一、NDV和H_9亚型AIV在血凝抑制及混合病毒在鸡胚增殖中的相互干扰（论文文献综述）
刘艳晶[1]（2021）在《重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1 Re-11株+Re-12株，H7N9 H7-Re3株）研究》文中指出高致病性禽流感是H5亚型和H7亚型流感病毒引起的一种禽类高度致死性传染病,它不仅严重危害养禽业发展,而且还具有重大公共卫生意义。疫苗免疫是中国防治禽流感的重要手段之一,鉴于禽流感病毒突变率高,疫苗株应定期测评,必要时进行更新。国家禽流感参考实验室通过对禽流感监测、病毒分离鉴定及现用疫苗对流行病毒免疫效果评估表明,从2019年起,H7N9变异株在我国出现,与原三价疫苗中H7N9 H7-Re2病毒的抗原性存在差异,攻击H7-Re2株疫苗免疫鸡后,免疫鸡不能获得完全保护,需要进行疫苗种毒更新;而H5亚型禽流感病毒流行株与疫苗株抗原性相似,现有疫苗可以起到完全保护的作用,因此不需要更新种毒。国家禽流感参考实验室利用反向遗传操作技术进行H7N9禽流感疫苗种毒更新,构建出针对H7N9病毒抗原变异株的重组禽流感病毒疫苗候选株,命名为H7-Re3株。本研究首先对重组H7N9亚型H7-Re3株的生物特性、传代稳定性和免疫原性等进行了研究。结果表明,该毒株在鸡胚上能稳定传代且生长滴度高,对鸡胚和鸡均无致病性,具有良好的免疫原性,免疫鸡能抵御流行病毒的攻击,因此该毒株是理想的灭活疫苗毒株。随后,用H5亚型Re-11株、Re-12株和H7亚型H7-Re3株病毒分别接种鸡胚培养,收获感染鸡胚液,经浓缩、甲醛溶液灭活后,乳化制成3批三价灭活苗,并进行疫苗性状检验、对鸡的安全性、免疫效力、对流行毒株的免疫保护试验以及抗体和攻毒保护关系试验。结果显示,3批疫苗均合格;以2 m L/羽的剂量接种家禽,均无副作用。按建议剂量接种后,免疫后21 d,SPF鸡H5亚型Re-11株、Re-12株、H7亚型H7-Re3株平均HI抗体效价在7.7 log2以上,SPF鸭3种毒株HI抗体效价在1:124～1:148之间,商品鹅3种毒株HI抗体效价在1:32～1:44之间;用H5亚型2.3.4.4d分支、2.3.2.1d分支和H7N9效力检验毒株及流行株攻击免疫家禽,免疫家禽均无发病死亡且不排毒。以上结果表明,3批H5+H7三价灭活疫苗免疫鸡和水禽后能够对2019年监测到的H7N9抗原变异株及H5亚型2.3.4.4d分支、2.3.2.1d分支的代表毒株攻击提供完全免疫保护。疫苗接种后HI抗体与攻毒保护关系的研究表明,免疫鸡H5亚型Re-11株、Re-12株和H7亚型H7-Re3株HI抗体≥4log2时可对H5和H7亚型相应效检毒株攻击提供完全保护;H5亚型和H7亚型3种HI抗体≥1:10的免疫鸭,可为同源H5亚型和异源H7亚型效检毒株提供完全保护。最后,我们评估了重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1 Re-11株+Re-12株,H7N9H7-Re3株）的临床应用效果,主要包括安全性和免疫效果两方面,选取山东某场白羽肉种鸡、哈尔滨某场商品蛋鸡、宁夏某场蛋种鸡和山东某场种鸭进行评估。结果显示,鸡群和鸭群按照各自程序免疫三价疫苗后,均表现正常,疫苗安全性良好,同时能够让免疫鸡和鸭产生较高水平的抗体,具有良好的免疫效力,能够保护鸡群和鸭群免受H5和H7亚型高致病性禽流感病毒的攻击。本研究表明,重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1 Re-11株+Re-12株,H7N9 H7-Re3株）对鸡和水禽具有很好的安全性和免疫效果。该疫苗已于2020年9月开始在全国范围内应用,并取得了良好的效果,对H5和H7禽流感的防控起到了非常重要的作用。
王杨杨[2]（2021）在《表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组嵌合NDV的构建及其免疫效力》文中指出H9亚型禽流感病毒（Avian Influenza Virus,AIV）在我国流行范围广泛,家禽中的感染现象比较普遍。H9亚型AIV感染可导致母鸡产蛋量减少,与其它病原体共同感染可增加家禽的死亡率,造成严重的经济损失。传统的灭活疫苗对H9亚型AIV可提供临床保护,但不能完全清除体内的病毒,免疫鸡感染后仍能排毒。传统灭活疫苗免疫方式繁琐,需要较高的人力成本。随着我国养殖业规模化水平的提高,研制出操作简便、适合大规模免疫的新型疫苗,已成为未来家禽疫苗的研发趋势。为了研制出适应集约化养殖需要的新型、高效的H9亚型禽流感疫苗,本研究以能克服新城疫（Newcastle disease,ND）母源抗体干扰的嵌合新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）AI4-2FHN为载体,构建了一系列表达H9亚型AIV流行株HA基因的新型弱毒疫苗株。该新型疫苗株易于繁殖,能通过饮水、气雾方式免疫,免疫后可诱导鸡群体内产生有效的免疫应答,在临床免疫的过程中具有广泛的应用前景。1.表达H9亚型禽流感病毒的HA基因重组嵌合NDV的构建为开发新型的H9N2亚型AIV的活疫苗,本研究以嵌合NDV（AI4-2FHN株）基因组为骨架,在NDV基因组P、M基因之间插入不同修饰的H9N2AIV HA基因,构建出5个重组质粒。其中重组质粒pNDV/AI4-2FHN-292HA是在P和M基因之间插入一个完整的HA基因开放阅读框;重组质粒pNDV/AI4-2FHN-HAG是在P和M基因之间仅插入HA基因的胞外区;重组质粒pNDV/AI4-2FHN-HAF是将HA基因的胞外区和NDV的F基因的跨膜区、胞内区融合后插入到P和M基因之间;重组质粒pNDV/AI4-2FHN-HAMU和pNDV/AI4-2FHN-HAFU是在HA基因的两端分别添加NDV的M、F基因的上下游非编码区序列后插入到NDV的P和M基因之间。5个重组质粒分别与3个辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L共转染入BSR细胞,成功拯救出5株重组病毒。RT-PCR测序结果显示5株重组NDV已经构建成功。生物学特性测定结果显示,5株重组病毒的HA效价为8-91og2、MDT>120h、ICPI值均为0,均符合典型的弱毒特征。2.重组嵌合NDV的遗传稳定性以及免疫效力评价将构建成功的 5 株重组病毒（AI4-2FHN-292HA、AI4-2FHN-HAMU、AI4-2FHN-HAFU、AI4-2FHN-HAG、AI4-2FHN-HAF）在鸡胚中连续传至第 10 代,第 2、5、8代重组病毒的生物学特性试验及第1、3、5、8代重组病毒的HA基因序列比对、Western blot试验和IFA试验结果均显示重组病毒在传代过程中遗传稳定性高,HA蛋白可表达稳定。重组病毒高剂量接种试验鸡后,试验鸡无任何临床症状,表明重组病毒对鸡具有很好的安全性。免疫保护效力试验结果显示:5株重组病毒免疫SPF鸡后均能有效诱导H9亚型AIV特异性的HI抗体,可显着减少H9亚型AIV攻毒后的排毒量。同时,为了评价重组病毒在商品鸡的免疫效果,将5株重组病毒分别免疫2周龄商品鸡,3周后加免H9亚型AIV灭活苗,试验结果显示加免后,5株重组病毒免疫组都能迅速产生针对H9亚型AIV的特异性抗体,其中重组病毒AI4-2FHN-HAG产生速度最快。重组弱毒疫苗加灭活苗的免疫方式能显着提高商品鸡群中H9亚型AIV的特异性抗体的产生速度,并能显着减少排毒量,为新型疫苗的免疫方式提供了一种新的思路。
裴宇茹[3]（2021）在《2018-2020年华东地区H9N2亚型禽流感病毒流行病学和PB2蛋白适应性变异对病毒复制影响》文中认为H9N2亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）自1992年在我国广东省鸡群中发现以来,已蔓延至全国大多数地区,呈地方流行性,难以彻底根除。经过多年的遗传进化,H9N2亚型AIV的致病性和传播性不断增加,给家禽养殖业造成严重的经济损失。此外,H9N2亚型AIV可以突破种间屏障直接感染哺乳动物包括人;并提供内部基因给其他亚型AIV产生如H5NX、H7N9、H10N8等人兽共患的新型AIV。因此,H9N2亚型AIV对公共卫生具有潜在威胁。近年来,虽然我国H9N2亚型AIV优势基因型仍然是G57或S基因型,但已有研究表明H9N2亚型AIV各基因片段发生了适应性变异,导致其跨宿主传播能力以及对哺乳动物的致病性增强。尤其是PB2基因上的一些适应性变异能增强病毒在哺乳动物中的复制和致病性。因此,有必要对H9N2亚型AIV进行定期流行病学监测、遗传进化及PB2基因关键分子标记的分析。本研究对2018年10月至2020年1月期间我国华东地区活禽交易市场和养鸡场的禽类进行每月流行病学监测,对H9N2亚型AIV全基因组进行遗传进化分析,并对PB2基因适应性分子标记对病毒在细胞内复制和聚合酶活性的影响进行分析。1华东地区H9N2亚型禽流感病毒流行病学调查2018年10月至2020年1月,在华东地区活禽市场共采集1291份泄殖腔和喉头样品。通过SPF鸡胚培养和血凝血抑试验鉴定出408份AIV和NDV 阳性样品,病毒阳性样品占总样品数比例为31.58%（408/1291）。其中H9N2亚型AIV阳性样品178份（13.78%,178/1291）。同时,在养鸡场临床样品中分离鉴定105株H9N2亚型AIV,共获得H9N2病毒283株。在活禽市场408份阳性样品中,H9N2亚型AIV占比位居第一（43.63%,178/408）,其次是 H5 亚型（31.86%,130/408）、H3 亚型（15.68%,64/408）、NDV（7.35%,30/408）等。2018.10-2020.1 期间 H9N2 分离率（13.08%-14.5%）明显高于 2011.7-2016.9 期间分离率（0.21%-0.78%）,与 2016.10-2018.9（8.49%-15.12%）分离率没有明显差异。H9N2亚型AIV的主要宿主依旧是鸡（97.19%,173/178）;病毒样品的来源主要是华东地区江苏、山东和安徽等地;H9N2亚型AIV在炎热的夏季平均分离率达11.98%,无明显季节性差异。2华东地区H9N2亚型禽流感病毒分离株基因组遗传变异特征从H9N2分离株中选择277株进行HA和NA基因测序,获得277条HA基因、226条NA基因序列,根据HA和NA基因遗传进化结果选择55个代表性分离株进行全基因组测序,并运用MEGA 7.0最大似然法（Maximum Likelihood,ML）绘制全基因遗传发生树。分析结果显示,所有分离株的HA基因和NA基因均由病毒A/Duck/HongKong/Y280/97演化而来,分别分布在calde 15和calde 2;内部基因PB2基因和M基因由病毒A/Quail/HongKong/G 1/97演化而来,分别分布在clade 8和calde 3;PB1基因、PA基因、NP基因和NS基因由A/Chicken/Shanghai/F98/98演化而来,分别分布在clade 5、clade 7、clade 6和calde 7,因此分离到的H9N2亚型AIV毒株均属于S或G57基因型。其中HA基因已出现一个新的分支Group 3,该分支仅包含2018年末和2019年的毒株。所有毒株的HA蛋白均发生了影响病毒受体结合特性的第226位谷氨酰胺（Gln,Q）突变为亮氨酸（Leu,L）。大多数分离株（61.5%,139/226）NA基因与WJ57/12相似具有5个潜在糖基化位点,其余分离株有4个（25.67%,58/226）或6个（12.83%,29/226）潜在糖基化位点。聚合酶蛋白复合体发生多个与哺乳动物宿主适应性相关氨基酸位点,如 PB2 V147I（54/55）、A184T（50/55）、I292V（40/55）、A588V（53/55）,PB1 M317V（36/55）,PAK356R（50/55）、S409N（54/55）等,说明近两年H9N2病毒对哺乳动物宿主适应性不断增强的趋势。3 PB2蛋白适应性变异对病毒复制影响的研究根据NCBI数据库下载和实验室测序获得的PB2基因,比较H和S基因型毒株PB2基因序列,筛选出8个适应性变异位点（H→S）:V147I、A184T、R353K、R389K、S590G、T598V、L648V和V661A。基于H9N2/S代表株AH320反向遗传平台,分别对PB2不同结构域进行组合突变,检测其聚合酶活性。结果显示,AH320PB2 I147V、T184A两个位点组合突变和单点突变模式下的聚合酶活性和病毒复制滴度均降低,其中AH320-I147V+T184A组合突变导致的聚合酶活性降低最为显着。同时,与母本毒AH320 相比,在病毒感染 24h,AH320-I147V、AH320-T184A 和 AH320-I147V+T184A突变毒显着降低PB2基因的mRNA、vRNA、cRNA表达量以及PB2蛋白、NP蛋白的表达水平。结果表明,PB2蛋白适应性变异147、184是影响S基因型H9N2毒株在哺乳动物细胞复制能力的关键氨基酸。在2018-2020年期间,S（或G57）基因型的H9N2病毒仍然是华东地区活禽市场中AIV的主要亚型。HA蛋白和聚合酶复合体蛋白PB2,PB1和PA均显示出更多的哺乳动物适应性分子标记。此外,研究表明PB2蛋白147、184是影响S基因型H9N2病毒在哺乳动物细胞复制能力的关键氨基酸位点。
李刚[4]（2021）在《H7N9亚型禽流感病毒灭活标记疫苗的研制》文中提出2013～2016间,H7N9亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）对禽呈现低致病性,但在2016年底之后,逐渐被H7N9亚型高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV）所取代。相比于低致病性禽流感病毒（Low pathogenic avian influenza virus,LPAIV）,H7N9亚型HPAIV不仅致病力强,而且与LPAIV的遗传距离不断加大。尽管目前H7灭活疫苗已由Rel更新至Re3,但仍难实现对部分流行株的覆盖,因此需要研制广谱高效的H7N9亚型AIV疫苗。净化是控制该疫病的有效手段,已列入我国政府制定的国家动物防疫中长期计划,但现有疫苗难以运用血清学诊断方法区别自然感染和疫苗免疫动物,因此迫切需要研制可用于区别自然感染和疫苗免疫动物（Differentiating infected from vaccinated animals,DIVA）的标记疫苗用于 H7N9亚型AIV的净化。1.H7N9亚型HPAIV HA和NA基因供体毒株的筛选对实验室前期分离的 3 株 H7N9 亚型 HPAIVs A/Chicken/Guangdong/GD4/2017（GD4）、A/Chicken/Guangdong/HZLH2/2017（HZLH2）和 A/Chicken/Hebei/XT-3/2017（XT-3）进行空斑纯化及遗传进化分析,结果显示,3株病毒株的HA基因均属于长江三角洲系A/Duck/Zhejiang/12/2011（H7N3）所属分支,且与H7-Re2疫苗株的HA基因供体毒株A/Chicken/Guangxi/SD098遗传距离相近。3株毒HA蛋白裂解位点处均有连续碱性氨基酸的插入,包含两种高致病性毒株裂解位点模式,分别是PEIPKGKRTAR↓ GLF和PEIPKRKRTAR ↓ GLF,其中GD4和HZLH2属于第一种裂解位点模式,XT-3属于第二种裂解位点模式。3株毒HA蛋白受体结合位点均为186V和226Q,鹅红细胞凝集试验证明这些毒株均具有α2,3和α2,6双受体偏嗜性。热稳定性试验结果显示,在37℃和42℃条件下,GD4和HZLH2的HA效价保持不变,XT-3的HA效价（log2）由9降低为8;在56℃条件下作用90 min后,GD4、HZLH2、XT-3的HA效价（log2）分别由原来的10、10、9降低为7、8、2,由此判定GD4、HZLH2、XT-3分别属于中等热稳定型、热稳定型和热不稳定型病毒。在pH稳定性试验中,3株毒的HA效价在pH为3.0、5.0和9.0环境中均未出现明显降低,显示了良好的pH稳定性。生物学特性测定结果显示,GD4具有更高的HA效价和EID50滴度,分别达10 log2和8.17 log10/0.1 mL。静脉接种致病指数（Intravenous pathogenicity index,IVPI）试验显示,GD4 的致病指数为2.55,符合HPAIV特征。基于GD4制备油乳灭活疫苗并免疫SPF鸡,制备抗血清用于交叉血凝抑制（Hemagglutination inhibition,HI）试验,结果显示,H7-Re2血清针对HPAIV HZLH2和XT-3毒株的交叉反应能力不足,GD4免疫血清针对H7-Re2标准抗原、GD4毒株、LPAIV JD/17和HPAIV HZLH2、XT-3具有更好的交叉反应性,因此选择GD4株作为供体毒株为后续疫苗候选株的构建提供HA和NA基因。2.H7N9 亚型重组病毒株rGD4HALo-mH3-NA-TX 的构建及生物学特性分析本研究选用 H7N9 亚型 HPAIV A/Chicken/Guangdong/GD4/2017（GD4）为 HA 和NA基因供体毒株,并对HA基因裂解位点处连续碱性氨基酸进行缺失致弱,并根据前期针对H7亚型特异性抗原表位的筛选结果将其HA2区域的12肽（HA2-12）（463ADS EMDKLYERVKRQLRENA482）替换为 H3 亚型相应肽段（463ADSEMNKLFEKTKKQL RENA482）作为DIVA疫苗的标记,并与繁殖能力强的H9N2亚型鸡胚高度适应性AI V A/Chicken/Taixing/10/2010（TX）的内部骨架（PB2、PB1、PA、NP、M、NS）进行组合,通过反向遗传技术拯救出一株H7N9亚型重组病毒株,命名为rGD4HALo-mH3-NA-TX。间接免疫荧光试验结果显示,该毒株对H7亚型HA2-12肽单抗3G10呈阴性反应,而野生型毒株GD4呈阳性反应,表明12肽段替换成功,可以作为DIVA的标记;连续传代 5 次后,rGD4HAIo-mH3-NA-TX 的 HA 效价为 10 log2,EID50 值为 8.50 log10/0.1 mL,与亲本株rGD4相当;在鸡胚感染试验中,GD4株可以在接种后约36 h致死鸡胚,而rGD4HALo-mH3-NA-TX在不同的稀释度下均不致死鸡胚,IVPI试验结果显示,所有接种r GD4HALo-mH3-NA-TX的鸡都存活且没有明显的临床症状,致病指数为0.01,表明该重组病毒致弱成功。3.H7N9亚型重组病毒株rGD4HALo-mH3-NA-TX免疫效力评价及DIVA特性鉴定交叉HI试验显示,与H7-Re2血清相比,H7N9亚型重组病毒株rGD4HALo-mH3-NA-TX免疫血清针对H7-Re2标准抗原、GD4毒株、LPAIV JD/17和HPAIV HZLH2和XT-3具有更好的交叉反应性;将H7N9亚型重组病毒株rGD4HALo-mH3-NA-TX制备油乳剂灭活疫苗并免疫3周龄SPF鸡,评估体重变化、HI抗体水平及消长规律,结果显示,rGD4HALo-mH3-NA-TX一次免疫20 d内体重变化与PBS免疫组相当,表明该灭活疫苗安全性高;在一次免疫后2周,rGD4HALo-mH3-NA-TX免疫组HI效价（log2）为7.15±1.63,高于 GD4（6.10±1.57）和 JD-cHA/17（5.40±1.64）免疫组,在一免后三周,rGD4HALo-mH3-NA-TX 免疫组 HI 水平（8.60±1.60）与 GD4 免疫组（8.70±1.22）相当,高于JD-cHA/17免疫组（8.00±1.72）。从抗体持续时间上分析发现,rGD4HALo-mH3-NA-TX免疫组在第五周HI水平达到峰值（9.80±0.45 1og2）,随后缓慢下降,但在免疫后11周仍可达7.40±0.55 log2。交叉攻毒保护试验结果显示,当分别用JD/17和GD4以106EID50剂量滴鼻点眼攻毒时,rGD4HALo-mH3-NA-TX免疫组体重增长水平均大于GD4、JD-cHA/17和 PBS 免疫组;rGD4HALo-mH3-NA-TX 免疫组能够提供针对 HPAIV（GD4）和 LPAIV（JD/17）更强的交叉排毒保护水平,分别为90%和80%,而JD-cHA/17免疫组分别为60%和80%,GD4免疫组分别为80%和70%。用建立的竞争抑制ELISA方法评价rGD4HALo-mH3-NA-TX的 DIVA 特性,结果显示,针对 GD4（56.79±3.76%）、JD/17（55.33±3.06%）、和 H7-Re2（48.56±3.98%）血清的抑制率显着高于阴性值（16.14%）,但针对rGD4HALo-mH3-NA-TX免疫血清的抑制率为11.71±0.37%,低于阴性对照,表明所构建的重组毒株的免疫血清能够与野毒株感染血清加以区分,具有明显的DIVA特性。综上,H7N9亚型重组病毒株rGD4HALo-mH3-NA-TX繁殖性能强、生产安全性高、具有DIVA特性,可针对H7N9亚型LPAIV和HPAIV提供高效的交叉免疫保护力,可作为一株理想的H7N9亚型AIV标记疫苗候选株。
朱子晨[5]（2021）在《禽流感病毒NS1蛋白拮抗干扰素水平的差异在NDV-AIV共感染过程中的作用》文中进行了进一步梳理禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）和新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）是世界范围内危害禽类的两种重要病毒,两者临床症状相似,主要引起家禽亚临床感染和呼吸道综合征。全球范围AIV和NDV共感染的现象普遍存在,且AIV与NDV共感染时存在相互抑制;尽管研究表明AIV与NDV在体内外感染时存在相互干扰,但这些结果大多基于流行病学数据以及基因水平的初步验证,本研究以NDV Herts/33以及H5N1（A/mallard/Huadong/S/2005）、H9N2（A/Hong Kong/1073/99）为研究对象,建立了NDV与AIV体外共感染模型,探讨了NDV与AIV在单独感染与共感染时的复制差异,深入研究了AIV NS1蛋白在NDV和AIV共感染过程中的作用及可能机制。NDV与AIV在共感染时可能存在拮抗现象。本试验建立了NDV与AIV体外共感染模型,并检测了在NDV和AIV感染的不同时期,AIV和NDV对病毒复制的影响。结果显示,NDV预先感染细胞可以显着降低H9N2亚型AIV NP蛋白表达量,然而NDV预先感染细胞对H5N1亚型AIV NP蛋白表达量无影响。其次,H9N2亚型AIV和H5N1亚型AIV预先感染细胞均能显着降低NDV NP蛋白的表达量。最后,TBK1通路及干扰素测定显示,H9N2亚型AIV不能抑制NDV引起TBK1磷酸化修饰及干扰素的上调表达,而H5N1亚型AIV可以抑制NDV引起TBK1磷酸化修饰及干扰素上调。表明NDV可以有效地抑制H9N2亚型AIV复制但不能抑制H5N1亚型AIV复制;NDV抑制不同亚型AIV复制的差异可能跟干扰素相关。H9N2亚型AIV和H5N1亚型AIV均能有效地抑制NDV复制。AIV NS1蛋白的可以有效拮抗宿主的干扰素以保证病毒复制。为了探究NS1蛋白是否在NDV抑制AIV的感染中扮演重要角色,本试验成功构建了高致病性、低致病性毒株NS1替换AIV感染性克隆,比较NDV感染对野生型AIV以及替换NS1 AIV复制的影响和对NDV诱导干扰素的拮抗作用。结果显示,NDV感染能显着降低H9N2与H5N1-s H9NS1 NP蛋白的表达量,抑制AIV复制,同时NDV预处理可以抑制H9N2复制且引起干扰素上调。La Sota与H5N1、H5N1H9NS1体内共感染实验表明,NDV在体内不能抑制H5N1的复制但能抑制NS1替换毒株H5N1H9NS1的复制,且NDV先感染机体的情况下,H5N1H9NS1相较于H5N1能引起更显着的干扰素上调,因此,NS1蛋白拮抗干扰素功能的强弱是影响NDV抑制AIV复制的关键因素。本试验前期研究发现,NDV感染诱导应激颗粒（Stress granules,SGs）形成,促进病毒复制。为探究H9N2对NDV感染诱导应激颗粒的影响,本试验比较了NDV与H9N2WT、H9N2H5NS1共感染时G3BP1的聚集情况,并通过H9N2 NS1蛋白过表达载体与NDV感染进行验证。结果显示,共感染时H9N2、H9N2H5NS1都明显抑制了G3BP1表达,且H9N2H5NS1抑制效果更明显。说明不同亚型的AIV NS1蛋白在共感染过程中影响了G3BP1的聚集程度,过表达结果显示H9N2 NS1蛋白对NDV诱导形成的G3BP1有显着拮抗作用。综上所述,在NDV与AIV共感染过程中,NS1H5比NS1H9具有更强的拮抗干扰素产生的能力,且对G3BP1有更强的抑制作用。本研究首次揭示了AIV NS1蛋白是NDV-AIV共感染相互抑制过程中具有差异性的关键因素,本研究将为更好地理解NDV-AIV共感染奠定基础,也为未来疾病防控提供理论支撑。
冯林[6]（2020）在《H9N2 AIV、IBV和ILTV TaqMan三重荧光定量PCR检测方法的建立和应用》文中研究表明家禽呼吸道病原是世界范围内家禽发病和死亡的主要原因,常见的有禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、新城疫病毒、大肠杆菌、支原体等,其中病毒性疾病导致发生急性和高度接触性感染,对经济影响最重要。与单个病原感染相比,多种病原混合感染在家禽很常见,并导致更严重的临床症状,如气管堵塞、呼吸困难等。低致病性H9N2亚型禽流感病毒在我国鸡群中广泛流行,当与其他呼吸道病原体,特别是与IBV、ILTV等呼吸道病原共感染,可加重H9N2感染而且死亡率差异大。IBV有多种血清型,缺乏交叉免疫,保护效果差,经常导致免疫失败。传染性喉气管炎近年来也在鸡群中时有发生。这些病原体对养禽业具有重要意义,并具有巨大的经济影响,因为它们能够单独或与其他禽类病原体混合感染诱发疾病。目前已经开发出许多用于检测禽呼吸道病毒的荧光定量PCR方法,为从事禽呼吸道病毒感染诊断的人们提供了参考。但是,这些检测方法大多数都只能检测一种病毒,并且不同方法的反应条件也不尽相同。因此,迫切需要一种检测多种重要病原体的可靠的多重荧光定量PCR方法,以用于检测未知样品。本研究旨在建立一种用于检测H9N2 AIV、IBV和ILTV的三重TaqMan荧光定量PCR方法,可同时快速检测H9N2AIV、IBV、ILTV三种病毒,并在2019年从我国17个省份发生呼吸道疾病鸡群采集病料样品660份,应用建立的方法进行了三种病原的临床样品检测。1.H9N2 AIV、IBV和ILTV TaqMan三重荧光定量PCR检测方法的建立H9N2AIV、IBV和ILTV可引起家禽呼吸道疾病,因其临床表现相似,三者之间或与其它病原体常发生混合感染,临床诊断容易混淆。本研究中,我们建立了 一 种三重实时荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantification PCR,RT-qPCR）检测方法来直接检测3种病毒。该方法以H9N2的HA基因、IBV的5’非编码区和ILTV的ICP4基因为靶基因,设计引物和TaqMan探针。重组质粒标准品10倍倍比稀释（5×100～5×109copies/μL）分析RT-qPCR灵敏度,单检测具有理想的R2值和效率,检测灵敏度较高。H9AIV、IBV和ILTV的检测限分别在50、500和500copies/反应。批内和批间具有相对较小的变异值,可重复性良好。RT-qPCR具有极好的特异性,与阴性样本或其它常见禽病毒没有交叉反应。H9N2AIV、IBV和ILTV的探针使用不同荧光标记（FAM、HEX和Cy5）,可以同时检测这三种病毒。三重RT-qPCR的R2值、PCR扩增效率和较小的批内和批间变异性与单检测具有可比性。这是首次使用三重RT-qPCR对气管和肺混合样品或棉拭样品同时检测H9N2、IBV和ILTV,并且三重RT-qPCR的检测限与单检测方法相同。因此,该方法节省了时间,可提供定量结果且三者之间没有交叉反应。本文建立的三重RT-qPCR检测方法可用于单或三重检测,适用于大批量检测,且具有可靠的灵敏度和特异性,有望对这三种常见的病毒进行监测。2.TaqMan三重荧光定量PCR方法在临床样品检测中的应用从我国江苏、山东、河北等17个省份共采集了 660份临床样品,样品处理后,用建立的TaqMan三重荧光定量PCR的方法进行三种病原的检测病毒的核酸。其中总检出率IBV最高（30.91%）,其次为ILTV（19.39%）和H9AIV（14.7%）。H9和IBV、H9和ILTV、IBV和ILTV混合感染的检出率分别为4.39%、3.79%和8.03%,3种病原共感染的检出率为1.21%。时间分布上,一年四季均可发病,但是12月份混合感染的检出率最高,IBV和ILTV、H9N2 AIV和ILTV、H9N2AIV和IBV的共感染率分别为21.52%、10.13%、4.22%,三种病原混合感染率为3.38%。根据宿主分布特点来看肉鸡3种病原的检出率均比蛋鸡高,尤其是IBV,检出率高达54.07%。根据其地域分布规律,可看出江苏、山东、河北的病原检出率较高,当然,这也可能与各省的采样量不均匀有关。综上所述,H9AIV、IBV、ILTV在我国养禽业中依然盛行,应当做好流行病学监测,为疾病的预防控制指明方向。本研究建立的三重检测方法在临床上进行疾病的诊断和流行病学调查中具有快速、特异性强等优点,为疾病诊断和流行病学监测提供了一个有力的技术支持。
赵大杰[7]（2020）在《NDV和H9N2亚型AIV共感染对病毒增殖和致病性影响》文中进行了进一步梳理新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）是副黏病毒科、副黏病毒属代表种,新城疫（Newcastle disease,ND）是由NDV强毒引起的鸡和多种禽类的急性高度接触性传染病,禽感染NDV常呈败血症经过,主要特征是呼吸困难、下痢、神经紊乱、粘膜和浆膜出血,其发病率和死亡率极高。H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）属于正粘病毒科、流感病毒属A型流感病毒,可引起家禽呼吸道症状、产蛋率下降和免疫抑制,使感染禽继发感染其它病原体,造成家禽发病率和死亡率上升。由于NDV与AIV共同感染情况在家禽养殖或野禽中时有发生,导致被感染禽病毒传播扩散和致病性更加复杂。近年研究只初步探讨NDV与H9N2亚型AIV共感染宿主后两种病毒之间相互干扰的影响,对病毒致病机制和相互干扰机制尚未明确,对宿主致病性影响也未见深入报道。为了解NDV和H9N2亚型AIV单独感染和共感染SPF鸡胚后对病毒增殖和鸡胚致病性影响,本实验采用血凝试验和血凝抑制试验（HA-HI）、RT-PCR、1日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI）、最小致死量鸡胚平均死亡时间（MDT）、ELISA、RT-qPCR以及组织切片等方法,检测病毒增殖情况和病毒对鸡胚致病性影响,以期为临床防制NDV和H9N2亚型AIV共感染提供新思路和新方向。1、基因Ⅶd亚型NDV-DQ株病毒增殖和致病性测定为了解基因Ⅶd亚型NDV-DQ株致病性和单独感染SPF鸡胚后对病毒增殖影响,本研究采用HA-HI、ICPI、MDT、ELISA等方法,检测病毒HA效价和血清HI效价、计算NDV的ICPI和MDT、并测定7个时段（3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72h和96h）收集的鸡胚尿囊液和胚体在蛋白水平上病毒增殖情况,结果显示:基因Ⅶd亚型NDVDQ株HA效价平均在8log2左右,其病毒血凝性可被NDV阳性血清抑制,ICPI为1.80,MDT为56.6 h,根据强毒力型新城疫判定指标,可判定该NDV为强毒株;NDV单独感染鸡胚后,NDV病毒含量在鸡胚尿囊液和胚体中提升情况基本一致,病毒含量在24 h～48 h提升最快,在24 h～72 h稳定提升,在72 h时病毒含量达到最高,且尿囊液中NDV病毒含量比胚体高。2、H9N2亚型AIV-AS株病毒增殖和致病性测定为了解H9N2亚型AIV-AS株致病性和感染SPF鸡胚后对病毒增殖影响,本研究采用HA-HI、MDT和ELISA等方法,测定病毒HA效价和血清HI效价、计算AIV的MDT、并测定7个时段（3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h和96 h）收集鸡胚尿囊液和胚体在蛋白水平上病毒增殖情况,结果显示:H9N2亚型AIV-AS株HA效价平均在7log2左右,其病毒血凝性可被AIV H9阳性血清抑制,MDT为74.4 h,可判定该AIV为弱毒株;AIV单独感染鸡胚后,AIV病毒含量在鸡胚尿囊液和胚体中提升情况基本一致,病毒含量在48 h～72 h提升最快,在48 h～96 h稳定提升,在96 h时病毒含量达到最高,且尿囊液中NDV病毒含量比胚体高。3、NDV和H9N2亚型AIV共感染对病毒增殖和致病性影响为了解基因Ⅶd亚型NDV-DQ强毒株和H9N2亚型AIV-AS弱毒株共感染SPF鸡胚后对病毒增殖和鸡胚致病性影响,本实验设计NDV（AIV）提前12 h、6 h和3h感染鸡胚,之后于0 h感染AIV（NDV）,并设定0 h同时感染组合、NDV（AIV）单独感染组和对照组,于共感染24 h和48 h收集鸡胚尿囊液和胚体,采用RT-PCR、RTqPCR、ELISA、HA-HI和组织切片等方法对收集样本做试验检测。RT-PCR结果显示:对收集样本作NDV和AIV核酸RT-PCR扩增,可见亮度不一359 bp和377 bp大小的特异性目的条带。RT-qPCR和ELISA结果显示:AIV在鸡胚尿囊液和胚体中均抑制NDV增殖,抑制程度随时间而增加;共感染24 h时NDV在鸡胚尿囊液中促进AIV增殖,在48 h时抑制AIV增殖;而共感染24 h和48 h时NDV在胚体中抑制AIV增殖。HA-HI结果表明NDV和AIV之间存在干扰现象,AIV严重干扰NDV增殖。NDV和AIV共感染鸡胚后造成整个胚体充血,在头、腹、背、翅和趾部有出血点。病理组织切片观察可知,鸡胚肝脏和心脏因病毒增殖影响而受到程度不一的病理损伤。综上所述,本研究证明NDV-DQ株是强毒株,H9N2亚型AIV-AS株是弱毒株,两种病毒单独感染鸡胚均能致死鸡胚,均可在鸡胚尿囊液和胚体中增殖,且尿囊液中病毒含量比胚体中高。NDV强毒株和H9N2亚型AIV弱毒株共感染鸡胚可引起病毒增殖的相互干扰,干扰程度受感染先后顺序以及感染时间影响,AIV对NDV干扰作用较NDV对AIV干扰作用显着,AIV一直抑制NDV增殖,NDV在共感染鸡胚后24 h可促进AIV增殖,之后出现抑制AIV增殖。NDV和H9N2亚型AIV共感染对鸡胚胚体、肝脏和心脏组织均有致病作用,可引起肝脏出血、纤维蛋白渗出和细胞颗粒变性等病理变化,引起心脏组织出血和颗粒变性等病理变化,共感染提高了病毒致病性,共感染时间越长鸡胚病变越严重。
倪小舒[8]（2020）在《鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感（H9亚型）三联灭活疫苗的研制》文中提出新城疫、传染性支气管炎和H9亚型禽流感是养禽业必须预防和控制的三种重要疫病。新城疫是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起,近年来在我国主要流行的是基因Ⅶ型强毒株;鸡传染性支气管炎是由传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起的急性、高度接触性传染病;H9亚型禽流感在我国家禽中广泛存在,传播效力高,传播速度快,是目前最难控制的禽流感之一。为了抵御这三种疾病的侵害,降低单价苗频繁免疫接种带来的副反应,研制免疫效力优、交叉保护性好的鸡新城疫、传染性支气管炎和禽流感（H9亚型）三联灭活苗是必要的。本研究通过反向遗传技术构建了 4株重组H9亚型禽流感病毒（AIV）,分别制成单价灭活苗,比较免疫后抗体水平及攻毒保护情况;选取免疫原性较好的AH515-PR8株与NDV（A-Ⅶ株）、IBV（QXL87株）制成三联灭活疫苗,并将该疫苗与市售同类产品进行免疫效力的比较。1.重组H9亚型AIV的构建利用反向遗传技术,以H1N1流感病毒A/Texas/05/2009×Puerto Rico/8/1934的六个内部基因为骨架,构建了含4株H9N2亚型AIV流行株的囊膜糖蛋白（HA、NA）基因的重组病毒A3-PR8、AH515-PR8、TM343-PR8与XZ349-PR8。将4株重组病毒在鸡胚上进行连续传代,其中A3-PR8株、AH515-PR8株与TM343-PR8株均能在鸡胚中稳定生长,红细胞凝集价达到29及以上。分别对4株重组病毒E6代次的病毒含量进行测定,与对应的原始毒株进行比较,发现重组毒株的病毒含量提升0.5～0.8个滴度。2.重组H9亚型AIV疫苗候选株的免疫原性评价试验分为A3-PR8组、AH515-PR8组、TM343-PR8组、疫苗株WJ57-PR8组和攻毒对照组,各免疫组采用21日龄SPF鸡10只,攻毒对照组采用21日龄SPF鸡5只。各免疫组分别以颈部皮下注射的方式免疫,每只鸡0.2mL（含2×108.5EID50病毒）;攻毒对照组接种等量PBS。免疫后第7、14、21、28天采血,测定血清中H9亚型AIV的血凝抑制（HI）抗体效价。结果表明,AH515-PR8组在免疫后抗体水平不断上升,且一直高于其它免疫组;免疫后28d,抗体效价最高,为28.9,高出其余组0.4～0.7个滴度。在攻毒后,AH515-PR8组、TM343-PR8组与疫苗株WJ57-PR8相比,排毒量有明显下降。其中AH515-PR8组排毒量最低,5d时病毒分离率为0%。3.新支流三联灭活疫苗免疫效力评价将50只SPF鸡随机分为免疫组A1组、B1组、A2组与B2组,每组各10只;攻毒对照A3组与B3组,每组各5只。A1、B1两组于21日龄免疫新支流三联灭活疫苗,含3.5×108EID50 NDV、4×106EID50 IBV、5.8×108EID50AIV;A2、B2 两组免疫市场同类产品。免疫后7d、14d、21d、28d采血分离血清,使用HI试验测定NDV与AIV的抗体效价,使用ELISA试验测定IBV的抗体水平。结果显示,免疫后28d,NDV抗体均值达到29.3,比同类产品高出1个滴度;AIV抗体均值为210.2,比同类产品组高出0.7个滴度;IBV抗体免疫后7d时均为阴性;14d时A1组抗体阳性率为80%,比B1组高出10%;21d、28d时两组抗体阳性率均为100%。使用NDV JS02/06株对A1、A2、A3组通过滴鼻点眼的途径攻毒,使用H9亚型AIV WJ57株对B1、B2、B3组通过翅静脉注射的途径攻毒。攻毒后于3、5、7d采集喉头与泄殖腔拭子测定排毒。在NDV部分,A1组临床保护率为100%,比A2组高出10%,同时大幅降低NDV的排毒,在攻毒后7d病毒分离率为10%。在AIV部分,B1组3d时排毒率为20%,5d时排毒率为0%,均低于B2组。综上所述,本研究构建了 4株重组H9亚型AIV A3-PR8、AH515-PR8、TM343-PR8与 XZ349-PR8,其中 AH515-PR8 株免疫原性最佳。AH515-PR8 株与 NDV（A-Ⅶ株）、IBV（QXL87株）制成三联灭活疫苗后均展现了良好的免疫保护效果,为研制商品化的新支流三联灭活疫苗奠定基础。
李云燕[9]（2020）在《广西野鸟源H9亚型禽流感病毒分离鉴定和全基因组测序分析及二重RT-LAMP检测方法的建立》文中研究表明禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）属于正粘病毒科,A型流感病毒属。H9亚型AIV感染通常会使家禽表现出产蛋量下降、生长缓慢及呼吸道症状,严重危害家禽产业的健康发展。该亚型病毒不仅能感染家禽和鸟类,也能直接感染人类,还能为新的感染人的重组病毒如H5N6、H7N9、和H10N8等提供部分或全部内部基因,严重危害人类公共卫生安全。广西地理位置特殊,加强该地区H9亚型AIV生态进化的研究对禽流感的有效防控具有重要意义为了解广西地区野鸟源H9亚型AIV遗传进化情况,本研究对2017-2019年间从不同活禽市场采集的斑鸠、鸽子和山鸡等野鸟咽喉和泄殖腔拭子进行病毒分离和纯化,用RT-PCR方法扩增分离株全基因并克隆测序,同时对测序结果进行遗传进化分析。结果表明成功分离鉴定出15株H9亚型AIV,均符合低致病性禽流感的分子特征,遗传进化分析发现其全基因来源较为复杂,一共出现3种不同的基因组合形式。为了建立快速检测不同亚型禽流感病毒方法,本研究利用环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）检测方法快速、敏感和成本低的优点,从NCBI下载不同HA和NA基因序列,利用Primer Explorer V5（http://primerexplorer.jp/lampv5e/）在线软件设计多对HA（H9和H5）和NA（N2）LAMP特异性引物,同时又设计了四组使用不同荧光标记的探针（HA-H9-探针和NA-N2-探针组合,HA-H9-探针和HA-H5-探针组合）,成功建立了快速检测H9和N2亚型AIV和区分H9、H5亚型AIV的二重荧光RT-LAMP检测方法。
石磊[10]（2020）在《表达H7N9亚型禽流感病毒血凝素基因的重组新城疫病毒载体疫苗的构建及血凝素抗原表位鉴定》文中研究指明自2013年在中国长三角地区首次出现以来,H7N9亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）引起严重的人感染事件,造成的病死率较高,给公共卫生安全带来了巨大挑战。2016年底,出现了高致病性（highlypathogenic,HP）H7N9禽流感病毒的变异株,在鸡群中引起疫病的暴发,给家禽养殖业带来了巨大的经济损失。疫苗接种是防控禽流感的最有效措施之一。但是,目前临床使用的H7N9禽流感灭活疫苗只能通过肌肉注射方式进行免疫,存在接种费时费力、仅能诱导体液免疫、导致禽群应激等缺点。新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）是构建家禽双价疫苗的理想载体,具有安全性好、繁殖性能强、能够诱导粘膜、体液和细胞免疫、可通过喷雾、饮水等途径进行大规模免疫接种等优点。因此,本研究的目的是以NDV为载体表达H7N9亚型AIV的主要保护性抗原——血凝素（hemagglutinin,HA）基因,构建活载体疫苗并评价其免疫效力。另外,H7N9亚型AIV是一种新发人兽共患传染病,对病毒HA蛋白抗原表位的认识还不全面。因此,本研究利用针对H7N9HA蛋白的一系列单克隆抗体,对HA蛋白的B细胞抗原表位进行排谱,并鉴定其中的免疫优势表位,为疫苗设计改造提供参考。1.表达H7N9亚型禽流感病毒HA基因的重组新城疫病毒活载体疫苗的构建与评价本研究以一株致弱的重组基因Ⅶ型NDV（rAI4）为骨架,并选取与各年份分离株交叉反应性良好的 H7N9 毒株（A/chicken/Guangdong/GD15/2016,GD15）作为HA基因的供体,通过反向遗传学构建了一株表达H7N9 HA基因的重组新城疫病毒载体疫苗（rAI4HA）。体外试验结果显示,该重组疫苗的基本生物学特性与母本病毒rAI4相似,在细胞及鸡胚中均具有较高的繁殖滴度,且毒力较低。另外,重组病毒在鸡胚中连续传代后,能够稳定表达HA蛋白,且未发现任何基因突变,表明疫苗的遗传稳定性良好。动物免疫试验显示,使用106半数鸡胚感染量（50%embryo infectiousdose,EID50）的rAI4HA经滴鼻点眼途径免疫2周龄SPF鸡,免疫后2周即可诱导产生较高的针对NDV的血凝抑制（hemagglutination inhibition,HI）抗体,与载体疫苗rAI4相似。但是,rAI4HA在免疫后第4周诱导的针对H7N9的HI抗体较低（平均滴度:2 log2）,血清转化率仅为20%（HI≥4 log2）。病毒中和（virusneutralization,VN）实验显示,rAI4HA免疫鸡血清对H7N9病毒没有中和活性。值得注意的,当使用ELISA方法进行检测时,免疫血清中存在针对H7N9HA蛋白高水平的IgY抗体（平均滴度:200）。攻毒保护试验结果显示,当使用105 EID50的HPH7N9病毒进行攻毒时,未免疫鸡在攻毒后3天内全部死亡,且表现严重的临床症状;rAI4免疫鸡在攻毒后7天内也全部死亡;rAI4HA免疫鸡在攻毒后未显示任何临床症状且未发生死亡。此外,与空载体rAI4相比,rAI4HA免疫鸡攻毒后的排毒率与排毒量显着下降。以上结果说明,候选疫苗株rAI4HA的繁殖滴度高、安全性与遗传稳定性较好,一次免疫即可诱导针对NDV与H7N9较高的抗体应答,能够提供针对H7N9病毒感染的100%的保护率,且能显着抑制排毒,在H7N9禽流感防控中显示较大的潜力。此外,rAI4HA诱导的抗体反应以较低的HI抗体、较高的H7N9特异性IgY抗体为特征,提示至少对于NDV-H7N9载体疫苗而言,传统的血清学指标不能准确反映疫苗真实的免疫效果。2.H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白B细胞抗原表位的预测及排谱重组载体疫苗rAI4HA虽然只能诱导产生低水平的针对H7N9的HI/VN抗体水平,却能诱导高水平的IgG抗体,可能与H7N9HA蛋白特殊的免疫特性有关,即HA蛋白中的非中和性B细胞抗原表位可能取代传统的HI/VN表位而成为优势表位。因此,本研究使用多个预测工具对HA蛋白潜在的B细胞抗原表位进行预测,综合预测结果设计并合成了 19条多肽,基本覆盖全长HA蛋白。我们用合成的多肽与24株H7N9 HA特异性的单克隆抗体反应,对HA蛋白的线性B细胞表位进行排谱。结果显示,8株单克隆抗体能与多肽特异性结合,其中有部分抗体识别的是相同的表位。共鉴定3个新的线性B细胞表位,均位于HA蛋白茎部区,且识别这些表位的单克隆抗体均没有HI/VN活性。然后,将筛选到的3条多肽进行截短对抗原表位进行了精细定位,以此鉴定了其中两个抗原表位的核心基序,分别为373-TAA-375与459-E。将鉴定的核心基序氨基酸位点突变后,HA蛋白与对应抗体的反应性丧失或减弱。但是,其中一条多肽截短后均不再与单抗发生反应,提示该单抗可能识别的是构象表位。我们使用噬菌体表面展示随机多肽文库对该单抗识别的表位进行筛选,鉴定了其结合的模拟肽基序为HEMWGLHSFDMT。序列比对结果显示,该模拟表位位于HA蛋白茎部区428-450 aa,是由不连续氨基酸位点组成的构象型B细胞表位,429-E-431-W-445-H-448-D为该表位的核心位点。因此,我们用单抗排谱的方法在H7N9 HA蛋白的茎部区中鉴定了 3条新的非中和抗体识别的抗原表位,2条为线性表位,1条为构象表位。3.H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白优势表位的鉴定NDV-H7N9载体疫苗诱导的抗体以高水平的非中和抗体为主,说明这些抗体识别的抗原表位可能是HA蛋白的优势表位。为了鉴定H7N9 HA蛋白中的优势抗原表位,我们用合成的多肽与不同来源的H7N9抗血清反应,并用竞争ELISA的方法鉴定NDV-H7N9免疫血清识别的优势表位。结果显示,HA蛋白19条潜在的线性B细胞表位与H7N9灭活疫苗免疫鸡与小鼠血清以及NDV-H7N9免疫鸡血清均不反应;部分表位与H7N9病毒感染鸡血清反应,其中HA茎部区的表位与血清的反应性较强。这些结果提示,HA蛋白的构象表位可能是H7N9疫苗免疫血清识别的优势表位。此外,前期peptide-ELISA实验显示,大部分单抗与线性B细胞表位不反应,表明这些单克隆抗体针对的表位也可能是构象性表位。因此,我们使用竞争ELISA方法评价这些单克隆抗体和NDV-H7N9免疫血清与HA蛋白结合的竞争性。结果显示,2B11 1F3和4B7 4D5两株单抗具有显着的竞争效应,能使免疫血清与HA蛋白的结合性下降50%左右,表明它们针对的表位是诱导NDV-H7N9疫苗抗体应答的优势表位。此外,2B11 1F3和4B74D5两株单抗与免疫血清的竞争没有叠加效应,说明它们可能针对的是同一表位。然后,我们使用噬菌体表面展示随机多肽文库对4B74D5识别的表位进行筛选,鉴定其识别的模拟肽基序为SNTALPSKFYGY,与HA蛋白序列吻合的关键氨基酸为331-N-336-P-361-Y-362-G,为单抗识别的核心基序。结果说明,H7N9疫苗诱导的抗体应答与病毒自然感染诱导的抗体应答存在明显差异,并鉴定HA蛋白331-N-336-P-361-Y-362-G基序为NDV-H7N9载体疫苗诱导抗体应答的优势表位。
二、NDV和H_9亚型AIV在血凝抑制及混合病毒在鸡胚增殖中的相互干扰（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、NDV和H_9亚型AIV在血凝抑制及混合病毒在鸡胚增殖中的相互干扰（论文提纲范文）
（1）重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1 Re-11株+Re-12株，H7N9 H7-Re3株）研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 禽流感病毒介绍 |
| 1.2 H5和H7亚型禽流感的流行及危害 |
| 1.2.1 H5亚型禽流感的流行及危害 |
| 1.2.2 H7亚型禽流感的流行及危害 |
| 1.2.3 H7N9亚型流感的流行和危害 |
| 1.3 H5、H7亚型禽流感的防控 |
| 1.3.1 H5亚型禽流感疫苗研究进展 |
| 1.3.2 H7N9禽流感疫苗研究进展 |
| 1.3.3 禽流感综合防治措施 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 重组禽流感病毒H7N9亚型H7-RE3株生物学特性研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒株 |
| 2.1.2 实验动物及试验地 |
| 2.1.3 标准阳性血清及抗原 |
| 2.1.4 疫苗 |
| 2.1.5 主要试剂和仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 重组禽流感病毒H7-Re3株在鸡胚中的增殖及其鉴定 |
| 2.2.2 重组禽流感病毒H7-Re3株的致病性试验 |
| 2.2.3 重组禽流感病毒H7-Re3株灭活疫苗的免疫效力试验 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 重组禽流感病毒H7-Re3株在鸡胚中的增殖和遗传稳定性结果 |
| 2.3.2 致病性试验结果 |
| 2.3.3 重组禽流感病毒H7-Re3株灭活疫苗的免疫效力试验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗的实验室研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 疫苗用毒株 |
| 3.1.2 效检病毒株 |
| 3.1.3 试验鸡胚和试验动物 |
| 3.1.4 HI抗原和标准阳性血清 |
| 3.1.5 主要试剂和仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 活性成分抗原相容性研究 |
| 3.2.2 安全性检验 |
| 3.2.3 疫苗效力检验 |
| 3.2.4 3批疫苗免疫效力试验 |
| 3.2.5 对流行毒株的免疫效力试验 |
| 3.2.6 重组禽流感H7亚型H7-Re3株HI抗体与攻毒保护关系研究 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 抗原病毒液制备及浓缩结果 |
| 3.3.2 病毒液灭活检验结果 |
| 3.3.3 制备疫苗检验结果 |
| 3.3.4 安全性检测结果 |
| 3.3.5 两种不同抗原含量的三价苗分别与三种单苗免疫效力比较结果 |
| 3.3.6 3批三价疫苗免疫效力试验结果 |
| 3.3.7 对流行毒株的免疫效力试验结果 |
| 3.3.8 抗体与攻毒保护关系研究结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗的临床应用评估 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 抗原及标准阳性血清 |
| 4.1.2 疫苗 |
| 4.1.3 试验动物及场地 |
| 4.1.4 试剂和仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 三价疫苗对山东某场白羽肉种鸡的安全性和免疫效果研究 |
| 4.2.2 三价疫苗对肇东某场商品蛋鸡的安全性和免疫效果研究 |
| 4.2.3 三价疫苗对宁夏某场蛋种鸡的安全性和免疫效果研究 |
| 4.2.4 三价疫苗对山东某场种鸭的安全性和免疫效果研究 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 安全性评估结果 |
| 4.3.2 三价疫苗对山东某场白羽肉种鸡的免疫效果研究结果 |
| 4.3.3 三价疫苗对肇东某场商品蛋鸡的免疫效果研究结果 |
| 4.3.4 三价疫苗对宁夏某场蛋种鸡的免疫效果研究结果 |
| 4.3.5 三价疫苗对山东某场种鸭的免疫效果研究结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组嵌合NDV的构建及其免疫效力（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 新城疫病毒载体疫苗研究进展 |
| 1 新城疫病毒 |
| 1.1 NDV基因组 |
| 1.2 NDV毒力 |
| 2 NDV反向遗传系统的建立 |
| 3 NDV载体疫苗 |
| 3.1 NDV载体疫苗的发展 |
| 3.2 NDV载体疫苗的应用 |
| 4 母源抗体对NDV载体疫苗的干扰 |
| 5 克服母源抗体对载体疫苗干扰的方法 |
| 第一章 表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组嵌合NDV的构建及鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒,病毒,细胞株 |
| 1.2 试验试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 分子生物学软件 |
| 1.5 供体遗传株的分析与筛选 |
| 2 方法 |
| 2.1 5株重组病毒的构建策略 |
| 2.2 全长克隆pNDV/AI4-2FHN-292HA的构建 |
| 2.3 全长克隆pNDV/AI4-2FHN-HAMU的构建 |
| 2.4 全长克隆pNDV/AI4-2FHN-HAFU的构建 |
| 2.5 全长克隆pNDV/AI4-2FHN-HAG的构建 |
| 2.6 全长克隆pNDV/AI4-2FHN-HAF的构建 |
| 2.7 重组病毒株的拯救 |
| 2.8 重组病毒的鉴定 |
| 2.9 重组病毒的生物学特性测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 毒株的筛选 |
| 3.2 中间质粒的PCR鉴定 |
| 3.3 5个全长质粒的酶切鉴定 |
| 3.4 5株重组病毒的拯救与鉴定 |
| 3.5 重组病毒的生物学特性测定 |
| 4 讨论 |
| 第二章 重组病毒的免疫保护效力评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验材料与试剂 |
| 1.2 主要仪器及设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 检测5株重组病毒的遗传稳定性 |
| 2.2 外源基因表达的鉴定 |
| 2.3 重组病毒超剂量接种安全试验 |
| 2.4 重组病毒的免疫保护试验 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 重组病毒的生物学特性的测定 |
| 3.2 HA蛋白基因序列的稳定性 |
| 3.3 外源基因的表达鉴定 |
| 3.4 重组病毒超剂量接种安全试验 |
| 3.5 重组病毒的免疫保护性试验 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表论文 |
（3）2018-2020年华东地区H9N2亚型禽流感病毒流行病学和PB2蛋白适应性变异对病毒复制影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1 H9N2亚型禽流感病毒流行病学 |
| 1.1 H9N2亚型禽流感在我国的暴发和流行 |
| 1.2 H9N2亚型AIV的进化和重组 |
| 2 H9N2亚型禽流感病毒蛋白研究进展 |
| 2.1 血凝素蛋白(Hemagglutinin Proteins,HA) |
| 2.2 神经氨酸酶蛋白(Neuraminidase Proteins,NA) |
| 2.3 聚合酶复合体蛋白(Polymerase Complex Proteins) |
| 2.4 核蛋白(Nucleoprotein,NP) |
| 2.5 基质蛋白(Matrix Proteins,M) |
| 2.6 非结构蛋白(Nonstructural Proteins,NS) |
| 3 PB2蛋白适应性变异对病毒复制影响的研究进展 |
| 3.1 PB2蛋白的功能结构域 |
| 3.2 PB2蛋白关键氨基酸位点对病毒复制影响 |
| 4 结语 |
| 第一章 华东地区H9N2亚型禽流感病毒流行病学调查 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒与阳性血清 |
| 1.2 病毒运输液 |
| 1.3 SPF鸡胚和SPF鸡红细胞 |
| 1.4 仪器设备 |
| 1.5 其它材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 样品采集 |
| 2.2 病毒分离 |
| 2.3 病毒亚型鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒亚型鉴定结果 |
| 3.2 近十年来活禽交易市场H9N2亚型AIV分离率 |
| 3.3 H9N2亚型AIV的分布特点 |
| 3.4 养鸡场H9N2亚型AIV的鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 华东地区H9N2亚型禽流感病毒分离株基因组遗传变异特征 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 SPF鸡胚 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 实验器材 |
| 1.5 引物设计 |
| 1.6 数据库和分子生物学软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒RNA的提取与反转录 |
| 2.2 RT PCR扩增及电泳检测 |
| 2.3 PCR胶块产物回收纯化 |
| 2.4 DNA测序与序列处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 HA基因 |
| 3.2 NA基因 |
| 3.3 M基因 |
| 3.4 NP基因 |
| 3.5 NS基因 |
| 3.6 PB2基因 |
| 3.7 PB1基因 |
| 3.8 PA基因 |
| 4 讨论 |
| 第三章 PB2蛋白适应性变异对病毒复制影响的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株与质粒 |
| 1.2 细胞系与鸡胚 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 实验器材 |
| 1.5 数据库和分子生物学软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 PB2蛋白适应性变异位点分析 |
| 2.2 构建单点和多点突变质粒 |
| 2.3 测定聚合酶活性 |
| 2.4 拯救病毒和生长动力学测定 |
| 2.5 相对荧光定量法检测PB2基因的mRNA、vRNA和cRNA表达 |
| 2.6 Wersten-blot检测蛋白表达水平 |
| 3 结果 |
| 3.1 组合位点突变对聚合酶活性的影响 |
| 3.2 组合突变毒株生长动力学 |
| 3.3 单点突变毒株聚合酶活性 |
| 3.4 单点突变毒株的生长动力学 |
| 3.5 单点突变毒株mRNA,cRNA,vRNA的表达水平 |
| 3.6 单点突变毒株的蛋白表达水平 |
| 4 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 附录: H9N2亚型禽流感病毒背景信息 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（4）H7N9亚型禽流感病毒灭活标记疫苗的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述: H7N9亚型禽流感病毒的流行现状及其疫苗的研究进展 |
| 1 禽流感概述 |
| 2 H7N9亚型禽流感研究进展 |
| 3 H7N9亚型禽流感疫苗研制策略 |
| 4 针对禽流感病毒的DIVA策略 |
| 5 目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 H7N9亚型HPAIV HA和NA基因供体毒株的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 H7N9亚型重组病毒株rGD4_(HALo-mH3-NA)-TX的构建及生物学特性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 H7N9亚型重组病毒株rGD4_(HALo-mH3-NA)-TX免疫效力评价及DIVA特性鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（5）禽流感病毒NS1蛋白拮抗干扰素水平的差异在NDV-AIV共感染过程中的作用（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1.前言 |
| 1.1 多种病原共感染研究进展 |
| 1.1.1 多病原共感染概述 |
| 1.1.2 病毒和衣原体 |
| 1.1.3 细菌和真菌 |
| 1.1.4 病毒和病毒 |
| 1.1.5 病毒与细菌 |
| 1.1.5.1 致病菌和病毒共感染 |
| 1.1.5.2 感染机制 |
| 1.2 NDV-AIV共感染概述 |
| 1.2.1 NDV概述 |
| 1.2.2 AIV概述 |
| 1.2.3 AIV NS1蛋白概述 |
| 1.2.4 NDV与AIV共感染现状 |
| 1.3 共感染机制研究的目的与意义 |
| 1.3.1 NDV与AIV两者异同 |
| 1.3.2 本研究目的与意义 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 伦理声明 |
| 2.1.2 实验用病毒、细胞及抗体 |
| 2.1.3 所用溶液试剂与配制 |
| 2.1.4 主要设备仪器 |
| 2.1.5 统计学分析 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 共感染基本操作 |
| 2.2.1.1 细胞上病毒共感染实验设计 |
| 2.2.1.2 A549细胞复苏、传代及铺板 |
| 2.2.1.3 禽流感病毒H9N2亚型感染A549最适胰酶浓度的确定 |
| 2.2.1.4 病毒在细胞上的共感染 |
| 2.2.1.5 收集和处理细胞样品 |
| 2.2.1.6 间接免疫荧光实验 |
| 2.2.1.7 Western Blot分析 |
| 2.2.1.8 荧光实时定量检测 |
| 2.2.1.9 胶回收、连接与转化 |
| 2.2.1.10 质粒提取 |
| 2.2.2 病毒拯救及共感染 |
| 2.2.2.1 H5亚型AIV和H9亚型AIV8个基因片段的鉴定与回收 |
| 2.2.2.2 替换NS1基因H5和H9亚型AIV的拯救、传代与鉴定 |
| 2.2.2.3 重组病毒生物学特性测定 |
| 2.2.2.4 替换NS1毒株与新城疫体外共感染 |
| 2.2.2.5 替换NS1毒株与新城疫体内共感染 |
| 2.2.3 H9N2亚型AIV与NDV共感染过程中SG与AIV拮抗作用 |
| 2.2.3.1 剂量梯度NDV与H9N2共感染 |
| 2.2.3.2 构建H9N2亚型NS1蛋白过表达载体 |
| 2.2.3.3 NS1_(H9N2)蛋白在共感染过程中的作用 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 NDV对不同亚型AIV的抑制作用 |
| 3.1.1 H9N2亚型AIV感染A549细胞最适胰酶浓度的确定 |
| 3.1.2 NDV感染对H9N2亚型AIV的影响 |
| 3.1.3 NDV感染对H5N1亚型AIV的影响 |
| 3.1.4 AIV感染对NDV的影响 |
| 3.1.5 NDV与不同亚型AIV共感染中TBK1通路水平的测定 |
| 3.1.6 NDV与不同亚型AIV共感染中干扰素表达的水平 |
| 3.2 拯救替换NS1基因的流感病毒及拯救病毒的共感染 |
| 3.2.1 替换NS1基因流感病毒的拯救 |
| 3.2.2 替换NS1基因流感病毒的鉴定 |
| 3.2.3 替换NS1基因流感病毒的生物学特性测定 |
| 3.2.4 NDV与替换NS1基因AIV在共感染中干扰素的水平 |
| 3.2.5 NDV感染对替换NS1基因AIV在体外A549细胞上的影响 |
| 3.2.6 NDV感染对替换NS1基因AIV在体内SPF鸡上的影响 |
| 3.3 SG在 NDV-AIV共感染中的功能初探 |
| 3.3.1 不同剂量NDV的预处理对H9N2的影响 |
| 3.3.2 H9N2对NDV诱导G3BP1聚集的影响 |
| 3.3.3 H9N2 NS1蛋白对NDV诱导G3BP1聚集的影响 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（6）H9N2 AIV、IBV和ILTV TaqMan三重荧光定量PCR检测方法的建立和应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1 鸡呼吸道疾病病因分析 |
| 1.1 病原体感染 |
| 1.2 环境因素 |
| 1.3 免疫应激 |
| 1.4 自身生理结构因素 |
| 2 H9N2亚型禽流感病毒 |
| 2.1 病原学 |
| 2.2 遗传进化 |
| 2.3 H9N2 AIV的流行现状 |
| 3 传染性支气管炎病毒 |
| 3.1 病原学 |
| 3.2 遗传进化 |
| 3.3 IBV流行现状 |
| 4 传染性喉气管炎病毒 |
| 4.1 病原学 |
| 4.2 遗传进化 |
| 4.3 ILT流行现状 |
| 5 分子生物学检测方法 |
| 5.1 AIV检测方法 |
| 5.2 IBV检测方法 |
| 5.3 ILTV检测方法 |
| 5.4 禽呼吸系统疾病多重检测方法 |
| 参考文献 |
| 第一章 H9N2 AIV、IBV和ILTV TaqMan三重荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要生物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要生物学软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物、探针的设计与合成 |
| 2.2 质粒标准品的制备 |
| 2.3 荧光定量PCR反应体系和条件的优化 |
| 2.4 特异性、灵敏度、重复性试验 |
| 2.5 抗干扰试验 |
| 2.6 样品检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 质粒标准品构建结果 |
| 3.2 单和三重荧光定量PCR反应体系和条件的优化结果 |
| 3.3 单荧光定量PCR的评估 |
| 3.4 三重荧光定量PCR的评估 |
| 3.5 荧光定量PCR检测结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 TaqMan三重荧光定量PCR方法在临床样品检测中的应用 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要生物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要生物学软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 病料处理 |
| 2.2 病料总RNA和DNA的提取 |
| 2.3 三重荧光定量PCR检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 临床症状 |
| 3.2 检测结果 |
| 3.3 时间分布特点分析 |
| 3.4 宿主分布特点分析 |
| 3.5 地域分布特点分析 |
| 3.6 月龄分布特点分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（7）NDV和H9N2亚型AIV共感染对病毒增殖和致病性影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 文献综述 |
| 1 新城疫病毒研究进展 |
| 1.1 新城疫病毒概述 |
| 1.2 新城疫病毒流行历史和现状 |
| 1.3 新城疫病毒基因组结构和功能 |
| 2 H9N2亚型禽流感病毒研究进展 |
| 2.1 H9N2亚型禽流感病毒概述 |
| 2.2 H9N2亚型禽流感病毒流行历史和现状 |
| 2.3 AIV基因组编码的功能蛋白 |
| 3 新城疫病毒与禽流感病毒共感染研究进展 |
| 4 研究目的和意义 |
| 第一章 基因Ⅶd亚型NDV-DQ株病毒增殖和致病性测定 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验鸡胚和鸡 |
| 1.2 实验毒株和细胞 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 NDV-DQ株复壮 |
| 2.2 NDV-F4株鉴定 |
| 2.2.1 NDV-F4株RT-PCR鉴定 |
| 2.2.1.1 引物设计 |
| 2.2.1.2 病毒RNA提取 |
| 2.2.1.3 cDNA合成 |
| 2.2.1.4 病毒核酸PCR扩增 |
| 2.2.2 NDV-F4株TCID_(50) 测定 |
| 2.2.2.1 CEF制备 |
| 2.2.2.2 病毒感染CEF |
| 2.2.2.3 TCID_(50)计算 |
| 2.3 NDV增殖和致病性测定 |
| 2.3.1 NDV-F4株HA-HI测定 |
| 2.3.1.1 鸡红细胞悬液配置 |
| 2.3.1.2 HA效价测定 |
| 2.3.1.3 HI效价测定 |
| 2.3.2 NDV-F4株ICPI测定 |
| 2.3.3 NDV-F4株MDT测定 |
| 2.3.4 NDV-F4 株感染鸡胚HA-HI效价测定 |
| 2.3.5 NDV-F4 株感染鸡胚RT-PCR鉴定 |
| 2.3.6 NDV-F4 株感染鸡胚NDV NP基因表达蛋白测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 NDV-DQ株复壮结果 |
| 3.2 NDV-F4株鉴定结果 |
| 3.2.1 RT-PCR鉴定结果 |
| 3.2.2 NDV-F4株TCID_(50) 测定结果 |
| 3.3 NDV增殖和致病性测定结果 |
| 3.3.1 NDV-F4株HA-HI测定结果 |
| 3.3.2 NDV-F4株ICPI测定结果 |
| 3.3.3 NDV-F4株MDT测定结果 |
| 3.3.4 NDV-F4 株感染鸡胚HA-HI测定结果 |
| 3.3.5 NDV-F4 株感染鸡胚RT-PCR鉴定结果 |
| 3.3.6 NDV-F4 株感染鸡胚NDV NP基因表达蛋白检测结果 |
| 3.3.6.1 标准曲线绘制结果 |
| 3.3.6.2 NDVNP基因表达蛋白含量检测结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 H9N2 亚型AIV-AS株病毒增殖和致病性测定 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验鸡胚和鸡 |
| 1.2 实验毒株和细胞 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 AIV-AS株复壮 |
| 2.2 AIV-F4株鉴定 |
| 2.2.1 AIV-F4株RT-PCR鉴定 |
| 2.2.1.1 引物设计 |
| 2.2.1.2 AIV RNA提取 |
| 2.2.1.3 cDNA合成 |
| 2.2.1.4 AIV病毒核酸PCR扩增 |
| 2.2.2 AIV-F4株TCID_(50) 测定 |
| 2.3 AIV增殖和致病性测定 |
| 2.3.1 AIV-F4株HA-HI测定 |
| 2.3.2 AIV-F4株MDT测定 |
| 2.3.3 AIV-F4 株感染鸡胚HA-HI测定 |
| 2.3.4 AIV-F4 株感染鸡胚RT-PCR检测 |
| 2.3.5 AIV-F4 株感染鸡胚AIV NP基因表达蛋白检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 AIV-AS株复壮结果 |
| 3.2 AIV-F4株鉴定结果 |
| 3.2.1 AIV-F4株RT-PCR检测结果 |
| 3.2.2 AIV-F4株TCID_(50) 测定结果 |
| 3.3 AIV增殖和致病性测定结果 |
| 3.3.1 AIV-F4株HA-HI测定结果 |
| 3.3.2 AIV-F4株MDT测定结果 |
| 3.3.3 AIV-F4 株感染鸡胚HA-HI测定结果 |
| 3.3.4 AIV-F4 株感染鸡胚RT-PCR检测结果 |
| 3.3.5 AIV-F4 株感染鸡胚AIV NP基因表达蛋白检测结果 |
| 3.3.5.1 标准曲线绘制结果 |
| 3.3.5.2 AIVNP基因表达蛋白含量检测结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 NDV和 AIV共感染对病毒增殖和致病性影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验鸡胚 |
| 1.2 实验毒株 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 试验设计与分组 |
| 2.2 NDV和 AIV共感染鸡胚后病毒增殖测定 |
| 2.2.1 病毒核酸RT-PCR检测 |
| 2.2.2 病毒NP基因mRNA测定 |
| 2.2.2.1 鸡胚尿囊液和胚体总mRNA提取 |
| 2.2.2.2 鸡胚尿囊液和胚体总mRNA反转录成cDNA |
| 2.2.2.3 qPCR扩增 |
| 2.2.3 病毒NP基因表达蛋白检测 |
| 2.3 NDV和 AIV共感染鸡胚后病毒致病性测定 |
| 2.3.1 病毒HA效价和血清HI效价测定 |
| 2.3.2 眼观大体观察 |
| 2.3.3 组织变化观察 |
| 3 结果 |
| 3.1 NDV和 AIV共感染鸡胚后病毒增殖测定结果 |
| 3.1.1 病毒核酸RT-PCR检测结果 |
| 3.1.1.1 NDV核酸RT-PCR检测结果 |
| 3.1.1.2 AIV核酸RT-PCR检测结果 |
| 3.1.2 病毒NP基因mRNA测定结果 |
| 3.1.2.1 引物特异性验证结果 |
| 3.1.2.2 NDV NP基因mRNA检测结果 |
| 3.1.2.3 AIV NP基因mRNA检测结果 |
| 3.1.3 病毒NP基因表达蛋白检测结果 |
| 3.1.3.1 标准曲线绘制结果和病毒表达含量结果 |
| 3.1.3.2 NDVNP基因表达蛋白含量检测结果 |
| 3.1.3.3 AIVNP基因表达蛋白含量检测结果 |
| 3.2 NDV和 AIV共感染鸡胚后病毒致病性测定结果 |
| 3.2.1 病毒HA效价和血清HI效价测定结果 |
| 3.2.2 大体观察结果 |
| 3.2.3 组织变化观察结果 |
| 3.2.3.1 试验Ⅰ组、CG-0组和对照组肝脏组织切片结果 |
| 3.2.3.2 试验Ⅱ组肝脏组织切片结果 |
| 3.2.3.3 试验Ⅰ组、CG-0组和对照组心脏组织切片结果 |
| 3.2.3.4 试验Ⅱ组心脏组织切片结果 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感（H9亚型）三联灭活疫苗的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 1 H9N2亚型禽流感流行情况及疫苗研究进展 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 H9N2亚型AIV的遗传进化 |
| 1.3 中国H9N2亚型AIV的流行现状 |
| 1.4 H9N2亚型AIV的生物学特性 |
| 1.5 H9N2亚型禽流感的基因重配 |
| 1.6 H9N2亚型AIV疫苗研究进展 |
| 1.6.1 常规全病毒灭活疫苗 |
| 1.6.2 重组病毒疫苗和载体病毒疫苗 |
| 2 新城疫流行情况及疫苗研究进展 |
| 2.1 新城疫的流行情况 |
| 2.2 新城疫疫苗研究进展 |
| 2.2.1 常规疫苗 |
| 2.2.2 新型疫苗 |
| 3 传染性支气管炎流行情况及疫苗研究进展 |
| 3.1 传染性支气管炎的流行情况 |
| 3.2 传染性支气管炎疫苗的研究进展 |
| 3.2.1 常规疫苗 |
| 3.2.2 新型疫苗 |
| 4 研究目的与意义 |
| 第一章 以PR8为骨架的重组H9N2亚型禽流感病毒的构建与筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株,细胞株和实验动物 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 质粒的构建 |
| 2.1.1 病毒RNA提取及cDNA制备 |
| 2.1.2 PCR扩增目的基因 |
| 2.1.3 连接中间载体(Blunt Simple) |
| 2.1.4 连接工作载体(PHW2000) |
| 2.1.5 质粒转化 |
| 2.1.6 酶切鉴定 |
| 2.2 反向遗传病毒的拯救及鉴定 |
| 2.2.1 质粒转染 |
| 2.2.2 病毒的拯救 |
| 2.2.3 病毒的传代培养 |
| 2.2.4 鸡胚半数感染量(EID_(50))测定 |
| 2.3 灭活疫苗的制备 |
| 2.3.1 疫苗制备原料的准备 |
| 2.3.2 抗原稀释与灭活 |
| 2.3.3 水相制备 |
| 2.3.4 油相制备 |
| 2.3.5 疫苗乳化 |
| 2.4 免疫效力的测定与攻毒保护试验 |
| 2.4.1 抗体水平监测 |
| 2.4.2 攻毒保护实验 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 序列进化树分析 |
| 3.2 HA、NA基因的PCR扩增结果 |
| 3.3 构建质粒的酶切鉴定结果 |
| 3.4 转染0H、48H、96H的细胞观察结果 |
| 3.5 重组毒株E6代EID_(50)与原始毒株EID_(50)的比较 |
| 3.6 免疫后抗体水平的监测 |
| 3.7 排毒检测结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 新支流三联灭活疫苗的制备及与同类产品免疫效力比较 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 SPF种蛋 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 新支流三联灭活疫苗的制备 |
| 2.1.1 抗原制备 |
| 2.1.2 抗原浓缩 |
| 2.1.3 抗原灭活 |
| 2.1.4 半成品检验 |
| 2.1.5 疫苗制备 |
| 2.1.6 成品检验 |
| 2.2 新支流三联灭活疫苗与同类产品免疫效力对比 |
| 2.2.1 抗体水平检测 |
| 2.2.2 攻毒保护试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒浓缩效果检验 |
| 3.2 疫苗半成品检验 |
| 3.3 疫苗成品检验 |
| 3.4 NDV抗体水平的监测 |
| 3.5 IBV抗体水平的监测 |
| 3.6 H9亚型AIV抗体水平的监测 |
| 3.7 攻毒后生存曲线示意图 |
| 3.8 排毒检测结果 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）广西野鸟源H9亚型禽流感病毒分离鉴定和全基因组测序分析及二重RT-LAMP检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 A型流感病毒简介 |
| 1.2 禽流感病毒病原学特征 |
| 1.2.1 病毒形态结构 |
| 1.2.2 禽流感基因编码的蛋白及其功能 |
| 1.2.3 禽流感病毒的抗原漂移和抗原转变 |
| 1.3 H9N2亚型禽流感病毒 |
| 1.3.1 H9N2亚型禽流感病毒在中国的爆发和流行 |
| 1.3.2 H9N2亚型禽流感病毒诊断技术 |
| 1.4 环介导等温核酸扩增检测技术(LAMP)研究进展 |
| 1.4.1 LAMP技术基本原理 |
| 1.4.2 可视化LAMP技术 |
| 1.4.3 与其它技术相结合的LAMP技术 |
| 1.5 本课题研究的意义 |
| 第二章 广西野鸟源H9亚型禽流感病毒的分离鉴定和生物学特性研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.1.3 鸡胚与标准血清 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒分离 |
| 2.2.2 病毒鉴定 |
| 2.2.3 分离株生物学特性测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒分离鉴定 |
| 2.3.2 分离株HA和NA基因型鉴定及标准命名 |
| 2.3.3 分离株生物学特性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 15株广西野鸟源H9N2亚型禽流感病毒分离株全基因组序列测定及遗传进化分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 分离株RT-PCR全基因组扩增 |
| 3.2.2 RT-PCR扩增产物胶回收与连接转化 |
| 3.2.3 阳性菌液的鉴定与测序 |
| 3.2.4 测序结果分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 扩增及序列测定结果 |
| 3.3.2 遗传进化分析结果 |
| 3.3.3 15株野鸟源H9N2亚型AIV分离株基因分型 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 H9和N2 亚型禽流感病毒二重荧光RT-LAMP检测方法的建立 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 毒株 |
| 4.1.2 主要试剂与仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 引物设计 |
| 4.2.2 标准品的制备 |
| 4.2.3 反应体系的优化 |
| 4.2.4 特异性试验 |
| 4.2.5 干扰性试验 |
| 4.2.6 敏感性试验 |
| 4.2.7 临床样品检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 反应体系 |
| 4.3.2 结果观察 |
| 4.3.3 特异性试验 |
| 4.3.4 干扰性试验 |
| 4.3.5 敏感性试验 |
| 4.3.6 临床样品检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 H9和H5 亚型禽流感病毒二重荧光RT-LAMP检测方法的建立 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 毒株 |
| 5.1.2 主要试剂与仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 引物设计 |
| 5.2.2 标准品的制备 |
| 5.2.3 反应体系的优化 |
| 5.2.4 特异性试验 |
| 5.2.5 干扰性试验 |
| 5.2.6 敏感性试验 |
| 5.2.7 临床样品检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 反应体系 |
| 5.3.2 结果观察 |
| 5.3.3 特异性试验 |
| 5.3.4 干扰性试验 |
| 5.3.5 敏感性试验 |
| 5.3.6 临床样品检测结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间科研成果 |
（10）表达H7N9亚型禽流感病毒血凝素基因的重组新城疫病毒载体疫苗的构建及血凝素抗原表位鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 H7N9亚型禽流感疫苗研究进展 |
| 1. H7N9亚型禽流感病毒流行现状 |
| 2. H7N9禽流感疫苗的临床前研究 |
| 3. H7N9疫苗诱导的抗体应答特征 |
| 4. B细胞表位鉴定对疫苗设计的启示 |
| 参考文献 |
| 第一章 表达H7N9亚型禽流感病毒血凝素基因的重组新城疫病毒载体疫苗的构建与评价 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 H7N9禽流感病毒HA蛋白B细胞抗原表位的预测及排谱 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 H7N9禽流感病毒HA蛋白优势表位的鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录 |
四、NDV和H_9亚型AIV在血凝抑制及混合病毒在鸡胚增殖中的相互干扰（论文参考文献）
- [1]重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1 Re-11株+Re-12株，H7N9 H7-Re3株）研究[D]. 刘艳晶. 中国农业科学院, 2021
- [2]表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组嵌合NDV的构建及其免疫效力[D]. 王杨杨. 扬州大学, 2021
- [3]2018-2020年华东地区H9N2亚型禽流感病毒流行病学和PB2蛋白适应性变异对病毒复制影响[D]. 裴宇茹. 扬州大学, 2021
- [4]H7N9亚型禽流感病毒灭活标记疫苗的研制[D]. 李刚. 扬州大学, 2021
- [5]禽流感病毒NS1蛋白拮抗干扰素水平的差异在NDV-AIV共感染过程中的作用[D]. 朱子晨. 山东农业大学, 2021(01)
- [6]H9N2 AIV、IBV和ILTV TaqMan三重荧光定量PCR检测方法的建立和应用[D]. 冯林. 扬州大学, 2020(04)
- [7]NDV和H9N2亚型AIV共感染对病毒增殖和致病性影响[D]. 赵大杰. 贵州大学, 2020(04)
- [8]鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感（H9亚型）三联灭活疫苗的研制[D]. 倪小舒. 扬州大学, 2020(04)
- [9]广西野鸟源H9亚型禽流感病毒分离鉴定和全基因组测序分析及二重RT-LAMP检测方法的建立[D]. 李云燕. 广西大学, 2020(02)
- [10]表达H7N9亚型禽流感病毒血凝素基因的重组新城疫病毒载体疫苗的构建及血凝素抗原表位鉴定[D]. 石磊. 扬州大学, 2020