征的相关机制,更好地了解了HPV的致癌中的型别特异性差异,为制定有针对性的宫颈癌防控策略提供了科学证据。第一部分 HPV58E6兔单克隆抗体的制备目的：研发HPV58E6特异性兔单克隆抗体,为进一步体外研究HPV58E6提供基础。方法：通过将HPV58E6序列与HPV16E6,HPV31E6,HPV33E6,HPV52E6,HPV67E6等同源性较高的序列进行比对,找出HPV58E6的特异性序列,针对该特异性序列设计两条HPV58E6多肽片断,将其交联至三种不同载体蛋白,免疫新西兰大白兔,获得免疫血清,取血清筛选出抗体阳性的大白兔并做ELISA确定滴度,分离筛选出的大白兔脾细胞并与融合伴侣细胞240E-W2进行细胞融合,之后铺板到96孔培养板,在1640AB培养基中进行克隆培养,对细胞上清进行ELISA筛选,找到表达HPV58E6特异性抗体的阳性细胞克隆,针对阳性克隆,提取细胞RNA,用引物F1/R1进行RT-PCR扩增,得到多个重链cDNA和多个轻链cDNA;将cDNA分别构建到pTT5质粒表达载体中,将包含重链cDNA的pTT5质粒与包含轻链cDNA的pTT5质粒进行两两配对,共转染到HEK-293-6E细胞后进行细胞培养；取细胞培养的上清液,进行ELISA检测；筛选IgG浓度最高且滴度OD值大于0.3的配对,即为HPV58E6特异性兔单克隆抗体的重链和轻链配对。制备重组抗体并进行测序分析,从而获得特异性HPV58E6兔单克隆抗体。结果：1.设计的特异性HPV58E6多肽片段免疫新西兰大白兔后获得的血清能够结合pEGFP-C1-HPV58E6质粒转染293T细胞所提取的蛋白。2.杂交瘤细胞上清在pEGFP-C1-HPV16E6质粒转染组未见条带,而在pEGFP-C1-HPV58E6质粒转染组可见条带。3.重组抗体ZJM1B-9在pEGFP-C1-HPV16E6质粒转染组未见条带,而在pEGFP-C1-HPV58E6质粒转染组可见条带。结论：1.采用杂交瘤技术可以成功获得抗HPV58E6兔单克隆抗体。2.获得的抗HPV58E6兔单克隆抗体可以特异性结合HPV58E6蛋白,而不能结合HPV16E6蛋白。第二部分：HPV58与HPV16 E6/E7致官颈癌功能差异的研究目的：明确HPV16与HPV58癌基因E6/E7在细胞表型方面的差异,及E6-P53和E7-pRB的表达和定位的区别,从细胞表型和分子水平阐述两种病毒致癌能力的差异。方法：通过构建pFLAG-CMV5.1-HPV58E6/E7和pFLAG-CMV5.1-HPV16E6/E7真核生物表达质粒,转染293T和U20S细胞,通过流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,CCK8检测细胞增殖能力,Transwell检测细胞侵袭能力,免疫荧光共聚焦拍摄细胞E6-P53和E7-pRB的共表达和共定位,比较HPV58E6/E7和HPV16E6/E7基因对细胞周期、凋亡、侵袭能力的差异及下游分子的表达差异。结果：1.在293T和U20S细胞中,相比阴性对照组,HPV58E6/E7过表达能促进细胞增殖；相比]HPV58E6/E7, HPV16E6/E7过表达促进细胞增殖能力更强。2.在293T细胞中,HPV58E6/E7组细胞周期S期比例分别为42.68%和45.39%,而HPV16E6/E7组细胞周期S期比例分别52.66%和49.18%。在U20S细胞中,]HPV58E6/E7组细胞周期S期比例分别为32.73%和27.03%,而HPV16E6/E7组细胞周期S期比例分别37.32%和36.24%。3.在293T细胞中,]HPV58E6/E7组细胞早期凋亡比例分别为9.66%和12.1%,而HPV16E6/E7组细胞早期凋亡比例分别为6.6%和14.0%。在U20S细胞中,HPV58E6/E7组细胞早期凋亡比例分别为5.63%和5.22%,而HPV16E6/E7组细胞早期凋亡比例分别为3.84和3.44%。4.在293T和U20S细胞中,相比阴性对照组,HPV58E6/E7组细胞侵袭能力增强；相比HPV58E6/E7, HPV16E6/E7组细胞侵袭能力更强。5.在293T和U20S细胞中,相比HPV58E6组,HPV16E6组P53下降更显着,且胞核内表达更低；同时相比HPV58 E7组,HPV16E7组pRB表达增多,且在核内表达更多。结论：与HPV58 E6/E7相比,HPV16 E6/E7显示了更强的促进细胞周期进程、抑制细胞凋亡、促进细胞侵袭能力和降解P53和pRB能力,提示HPV16比HPV58具有更强的致癌力。第三部分：HPV相关受体基因变异与型别特异官颈感染和病变进展的相关性研究目的：明确不同个体之间的HPV感染相关受体是否存在型别特异的与宫颈感染和病变进展的相关的单核甘酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）.方法：在3299例宫颈脱落细胞样本中,挑选出单一HPV16,18,52,58阳性和HPV阴性,共875例,提取DNA,通过Illumina BeadXpress VeraCode platform SNP分型检测技术,对HPV感染相关受体基因（EGFR, PPIB, HSPG2, FGFR2, FURIN, ITGA6, TSPAN1和SDC2）上的96个tagSNP位点进行检测,分析目的基因SNP与型别特异HPV感染和官颈病变进展的相关性。在对照组中检验Hardy-Weinberg平衡。运用Haploview, SPSS16.0, PLINK等软件分析SNP结果。结果：对病毒型别特异性感染的易感性分析显示,HPV16有2个SNP（rs28384376, rs12034979）显着相关和3个单倍型（"GGAA", "GGGG"和“GA”）临界相关,HPV18有4个SNP（rs2575738, rs6697265, rs2575712, rs2575735）和3个单倍型（“GGG”,“GGA”和"GGAGA"）显着相关,HPV52有2个SNP （rs10510097, rs12718946）和2个单倍型（"GGGAA"和“GGA”）显着相关,HPV58有3个SNP （rs4947972, rs2981451, rs2575735）和2个单倍型（“GC”和“GA”）显着相关。对病毒型别特异性宫颈病变进展的易感性分析显示,HPV16有5个SNP（rs3135772, rs2556537, rs12034979, rs1047057, rs16894821）和1个单倍型（“GG”）显着相关,HPV18有3个SNP （rs6697265, rs6680566, rs16860426）和1个单倍型（“GG”）显着相关,HPV52有3个SNP （rs878949, rs12718946, rs12668175）和1个单倍型（“CAA”）显着相关,HPV58未见有显着相关的SNP位点和单倍型。结论：宿主HPV感染相关受体不同的基因变异呈现了不同的病毒型别特异感染和病变进展的易感性,可能在宫颈癌筛查中有潜在的应用价值。
二、HPV58 E6基因的克隆及体外表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HPV58 E6基因的克隆及体外表达（论文提纲范文）
（1）宫颈脱落细胞HPV58感染状况及其E6E7重组病毒的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第1章 宫颈脱落细胞HPV58型感染状况分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 主要仪器 |
| 1.1.2 实验用试剂 |
| 1.1.3 溶液配制 |
| 1.1.4 标本及临床资料的收集 |
| 1.1.5 研究方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 所提标本DNA的质量检测 |
| 1.2.2 HPV总感染率的检测 |
| 1.2.3 HPV16 型,HPV18 型和HPV58 型感染率的检测 |
| 1.2.4 不同年龄段女性及不同病理分型女性HPV感染状况 |
| 1.2.5 不同组织学类型的病理图片 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 本地区HPV感染型别特点 |
| 1.3.2 本地区HPV感染年龄分布特点 |
| 1.3.3 本地区HPV感染与病理组织学分型的关系 |
| 1.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第2章 人乳头瘤病毒58型E6E7融合基因重组巨细胞病毒的构建及鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 实验用试剂 |
| 2.1.3 溶液配制 |
| 2.1.4 材料 |
| 2.1.5 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 HPV58E6和E7野生型与突变型融合基因片段的合成 |
| 2.2.2 Gal K插入SW102-T-ORF75-BAC |
| 2.2.3 HPV58E6E7 融合基因代替Gal K基因 |
| 2.2.4 转染与未转染细胞生长状况 |
| 2.2.5 转染与未转染细胞中T-ORF75-HPV58-m E6E7 与T-ORF75-HPV58-w E6E7 表达状况 |
| 2.2.6 软琼脂克隆实验 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 第3章 综述 |
| 3.1 人乳头瘤病毒的结构 |
| 3.2 HPV各基因区的功能 |
| 3.2.1 早期基因区(E区)的功能 |
| 3.2.2 晚期基因区(L区)的功能 |
| 3.2.3 长调控区(LCR)的功能 |
| 3.3 HPV分类及相关疾病 |
| 3.4 年龄与HPV感染的关系 |
| 3.5 HPV持续感染与宫颈病变的关系 |
| 3.6 HPV致病机制 |
| 3.6.1 HPV DNA的整合 |
| 3.6.2 HPV与细胞周期 |
| 3.7 HPV58型感染 |
| 3.7.1 1HPV58型病毒的分子结构与生物学意义 |
| 3.7.2 HPV感染的过程 |
| 3.7.3 HPV58的整合状态 |
| 3.8 HPV检测方法 |
| 3.8.1 形态学检测的方法 |
| 3.8.2 杂交捕获法(HC2) |
| 3.8.3 HPVL1区通用引物检测方法 |
| 3.8.4 HPVE区分型的检测方法 |
| 3.8.5 APOT检测系统 |
| 3.9 HPV疫苗研究进展 |
| 3.9.1 HPV预防性疫苗 |
| 3.9.2 HPV治疗性疫苗 |
| 3.10 HPV疫苗在我国的应用现状 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间研究成果 |
（2）CRISPR-Cas9对HPV58阳性宫颈癌C33A细胞的基因编辑与治疗的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分: CRISPR-Cas9系统在HPV58阳性宫颈癌细胞增殖与凋亡的影响及其机制的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 第二部分: PBAE和Micelle与CRISPR-Cas9质粒合成纳米药物用于治疗HPV58相关宫颈癌的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 本研究的创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 附件 |
（3）HPV16治疗性mRNA纳米疫苗的制备及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 学位论文数据集 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 HPV的概述 |
| 1.1.1 HPV的结构、功能、生物学性质 |
| 1.1.2 HPV病毒的永生化 |
| 1.1.3 HPV病毒的致癌机制 |
| 1.2 HPV疫苗 |
| 1.2.1 HPV预防性疫苗 |
| 1.2.2 HPV治愈性疫苗 |
| 1.3 HPV治疗性疫苗的国内外研究进展 |
| 1.4 RNA疫苗 |
| 1.4.1 RNA疫苗的成分 |
| 1.4.2 非病毒载体技术传递mRNA疫苗 |
| 1.4.3 mRNA疫苗免疫治疗原理 |
| 1.5 本课题的研究意义 |
| 1.6 本课题的研究内容 |
| 1.7 本课题的技术路线 |
| 第二章 HPV治疗性mRNA疫苗的制备 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 目的基因片段的获得及表达载体的构建 |
| 2.3.2 TOP10感受态细胞的制备 |
| 2.3.3 目的片段的转化 |
| 2.3.4 重组质粒DNA的提取 |
| 2.3.5 重组质粒的线性化酶切及胶回收 |
| 2.3.6 体外转录成mRNA |
| 2.3.7 mRNA的纯化 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 目的基因测序结果分析 |
| 2.4.2 感受态效率测定 |
| 2.4.3 重组质粒线性化模板鉴定 |
| 2.4.4 mRNA的鉴定分析 |
| 2.4.6 核酸质量分析 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 mRNA疫苗保护递送系统的构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 仪器设备 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 293细胞的传代培养 |
| 3.3.2 化学试剂转染293细胞 |
| 3.3.3 阳离子脂质体纳米颗粒的设计 |
| 3.3.4 LNPs的合成 |
| 3.3.5 LNPs与mRNA疫苗的自组装 |
| 3.3.6 纳米粒子转染293细胞 |
| 3.3.7 ELISA检测293细胞表达量 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 GFP显微镜镜检图 |
| 3.4.2 LNPs动态光散射分析 |
| 3.4.3 LNPs与HPV疫苗的络合分析 |
| 3.4.4 HPV纳米疫苗的粒径分析 |
| 3.4.5 HPV纳米疫苗的电荷、包封率分析 |
| 3.4.6 HPV纳米疫苗的SEM分析 |
| 3.4.7 ELISA检测结果 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 E6E7融合蛋白的原核表达纯化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 试剂材料 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 目的基因和表达载体pET28a的构建 |
| 4.3.2 BL21感受态细胞的制备 |
| 4.3.3 Pet28a-E6E7转入BL21 |
| 4.3.4 E6E7融合蛋白的BL21菌株表达 |
| 4.3.5 SDS-PAGE分析表达产物 |
| 4.3.6 目的蛋白的诱导条件优化 |
| 4.3.7 E6E7包涵体的变性和复性 |
| 4.3.8 BCA蛋白浓度的测定 |
| 4.3.9 WB检测融合蛋白结合活性 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 重组质粒测序鉴定 |
| 4.4.2 融合蛋白E6E7的BL21菌株表达 |
| 4.4.3 E6E7的最适诱导条件 |
| 4.4.4 BCA测定蛋白浓度 |
| 4.4.5 包涵体的复性分析 |
| 4.4.6 WB检测结果 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 HPV mRNA-LNPs纳米疫苗免疫原性研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.2.3 仪器设备 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 动物实验分组及免疫方案 |
| 5.3.2 ELISA检测小鼠血清IgG |
| 5.3.3 小鼠脾脏单个核细胞悬液的制备 |
| 5.3.4 ELISPOT检测 IFN-γ |
| 5.3.5 ELISA检测 IL-4、TNF-α |
| 5.3.6 FCM检测T细胞亚群 |
| 5.3.7 统计分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 肿瘤生长分析 |
| 5.4.2 小鼠血清抗体分析 |
| 5.4.3 小鼠细胞因子分析 |
| 5.4.5 T细胞亚群分析 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者和导师简介 |
| 附件 |
（4）人乳头瘤病毒18型致癌蛋白E7的性质鉴定和单克隆抗体的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1 人乳头瘤病毒概况 |
| 1.1 HPV基因组 |
| 1.2 HPV早期蛋白的概述 |
| 1.2.1 E1蛋白 |
| 1.2.2 E2蛋白 |
| 1.2.3 E4蛋白 |
| 1.2.4 E5蛋白 |
| 1.2.5 E6蛋白 |
| 1.2.6 E7蛋白 |
| 1.3 HPV晚期蛋白的概述 |
| 1.3.1 L1蛋白 |
| 1.3.2 L2蛋白 |
| 1.4 HPV分型 |
| 1.5 HPV的感染历程 |
| 1.6 HPV的流行性病学研究 |
| 2 E6的结构与功能研究 |
| 2.1 E6的结构生物学研究 |
| 2.2 E6的生物学功能研究 |
| 3 E7的结构与功能研究 |
| 3.1 E7的结构生物学研究 |
| 3.2 E7的生物学功能研究 |
| 4 HPV疫苗研究进展 |
| 4.1 HPV预防性疫苗研究进展 |
| 4.2 当前HPV预防性疫苗的局限 |
| 4.3 HPV治疗性疫苗研究进展 |
| 5 本论文研究目的、思路与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器设备 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.2.1 E.coli菌株 |
| 1.2.2 质粒 |
| 1.2.3 细胞株 |
| 1.2.4 实验动物 |
| 1.2.5 酶 |
| 1.2.6 抗体 |
| 1.2.7 常用试剂 |
| 1.2.8 其他耗材 |
| 1.3 工作站和软件 |
| 1.4 常用溶液及试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 大肠杆菌表达系统的构建 |
| 2.1.1 目的序列的选取 |
| 2.1.2 引物设计 |
| 2.2 真核表达系统重组质粒的构建 |
| 2.3 蛋白表达和纯化方法(以pTO-T7-HPV-18 E7为例) |
| 2.3.1 HPV-18 E7表达菌株的建立 |
| 2.3.2 工程菌的小量诱导表达 |
| 2.3.3 工程菌的大量诱导表达 |
| 2.3.4 AKTA色谱纯化分子筛层析 |
| 2.4 蛋白性质鉴定方法 |
| 2.4.1 SDS-PAGE和Western Blot分析蛋白大小和纯度 |
| 2.4.2 LC-MS/MS检测 |
| 2.4.3 高效液相色谱检测 |
| 2.4.4 AUC-SV检测方法 |
| 2.4.5 酶联免疫吸附反应检测抗原抗体的反应性 |
| 2.4.6 DSC(Differential Scanning Calorimetry)分析法 |
| 2.5 HPV-18 E7蛋白免疫动物实验 |
| 2.6 抗HPV-18 E7单克隆抗体的制备和筛选 |
| 2.6.1 杂交瘤细胞的获取 |
| 2.6.2 杂交瘤细胞的筛选 |
| 2.6.3 杂交瘤细胞的培养 |
| 2.7 抗HPV-18 E7单克隆抗体的初步性质鉴定 |
| 2.7.1 单抗腹水诱导 |
| 2.7.2 单抗纯化 |
| 2.7.3 蛋白免疫印迹分析单抗的构象性/线性 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分: HPV E6和E7蛋白表达与纯化研究 |
| 1.1 HPV E6和E7蛋白原核表达与纯化研究 |
| 1.1.1 MBP融合蛋白质粒构建及表达纯化 |
| 1.1.2 非保守半胱氨酸突变蛋白质粒构建及表达纯化 |
| 1.1.3 GST融合蛋白质粒构建及表达纯化 |
| 1.1.4 pTO-T7载体质粒构建及表达纯化 |
| 1.2 HPV E6和E7蛋白真核表达和纯化研究 |
| 1.2.1 三个真核表达系统的重组质粒构建及表达纯化 |
| 1.2.2 CHO表达系统质粒优化及表达鉴定 |
| 第一部分小结 |
| 第二部分: HPV18 E7-pTO-T7载体原核表达纯化条件的优化 |
| 2.1 HPV E6和E7基因序列密码子优化 |
| 2.2 HPV E6和E7蛋白镍亲和层析方案的优化 |
| 2.3 HPV18 E7蛋白存储缓冲液的优化 |
| 2.4 HPV18 E7蛋白凝胶过滤层析纯化 |
| 第二部分小结 |
| 第三部分: 原核表达HPV18 E7蛋白的理化性质研究 |
| 3.1 蛋白电泳、蛋白免疫印迹及肽指纹图谱分析HPV18 E7 |
| 3.2 高效液相色谱分析(HPLC)及分析型超速离心(AUC)检测样品均一性 |
| 3.3 差式扫描热量法(DSC)分析HPV18 E7蛋白热稳定性 |
| 第三部分小结 |
| 第四部分: 抗HPV18 E7单克隆抗体的制备及性质鉴定 |
| 4.1 HPV 18 E7单克隆抗体细胞株的筛选 |
| 4.2 HPV 18 E7单克隆抗体的制备与性质鉴定 |
| 4.2.1 单抗腹水制备与纯化 |
| 4.2.2 单抗与抗原反应性分析 |
| 4.2.3 单抗的亚型、线性及构象性质分析 |
| 4.2.4 单抗与各型别E6和E7的交叉反应性分析 |
| 第四部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 1 HPV E6和E7蛋白的可溶性表达 |
| 2 HPV18 E7抗体研究 |
| 3 HPV18 E7蛋白结构的研究 |
| 4 HPV18 E7致癌机制的研究 |
| 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在校期间发表成果 |
| 在校期间参与的科研项目 |
（5）AD-HPV16/18/58mE6E7三价重组腺病毒载体治疗性疫苗的免疫效果研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 AD-HPV16/18/58mE6E7 三价重组腺病毒载体治疗性疫苗对抗HPV58 型肿瘤的细胞免疫作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 第二章 稳定表达 HPV16E6 和 HPV16E7 蛋白小鼠宫颈癌TC-1 细胞系的验证 |
| 第1节 表达HPV16E6和HPV16E7 蛋白小鼠宫颈癌TC-1 细胞系的检验 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 第2节 稳定表达 HPV16E6 和 HPV16E7 蛋白小鼠宫颈癌 TC-1细胞株在小鼠体内的真核表达鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 第三章 AD-HPV16/18/58mE6E7 三价重组腺病毒载体治疗性疫苗对抗HPV16 型肿瘤的免疫作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 第四章 稳定表达HPV18E6E7 融合蛋白小鼠宫颈癌U14 细胞系的建立 |
| 第1节 表达HPV18E6E7 融合蛋白小鼠宫颈癌U14 细胞系的构建 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 第2节 稳定表达HPV18E6E7 融合蛋白小鼠子宫颈癌U14 细胞株在小鼠体内的真核表达 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 第五章 AD-HPV16/18/58mE6E7 三价重组腺病毒载体治疗性疫苗对抗HPV18 型肿瘤的免疫作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 全文讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 主要英文缩写词表 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（6）稳定表达人乳头瘤病毒58型（HPV58）E6E7融合基因的人宫颈癌细胞株C33A的构建及验证（论文提纲范文）
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒、引物、菌株、细胞、动物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组慢病毒LV-HPV58E6E7感染C33A细胞 |
| 1.2.3 重组慢病毒LV-HPV58E6E7对C33A细胞生 |
| 长及其周期的影响 |
| 1.2.4 稳定表达HPV58E6E7融合基因的荷瘤裸鼠 |
| 模型的建立及鉴定 |
| 1.2.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 流式细胞仪分选出的细胞及转染效率的检测 |
| 2.2 MTT法测定三组细胞生长曲线 |
| 2.3 流式细胞术检测各组细胞周期的变化 |
| 2.4 成功建立裸鼠皮下成瘤模型 |
| 2.5 q RT-PCR检测三组瘤组织中HPV58型E6E7融合基因的负载量 |
| 2.6 Western blot验证三组瘤组织中HIS标签蛋白的负载量 |
| 3 讨论 |
（7）HPV16/18/58三价治疗性腺病毒载体疫苗的构建及其抗HPV58肿瘤免疫效果的研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 HPV16/18/58 三价治疗性腺病毒载体疫苗的构建及其真核表达 |
| 第1节 点突变后失去转化活性的HPV16型、18 型、58 型ME6E7融合基因的获得 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 第2节HPV16/18/58ME6E7腺病毒载体疫苗的构建及真核表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 第二章 稳定表达HPV58E6E7融合蛋白小鼠子宫颈癌U14细胞系的建立 |
| 第1节 稳定表达HPV58E6E7融合蛋白小鼠子宫颈癌细胞U14细胞系的建立 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 第2节 稳定表达HPV58E6E7融合基因的U14细胞株在小鼠体内真核表达的鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 第三章 AD-HPV16/18/58ME6E7腺病毒载体疫苗抗HPV58型（+）肿瘤免疫作用的动物实验研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 论文主要缩略词表 |
| 综述 人乳头瘤病毒及其治疗性疫苗的研究动态 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（8）登革热流行病学调查及重症登革热病理机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 第一部分 登革热分子流行病学研究 |
| 前言 |
| 1 登革病毒的生物学特征 |
| 1.1 登革病毒的分子结构和基因组 |
| 1.2 登革病毒的复制和传播途径 |
| 1.3 世界范围内登革热的流行概况 |
| 2 中国历年登革热流行情况的回顾性研究 |
| 2.1 研究方法概述 |
| 2.2 中国历年登革热的地理分布 |
| 2.3 中国历年登革热的时间分布 |
| 2.4 中国历年登革热的人口分布 |
| 2.5 中国历年登革热的型别分布 |
| 2.6 中国历年登革热流行株的进化发育研究 |
| 3 云南省西双版纳州登革热分子流行病学研究 |
| 3.1 概述 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 2013年西双版纳州登革热流行病学研究 |
| 3.4 2015年西双版纳州登革热流行病学研究 |
| 讨论 第二部分 重症登革热临床病理观察 |
| 前言 |
| 1 研究背景及实验思路 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 临床研究设计及参与者招募 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 登革热血清中非结构蛋白NS1含量检测 |
| 3.2 登革热血清样本的常规血液指标检测结果 |
| 3.3 登革热血清中登革热病毒载量检测 |
| 3.4 登革热血清中免疫球蛋白IgG/IgM/IgA水平检测 |
| 3.5 登革热血清中补体C3/C4水平检测 |
| 讨论 第三部分 补体与重症登革热的相关性研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 白纹伊蚊细胞培养 |
| 1.2 登革病毒毒株扩增及鉴定 |
| 1.3 收获病毒液的滴度测定 |
| 1.4 人血清抗体依赖增强补体裂解模型的建立 |
| 1.5 人全血抗体依赖增强感染模型的建立 |
| 1.6 免疫比浊法测定补体C3 |
| 1.7 C3裂解产物(C3SP)C3a的定量检测 |
| 1.8 补体裂解产物C5a、C3bBb、C1q的定量检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 登革病毒的型别鉴定 |
| 2.2 利用人血清建立抗体依赖增强补体裂解模型 |
| 2.3 利用人全血建立ADE模型 |
| 2.4 利用人全血ADE模型研究补体活化途径 |
| 讨论 第四部分 补体旁路途径过度激活导致重症登革热的病理机制研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 人外周血淋巴细胞（PBMC）分离及培养 |
| 1.2 人外周血单核细胞初步纯化（Monocytes） |
| 1.3 美天旎MAC阴性磁珠分选人外周血单核细胞 |
| 1.4 阴性磁珠分选的人外周血单核细胞纯度鉴定 |
| 1.5 人外周血单核细胞培养条件摸索 |
| 1.6 人外周血单核细胞抗体依赖增强感染（ADE）模型的建立 |
| 1.7 C3a、C5a含量检测 |
| 1.8 ELISA法定量检测登革热血清中细胞因子IL-10含量 |
| 1.9 免疫共沉淀（Co-Immunopredpitation, Co-IP） |
| 1.10 SDS-PAGE鉴定免疫共沉淀收获液 |
| 1.11 质谱鉴定SDS-PAGE中的目标蛋白 |
| 1.12 Western Blot定性验证质谱结果 |
| 1.13 利用Transwell细胞培养皿进行单核细胞ADE模型-HuVEC共培养 |
| 1.14 免疫荧光染色检测HuVEC表面的补体膜攻击复合物C5b-9 |
| 1.15 伊红染色显示与单核细胞ADE模型共培养后HuVEC细胞骨架改变 |
| 2 结果 |
| 2.1 流式细胞术鉴定磁珠阴性分选的单核细胞纯度 |
| 2.2 单核细胞最适培养条件 |
| 2.3 利用人外周血单核细胞建立抗体依赖增强感染模型 |
| 2.4 C3a、C5a、IL-10含量检测 |
| 2.5 利用单核细胞ADE模型进行免疫共沉淀 |
| 2.6 目标蛋白的质谱鉴定 |
| 2.7 Western Blot验证质谱鉴定结果 |
| 2.8 免疫荧光染色检测HuVEC表面的补体膜攻击复合物C5b-9 |
| 2.9 伊红染色检测HuVEC的细胞骨架改变 |
| 讨论 全文总结 参考文献 附录 致谢 个人简历 |
（9）HPV58型E6和E7抗原的HLA限制性CTL表位的预测、筛选及免疫反应性的鉴定（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 主要英文缩写对照列表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 HPV58 E6和E7蛋白CTL抗原表位的预测、合成及其体液免疫反应性的鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 第二章 HPV58 E6和E7抗原的HLA限制性CTL表位的细胞免疫反应的鉴定-ELISPOT斑点实验 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 第三章 HPV58 E6和E7抗原的HLA限制性CTL表位的细胞毒性反应的鉴定——LDH释放试验 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 全文小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）人乳头瘤病毒致宫颈癌的型别特异性差异的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 1 前言 |
| 参考文献 |
| 2 第一部分 HPV58 E6兔单克隆抗体的制备 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 2.5 参考文献 |
| 3. 第二部分 HPV58与HPV16 E6/E7致官颈癌功能差异的研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 3.5 参考文献 |
| 4. 第三部分 HPV相关受体基因变异与型别特异官颈感染和病变进展的相关性研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 4.5 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
四、HPV58 E6基因的克隆及体外表达（论文参考文献）
- [1]宫颈脱落细胞HPV58感染状况及其E6E7重组病毒的构建[D]. 杜阳阳. 华北理工大学, 2020(02)
- [2]CRISPR-Cas9对HPV58阳性宫颈癌C33A细胞的基因编辑与治疗的实验研究[D]. 王雪恋. 山东大学, 2019(02)
- [3]HPV16治疗性mRNA纳米疫苗的制备及免疫原性研究[D]. 周茜. 北京化工大学, 2019(06)
- [4]人乳头瘤病毒18型致癌蛋白E7的性质鉴定和单克隆抗体的筛选[D]. 王致萍. 厦门大学, 2019(09)
- [5]AD-HPV16/18/58mE6E7三价重组腺病毒载体治疗性疫苗的免疫效果研究[D]. 覃露. 广西医科大学, 2019(08)
- [6]稳定表达人乳头瘤病毒58型（HPV58）E6E7融合基因的人宫颈癌细胞株C33A的构建及验证[J]. 贾超颖,马伟红,王鹤. 生物医学工程学杂志, 2017(04)
- [7]HPV16/18/58三价治疗性腺病毒载体疫苗的构建及其抗HPV58肿瘤免疫效果的研究[D]. 马伟红. 广西医科大学, 2017(08)
- [8]登革热流行病学调查及重症登革热病理机制研究[D]. 赵玉娇. 北京协和医学院, 2016(01)
- [9]HPV58型E6和E7抗原的HLA限制性CTL表位的预测、筛选及免疫反应性的鉴定[D]. 陈丽来. 广西医科大学, 2016(02)
- [10]人乳头瘤病毒致宫颈癌的型别特异性差异的研究[D]. 邹健. 浙江大学, 2016(02)
标签：hpv论文; crispr-cas9论文; 融合蛋白论文; 基因合成论文; 融合基因论文;