一、白藜芦醇增强巨噬细胞功能并抵抗乙醇诱导的小鼠免疫反应抑制（论文文献综述）
林杉[1]（2021）在《肿瘤代谢物乳酸诱导B细胞分化为Breg样细胞的分子机制》文中研究指明研究背景与目的:调节性B细胞（regulatory B cells,Bregs）是一群具有免疫调节功能的B细胞的统称,近年来的研究发现Breg细胞在自身免疫性疾病、感染、肿瘤等多种疾病参与免疫调节反应。Breg细胞通过多种机制发挥促肿瘤作用,而肿瘤微环境中Breg细胞的分化机制尚不明确。乳酸是肿瘤细胞的代谢产物之一,乳酸影响多种免疫细胞的分化及功能,在肿瘤免疫耐受、免疫逃逸等方面发挥重要作用。而乳酸对B细胞分化及功能影响的研究较少,尚不明确。本课题通过对体外乳酸处理后B细胞免疫表型和功能的变化及其机制的研究,结合小鼠体内LDHA敲低D121细胞肺腺癌模型中B细胞及CD8+T细胞等其他免疫细胞的比率及活性研究,阐释了乳酸诱导B细胞向Breg样细胞分化及促进肿瘤进展的作用及其机制。研究方法:（1）磁珠分选小鼠脾脏B细胞,使用BAFF,BAFF联合乳酸分别培养B细胞2天,流式检测乳酸对B细胞中Bregs相关表型分子表达的影响。磁珠分选小鼠脾脏CD4+和CD8+T细胞,将上述两组B细胞分别与CFSE标记的CD3、CD28刺激的CD4+和CD8+T细胞共培养2-3天,流式评估乳酸处理的B细胞对T细胞增殖的影响。（2）使用BAFF,BAFF联合乳酸分别培养小鼠脾脏B细胞2天,荧光定量PCR检测两组B细胞内IL-10等免疫抑制分子以及PPARα、NADPH氧化酶相关亚基m RNA的表达差异。流式检测两组B细胞内IL-10、TGFβ、PD-L1以及ROS等分子的表达差异。蛋白免疫印迹检测两组B细胞内p40phox和p47phox蛋白表达差异。（3）磁珠分选小鼠脾脏B细胞体外培养2天,分为BAFF,BAFF+乳酸,BAFF+GPR81激动剂,BAFF+乳酸+GPR81抑制剂,BAFF+乳酸+PPARα抑制剂处理组,比较不同处理方法对B细胞免疫抑制功能的影响。此外,在体外乳酸诱导的B细胞与T细胞共培养体系中,分别加入anti-IL-10抗体,anti-TGFβ抗体,anti-PD-L1抗体,iNOS拮抗剂,arg-1拮抗剂或过氧化氢酶,流式评估上述分子对乳酸诱导Breg样细胞免疫调节功能的影响。明确乳酸诱导Breg样细胞免疫抑制功能的分子机制。（4）应用慢病毒CRISPR/cas9技术敲低小鼠肺腺癌细胞系D121细胞内LDHA基因,分别给予B6小鼠接种NC组D121细胞和LDHA KD D121细胞得到肺腺癌小鼠模型。记录两组荷瘤鼠肿瘤大小,绘制肿瘤增长曲线,以此评估LDHA敲低对小鼠肿瘤增长的影响。第20天处死小鼠,流式检测两组荷瘤小鼠脾脏、肿瘤内CD8+INFγ+T细胞、CD8+GrB+T细胞、CD25+CD81+B细胞、IL-10+B细胞、Treg细胞和MDSCs的比例,以及B细胞内ROS表达水平,磁珠分选两组肿瘤内B细胞,荧光定量PCR比较两组B细胞中NADPH氧化酶相关亚基m RNA的表达水平,明确乳酸对Breg样细胞分化的影响及其促进肿瘤增长的机制。（5）流式细胞分析法测定肺癌患者及健康对照组外周血中CD24hiCD38hiB细胞和IL-10+B细胞的比例,磁珠分选健康人外周血中T和B细胞,乳酸培养B细胞2天,B细胞与CFSE标记的CD3、CD28刺激的T细胞共培养3-5天,流式评估乳酸对B细胞IL-10、ROS及CD24、CD38表达的影响,流式评估乳酸诱导的Breg样细胞对T细胞增殖的影响。通过免疫荧光染色明确肺腺癌组织及癌旁组织内LDHA与ROS+CD19+B细胞的共定位关系,明确乳酸对表达ROS的Breg样细胞分化的影响。研究结果:（1）乳酸上调小鼠B细胞CD25和CD81的表达,使B细胞具有Breg样表型。（2）乳酸诱导的Breg样细胞显着抑制T细胞增殖。乳酸诱导Breg样细胞免疫抑制功能与IL-10、TGFβ、PD-L1、arg-1、i NOS、IDO等效应分子无关。（3）乳酸通过NADPH氧化酶上调小鼠B细胞ROS的表达,乳酸诱导的Breg样细胞通过ROS发挥抑制T细胞增殖的免疫调节功能。（4）乳酸促进小鼠B细胞中GPR81 m RNA的表达,GPR81激动剂3,5-DHBA处理的B细胞高表达ROS,并抑制T细胞增殖,而GPR81阻断剂3-OBA可逆转乳酸诱导的Breg样细胞的免疫抑制功能,乳酸通过结合并激活GPR81受体诱导小鼠B细胞发挥免疫抑制功能。（5）乳酸通过结合小鼠B细胞表面GPR81受体,促进小鼠B细胞中PPARα的表达,诱导B细胞内ROS表达水平增高,PPARα阻断剂逆转乳酸诱导B细胞ROS的表达和免疫抑制功能的发挥,乳酸通过GPR81-PPARα-ROS通路诱导Breg样细胞分化并发挥免疫抑制功能。（6）LDHA敲低使荷瘤小鼠肿瘤体积减少,肿瘤组织内Ki-67表达降低,脾脏及肿瘤内CD25+CD81+B细胞和MDSCs比例降低,肿瘤组织内B细胞中NADPH氧化酶相关亚基m RNA及ROS表达水平降低,同时,肿瘤引流淋巴结、脾脏及肿瘤内CD8+INF-γ+T细胞及CD8+Gr B+T细胞比例增多,而肿瘤内Treg细胞比例降低。（7）肺腺癌患者外周血乳酸含量、CD24hiCD38hiBreg细胞和IL-10+Breg细胞比例高于健康对照组,乳酸上调B细胞CD24、CD38及IL-10的表达,并促进B细胞内NADPH氧化酶相关亚基m RNA及ROS表达水平,乳酸培养的B细胞通过ROS抑制T细胞增殖。人肺腺癌肿瘤组织内LDHA表达水平高于癌旁组织,并与表达ROS的CD19+B细胞共定位。结论:乳酸通过GPR81/PPARα/NADPH氧化酶信号诱导B细胞分化为Breg样细胞,Breg样细胞通过ROS抑制T细胞增殖,促进肿瘤进展,敲低肿瘤细胞内LDHA减少Breg样细胞的产生及其ROS的表达,提示靶向降低肿瘤微环境内乳酸含量,可以减少Breg样细胞的分化,进而起到抗肿瘤的治疗作用。这为肿瘤内Breg细胞的致病作用提供新的理论依据,为临床治疗肿瘤提供新的思路。
杨硕[2]（2021）在《艾蒿醇提物对脂多糖刺激的肉仔鸡生长、免疫和抗氧化功能的影响及其机理研究》文中认为本试验通过体内试验和体外试验相结合的方法,探讨艾蒿醇提物（Artemisia argyi alcohol extract,AAAE）对肉仔鸡生长、免疫和抗氧化功能的影响及其作用机理。主要研究内容及结果如下:第一部分:艾蒿醇提物对肉仔鸡血清免疫和抗氧化指标的影响试验采用单因子随机区组试验设计。共选择240只1日龄爱拔益加（AA）肉仔鸡,按照初始体重相近原则随机分为5个处理组,每个处理包括6个重复,每个重复包括8只鸡。饲喂5种日粮,该5种日粮是在基础日粮的基础上分别添加0、250、500、750和1000 mg/kg的AAAE。试验分为前期（1-21 d）和后期（22-42 d）,共42d。结果表明:试验后期,日粮添加750 mg/kg的AAAE极显着提高肉仔鸡ADG,且随AAAE添加量的增加,ADFI呈极显着一次线性降低;日粮中添加适宜剂量（500-1000 mg/kg）的AAAE显着增加肉仔鸡血清中免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）、抗炎细胞因子（IL-2和IL-4）含量以及抗氧化酶（CAT和SOD）活性,并且显着降低血清促炎细胞因子（IL-1β和IL-6）及MDA含量。综合考虑,750 mg/kg的AAAE促进肉仔鸡免疫和抗氧化功能的效果更理想。第二部分:艾蒿醇提物对LPS刺激的肉仔鸡生长、免疫和抗氧化功能的影响及其机理研究试验采用2×2二因子试验设计,分别为2个日粮AAAE添加水平（0和750 mg/kg日粮）和2个LPS水平（0和750（?）g/kg体重）。共选取体重相近的192只1日龄AA肉仔鸡随机分为4个处理,每个处理6个重复,每个重复8只鸡。试验共42 d,分为预饲期（0-14 d）、应激Ⅰ期（15-21 d,LPS注射期）、恢复Ⅰ期（22-28 d）、应激Ⅱ期（29-35 d,LPS注射期）和恢复Ⅱ期（36-42 d）。处理1和处理2饲喂基础日粮,处理3和处理4饲喂试验日粮（基础日粮中添加750 mg/kg AAAE）。分别在应激Ⅰ期（试验第15、17、19、21 d）和应激Ⅱ期（试验第29、31、33、35 d）给处理1和处理3组的肉仔鸡腹腔注射750（?）g/kg体重的LPS溶液（LPS溶于生理盐水中配制成浓度为100（?）g/m L的LPS溶液）,处理2和处理4组注射等量的生理盐水。结果表明:（1）在LPS刺激期（15-21,29-35 d）,日粮中添加AAAE可显着缓解因LPS刺激导致的肉仔鸡ADG、ADFI、营养物质（DM、CP、Ca）表观代谢率、HDL-C及十二指肠VH/CD的降低,及血清ALT、LDL-C、血细胞参数（RBC、WBC、LYM、PLT）、应激激素（CORT、ACTH）的升高;（2）添加AAAE可显着缓解因LPS刺激引起的肉仔鸡肝脏IL-1β、IL-6、IgG含量和NF-κB p65、IL-1β基因表达,十二指肠IL-2含量和TLR4、IL-1β基因表达,空肠IL-6含量和My D88、NF-κB p65、IL-1β基因表达,回肠IL-1β、IL-4、IgM含量和TLR4基因表达水平以及TLR4/NF-κB信号通路中关键因子NF-κB p65和IκBα蛋白表达和磷酸化水平的升高。（3）添加AAAE显着缓解因LPS刺激导致的肉仔鸡血清CAT、SOD活性,肝脏SOD、GSH-Px活性和Nrf2、CAT、SOD、GSH-Px、HO-1基因表达,脾脏、十二指肠、空肠和回肠Nrf2、CAT、SOD、GSH-Px基因表达及回肠CAT活性的降低,并显着降低血清和组织中MDA含量。此外,AAAE增加了组织中Nrf2、HO-1和SOD蛋白表达水平,并显着降低Keap1蛋白表达水平。这些结果提示:AAAE能够增强肉仔鸡血清和组织的免疫及抗氧化能力,从而缓解LPS诱导的肉仔鸡免疫应激损伤,其作用机制可能与TLR4/NF-κB和Keap1/Nrf2通路有关。第三部分:艾蒿醇提物中黄酮的分离、纯化及其对肉仔鸡外周血淋巴细胞免疫和抗氧化功能的影响通过聚酰胺-大孔树脂联用分离纯化艾蒿醇提物中的艾蒿黄酮（Artemisia argyi flavonoids,AAF）,用于外周血淋巴细胞（Peripheral blood lymphocytes,PBLs）培养试验。试验采用单因素完全随机试验设计,共设6个AAF添加水平（0、25、50、100、200、400（?）g/m L）,每个处理6个重复。结果表明:（1）添加50和100（?）g/m L AAF可显着增强淋巴细胞活力;（2）添加100和200（?）g/m L AAF显着降低细胞培养液中IL-1β含量及PBLs中IL-1β基因表达;25、200（?）g/m L和100（?）g/m L AAF剂量组分别增加了IL-2和IgG含量。另外,添加50和100（?）g/m L AAF显着降低TLR4、NF-κB p65基因表达;（3）添加100（?）g/m L AAF显着增加细胞培养液中GSH-Px、CAT、SOD活性并降低MDA含量,而且上调淋巴细胞中Nrf2、HO-1、SOD、CAT和GSHPx基因表达。综合考虑,添加100（?）g/m L AAF对淋巴细胞免疫和抗氧化作用效果最理想。第四部分:艾蒿黄酮通过TLR4/NF-κB信号通路调节肉仔鸡外周血淋巴细胞免疫功能的机理研究在第三部分研究的基础上,采用单因素完全随机试验设计,以LPS诱导淋巴细胞建立免疫应激模型,利用NF-κB抑制剂（PDTC）,从NF-κB信号通路探究AAF对淋巴细胞遭受应激损伤的缓解作用。将PBLs随机分成6个处理（每个处理6个重复）,分别是:空白对照组、LPS处理组、AAF处理组、LPS+PDTC处理组、LPS+AAF处理组和LPS+AAF+PDTC处理组。结果显示:（1）LPS+PDTC和LPS+AAF处理均显着降低了培养液中IL-1β和IL-4含量,并显着增加IgG和IgM含量。（2）与LPS组相比,LPS+PDTC组和LPS+AAF组中TLR4、My D88、NF-κB p65、NF-κB p50、IL-1β和IL-6基因表达显着降低,且NF-κB p65的蛋白表达和IκBα磷酸化水平显着降低。这表明AAF对LPS诱导的细胞应激损伤的保护作用能够通过调控NF-κB信号通路下游的IL-1β基因表达来减少炎性因子的释放。第五部分:艾蒿黄酮通过Keap1/Nrf2信号通路调节肉仔鸡外周血淋巴细胞抗氧化功能的机理研究采用单因素完全随机试验设计,以LPS诱导淋巴细胞建立免疫应激模型,利用Nrf2抑制剂（ML385）,从Nrf2信号通路探究AAF对应激损伤的淋巴细胞的抗氧化作用。将PBLs随机分成6个处理（每个处理6个重复）,分别是:空白对照组、LPS处理组、AAF处理组、LPS+ML385处理组、LPS+AAF处理组和LPS+AAF+ML385处理组。结果显示:LPS+ML385和LPS+AAF处理显着增加LPS刺激的细胞培养液中GSH-Px和SOD活性,降低MDA含量。与LPS应激组相比,LPS+ML385和LPS+AAF组中Nrf2、HO-1、GSH-Px和SOD的基因表达均显着增加,并显着降低Keap1蛋白表达水平。这表明AAF能够通过调控Keap1/Nrf2信号通路的激活,来缓解LPS刺激对淋巴细胞的损伤。
郭瑞琪[3]（2021）在《桔梗皂苷D依赖AMPK调节巨噬细胞极化改善小鼠肠道炎症的相关机制研究》文中进行了进一步梳理炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）指的是一系列发生于胃肠道的慢性炎症性疾病。患者的常见症状表现为严重的腹泻、腹痛、疲惫以及消瘦等。由于其病程长、难治愈、费用高,难以控制易恶化甚至致残等问题,IBD已经成为人类生存及生活的巨大负担。因此,开发安全且高效的针对IBD的新型治疗药物及治疗策略对IBD的控制及预防具有重要意义。巨噬细胞作为先天免疫系统的重要组分,在肠道稳态维持中具有重要作用,被认为可能成为一种治疗IBD的新型潜在靶点。激活的巨噬细胞可以概括地分为经典激活的巨噬细胞（M1）和交替激活的巨噬细胞（M2）。在稳定状态下,结肠的巨噬细胞表现出抗炎和促耐受性的M2样表型。在IBD患者中,M1型促炎巨噬细胞数量增加,可引起促炎细胞因子的过量产生,导致免疫失衡和肠道屏障损伤,促进肠道炎症的发展。而M2型巨噬细胞已被证明可以缓解肠道炎症并促进组织损伤修复。因此,具有调节巨噬细胞极化潜质的药物可能会对IBD的发生发展起到治疗作用。单磷酸腺苷激活的蛋白激酶（Adenosine monophosphateactivated protein kinase,AMPK）的激活能有效抑制M1型巨噬细胞极化,并驱动巨噬细胞转变为M2表型。研究表明AMPK激动剂可调节肠炎动物模型中的免疫反应,改善肠炎症状。桔梗皂苷D（Platycodin D,PLD）是一种从桔梗根部分离出来的三萜皂苷,已被证明具有抗炎、抗癌、抗氧化以及抗病毒等多种药理活性,但是PLD是否能够改善肠道炎症反应尚未见报道。最近的研究表明,PLD在Hep G2细胞、棕色脂肪细胞等细胞中均被发现具有AMPK激活功能。但是尚不清楚PLD能否通过激活AMPK调控巨噬细胞炎症反应。因此,本研究从巨噬细胞免疫调节角度出发,研究PLD对缓解肠道炎症,保护肠道功能的作用及其相关机制,为开发新型IBD治疗药物及治疗策略奠定理论基础。方法:通过给予小鼠连续7日3%葡聚糖硫酸钠（Dextran sulfate sodium,DSS）饮用水构建DSS诱导的肠炎小鼠模型。提前7天对小鼠进行PLD（10mg/kg）给药,直至第14天实验结束,以观察其疗效。对小鼠体重、粪便硬度和直肠出血情况进行每日记录,计算疾病活动指数（Disease activity index,DAI）以评价小鼠疾病严重程度。测量各组小鼠结肠的长度,HE染色法观察小鼠结肠组织病理学损伤情况。采用酶联免疫吸附实验（Enzyme linked immuno-sorbent assay,ELISA）和实时聚合酶链式反应（Real time-polymerase chain reaction,RT-PCR）实验分别检测血清和结肠组织中细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10的表达水平。RT-PCR法检测小鼠结肠组织中细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10的mRNA水平以及紧密连接蛋白1（Tight junction protein 1,TJP1）和Occludin（OCLN）的mRNA水平。异硫氰酸荧光素葡聚糖（FITC-Dextran）示踪法检测小鼠肠道通透性。免疫组化法检测小鼠结肠组织中紧密连接蛋白TJP1和OCLN的蛋白表达水平。结果:DSS诱导的肠炎小鼠表现出体重下降、DAI指数增加、结肠长度缩短、结肠粘膜受损、隐窝数量减少和炎症细胞浸润的症状。PLD给药有效缓解了DSS诱导的肠炎小鼠体重下降情况及DAI指数、增加了结肠长度、有效改善了结肠粘膜的受损情况、增加了结肠隐窝数量以及减少了结肠组织炎症细胞浸润情况。DSS诱导的肠炎小鼠表现出外周血清及结肠组织中炎症因子表达水平的增加,PLD给药有效降低了外周及结肠组织中炎症因子的表达水平。DSS诱导的肠炎小鼠紧密连接蛋白表达水平显着降低,伴有肠道通透性增加现象,PLD给药有效提高了紧密连接蛋白的表达水平,降低了肠道通透性,保护了小鼠的肠道屏障功能。二、巨噬细胞在PLD治疗DSS诱导的小鼠肠炎中的作用方法:制备DSS诱导的肠炎小鼠模型并进行PLD给药,在实验期间通过腹腔注射氯膦酸盐脂质体的方法,清除小鼠巨噬细胞。流式细胞术检测小鼠结肠、腹腔灌洗液、肠系膜淋巴结以及脾脏组织中巨噬细胞的比例。对小鼠体重、粪便硬度及直肠出血情况进行每日记录,计算DAI以评价小鼠疾病严重程度。测量各组小鼠结肠的长度,HE染色法观察小鼠结肠组织病理学损伤情况。一、PLD对DSS诱导的小鼠肠炎的作用结果:腹腔注射氯膦酸盐脂质体有效清除了DSS诱导的肠炎小鼠结肠、腹腔灌洗液、肠系膜淋巴结和脾脏中的巨噬细胞。清除巨噬细胞的DSS诱导的肠炎小鼠表示出体重下降,DAI指数增加,结肠粘膜受损,隐窝数量减少,炎症细胞浸润的情况。清除巨噬细胞组中,PLD无法改善DSS诱导的小鼠体重下降情况及DAI指数,且对结肠长度,结肠组织病理学改变无明显改善。三、PLD调节巨噬细胞极化及初步机制研究方法:制备DSS诱导的肠炎小鼠模型并进行PLD给药,流式细胞术检测小鼠结肠组织和腹腔灌洗液中巨噬细胞比例以及M1型M2型巨噬细胞的占比。RT-PCR检测结肠组织M1型巨噬细胞极化标志物iNOS、CD86和M2型巨噬细胞极化标志物Arg1、CD206的mRNA水平。Western Blot法检测结肠组织iNOS和Arg1的蛋白表达水平以及腹腔巨噬细胞极化调节相关通路PI3K/Akt和NF-κB通路相关蛋白表达水平。构建LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞炎症模型,ELISA法检测RAW 264.7细胞培养上清中细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10的表达水平。RT-PCR法检测RAW 264.7细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10的mRNA水平及极化标志物iNOS、CD86、Arg1和CD206的mRNA水平。免疫荧光法观察RAW 264.7细胞iNOS和Arg1的蛋白表达情况。流式细胞术检测RAW264.7细胞中M1型M2型巨噬细胞的比例。Western Blot法检测RAW 264.7细胞iNOS和Arg1以及极化调节相关通路PI3K/Akt和NF-κB通路相关蛋白表达水平。Western Blot和免疫荧光法检测NF-κB p65核转位情况。结果:在体内模型中,PLD给药降低了肠炎小鼠结肠组织和腹腔灌洗液中巨噬细胞的数量,降低M1型巨噬细胞的比例,增加M2型巨噬细胞的比例。PLD给药抑制了结肠组织iNOS的表达,促进了Arg1的表达。PLD给药促进了小鼠腹腔巨噬细胞中M2型巨噬细胞极化相关通路PI3K/Akt通路的激活,抑制了M1型巨噬细胞极化相关通路NF-κB通路的激活。在体外模型中,PLD给药抑制了LPS刺激的RAW 264.7细胞的炎症反应,抑制了iNOS的表达,降低了M1型巨噬细胞的比例,促进了Arg1的表达,增加了M2型巨噬细胞的比例。PLD给药促进了LPS刺激的RAW 264.7细胞中M2型巨噬细胞极化相关通路PI3K/Akt通路的激活,抑制了M1型巨噬细胞极化相关通路NF-κB通路的激活,同时抑制了NF-κB p65的核转位。四、PLD通过激活AMPK调控巨噬细胞极化方法:制备DSS诱导的肠炎小鼠模型并进行PLD给药,提取不同组别小鼠腹腔巨噬细胞,Western Blot法检测腹腔巨噬细胞中AMPK及p-AMPK的表达水平。构建LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞炎症模型,Western Blot法检测RAW264.7巨噬细胞中AMPK及p-AMPK的表达水平。siRNA沉默RAW 264.7细胞中AMPK表达,Western Blot法检测巨噬细胞极化标志物iNOS、Arg1及巨噬细胞极化调节相关通路PI3K/Akt,NF-κB通路相关蛋白表达水平。Western Blot和免疫荧光法检测NF-κB p65核转位情况。结果:在体内及体外模型中,PLD给药有效促进了巨噬细胞中AMPK的激活。在体外模型中沉默AMPK后,PLD给药对LPS刺激的RAW 264.7细胞巨噬细胞极化标志物iNOS和Arg1的蛋白表达水平以及巨噬细胞极化调节相关通路PI3K/Akt和NF-κB通路相关蛋白表达水平的影响减弱,同时减弱了PLD对NF-κB p65核转位的抑制作用。五、PLD通过激活AMPK保护肠道屏障功能方法:利用细胞电阻仪检测LPS刺激的RAW 264.7细胞/Caco-2细胞共培养肠道屏障模型中Caco-2细胞的跨上皮电阻。采用Western Blot法检测Caco-2细胞中紧密连接蛋白TJP1和OCLN的表达水平。采用AMPK抑制剂Compound C处理后,Western Blot法检测Caco-2细胞中紧密连接蛋白TJP1和OCLN的表达水平。结果:PLD给药有效增加了共培养肠道屏障模型中Caco-2细胞跨上皮电阻,增加了紧密连接蛋白TJP1和OCLN的表达水平。当在共培养体系中使用AMPK抑制剂Compound C抑制AMPK的激活后,PLD给药无法有效增加Caco-2细胞紧密连接蛋白TJP1和OCLN的蛋白表达水平。结论:1.PLD在DSS诱导的肠炎小鼠模型中具有保护作用。2.在体内DSS诱导的肠炎小鼠模型及体外LPS刺激的RAW 264.7细胞模型中,PLD均能抑制巨噬细胞的M1表型极化并促进巨噬细胞的M2表型极化。3.PLD可能通过激活AMPK调节PI3K/Akt和NF-κB通路,从而调节巨噬细胞极化。4.PLD可能通过激活AMPK调节巨噬细胞极化,保护肠道屏障功能,改善肠道炎症。创新性:1.本研究发现了PLD对炎症性肠病小鼠模型的保护作用。2.本研究通过选择性清除巨噬细胞的方式,证明了巨噬细胞在PLD对炎症性肠病小鼠模型的肠道保护过程中具有重要作用。3.本研究利用体内外模型,揭示了PLD抑制M1型巨噬细胞极化,促进M2型巨噬细胞极化的功能,进一步明确了PLD通过激活AMPK调节巨噬细胞极化,保护肠道屏障,改善小鼠肠道炎症的分子机制。4.本研究补充了PLD作为抗炎药物的开发价值,为开发有效的免疫调节剂及IBD新型天然成分药物奠定了理论基础。
徐磊[4]（2020）在《白藜芦醇抗动脉粥样硬化作用及其对Smads信号通路影响的研究》文中研究指明缺血性脑血管病主要病理基础为动脉粥样硬化,在动脉粥样硬化形成过程中,炎性反应贯穿动脉粥样硬化发生发展的全过程,Smads信号通路可以抑制脂代谢、抑制炎症反应和氧化应激发挥抗动脉粥样硬化作用,白藜芦醇主要通过抗炎、抑制低密度脂蛋白氧化修饰、抑制泡沫细胞生成、抑制斑块内新生血管、抗氧化等发挥抗动脉粥样硬化的作用。然而白藜芦醇、Smads信号通路、脂代谢、炎性反应和动脉粥样硬化之间具有何种关系,目前仍不确切。本研究为明确白藜芦醇的抗动脉粥样硬化作用及其是否通过Smads信号通路的抗炎、抗动脉粥样硬化作用机制,在成功复制兔动脉粥样硬化模型基础上,采用不同影像技术对颈动脉粥样硬化的影像学特点进行比较分析,同时观察白藜芦醇对影像学变化的影响,采用免疫组化和Western-blot技术对兔颈动脉粥样硬化Smads信号通路以及巨噬细胞标志物RAM11、平滑肌标志物Actin、血管内皮细胞标志物CD31的表达进行研究,对兔主动脉弓动脉粥样硬化和血脂、Lp-PLA2水平对比分析。本文研究包括以下内容:1.兔颈动脉和主动脉弓动脉粥样硬化模型建立与评价目的:建立兔颈动脉以及主动脉弓动脉粥样硬化模型。方法:健康普通级新西兰兔8只,雄性,体重2.7-3.3kg,兔龄3个月,颈动脉粥样硬化组4只,主动脉弓动脉粥样硬化组4只;颈动脉粥样硬化组中对照组2只,进食普通饲料,高脂饮食联合兔部分颈动脉结扎手术2只。结扎后,饲养3个月后进行颈部血管超声检查,并且进行解剖颈手术操作如下:耳缘静脉留置套管针,耳缘静脉缓慢推注5%苯巴比妥钠注射液100 mg/kg,进行麻醉,手术在无菌条件下进行,颈正中切口,显露并分离左侧颈动脉,在LJZ-4D手术显微镜下用缝针穿过颈动脉血管中间位置,10-0丝线结扎部分动脉阻断部分血管,造成约50%狭窄,逐层缝合创口。颈动脉动脉,进行HE染色;主动脉弓动脉粥样硬化组4只,正常饮食组2只,高脂饮食组2只。饲养3个月。随后进行麻醉,解剖主动脉弓,进行HE染色。结果:超声检查发现对照组显示兔颈动脉光滑,未见斑块,实验组,兔颈动脉可见血管腔存在部分狭窄,狭窄处可见斑块形成;局部大体解剖见对照组颈部血管表面光滑、平整,无斑块形成,实验组可见结扎线处形成局部斑块。HE染色发现对照组管壁光滑,内膜无增生,平滑肌层形态正常,未见斑块形成,实验组见颈动脉内膜增厚,平滑肌层形态不规则,管腔变窄,斑块形成明显。NDG内膜光滑,FDG见内膜增厚,内膜下巨噬细胞浸润。结论:经超声和病理学证实,成功制备兔颈动脉和主动脉弓动脉粥样硬化模型。2.利用不同影像技术观察白藜芦醇对兔动脉粥样硬化影响的研究目的:观察不同影像技术兔颈动脉粥样硬化改变及白藜芦醇对其的影响。方法:将30只健康普通级新西兰兔,随机分配为对照组、高脂饮食+SPL组、高脂饮食+白藜芦醇+SPL组。手术操作同前。喂养3个月后,进行超声（GE,美国）检测颈动脉血流速度、狭窄程度、斑块质地;HRMRI（西门子,Skyra 3.0T,德国）检测斑块质地、狭窄程度;PET/CT（联影u MI510）检测斑块核素摄取量。结果:超声结果显示对照组管腔光滑,未见斑块形成;高脂饮食+白藜芦醇+SPL组与高脂饮食+SPL组比较,颈动脉血流速度、狭窄程度减低（P>0.05）;斑块厚度、软斑块及混合斑块比例均较低（P<0.05）,斑块质地更趋于稳定斑块。HRMRI显示对照组颈总动脉形态正常,管腔内未见斑块;高脂饮食+白藜芦醇+SPL组对比高脂饮食+SPL组颈动脉狭窄减轻,血管内斑块减小,导致狭窄程度减低。PET-CT显示与高脂饮食+SPL组比较,高脂饮食+白藜芦醇+SPL组斑块（狭窄）部位核素核素摄取（SUV）减少（P<0.05）。结论:超声、HRMRI、PET/CT影像学检查评估兔颈动脉粥样硬化模型存在不同的优势,验证兔颈动脉粥样硬化斑块存在的同时,提示可发现易损斑块存在,白藜芦醇具有抗动脉粥样硬化作用,具有降低斑块内代谢、促进斑块稳定的作用。3.白藜芦醇介导Smads信号通路抗动脉粥样硬作用的研究目的:探讨白藜芦醇对兔颈动脉粥样硬化Smads信号通路的影响及其通过抗炎等实现抗动脉硬化作用。方法:对照组、高脂饮食+SPL组、高脂饮食+白藜芦醇+SPL组,影像学检查后解剖取材颈动脉,采用HE染色进行病理学检查,采用Western-blot、免疫组化技术观察Smad2、Smad3、Smad7表达,采用免疫组化技术观察RAM11、Actin、CD31表达,定量分析Western-blot结果,应用IPP软件对免疫组化结果测量Area、IOD值,用SPSS19.0软件数据统计,进行t检验。结果:HE染色显示对照组管壁光滑,未见斑块形成,白藜芦醇+高脂饮食+SPL组对比高脂饮食+SPL组斑块厚度减低（P<0.05）。免疫组化和Western-blot技术发现高脂饮食+SPL组与对照组对比Smad2、Smad3表达增高,Smad7表现增高;高脂饮食+白藜芦醇+SPL组与高脂饮食+SPL组对比Smad2、Smad3表达减低,Smad7表达增高结果一致。高脂饮食+白藜芦醇+SPL组对比高脂饮食+SPL组CD31、RAM11、Actin定量分析明显减低（P<0.05）,并且高脂饮食+白藜芦醇+SPL组与高脂饮食+SPL组CD31、RAM11、Actin定量分析都高于对照组（P<0.05）。结论:高脂饮食可激活Smads信号通路,白藜芦醇可能通过抑制Smad2、Smad3表达,提高Smad7表达,抑制巨噬细胞浸润、平滑肌增生、新生血管生成实现抗动脉粥样硬化作用。4.白藜芦醇对动脉粥样硬化兔血脂、Lp-PLA2影响的研究目的:探讨白藜芦醇对兔动脉粥样硬化模型血脂、Lp-PLA2的影响。方法:将普通级新西兰兔随机分为NDG、FDG、RFG三组。实验前进行心脏采血,进食3个月后,再次进行心脏采血,采用化学发光法检测血脂、采用干式荧光免疫分析检测Lp-PLA2水平,采血后麻醉进行主动脉弓取材,行HE染色观察病理变化,观察主动脉弓内膜厚度、平滑肌层厚度、内膜/平滑肌层比值,数据统计分析均采用SPSS19.0软件,进行t检验。结果:实验后三组TC、HDL-C、LDL-C、Lp-PLA2具有统计学差异（P<0.05）,并且RFG比FDG组TC、LDL-C、Lp-PLA2数值减低,具有统计学差异（P<0.05）。结论:白藜芦醇通过调节血脂、抑制Lp-PLA2实现抗动脉粥样硬化。
刘烨[5]（2020）在《负载白藜芦醇的zein/pectin核壳型纳米颗粒生物利用度及抗炎抗氧化活性研究》文中研究说明白藜芦醇作为植物性多酚,具有多种有益于人体健康的功能,但因白藜芦醇水溶性和生物利用度低等因素限制了应用。利用纳米输送体系包埋白藜芦醇有利于克服这些缺陷,而基于玉米醇溶蛋白的纳米输送体系是近年来研究热门。本课题组已开发了负载白藜芦醇的玉米醇溶蛋白/果胶核/壳型纳米粒,并初步探究了体外抗氧化能力。因此,本研究是在以往实验基础上通过细胞摄取、体外跨膜转运和体内口服吸收实验探究纳米颗粒包埋的白藜芦醇的生物可利用度,以及结合消化后细胞抗氧化试验和体内外抗炎试验,探究包埋白藜芦醇的胞内抗氧化活性和抗炎能力。主要研究结果如下:1.相同剂量下,Caco-2细胞在4 h内对纳米颗粒包埋白藜芦醇的吸收明显高于对游离白藜芦醇（预溶于DMSO）的吸收（p<0.05）。2.包埋的白藜芦醇在4 h内透过Caco-2单层细胞模型的量接近游离白藜芦醇的5倍（p<0.05）。3.体外抗炎实验中,与游离白藜芦醇相比,包埋的白藜芦醇能显着抑制炎症介质和炎症因子的水平,促进抗炎因子的释放（p<0.05）;同时,包埋的白藜芦醇能抑制TLR4蛋白的水平和MAPKs蛋白的磷酸化。4.与游离的白藜芦醇相比,给予细胞纳米颗粒包埋的白藜芦醇消化液处理,其胞内丙二醛（MDA）水平显着降低,超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和过氧化氢酶（CAT）活性显着升高（p<0.05）,同时具有很强的清除胞内ROS水平的能力（p<0.05）。5.体内吸收实验中,给予游离白藜芦醇水分散液并没有在血浆中检测到白藜芦醇含量;给予白藜芦醇PEG 400/水溶液可以发现在0.5h时血浆中白藜芦醇浓度最大,一直维持到2 h,之后快速下降,在8 h时就低于检出限;而给予包埋的白藜芦醇,血浆中白藜芦醇最大浓度是白藜芦醇溶液的4.4倍,并且半衰期、平均保留时间和浓度时间曲线下的面积分别是白藜芦醇溶液组的3.1、7.5和16.5倍。体内抗炎实验中也进一步证实了包埋的白藜芦醇在低、中、高剂量都能抑制炎症因子和介质的水平,促进抗炎因子的释放（p<0.05）,而游离白藜芦醇仅在高浓度给予时才有一定的抗炎作用;同时,包埋的白藜芦醇能更有效的抑制肝脏和肺脏中My D88、TRAF6、JNK、ERK1、ERK2和p38 MAPK m RNA的水平,且呈剂量效应关系（p<0.05）。综上所述,Caco-2细胞对玉米醇溶蛋白/果胶纳米粒包埋白藜芦醇的摄取明显高于游离白藜芦醇。包埋的白藜芦醇提高了Caco-2单层细胞模拟肠壁对白藜芦醇的跨膜转运,同时大鼠口服吸收实验证明了纳米颗粒包埋的白藜芦醇在体内能持续不断释放出白藜芦醇,提高了白藜芦醇的生物可利用度。纳米颗粒包埋的白藜芦醇消化液比游离白藜芦醇消化液具有更强的细胞抗氧化能力和清除胞内ROS的能力。与游离白藜芦醇相比,纳米颗粒负载的白藜芦醇明显提高了其体内外抗炎能力,尤其是高浓度的白藜芦醇纳米粒子在体内能近乎完全清除由LPS导致的炎症效应。
何泳龙[6]（2020）在《miR-150与白藜芦醇在痛风炎症中的作用机制研究》文中研究说明背景与目的:痛风（gout）是尿酸或尿酸盐（monosodium urate,MSU）晶体沉积于全身关节及其关节周围组织或器官而引起以高尿酸血症、急慢性痛风性关节炎、痛风石、尿酸性尿路结石以及尿酸性肾病为主要表现的一组临床综合征。近年来,在全球范围内痛风的发病率和患病率呈逐年升高趋势,且有年轻化趋势。流行病学资料显示,欧洲痛风患病率达1.4%,而我国痛风患病率1%3%。高尿酸血症是痛风发生的生化基础和最直接原因。研究证实,MSU可作为DAMPs激活TLRs介导的免疫炎症信号通路,释放IL-1β、TNF-α、IL-6等致炎因子。痛风区别于其它自身炎症性疾病或自身免疫性疾病的显着特征之一是急性发作后710天后可自行缓解,痛风这一特征的具体分子机制尚不清楚,是目前痛风发病机制中急需解决的问题之一。micro RNAs是一类长度约为18-25nt的内源性高度保守的非编码小RNA,它通过与靶基因的3’-UTR结合,形成RNA诱导的沉默复合体,来降解m RNA和/或抑制靶m RNA转录后翻译。mi RNAs在炎症反应的调节作用受到广泛的关注。近年来,越来越多的研究发现,mi RNAs在痛风发病过程中发挥重要作用。本课题组前期研究发现,mi R-150在MSU刺激的野生型小鼠骨髓诱导的巨噬细胞中呈高表达,提示mi R-150可能参与MSU诱导的炎症反应。中医认为痛风属于“痹症”范畴,是因脾胃运化功能失常所致。湿热瘀阻型和痰瘀互结证是痛风急性发作期最常见的证型,其治疗以清热利湿为主,而虎杖具有清热利湿的效果。近年来,发现虎杖提取物白藜芦醇具有通过调节细胞信号通路和mi RNAs来发挥抗炎作用而被广泛关注。有研究显示,白藜芦醇可能通过抑制NF-κB的活化来调控TLR4信号通路来抑制巨噬细胞分泌细胞因子发挥抗炎作用,但具体机制还有待进一步研究。本课题拟通过研究痛风患者mi R-150的变化情况、mi R-150调控痛风炎症机制以及白藜芦醇调控痛风炎症的机制探讨mi R-150在痛风炎症中的作用。材料与方法:1.收集痛风（其中,急性期60例（acute gout,AG）、间歇期60例（intercritical gout,IG）患者）和同期体检的48例健康体检者（health control,HC）外周静脉血标本以及临床和实验室资料,其中。采用RT-q PCR检测痛风患者外周血单个核细胞中mi R-150、SOCS1、STAT3、NF-κB P65 m RNA表达水平,Western blot检测痛风患者PBMCs中SOCS1、p-STAT3和p-NF-κB P65蛋白水平,并通过相关性分析mi R-150与实验室资料的相关关系。2.利用生物信息学分析并鉴定THP-1细胞中mi R-150的靶分子（1）结合文献查阅及利用生物信息学软件Target Scan、mi Rbase、RNAhybrid 2.2预测,筛选出与痛风炎症相关的mi R-150靶分子;（2）构建作用靶点双荧光素酶报告载体,与mi R-150 mimic（过表达）共转染至293T细胞中,观察mi R-150是否能与靶基因3’-UTR区中预测位点结合;（3）mi R-150 mimic（过表达mi R-150）和mi R-150 inhibitor（抑制mi R-150表达）共转染THP-1细胞,采用RT-q PCR法检测mi R-150和SOCS1 m RNA的表达,运用Western blot法检测SOCS1蛋白的水平。3.mi R-150 mimic/inhibitor对MSU刺激THP-1巨噬细胞炎症的影响（1）mi R-150 mimic/inhibitor转染THP-1细胞48h后予以100ng/ml PMA诱导分化24h,再予以100μg/ml的MSU刺激6h后收集细胞和上清液;（2）采用流式细胞术检测经（1）中处理后细胞凋亡情况;RT-q PCR法检测mi R-150、SOCS1 m RNA水平;Western blot法检测SOCS1、p-STAT3、p-NF-κB p65蛋白水平;采用ELISA法检测上清液中细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表达水平;4.白藜芦醇及SOCS1 si RNA对MSU刺激THP-1巨噬细胞炎症的影响（1）白藜芦醇单独或联合SOCS1 si RNA干预100μg/ml MSU刺激经100ng/ml PMA诱导分化的THP-1细胞,收集细胞和上清液;（2）采用流式细胞术检测经（1）中处理后的细胞凋亡情况;RT-q PCR检测SOCS1 m RNA水平;Western blot法检测SOCS1、p-STAT3、p-NF-κB p65蛋白水平;采用ELISA法检测上清液中细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表达水平;5.采用SPSS13.0统计软件包及Graph Pad Prism 5对所有数据进行分析统计,基因表达以2^（-??CT）表示,结果以均数±标准差（x±s）表示,多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）,进一步组间两两比较采用t检验（Bonferroni法）,相关性分析采用Spearman。P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.与健康对照组比较,痛风患者除炎症指标如WBC、GR、ESR和CRP外,与代谢相关的多个指标如血尿酸、BMI、血脂、血糖、血压均显着增高（P<0.01或P<0.05）;2.AG组患者外周血单个核细胞中mi R-150显着低于IG组和HC组（P均<0.05）,而IG与HC组之间差异无统计学意义（P>0.05）;3.利用生物信息学在线软件预测到SOCS1为mi R-150的靶基因;通过构建含有mi R-150作用靶点的双荧光素酶报告载体,证实了mi R-150能与SOCS1 m RNA上预测的结合位点结合;通过转染mi R-150 mimic/inhibitor至THP-1细胞后,结果发现,与Blank组比较,mi R-150 mimic组mi R-150显着上调（P<0.01）,而mi R-150inhibitor组mi R-150显着降低（P<0.01）;与Blank组比较,mi R-150mimic组SOCS1 m RNA和蛋白的表达水平显着下降（P<0.01）,而mi R-150 inhibitor组SOCS1 m RNA和蛋白的表达水平显着升高（P<0.01）。4.mi R-150对MSU刺激THP-1巨噬细胞炎症的影响:（1）RT-q PCR结果显示mi R-150在MSU刺激的THP-1巨噬细胞中表达显着增加（P<0.01）;RT-q PCR和Western blot结果显示SOCS1 m RNA和蛋白水平在MSU刺激的THP-1巨噬细胞中显着降低（P<0.05）;上清液中细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表达水平显着增加（P均<0.01）（2）mi R-150过表达时,RT-q PCR及Western blot结果显示SOCS1m RNA和蛋白表达水平均显着下调（P均<0.01）,Western blot结果显示p-NF-κB和p-STAT3蛋白表达显着升高（P均<0.05）;ELISA结果显示细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6表达水平显着增加（P均<0.01）;而mi R-150表达抑制时,结果显示SOCS1m RNA和蛋白表达水平均显着增加（P均<0.01）,而p-NF-κB和p-STAT3蛋白表达显着下降（P均<0.05）;上清液中细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6表达水平显着降低（P均<0.01）;（3）AG组和IG组PBMCs中SOCS1 m RNA和蛋白均显着低于HC组（P<0.01,P<0.05）,且AG组显着低于IG组（P<0.05）。AG组STAT3和NF-κB p65 m RNA水平显着高于IG组和HC组（P<0.05,P<0.01）,AG组p-STAT3和p-NF-κB p65蛋白水平显着高于IG组和HC组（P均<0.01）5.流式细胞术结果显示不同浓度的白藜芦醇、白藜芦醇单独或联合SOCS1 si RNA组细胞活性均大于96%,凋亡率小于5%,说明白藜芦醇联合MSU和SOCS1 si RNA以及不同浓度白藜芦醇联合MSU刺激THP-1细胞对细胞活性无显着影响（P均>0.05）。6.不同浓度（0,25,50,100μM）Res联合MSU刺激THP-1细胞后,结果发现mi R-150在各组间差异无统计学差异（P>0.05）。Res50μmol/L、100μmol/L联合MSU组SOCS1 m RNA和蛋白表达水平较MSU组显着增加（P均<0.05）,且SOCS1的表达水平呈现浓度依赖性;同时我们发现Res 50μmol/L、100μmol/L联合MSU组NF-κB p65 m RNA和p-NF-κB p65蛋白水平较MSU组显着下降,且随着Res浓度增加下降越明显（P<0.05,P<0.01）;7.不同浓度（0,25,50,100μM）Res联合MSU刺激THP-1细胞后,结果发现Res 50μmol/L、100μmol/L联合MSU组IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表达水平较MSU组显着下降（P均<0.01）,且随着Res浓度增加而下降;8.SOCS1 si RNA联合MSU刺激THP-1细胞后,与MSU组比较,SOCS1 m RNA和蛋白水平显着下降（P均<0.01）,而p-NF-κB p65和p-STAT3蛋白表达水平显着增加（P均<0.01）;9.与Res100+MSU组比较,SOCS1 si RNA组中SOCS1的m RNA和蛋白表达水平显着下降（P均<0.05）,而p-NF-κB p65和p-STAT3蛋白表达水平明显增加（P均<0.05）;上清液中IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表达水平显着增加（P均<0.01）。与SOCS1 si RNA联合MSU组比较,SOCS1 si RNA+Res100+MSU组SOCS1 m RNA和蛋白表达水平增加（P均<0.01）,而p-NF-κB p65和p-STAT3蛋白表达水平明显下调（P均<0.01）;上清液中IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表达水平显着降低（P均<0.01）。小结:1.除炎症指标如WBC、GR、ESR、CRP外,痛风患者代谢指标如BMI、血压、血糖、血脂等多项实验室指标均高于健康对照者,说明痛风患者容易伴发代谢相关性疾病。2.mi R-150在痛风患者PBMCs中和MSU诱导的巨噬细胞炎症反应中表达异常,提示mi R-150可能参与了痛风的发病。3.预测并验证了SOCS1为mi R-150靶分子;并通过转染实验发现SOCS1 m RNA和蛋白水平能够被mi R-150抑制,提示mi R-150可能通过降解SOCS1 m RNA而发挥抑制作用。4.SOCS1在痛风患者和MSU诱导的炎症反应中表达显着降低,而STAT3、NF-κB p65 m RNA和p-STAT3和p-NF-κB p65蛋白水平在痛风患者和MSU诱导的炎症反应中显着增加,提示SOCS1、NF-κB和STAT3信号通路可能参与痛风发病过程。5.mi R-150可能通过下调SOCS1的表达,进而促进NF-κB信号通路和STAT3的活化,使炎症因子分泌增多,进而加重炎症反应。6.白藜芦醇通过上调MSU诱导的THP-1巨噬细胞炎症反应中SOCS1的水平,降低p-NF-κB p65和p-STAT3以及炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6水平的降低,SOCS1 si RNA抑制SOCS1的表达后能逆转白藜芦醇的这种抑制效应,提示白藜芦醇调控NF-κB和STAT3的活化来抑制MSU诱导的痛风炎症反应可能是通过上调SOCS1的表达实现的。
时佳[7]（2020）在《两种糖基化酪蛋白消化物的免疫活性与肠屏障功能研究》文中研究说明本研究利用酪蛋白与乳糖发生美拉德反应制备乳糖糖基化酪蛋白,用胰蛋白酶分别消化酪蛋白和乳糖糖基化酪蛋白得到酪蛋白消化物和乳糖糖基化酪蛋白消化物;同时,利用转谷氨酰胺酶催化酪蛋白与壳寡糖发生糖基化反应制备壳寡糖糖基化酪蛋白,用胰蛋白酶分别消化酪蛋白和壳寡糖糖基化酪蛋白得到酪蛋白消化物和壳寡糖糖基化酪蛋白消化物。本研究旨在剖析两种蛋白质糖基化修饰的位点,并评估两种糖基化酪蛋白消化物的免疫活性及其对小肠上皮细胞屏障功能的影响。为评估乳品加工中存在的潜在风险以及新型蛋白质配料的开发提供理论依据。主要研究结果如下:（1）两种糖基化修饰的精准糖基化位点乳糖糖基化酪蛋白消化物中乳糖含量为10.58?0.10 g/kg蛋白质;相比酪蛋白消化物,乳糖糖基化酪蛋白消化物有较低的赖氨酸、组氨酸、酪氨酸和缬氨酸。利用LC/MS-MS分析技术从乳糖糖基化酪蛋白消化物中共鉴定出5个糖肽,其糖基化位点均在赖氨酸残基,发生糖基化反应的蛋白质是Alpha-S1-casein、Beta-casein和Kappa-casein。壳寡糖糖基化酪蛋白消化物中氨基葡萄糖的导入量为5.7?0.1 g/kg蛋白质,且氨基酸含量与酪蛋白消化物基本相同。从壳寡糖糖基化酪蛋白消化物中共鉴定出3个糖肽,其糖基化位点主要在谷氨酰胺残基,发生糖基化反应的蛋白质是Alpha-S1-casein和Alpha-S2-casein。（2）两种糖基化酪蛋白消化物的体外免疫活性两种糖基化酪蛋白消化物均具有体外免疫活性。但是,与酪蛋白消化物相比,乳糖糖基化酪蛋白消化物降低Con A诱导的脾淋巴细胞刺激指数（5.1%-10.8%）、降低巨噬细胞吞噬指数（4.8%-6.5%）、降低NK细胞活性（8.2%-19.6%）,以及减少脾淋巴细胞因子（IL-2和IFN-γ）和巨噬细胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的分泌;而壳寡糖糖基化酪蛋白消化物增加Con A诱导的脾淋巴细胞刺激指数（1.6%-3.9%）、增加巨噬细胞吞噬指数（4.6%-7.0%）、增加NK细胞活性（8.6%-17.3%）,以及促进脾淋巴细胞因子和巨噬细胞因子的分泌。因此,酪蛋白的酶法精准糖基化修饰提高了其消化物的体外免疫活性,而酪蛋白的美拉德反应糖基化修饰降低了其消化物的体外免疫活性。（3）两种糖基化酪蛋白消化物的体内免疫活性两种糖基化酪蛋白消化物均具有体内免疫活性。在正常BALB/c小鼠中,与灌胃生理盐水的空白组小鼠相比,各消化物处理组小鼠的血清生化指标数值均提高,免疫器官重量指数、免疫球蛋白含量、脾淋巴细胞增殖及NK细胞活性等指标也明显升高（P<0.05）。然而,酪蛋白消化物比乳糖糖基化酪蛋白消化物显示出更高的活性,而壳寡糖糖基化酪蛋白消化物比酪蛋白消化物显示出更高的活性。在环磷酰胺致免疫低下小鼠中,与生理盐水处理的正常组小鼠相比,模型组小鼠的上述指标均明显降低（P<0.05）。各消化物灌胃小鼠后,均可明显减轻环磷酰胺导致小鼠上述各项指标的下降。然而,酪蛋白消化物比乳糖糖基化酪蛋白消化物有更好的免疫提升效率,而壳寡糖糖基化酪蛋白消化物比酪蛋白消化物有更好的免疫活性。（4）两种糖基化酪蛋白消化物对正常小肠上皮细胞屏障功能的影响两种糖基化酪蛋白消化物均可以改善小肠上皮细胞屏障功能。相比酪蛋白消化物,乳糖糖基化酪蛋白消化物提高IEC-6细胞跨膜电阻值更少;壳寡糖糖基化酪蛋白消化物提高IEC-6细胞跨膜电阻值更多。各消化物处理细胞48 h后,酪蛋白消化物处理组细胞FD-4转运率从100%降低到64.0%-78.2%;乳糖糖基化酪蛋白消化物处理组细胞FD-4转运率降低到72.1%-83.4%;壳寡糖糖基化酪蛋白消化物处理组细胞FD-4转运率降低到64.1%-72.4%。而且,酪蛋白的美拉德反应糖基化修饰降低了其消化物提高抗菌活性和减少细菌移位的作用,酪蛋白的酶法精准糖基化修饰增加了其消化物提高抗菌活性和减少细菌移位的作用。此外,乳糖糖基化酪蛋白消化物处理组比酪蛋白消化物处理组有更少的细胞紧密连接蛋白质（ZO-1、occludin和claudin-1）表达,而壳寡糖糖基化酪蛋白消化物处理组比酪蛋白消化物处理组有更多的细胞紧密连接蛋白质（ZO-1、occludin和claudin-1）表达。整体上,美拉德反应糖基化修饰对蛋白质提高小肠上皮细胞屏障功能有不良的作用。酶法精准糖基化修饰对蛋白质提高小肠上皮细胞屏障功能有有益作用。（5）两种糖基化酪蛋白消化物对受损的小肠上皮细胞屏障功能的保护作用以2.5 mmol/L丙烯酰胺构建IEC-6细胞损伤模型。两种糖基化酪蛋白消化物均对受损的IEC-6细胞有保护作用。与酪蛋白消化物相比,乳糖糖基化酪蛋白消化物提高IEC-6细胞跨膜电阻值更少,而壳寡糖糖基化酪蛋白消化物提高IEC-6细胞跨膜电阻值更多。细胞被各消化物处理48 h后,酪蛋白消化物、乳糖糖基化酪蛋白消化物和壳寡糖糖基化酪蛋白消化物分别可以使FD-4转运率降低到76.6%-88.1%、79.3%-90.4%和73.0%-84.7%。该结果说明壳寡糖糖基化酪蛋白消化物作用细胞可以更有效的降低细胞膜通透性,而乳糖糖基化酪蛋白消化物作用细胞降低细胞膜通透性的效率较低。此外,乳糖糖基化酪蛋白消化物处理组比酪蛋白消化物处理组有更少的细胞紧密连接蛋白质（ZO-1、occludin和claudin-1）表达,而壳寡糖糖基化酪蛋白消化物处理组比酪蛋白消化物处理组有更多的细胞紧密连接蛋白质（ZO-1、occludin和claudin-1）表达。因此,酪蛋白的美拉德反应糖基化修饰不利于其消化物保护受损小肠上皮细胞膜的完整性,而酪蛋白的酶法精准糖基化修饰有利于其消化物保护受损小肠上皮细胞膜的完整性。综上所述,酶法精准糖基化修饰对蛋白质的免疫活性和其改善小肠上皮细胞屏障功能有有益作用;美拉德反应糖基化修饰对蛋白质的免疫活性和其改善小肠上皮细胞屏障功能有不良作用。
郭洪雷[8]（2020）在《Pirfenidone和Fraxinellone对实验小鼠慢性胰腺炎的疗效及分子机制研究》文中指出慢性胰腺炎（Chronic pancreatitis,CP）是由各种因素引起的一种胰腺组织慢性炎症-纤维化性疾病,其病理特征为腺泡萎缩、腺泡导管化生、炎细胞浸润、间质纤维化、胰管扩张/扭曲/狭窄和组织钙化。CP患者的主要临床表现为腹痛可伴腰背痛、脂肪泻、血糖升高和营养不良。小部分CP患者甚至可进展成胰腺癌,缩短了预期寿命。临床上治疗CP的主要手段为胰酶替代、体外震波碎石、内镜和外科手术。但是,尚无有效的药物可以逆转胰腺组织的慢性炎症及纤维化进程。因此,迫切需要研究CP的发病机制并寻找有效的治疗药物。胰腺纤维化是CP的重要病理特征之一。胰腺星状细胞（Pancreatic stellate cells,PSCs）在组织纤维化过程中发挥了关键作用。胰腺组织损伤所致的炎症反应激活了PSCs,PSCs活化后分泌大量的细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）,ECM沉积在组织间质内引起纤维化,最终导致了胰腺内外分泌功能的减退。此外,慢性炎症反应保证了PSCs的持续激活,加速了组织纤维化。巨噬细胞在慢性炎症反应中发挥了关键作用,不同功能类型的巨噬细胞均促进了CP的发展。吡非尼酮（Pirfenidone,PFD）是一种具有广谱抗纤维化作用的药物,已被FDA批准用于治疗特发性肺纤维化患者。梣酮（Fraxinellone,Frx）是从中草药中提取出来的一种多效性天然产物,具有抗炎、抑制肿瘤等作用。本研究将通过小鼠模型和体外细胞实验来探索PFD和Frx对CP的疗效及其分子作用机制,旨在为CP的临床药物治疗提供实验基础。本研究在C57BL/6雄性小鼠体内反复腹腔注射雨蛙素6周造CP模型,对照组小鼠体内反复腹腔注射生理盐水。治疗药物PFD或Frx从CP造模的第4周开始灌胃,持续约4周。每周监测各组小鼠的体重变化,可见单纯雨蛙素造模组小鼠的体重比对照组小鼠明显下降,而PFD或Frx治疗组小鼠的体重比单纯雨蛙素组小鼠显着增加,这说明PFD和Frx可以改善CP小鼠的体重变化,改善营养状况。小鼠处死后将胰腺组织进行石蜡包埋,切片进行H&E染色、Sirius red染色、Masson’s trichrome染色和IHC染色以评估CP的严重程度。单纯雨蛙素造模组小鼠的胰腺组织切片染色结果显示腺泡萎缩、炎细胞浸润、腺泡导管化生和纤维化形成,而对照组小鼠的胰腺切片染色结果显示正常的组织结构。PFD或Frx治疗组小鼠的胰腺切片染色结果显示组织损害程度明显减轻,CP病理学评分有所改善。此外,本研究提取了小鼠胰腺组织的RNA,进行RT-PCR和q PCR实验,分析了目的基因的转录表达情况。与对照组相比,单纯雨蛙素造模组小鼠胰腺组织内纤维化相关基因（αSMA、FN、Col1α1、TGFβ）和炎症相关基因（F4/80、CD68、TNFα、IL-6、CCL2）的转录表达明显增加,而PFD或Frx治疗可以减少纤维化和炎症相关基因的表达,这为体内实验PFD或Frx的疗效提供了一种解释机制。为进一步探索PFD和Frx的分子作用机制,本研究将进行大量体外实验,主要针对在CP发生发展过程中发挥关键作用的PSCs和巨噬细胞。首先分析PFD或Frx对PSCs活化及ECM合成的影响。本研究通过q PCR实验分析了PSCs活化marker（αSMA）及ECM（FN、Col1α1）的转录表达,并检测纤维化相关细胞因子CTGF和基质金属蛋白酶（MMP2/9）及其抑制剂（TIMP1/2）的转录表达。WB和IF实验分析了fibronectin、collagen和CTGF的蛋白表达。上述实验结果证明PFD和Frx能够抑制PSCs的激活和ECM的合成。为进一步解析PFD抑制PSCs活化的分子机制,本研究进行PSCs的转录组测序分析,找到了药物处理组和对照组之间的差异表达基因并推测出4条细胞信号转导通路与PFD的作用密切相关。随后通过q PCR、WB和IF实验分析了TGF-β/Smad信号通路、Wnt/β-catenin信号通路、JAK/STAT信号通路和Hippo信号通路中的关键组分的表达情况。实验结果显示PFD减少了转录因子Smad2/3的磷酸化,降低了LRP6和GSK3β的磷酸化水平,减少了activeβ-catenin的表达,并下调了靶基因CCND1、c-Myc和LEF1的表达。此外,PFD还能够减少转录因子STAT3的磷酸化,而对YAP的磷酸化无明显影响。上述结果证明PFD通过TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin和JAK/STAT信号通路抑制了PSCs活化与ECM的合成。除了影响PSCs的激活,PFD还可以抑制PSCs的迁移,被细胞划痕实验和Transwell迁移实验所证实。此外,流式细胞实验结果还显示PFD可以增加PSCs的凋亡。对于Frx抑制PSCs活化的分子机制,本研究主要分析了MAPK和GSK3β/β-catenin信号通路。WB实验证明Frx可以降低p38 MAPK和GSK3β的磷酸化水平,减少activeβ-catenin及基因CCND1、c-Myc和LEF1的表达。因此推测Frx通过p38 MAPK/GSK3β/β-catenin信号通路抑制了PSCs活化与ECM的合成。巨噬细胞在胰腺慢性炎症中发挥着关键作用。本研究将进行体外实验分析PFD和Frx对巨噬细胞功能的影响。用LPS刺激巨噬细胞使其发生M1型极化,发挥促炎功能。用IL-4/IL-13刺激巨噬细胞使其发生M2型极化,发挥促纤维化功能。用PFD或Frx分别处理不同功能类型的巨噬细胞。由q PCR实验可知PFD下调了基因i NOS、TNFα和IL-1β的转录表达而没有影响基因CD206、CD301和Arg1。由WB实验可知PFD减少了CD86、i NOS、TNFα和IL-1β的蛋白表达而没有影响CD206、IL-4R、Arg1和TGFβ。此外,WB和IF实验结果显示PFD降低了STAT3的磷酸化水平而没有影响STAT1、IκBα和p65的磷酸化。因此说明PFD抑制巨噬细胞M1型极化,通过STAT3信号发挥抗炎功能,而没有影响巨噬细胞M2型极化。关于Frx对巨噬细胞功能的研究,首先进行了巨噬细胞的转录组测序分析,找到了药物处理组和对照组之间的差异表达基因,推测Frx既影响了巨噬细胞M1型极化,又影响了M2型极化。随后的q PCR和WB实验结果显示Frx下调了M1型、M2型极化相关的基因表达。WB结果还显示Frx可以抑制LPS刺激升高的IκBα和p65的磷酸化水平,而且可以抑制IL-4/IL-13刺激增加的IL-4R的表达。因此证明Frx通过NFκB信号通路抑制巨噬细胞的促炎功能,通过减少IL-4R抑制巨噬细胞的促纤维化功能。此外,用PSCs的上清液刺激巨噬细胞可使其发生M2型极化。q PCR结果显示Frx可以减少PSCs分泌趋化因子CCL2的表达,并下调了巨噬细胞分泌促纤维化因子TGFβ和PDGF的表达,而且可以拮抗PSCs上清液的作用。因此说明Frx还影响了PSCs与巨噬细胞之间的交互作用。综上所述,PFD和Frx可以缓解雨蛙素诱导的小鼠CP,抑制PSCs活化及ECM的合成,并减轻巨噬细胞的促炎促纤维化作用,有希望作为临床药物治疗CP。
丛丽[9]（2020）在《金雀异黄素调控NF-κB/miR-21抑制LPS诱导炎症细胞反应的机制研究》文中提出动脉粥样硬化是一个慢性炎症过程,炎症反应参与其发生发展。金雀异黄素（GEN）具有抗炎活性,但作用机制尚未完全阐释。课题组前期研究显示GEN抑制活化炎症细胞的转录因子NF-κB,下调miR-21和TLR4表达,生物信息学分析发现miR-21与TIPE2 CDS区存在特异性结合位点。据此我们推测:NF-κB/miR-21/TIPE2信号轴在炎症细胞反应中扮演重要角色,GEN通过抑制NF-κB,下调miR-21表达,进而活化TIPE2,阻断TLR4信号转导,最终发挥抗炎作用。为验证上述科学假说,本研究用脂多糖（LPS）刺激RAW264.7细胞和THP-1细胞构建炎症细胞反应模型,LPS诱导C57小鼠血管慢性炎症反应构建动物模型。RT-qPCR检测LPS对炎症细胞miR-21、miR-155、miR-125a表达的影响。利用慢病毒构建稳定过表达和敲降miR-21细胞系,NF-κB抑制剂PDTC和GEN单独或联合处理细胞后再用LPS刺激,RT-qPCR、Western Blot、IF分别检测TNF-α、IL-6、MCP-1、i NOS、COX-2、NF-κB p65、miR-21表达,分析miR-21、PDTC对GEN抗炎作用的影响。不同浓度GEN处理巨噬细胞,CCK8和乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒分别检测细胞活力及细胞外LDH含量,评价GEN对细胞活力的影响。RT-qPCR检测不同浓度或不同孵育时间的GEN对活化巨噬细胞miR-21表达的影响。构建miR-21宿主基因Vmp1启动子报告基因载体、NF-κB p65过表达载体并转染至巨噬细胞,双荧光素酶启动子活性报告基因实验分析NF-κB和GEN对Vmp1启动子活性的影响。利用慢病毒构建TIPE2稳定过表达和敲降细胞系,miR-21 mimic转染至细胞后再用GEN、LPS处理,RT-qPCR、Western Blot检测GEN对TIPE2、TLR4、MyD88、TRIF表达的影响及TIPE2对GEN生物学效应的影响,并分析miR-21对GEN调控TIPE2/TLR4的影响。双荧光素酶报告基因实验研究miR-21与TIPE2的靶向关系,并通过RT-qPCR和Western Blot进行验证。采用腹腔注射LPS联合胃灌注GEN、尾静脉注射miR-21拮抗剂,或腹腔注射LPS联合胃灌注GEN、皮下注射PDTC处理高脂饮食喂养的C57小鼠。分别通过RT-qPCR检测主动脉、外周血单个核细胞（PBMC）、腹腔巨噬细胞（PMΦ）的miR-21、iNOS、COX-2、NF-κB p65、TIPE2、TLR4、MyD88、TRIF表达,Western Blot、IHC、IF分析主动脉、脾脏、PMΦ炎症相关蛋白表达,HE染色观察脾脏形态学改变,生化分析仪检测血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇的含量并计算动脉硬化指数,探索GEN、miR-21和PDTC对小鼠血管慢性炎症反应的影响。结果显示,LPS能促进炎症相关因子表达,可用于构建炎症细胞反应模型,并上调炎症细胞miR-21表达。敲降miR-21后,活化炎症细胞的炎症相关因子表达水平明显降低,而过表达miR-21可恢复其表达。同时,过表达NF-κB p65能增强miR-21宿主基因Vmp1的启动子活性,而PDTC作用与之相反,且PDTC能显着下调活化炎症细胞miR-21及炎症相关因子表达,然而过表达miR-21处理又可有效减弱PDTC对miR-21和炎症细胞反应的抑制作用。此外,实验浓度范围内的GEN不影响巨噬细胞活力,并以剂量、时间依赖的方式下调miR-21,过表达miR-21可明显抵消GEN对炎症细胞反应的抑制作用。高脂饮食喂养联合腹腔注射LPS能诱导小鼠血管慢性炎症反应,miR-21拮抗剂可有效减缓血管慢性炎症反应,并与GEN协同抑制炎症相关因子表达,降低血脂水平。此外,PDTC可增强GEN对活化巨噬细胞及血管慢性炎症小鼠miR-21、炎症相关因子表达的抑制作用。GEN虽能有效降低miR-21宿主基因的启动子活性,但过表达NF-κB p65又可显着减弱这一效应。GEN可上调血管慢性炎症小鼠TIPE2表达,并抑制TLR4、MyD88和TRIF表达,这一结果在活化巨噬细胞中得到证实。此外,敲降TIPE2能逆转GEN对炎症细胞反应的抑制作用以及对TLR4信号通路的阻断功能,而过表达TIPE2作用与之相反。虽然miR-21mimic可拮抗GEN恢复TLR4信号转导,但过表达TIPE2处理后又能明显减弱miR-21 mimic的作用。miR-21 inhibitor可促进TIPE2表达,miR-21 mimic作用与之相反,并能显着降低野生组荧光素酶活性。综合上述研究结果,可得出以下结论;（1）LPS通过NF-κB增强mi R-21宿主基因启动子活性,促进miR-21转录表达,激活炎症细胞反应。（2）GEN下调NF-κB减少miR-21表达,进而活化TIPE2,通过My D88依赖型和TRIF依赖型途径抑制TLR4炎症信号转导,发挥抗炎活性。
葛嘉媛[10]（2020）在《巨噬细胞极化与自噬关系在糖尿病创面愈合中的影响研究》文中研究说明研究背景:随着生活水平的不断提高,人们饮食结构的变化,作为常见的代谢疾病之一,糖尿病（DM）发病率呈现逐年递增的趋势。DM并发症多为慢性并发症,以血管神经病变为主,而DM足溃疡因创面长期处于慢性炎症状态,导致创面迁延难愈。巨噬细胞在不同的极化状态下会影响所分泌的炎症细胞因子,VEGF、TNF-α等细胞因子在伤口愈合过程中起着关键作用。自噬做为细胞膜的运输途径,与炎症创面修复有潜在联系。目前,国内外对于DM慢性创面的致病机制研究日趋深入,有研究发现,自噬参与巨噬细胞极化的调控,能够引起巨噬细胞不同的极化状态从而影响慢性炎症性疾病进程。同时也有研究表明,DM创面愈合与巨噬细胞不同极化状态有着密切联系。目的:研究人为干预细胞自噬对于巨噬细胞极化状态的影响以及对于DM慢性炎症创面愈合的影响。方法:研究自噬与巨噬细胞极化对于DM慢性炎症创面愈合的影响。采用高葡萄糖培养的方式培养RAW264.7巨噬细胞,构建糖尿病细胞模型。通过CCK-8实验检测RAW264.7巨噬细胞在高糖培养液中细胞增殖能力,选取合适葡萄糖浓度构建DM细胞模型。实验分为诱导剂组、抑制剂组、空白对照组,设置检测时间节点6H、12H、18H、24H、48H。分别用白藜芦醇（RES）、3-MA与添加葡萄糖高糖培养液共培养细胞,采用免疫荧光双标染色技术检测处理后自噬蛋白LC3和P62的表达差异,通过Western blot检测巨噬细胞极化标记物CD16（M1）、CD206（M2）、F4/80（MO）及自噬相关P62和LC3的蛋白表达差异。采用实时荧光定量PCR（QPCR）技术检测DM慢性炎症创面愈合相关细胞因子TNF-α、IL-6（M1型巨噬细胞）及VEGF、IL-4（M2型巨噬细胞）的mRNA表达水平。结果:通过CCK-8检测RAW264.7巨噬细胞在不同浓度高糖培养液下的细胞增殖能力,并成功构建DM细胞模型。通过免疫荧光技术及Western blot检测结果表明DM白藜芦醇组,LC3表达明显升高,P62表达降低,M1型巨噬细胞标记物CD16表达增加;而3-MA组LC3表达水平显着降低,P62表达增加,M2型巨噬细胞表面标志物CD206表达增加。QPCR检测各组细胞的TN--α、IL-4及VEGF、IL-6的mRNA表达的结果表明自噬能够调节巨噬细胞极化,同时与调节DM慢性炎症创面愈合相关。结论:1.RES能够诱导巨噬细胞自噬活性,并诱导巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化。2.3-MA通过抑制巨噬细胞自噬活性,促使巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化。3.DM慢性炎症创面中,通过调节细胞自噬,能够影响巨噬细胞向不同极性状态转化,影响巨噬细胞TN-α、IL-4及VEGF、IL-6炎性因子的分泌,从而调节创面内炎症反应,作用于DM慢性炎症创面,促进创面愈合。
二、白藜芦醇增强巨噬细胞功能并抵抗乙醇诱导的小鼠免疫反应抑制（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、白藜芦醇增强巨噬细胞功能并抵抗乙醇诱导的小鼠免疫反应抑制（论文提纲范文）
（1）肿瘤代谢物乳酸诱导B细胞分化为Breg样细胞的分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 调节性B细胞概述 |
| 1.2 调节性B细胞与肿瘤 |
| 1.3 肿瘤微环境中调节性B细胞的来源 |
| 1.4 乳酸对肿瘤微环境免疫反应的影响 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 调节性B细胞生物学特性 |
| 2.1.1 调节性B细胞分类及分子标志 |
| 2.1.2 调节性B细胞抑制功能机制 |
| 2.1.3 调节性B细胞的起源及分化 |
| 2.2 调节性B细胞在自身免疫性疾病、感染和肿瘤中的作用 |
| 2.2.1 Breg细胞在自身免疫性疾病中的作用 |
| 2.2.2 Breg细胞在感染性疾病中的作用 |
| 2.2.3 Breg细胞在肿瘤中的作用 |
| 2.3 ROS在B细胞中作为信号分子的作用 |
| 2.3.1 ROS在B细胞中的产生和降解 |
| 2.3.2 ROS调节B细胞的成熟、活化和增殖 |
| 2.3.3 ROS影响B细胞功能 |
| 2.4 乳酸促进肿瘤发生发展机制 |
| 2.4.1 乳酸的来源与代谢 |
| 2.4.2 乳酸在肿瘤发生发展中的作用 |
| 2.4.3 乳酸/GPR81 信号通路对肿瘤的影响 |
| 2.4.4 乳酸作为肿瘤治疗靶点 |
| 第3章 乳酸诱导小鼠B细胞分化为Breg样细胞的分子机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 材料和试剂 |
| 3.2.3 仪器设备 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 磁珠分选B6 小鼠B220~+B细胞 |
| 3.3.2 磁珠分选CD8~+T细胞 |
| 3.3.3 磁珠分选CD4~+T细胞 |
| 3.3.4 磁珠分选B6 小鼠na(?)ve CD4~+T细胞 |
| 3.3.5 CFSE染色 |
| 3.3.6 乳酸培养小鼠B220 细胞抑制功能实验 |
| 3.3.7 CFSE法检测细胞增殖 |
| 3.3.8 慢病毒CRISPR/Cas9 技术构建LDHA基因敲除D121 细胞混合克隆稳定株 |
| 3.3.9 小鼠肺腺癌模型的构建 |
| 3.3.10 小鼠肿瘤组织消化 |
| 3.3.11 肿瘤组织B淋巴细胞分选 |
| 3.3.12 组织染色 |
| 3.3.13 流式分析 |
| 3.3.14 qRT-PCR检测 |
| 3.3.15 Western blot |
| 3.3.16 统计分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 乳酸诱导B细胞具有CD25~+CD81~+Breg样细胞的表型 |
| 3.4.2 乳酸诱导的Breg样细胞具有免疫抑制功能 |
| 3.4.3 乳酸诱导的Breg样细胞不能诱导Treg细胞分化及CD4~+T细胞凋亡 |
| 3.4.4 乳酸诱导的Breg样细胞抑制T细胞增殖机制研究 |
| 3.4.5 乳酸激活B细胞表面GPR81 受体诱导ROS表达 |
| 3.4.6 乳酸激活B细胞内PPARα诱导ROS表达 |
| 3.4.7 乳酸通过结合GPR81 受体激活PPARα诱导ROS产生 |
| 3.4.8 降低肿瘤内乳酸浓度对B细胞及其他免疫细胞比例及功能的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 乳酸诱导人外周血B细胞分化为Breg样细胞 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和仪器 |
| 4.2.1 研究对象入组及排除标准 |
| 4.2.2 实验材料 |
| 4.2.3 仪器 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞 |
| 4.3.2 磁珠分选人外周血CD3~+T/CD19~+B细胞 |
| 4.3.3 乳酸培养人CD19~+B细胞抑制功能试验 |
| 4.3.4 流式检测 |
| 4.3.5 qRT-PCR检测 |
| 4.3.6 人肺腺癌组织及癌旁组织免疫荧光染色 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 肺腺癌患者外周血乳酸含量及Breg细胞比率 |
| 4.4.2 乳酸诱导人外周血B细胞分化为Breg样细胞 |
| 4.4.3 人肺腺癌组织及癌旁组织内乳酸对 B 细胞 ROS 表达的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 结论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）艾蒿醇提物对脂多糖刺激的肉仔鸡生长、免疫和抗氧化功能的影响及其机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 植物醇提物的生物学功能 |
| 1.1.1 植物醇提物的抗氧化作用 |
| 1.1.2 植物醇提物的免疫调节作用 |
| 1.1.3 植物醇提物的其它作用 |
| 1.1.4 植物醇提物在畜禽生产中的应用 |
| 1.2 艾蒿及其生物学功能 |
| 1.2.1 艾蒿概述 |
| 1.2.2 艾蒿的化学成分 |
| 1.2.3 艾蒿的生物学功能 |
| 1.3 本论文研究的目的意义 |
| 1.4 本论文研究的总体思路 |
| 1.4.1 技术路线 |
| 1.4.2 主要研究内容 |
| 2 试验研究 |
| 2.1 艾蒿醇提物对肉仔鸡血清免疫和抗氧化指标的影响 |
| 2.1.1 引言 |
| 2.1.2 材料与方法 |
| 2.1.3 结果与分析 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.1.5 小结 |
| 2.2 艾蒿醇提物对LPS刺激的肉仔鸡生长、营养代谢率、血液相关指标及肠道形态的影响 |
| 2.2.1 引言 |
| 2.2.2 材料与方法 |
| 2.2.3 结果与分析 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 小结 |
| 2.3 艾蒿醇提物对LPS刺激的肉仔鸡免疫和抗氧化功能的影响及其调控机理的研究 |
| 2.3.1 引言 |
| 2.3.2 材料与方法 |
| 2.3.3 结果与分析 |
| 2.3.4 讨论 |
| 2.3.5 小结 |
| 2.4 艾蒿黄酮的分离、纯化及其对肉仔鸡外周血淋巴细胞免疫和抗氧化功能的影响 |
| 2.4.1 引言 |
| 2.4.2 材料与方法 |
| 2.4.3 结果与分析 |
| 2.4.4 讨论 |
| 2.4.5 小结 |
| 2.5 艾蒿黄酮通过TLR4/NF-κB信号通路调节肉仔鸡外周血淋巴细胞免疫功能的机理研究 |
| 2.5.1 引言 |
| 2.5.2 材料与方法 |
| 2.5.3 结果与分析 |
| 2.5.4 讨论 |
| 2.5.5 小结 |
| 2.6 艾蒿黄酮通过Keap1/Nrf2 信号通路调节肉仔鸡外周血淋巴细胞抗氧化功能的机理研究 |
| 2.6.1 引言 |
| 2.6.2 材料与方法 |
| 2.6.3 结果与分析 |
| 2.6.4 讨论 |
| 2.6.5 小结 |
| 3 总体讨论与结论 |
| 3.1 总体讨论 |
| 3.1.1 艾蒿醇提物对肉仔鸡免疫功能的影响及其作用机理 |
| 3.1.2 艾蒿醇提物对肉仔鸡抗氧化功能的影响及作用机理 |
| 3.2 总体结论 |
| 3.3 创新点 |
| 3.4 有待进一步解决的问题 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（3）桔梗皂苷D依赖AMPK调节巨噬细胞极化改善小鼠肠道炎症的相关机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 炎症性肠病 |
| 1.1.1 炎症性肠病的概述 |
| 1.1.2 炎症性肠病的发病机制 |
| 1.2 巨噬细胞 |
| 1.2.1 巨噬细胞的概述 |
| 1.2.2 巨噬细胞极化 |
| 1.2.3 巨噬细胞极化相关信号通路 |
| 1.2.4 巨噬细胞与IBD |
| 1.3 AMPK |
| 1.3.1 AMPK的概述 |
| 1.3.2 AMPK与巨噬细胞 |
| 1.3.3 AMPK与肠道疾病 |
| 1.4 桔梗皂苷D与炎症性疾病 |
| 第2章 PLD对DSS诱导的小鼠肠炎的作用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 主要试剂的配制 |
| 2.3 主要实验方法 |
| 2.3.1 DSS诱导的肠炎小鼠模型的构建及给药 |
| 2.3.2 疾病活动指数评价标准 |
| 2.3.3 小鼠样本的采集与处理 |
| 2.3.4 HE染色法观察小鼠结肠组织病变 |
| 2.3.5 ELISA法检测样本中细胞因子的表达水平 |
| 2.3.6 小鼠结肠组织总RNA提取 |
| 2.3.7 RT-PCR法检测样本炎症因子、紧密连接蛋白表达水平 |
| 2.3.8 FITC-Dextran肠道通透性实验 |
| 2.3.9 免疫组织化学法检测结肠组织紧密连接蛋白表达情况 |
| 2.3.10 统计学处理 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 PLD对DSS诱导的肠炎小鼠体重的影响 |
| 2.4.2 PLD对DSS诱导的肠炎小鼠疾病活动指数的影响 |
| 2.4.3 PLD对DSS诱导的肠炎小鼠结肠组织病理学的影响 |
| 2.4.4 PLD对DSS诱导的肠炎小鼠细胞因子水平的影响 |
| 2.4.5 PLD对DSS诱导的肠炎小鼠肠道屏障功能的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 巨噬细胞在PLD治疗DSS诱导的小鼠肠炎中的作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 主要试剂的配制 |
| 3.2.4 主要实验仪器 |
| 3.3 主要实验方法 |
| 3.3.1 小鼠巨噬细胞清除实验 |
| 3.3.2 小鼠结肠组织单细胞悬液的制备 |
| 3.3.3 小鼠MLN单细胞悬液的制备 |
| 3.3.4 小鼠脾脏单细胞悬液的制备 |
| 3.3.5 小鼠腹腔灌洗液的制备 |
| 3.3.6 流式细胞术检测小鼠样本巨噬细胞比例 |
| 3.3.7 小鼠结肠组织HE染色 |
| 3.3.8 统计学处理 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 氯膦酸盐脂质体清除小鼠体内巨噬细胞 |
| 3.4.2 巨噬细胞清除后PLD对DSS诱导的肠炎小鼠体重的影响 |
| 3.4.3 巨噬细胞清除后PLD对DSS诱导的肠炎小鼠DAI的影响 |
| 3.4.4 巨噬细胞清除后PLD对DSS诱导的肠炎小鼠结肠组织病理学的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 PLD调节巨噬细胞极化及初步机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验细胞 |
| 4.2.3 实验试剂 |
| 4.2.4 主要试剂的配制 |
| 4.2.5 主要实验仪器 |
| 4.3 主要实验方法 |
| 4.3.1 DSS诱导的肠炎小鼠模型的构建及给药 |
| 4.3.2 小鼠结肠组织单细胞悬液的制备 |
| 4.3.3 小鼠结肠组织总RNA提取 |
| 4.3.4 小鼠结肠组织总蛋白提取 |
| 4.3.5 小鼠腹腔灌洗液的制备 |
| 4.3.6 小鼠腹腔巨噬细胞的提取 |
| 4.3.7 流式细胞术检测小鼠样本巨噬细胞比例 |
| 4.3.8 RAW264.7细胞培养 |
| 4.3.9 PLD对 RAW264.7细胞的细胞活性实验 |
| 4.3.10 LPS刺激RAW264.7细胞模型的构建及给药 |
| 4.3.11 ELISA法检测RAW264.7细胞培养上清中细胞因子的表达 |
| 4.3.12 RAW264.7细胞总RNA提取 |
| 4.3.13 RT-PCR检测细胞因子及巨噬细胞极化标志分子mRNA表达水平 |
| 4.3.14 免疫荧光法观察RAW264.7细胞iNOS、Arg1和p65的表达情况 |
| 4.3.15 RAW264.7细胞总蛋白提取 |
| 4.3.16 RAW264.7细胞核蛋白与浆蛋白提取 |
| 4.3.17 蛋白样本浓度测定 |
| 4.3.18 Western Blot实验 |
| 4.3.19 流式细胞术检测RAW264.7细胞M1 型M2 型巨噬细胞比例 |
| 4.3.20 统计学处理 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 PLD对DSS诱导的肠炎小鼠结肠组织巨噬细胞的影响 |
| 4.4.2 PLD对DSS诱导的肠炎小鼠腹腔巨噬细胞的影响 |
| 4.4.3 PLD对RAW264.7细胞活性的影响 |
| 4.4.4 PLD对LPS刺激的RAW264.7细胞模型细胞因子水平的影响 |
| 4.4.5 PLD对LPS刺激的RAW264.7细胞模型中巨噬细胞极化的影响 |
| 4.4.6 PLD对LPS刺激的RAW264.7细胞中巨噬细胞极化相关通路PI3K/Akt和 NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 PLD通过激活AMPK调控巨噬细胞极化 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 实验细胞 |
| 5.2.3 实验试剂 |
| 5.2.4 主要试剂的配制 |
| 5.2.5 主要实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 RAW264.7细胞培养 |
| 5.3.2 LPS刺激RAW264.7细胞模型的构建及给药 |
| 5.3.3 RAW264.7细胞转染 |
| 5.3.4 RAW264.7细胞总蛋白提取 |
| 5.3.5 RAW264.7细胞浆蛋白及核蛋白提取 |
| 5.3.6 Western Blot实验 |
| 5.3.7 免疫荧光实验 |
| 5.3.8 统计学处理 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 PLD对 LPS刺激的RAW264.7细胞中AMPK激活情况的影响 |
| 5.4.2 PLD对DSS诱导的肠炎小鼠腹腔巨噬细胞中AMPK激活情况的影响 |
| 5.4.3 siRNA对 RAW264.7细胞中的AMPK表达水平的影响 |
| 5.4.4 沉默AMPK后,PLD对LPS刺激的RAW264.7细胞中巨噬细胞极化标志蛋白iNOS和 Arg1 的蛋白表达水平的影响 |
| 5.4.5 沉默AMPK后,PLD对LPS刺激的RAW264.7细胞巨噬细胞极化相关通路PI3K/Akt及NF-κB信号通路相关蛋白的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第6章 PLD通过激活AMPK保护肠道屏障功能 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 实验细胞 |
| 6.2.2 实验试剂 |
| 6.2.3 主要试剂的配制 |
| 6.2.4 主要实验仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 RAW264.7细胞培养 |
| 6.3.2 Caco-2 细胞培养 |
| 6.3.3 PLD对 Caco-2细胞的细胞活性实验 |
| 6.3.4 LPS刺激的共培养肠道屏障模型构建及给药 |
| 6.3.5 Caco-2 细胞总蛋白提取 |
| 6.3.6 Western Blot实验 |
| 6.3.7 统计学处理 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.4.1 PLD对Caco-2细胞活性的影响 |
| 6.4.2 PLD对共培养肠道屏障模型中Caco-2细胞跨上皮电阻的影响 |
| 6.4.3 PLD对共培养肠道屏障模型中Caco-2细胞紧密连接蛋白表达的影响 |
| 6.4.4 抑制AMPK激活后,PLD对共培养肠道屏障模型中Caco-2细胞紧密连接蛋白表达的影响 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第7章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）白藜芦醇抗动脉粥样硬化作用及其对Smads信号通路影响的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写表 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 白藜芦醇抗动脉粥样硬化机制研究 |
| 2.1.1 白藜芦醇概述 |
| 2.1.2 抗炎活性 |
| 2.1.3 抗氧化活性 |
| 2.1.4 抑制血小板聚集 |
| 2.1.5 抑制泡沫细胞生成 |
| 2.1.6 新生血管中的作用 |
| 2.1.7 调节血管收缩与扩张 |
| 2.1.8 抑制低密度脂蛋白氧化修饰 |
| 2.1.9 小结 |
| 2.2 SMADS信号通路与动脉粥样硬化 |
| 2.2.1 Smads信号通路概述 |
| 2.2.2 Smads信号通路与动脉粥样硬化 |
| 2.3 白藜芦醇与SMADS信号通路 |
| 第3章 兔颈动脉和主动脉弓动脉粥样硬化模型建立与评价 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 兔颈动脉模型建立可操作性评价 |
| 3.2.2 超声检查判定颈动脉粥样硬化 |
| 3.2.3 解剖颈动脉局部病理学改变 |
| 3.2.4 兔主动脉弓动脉粥样硬化模型评价 |
| 3.2.5 兔心脏采血操作性评价 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 利用不同影像技术观察白藜芦醇对兔动脉粥样硬化影响的研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 超声观察兔颈动脉粥样硬化 |
| 4.2.2 HRMRI检测兔颈动脉硬化斑块 |
| 4.2.3 PET-CT检测兔颈动脉硬化斑块 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 白藜芦醇介导SMADS信号通路抗动脉粥样硬作用的研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 白藜芦醇对兔颈动脉硬化的影响 |
| 5.2.2 兔颈动脉硬化Smads表达及白藜芦醇对其的影响 |
| 5.2.3 兔颈动脉硬化CD31、RAM11、Actin表达及白藜芦醇对其的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 白藜芦醇对动脉粥样硬化兔血脂、LP-PLA2影响的研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 动脉粥样硬化兔血脂、Lp-PLA2水平变化 |
| 6.2.2 HE染色病理学观察 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）负载白藜芦醇的zein/pectin核壳型纳米颗粒生物利用度及抗炎抗氧化活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 序言 |
| 1.1 白藜芦醇概况 |
| 1.1.1 抗炎抗氧化作用 |
| 1.1.2 抗衰老作用 |
| 1.1.3 肝脏和神经保护作用 |
| 1.1.4 心血管保护作用和抗血小板聚集 |
| 1.1.5 肥胖和糖尿病的预防 |
| 1.1.6 抗癌和抗增殖 |
| 1.2 白藜芦醇在应用时的局限性 |
| 1.3 常见的白藜芦醇包埋体系研究现状 |
| 1.3.1 基于乳液体系的传输系统 |
| 1.3.2 基于脂质体体系的传输系统 |
| 1.3.3 固体脂质传输系统 |
| 1.3.4 基于生物聚合物体系的传输系统 |
| 1.3.5 基于高分子化合物的传输系统 |
| 1.4 玉米醇溶蛋白纳米输送体系的概况 |
| 1.5 生物可利用度的研究方法 |
| 1.5.1 模拟体外胃肠道消化 |
| 1.5.2 Caco-2细胞单层模型 |
| 1.5.3 动物口服实验 |
| 1.6 本课题立题依据和研究目的 |
| 1.7 本课题的研究内容 |
| 第二章 En-RES的 Caco-2 细胞摄取及转运 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 主要溶液配制 |
| 2.3.2 细胞培养、传代和复苏 |
| 2.3.3 纳米颗粒样品的制备 |
| 2.3.4 En-RES和 RES对 Caco-2 细胞的毒性 |
| 2.3.5 Caco-2 细胞对En-RES和 RES的摄取情况 |
| 2.3.6 液相条件 |
| 2.3.7 Caco-2单层细胞模型的建立 |
| 2.3.8 Caco-2单层细胞模型的评价 |
| 2.3.9 转运实验 |
| 2.3.10 数据处理 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 包埋白藜芦醇的纳米颗粒特性 |
| 2.4.2 En-RES对 Caco-2 细胞的毒性 |
| 2.4.3 Caco-2 细胞对En-RES的摄取情况 |
| 2.4.4 Caco-2细胞模型的完整性 |
| 2.4.5 Caco-2细胞模型的紧密性 |
| 2.4.6 Caco-2 单层细胞模型对En-RES的转运 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 En-RES的体外抗炎活性 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要仪器 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 主要试剂配制 |
| 3.3.2 RAW264.7巨噬细胞培养和细胞活力研究 |
| 3.3.3 细胞上清中炎症相关因子和介质的分泌情况 |
| 3.3.4 蛋白提取和Western Blot分析 |
| 3.3.5 数据处理 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 En-RES对 RAW264.7 细胞的毒性作用 |
| 3.4.2 En-RES对炎症相关因子和介质分泌情况的影响 |
| 3.4.3 En-RES对 TLR4和MAPKs信号通路蛋白水平表达的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 En-RES体外模拟消化液的细胞内抗氧化能力 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 主要仪器 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 模拟胃肠道消化 |
| 4.3.2 液相条件 |
| 4.3.3 HepG2细胞的培养 |
| 4.3.4 细胞毒性实验 |
| 4.3.5 细胞中MDA、SOD、GSH-Px、CAT水平测定 |
| 4.3.6 清除细胞内活性氧(ROS)实验 |
| 4.3.7 数据处理 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 消化液对细胞的毒性 |
| 4.4.2 消化液对细胞中MDA、SOD、GSH-Px、CAT水平的影响 |
| 4.4.3 清除细胞内ROS的能力 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 En-RES的体内吸收及抗炎活性 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 主要仪器 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 体内吸收实验 |
| 5.3.2 体内抗炎研究 |
| 5.3.3 数据分析 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 口服En-RES的生物利用度 |
| 5.4.2 体内抗炎活性 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（6）miR-150与白藜芦醇在痛风炎症中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英汉缩略语名词对照 |
| 前言 |
| 第一部分 miR-150在痛风患者外周血单个核细胞中的变化特点 |
| 1.材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第二部分 miR-150及其靶基因和相关分子的变化特点 |
| 1 材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 mi R-150对MSU刺激THP-1 巨噬细胞炎症的影响及机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四部分 白藜芦醇通过影响SOCS1的表达调控痛风炎症反应 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文附图 |
| 综述 两个世界的相互联系:microRNA和NLRP3炎性体 |
| Reference |
| 致谢 |
| 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（7）两种糖基化酪蛋白消化物的免疫活性与肠屏障功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 食品蛋白质的概述 |
| 1.2.1 蛋白质分类 |
| 1.2.2 蛋白质的生物活性 |
| 1.3 酪蛋白性质及其应用 |
| 1.3.1 组成 |
| 1.3.2 分子结构 |
| 1.3.3 胶束结构 |
| 1.3.4 重要功能性质及其应用 |
| 1.4 蛋白质的改性技术 |
| 1.4.1 物理改性 |
| 1.4.2 化学改性 |
| 1.4.3 酶法改性 |
| 1.5 美拉德反应途径蛋白质改性及其研究进展 |
| 1.5.1 美拉德反应机制 |
| 1.5.2 对蛋白质结构与功能性质的影响 |
| 1.5.3 对蛋白质生物活性的有益影响 |
| 1.5.4 对蛋白质生物活性的不良作用 |
| 1.6 转谷氨酰胺酶途径蛋白质改性及研究进展 |
| 1.6.1 转谷氨酰胺酶的性质 |
| 1.6.2 转谷氨酰胺酶的安全性及交联产物的生物可利用性 |
| 1.6.3 在食品加工中的应用 |
| 1.6.4 转谷氨酰胺酶途径糖基化修饰 |
| 1.7 免疫 |
| 1.7.1 免疫系统的组成 |
| 1.7.2 免疫系统的作用 |
| 1.7.3 免疫器官和免疫细胞的功能 |
| 1.7.4 免疫分子 |
| 1.7.5 食品成分对免疫系统的作用 |
| 1.8 肠道屏障功能 |
| 1.8.1 物理屏障 |
| 1.8.2 化学屏障 |
| 1.8.3 微生物屏障 |
| 1.8.4 免疫屏障 |
| 1.8.5 食品成分对肠道的健康作用 |
| 1.9 选题意义及研究内容 |
| 1.9.1 研究目的和意义 |
| 1.9.2 主要研究内容 |
| 1.9.3 研究创新点 |
| 第二章 试验材料与方法 |
| 2.1 研究的技术路线 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 原料与试剂 |
| 2.2.2 主要仪器与设备 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 两种糖基化酪蛋白消化物的制备 |
| 2.3.2 消化物的化学分析 |
| 2.3.3 消化物对小鼠免疫细胞的作用 |
| 2.3.4 消化物对小鼠体内免疫的作用 |
| 2.3.5 消化物对小肠上皮细胞屏障功能的影响 |
| 2.3.6 消化物对受损的小肠上皮细胞屏障功能的保护作用 |
| 2.3.7 数据处理与统计 |
| 第三章 两种糖基化酪蛋白消化物的化学分析 |
| 3.1 乳糖糖基化酪蛋白消化物化学特征 |
| 3.1.1 基本化学特征 |
| 3.1.2 消化物氨基酸的组成 |
| 3.1.3 消化物的糖基化位点 |
| 3.2 壳寡糖糖基化酪蛋白消化物化学特征 |
| 3.2.1 基本化学特征 |
| 3.2.2 消化物氨基酸的组成 |
| 3.2.3 消化物的糖基化位点 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 美拉德反应糖基化修饰 |
| 3.3.2 酶法糖基化修饰 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 糖基化酪蛋白消化物对小鼠免疫状态的影响 |
| 4.1 乳糖糖基化对酪蛋白消化物调节小鼠免疫细胞功能的影响 |
| 4.1.1 消化物对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用 |
| 4.1.2 消化物对小鼠巨噬细胞的吞噬作用 |
| 4.1.3 消化物对NK细胞活性的影响 |
| 4.1.4 消化物对免疫细胞因子分泌的影响 |
| 4.2 乳糖糖基化对酪蛋白消化物调节正常小鼠免疫状态的影响 |
| 4.2.1 消化物对正常小鼠生化指标的影响 |
| 4.2.2 消化物对正常小鼠血清免疫球蛋白分泌的影响 |
| 4.2.3 消化物对正常小鼠免疫器官指数的影响 |
| 4.2.4 消化物对正常小鼠免疫细胞活性的影响 |
| 4.3 乳糖糖基化对酪蛋白消化物调节免疫低下小鼠免疫状态影响 |
| 4.3.1 消化物对免疫低下小鼠生化指标的影响 |
| 4.3.2 消化物对免疫低下小鼠血清免疫球蛋白分泌的影响 |
| 4.3.3 消化物对免疫低下小鼠免疫器官指数的影响 |
| 4.3.4 消化物对免疫低下小鼠免疫细胞活性的影响 |
| 4.4 精准糖基化对酪蛋白消化物调节小鼠免疫细胞功能的影响 |
| 4.4.1 消化物对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用 |
| 4.4.2 消化物对小鼠巨噬细胞的吞噬作用 |
| 4.4.3 消化物对NK细胞活性的影响 |
| 4.4.4 消化物对免疫细胞因子分泌的影响 |
| 4.5 精准糖基化对酪蛋白消化物调节正常小鼠免疫状态的影响 |
| 4.5.1 消化物对正常小鼠生化指标的影响 |
| 4.5.2 消化物对正常小鼠血清免疫球蛋白分泌的影响 |
| 4.5.3 消化物对正常小鼠免疫器官指数的影响 |
| 4.5.4 消化物对正常小鼠免疫细胞活性的影响 |
| 4.6 精准糖基化对酪蛋白消化物调节免疫低下小鼠免疫状态影响 |
| 4.6.1 消化物对免疫低下小鼠生化指标的影响 |
| 4.6.2 消化物对免疫低下小鼠血清免疫球蛋白分泌的影响 |
| 4.6.3 消化物对免疫低下小鼠免疫器官指数的影响 |
| 4.6.4 消化物对免疫低下小鼠免疫细胞活性的影响 |
| 4.7 讨论 |
| 4.7.1 蛋白质糖基化修饰对体外免疫活性的影响 |
| 4.7.2 蛋白质糖基化修饰对体内免疫活性的影响 |
| 4.8 本章小结 |
| 第五章 糖基化酪蛋白消化物对小肠上皮细胞屏障功能的影响 |
| 5.1 乳糖糖基化对消化物提高小肠上皮细胞屏障功能的影响 |
| 5.1.1 消化物对小肠上皮细胞的增殖作用 |
| 5.1.2 消化物对小肠上皮细胞跨膜电阻的影响 |
| 5.1.3 消化物对小肠上皮细胞的细胞膜通透性的影响 |
| 5.1.4 消化物对小肠上皮细胞抗菌活性和细菌移位的影响 |
| 5.1.5 消化物对小肠上皮细胞蛋白质表达的影响 |
| 5.2 乳糖糖基化对消化物改善受损小肠上皮细胞屏障功能的影响 |
| 5.2.1 丙烯酰胺对小肠上皮细胞的毒性作用 |
| 5.2.2 消化物对受损小肠上皮细胞活性的影响 |
| 5.2.3 消化物对受损小肠上皮细胞跨膜电阻的影响 |
| 5.2.4 消化物对受损小肠上皮细胞的细胞膜通透性的影响 |
| 5.2.5 消化物对受损小肠上皮细胞蛋白质表达的影响 |
| 5.3 精准糖基化对消化物改善小肠上皮细胞屏障功能的影响 |
| 5.3.1 消化物对小肠上皮细胞的增殖作用 |
| 5.3.2 消化物对小肠上皮细胞跨膜电阻的影响 |
| 5.3.3 消化物对小肠上皮细胞的细胞膜通透性的影响 |
| 5.3.4 消化物对小肠上皮细胞抗菌活性和细菌移位影响 |
| 5.3.5 消化物对小肠上皮细胞蛋白质表达的影响 |
| 5.4 精准糖基化对消化物改善受损小肠上皮细胞屏障功能的影响 |
| 5.4.1 消化物对受损小肠上皮细胞活性的影响 |
| 5.4.2 消化物对受损小肠上皮细胞跨膜电阻的影响 |
| 5.4.3 消化物对受损小肠上皮细胞的细胞膜通透性的影响 |
| 5.4.4 消化物对受损小肠上皮细胞蛋白质表达的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.5.1 蛋白质糖基化与其对小肠上皮细胞屏障功能的改善作用 |
| 5.5.2 蛋白质糖基化与其对受损小肠上皮细胞屏障功能的改善作用 |
| 5.6 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（8）Pirfenidone和Fraxinellone对实验小鼠慢性胰腺炎的疗效及分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 第一部分 Pirfenidone缓解雨蛙素诱导的小鼠慢性胰腺炎 |
| 一、实验结果 |
| 二、分析与讨论 |
| 三、结论 |
| 第二部分 Pirfenidone抑制胰腺星状细胞活化及其分子作用机制 |
| 一、实验结果 |
| 二、分析与讨论 |
| 三、结论 |
| 第三部分 Pirfenidone抑制巨噬细胞M1 极化及其分子作用机制 |
| 一、实验结果 |
| 二、分析与讨论 |
| 三、结论 |
| 第四部分 Fraxinellone缓解雨蛙素诱导的小鼠慢性胰腺炎 |
| 一、实验结果 |
| 二、分析与讨论 |
| 三、结论 |
| 第五部分 Fraxinellone抑制胰腺星状细胞活化及其分子作用机制 |
| 一、实验结果 |
| 二、分析与讨论 |
| 三、结论 |
| 第六部分 Fraxinellone调控巨噬细胞的功能及其分子作用机制 |
| 一、实验结果 |
| 二、分析与讨论 |
| 三、结论 |
| 参考文献 |
| 综述 慢性胰腺炎的试验性药物治疗进展 |
| 综述的参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（9）金雀异黄素调控NF-κB/miR-21抑制LPS诱导炎症细胞反应的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言与文献综述 |
| 1.1 炎症细胞反应与动脉粥样硬化 |
| 1.2 金雀异黄素的结构特征与生物学活性 |
| 1.3 金雀异黄素的抗炎作用及分子机制 |
| 1.4 炎症细胞反应的表观遗传调控 |
| 1.5 miRNA与炎症细胞反应 |
| 1.6 雌激素调控miR-21影响炎症细胞反应 |
| 1.7 免疫负调控因子TIPE2 |
| 1.8 炎症信号受体TLR4 |
| 1.9 立题依据和意义 |
| 第二章 NF-κB/miR-21 调控LPS诱导的炎症细胞反应 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 构建LPS诱导的炎症细胞反应模型 |
| 2.3.2 LPS上调炎症细胞miR-21 表达 |
| 2.3.3 miR-21促进炎症细胞反应 |
| 2.3.4 活化炎症细胞miR-21 表达依赖于转录因子NF-κB |
| 2.3.5 NF-κB/miR-21 调控炎症细胞反应 |
| 2.3.6 LPS依赖NF-κB增强miR-21 宿主基因启动子活性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 金雀异黄素调控NF-κB/miR-21 抑制炎症细胞反应 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 GEN对巨噬细胞活力的影响 |
| 3.3.2 GEN以剂量、时间依赖的方式抑制活化巨噬细胞miR-21表达 |
| 3.3.3 GEN抑制miR-21 表达发挥抗炎作用 |
| 3.3.4 GEN对炎症细胞反应的抑制作用依赖于NF-κB |
| 3.3.5 GEN抑制NF-κB,下调miR-21 表达 |
| 3.3.6 GEN对活化巨噬细胞miR-21 宿主基因启动子活性的抑制作用依赖于NF-κB |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 金雀异黄素调控miR-21/TIPE2/TLR4 抑制炎症细胞反应的分子机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 GEN促进免疫负调控因子TIPE2 表达 |
| 4.3.2 GEN通过调控TIPE2 发挥抗炎作用 |
| 4.3.3 GEN抑制炎症信号受体TLR4 介导的信号转导 |
| 4.3.4 GEN上调TIPE2,抑制TLR4 信号通路 |
| 4.3.5 GEN通过抑制miR-21 调控TIPE2/TLR4 信号通路 |
| 4.3.6 TIPE2是miR-21 的直接靶标 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 研究结论与展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表(中英文对照) |
| 攻读博士学位期间撰写和发表的论文 |
| 致谢 |
（10）巨噬细胞极化与自噬关系在糖尿病创面愈合中的影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 关于自噬的相关论述 |
| 1.1.1 自噬的形成阶段 |
| 1.1.2 自噬的分类 |
| 1.2 巨噬细胞极化 |
| 1.3 巨噬细胞极化与自噬的关系 |
| 1.4 自噬与糖尿病发病之间的关联 |
| 1.5 关于糖尿病创面与巨噬细胞极化的关系的研究现状 |
| 1.6 自噬在DM创面慢性炎症微环境下的作用 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料和仪器 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.1.3 实验主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 细胞冻存 |
| 2.2.3 CCK-8检测细胞增殖 |
| 2.2.4 实验分组及处理 |
| 2.2.5 免疫荧光技术检测自噬相关LC3及巨噬细胞极化相关免疫细胞数量 |
| 2.2.6 免疫印记实验检测自噬相关LC3、P62及巨噬细胞极化标志物CD16、CD206、F4/80蛋白表达 |
| 2.2.7 实时荧光定量核酸扩增检测技术检测TNF-α、IL-4及VEGF、IL-6的mRNA表达 |
| 2.3 统计学分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 CCK-8实验检测细胞增殖能力 |
| 3.2 免疫荧光技术检测巨噬细胞自噬标志蛋白LC3阳性率以及M1型巨噬细胞、M2型巨噬细胞标记阳性率 |
| 3.3 WESTERN BLOT技术检测巨噬细胞自噬标志蛋白LC3、P62与巨噬细胞极化标志蛋白CD16、CD206与F4/80 |
| 3.4 实时荧光定量PCR技术检测TNF-A、IL-6及VEGF、IL-4的MRNA表达 |
| 第四章 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
四、白藜芦醇增强巨噬细胞功能并抵抗乙醇诱导的小鼠免疫反应抑制（论文参考文献）
- [1]肿瘤代谢物乳酸诱导B细胞分化为Breg样细胞的分子机制[D]. 林杉. 吉林大学, 2021(01)
- [2]艾蒿醇提物对脂多糖刺激的肉仔鸡生长、免疫和抗氧化功能的影响及其机理研究[D]. 杨硕. 内蒙古农业大学, 2021(01)
- [3]桔梗皂苷D依赖AMPK调节巨噬细胞极化改善小鼠肠道炎症的相关机制研究[D]. 郭瑞琪. 吉林大学, 2021(01)
- [4]白藜芦醇抗动脉粥样硬化作用及其对Smads信号通路影响的研究[D]. 徐磊. 吉林大学, 2020(03)
- [5]负载白藜芦醇的zein/pectin核壳型纳米颗粒生物利用度及抗炎抗氧化活性研究[D]. 刘烨. 广东药科大学, 2020(01)
- [6]miR-150与白藜芦醇在痛风炎症中的作用机制研究[D]. 何泳龙. 成都中医药大学, 2020(02)
- [7]两种糖基化酪蛋白消化物的免疫活性与肠屏障功能研究[D]. 时佳. 东北农业大学, 2020(04)
- [8]Pirfenidone和Fraxinellone对实验小鼠慢性胰腺炎的疗效及分子机制研究[D]. 郭洪雷. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [9]金雀异黄素调控NF-κB/miR-21抑制LPS诱导炎症细胞反应的机制研究[D]. 丛丽. 湖南师范大学, 2020(01)
- [10]巨噬细胞极化与自噬关系在糖尿病创面愈合中的影响研究[D]. 葛嘉媛. 广州中医药大学, 2020(06)